CN109400410B - 利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备苏氨酸发酵液，步骤2）制备蛋白粉，步骤3）制备苏氨酸，步骤4）收集苏氨酸发酵废液，步骤5）制备生物有机质。本发明方法在制备苏氨酸的同时制备了生物有机质，其可以用作液体肥料，实现了变废为宝，一举两得。

Description

利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法。

背景技术

苏氨酸是一种必需的氨基酸，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸，随着赖氨酸、蛋氨酸合成品在配合饲料中的广泛应用，苏氨酸逐渐成为影响畜禽生长的主要限制性因素。苏氨酸主要用做饲料添加剂，其生产步骤为浓缩、结晶、提取菌体蛋白，而其过程中产生的母液处理难度较大，成本较高，难以获得性价比较高的副产品。

目前氨基酸发酵工业的废水小部分用于液体肥料的开发，还有很小部分用于固体有机肥的喷浆造粒工艺。但是，喷浆造粒的需液量少，不能消耗大量的氨基酸工业废液。同时也由于液体的基本特性，存在着诸如酸性较强、腐蚀性较强、臭气较重、氨基酸废液成分难以优化、田间效果不良、甚至对某些作物有害等负面因素，使氨基酸废液在有机肥料方面的利用一直受到限制，所生产的肥料，无论是固体废料还是液体肥料，都难以推广。这些都抑制着氨基酸工业废水的循环利用。随着氨基酸工业的发展，所产生的氨基酸废水的量也越来越多。同属水资源越来越紧缺，环境保护压力越来越大，氨基酸工业废水的处理也越来越成为困扰氨基酸工业发展的一大难题。

氨基酸发酵废液依然含有大量的氨基酸残余和有机质残留。这一方面使得氨基酸废水COD较高，处理起来十分困难，另一方面又在种植业养殖业等方面具备利用的潜力。目前，微生物生物技术利用微生物的代谢功能可对物料中的有机成分实现有特征的转化，形成有特征的次生代谢物，并改变物料的理化学特性和生化学特性。同时某些微生物又能对农作物的生长产生促进作用，对土壤起到提升呼吸能力的作用，带来土壤改良和植物肥料效应，是微生物肥料的主力军。申请人之前的专利技术对苏氨酸发酵废液进行了改进，其中“一种利用苏氨酸发酵废弃物制备的肥料”，在制备苏氨酸的同时，将发酵废弃物制备了固体肥料，取得了较好的经济效益；“利用苏氨酸发酵废弃物制备的复混肥”利用发酵废弃物制备了微生物菌肥。

发明内容

本发明的目的在于提供了利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法，该方法在制备苏氨酸的同时制备了生物有机质，其可以用作液体肥料，实现了变废为宝，一举两得。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备苏氨酸发酵液，步骤2）制备蛋白粉，步骤3）制备苏氨酸，步骤4）收集苏氨酸发酵废液，步骤5）制备生物有机质。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）制备苏氨酸发酵液：将产苏氨酸的大肠杆菌工程菌按照8%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为36h，然后按照10%的接种量接入莱茵衣藻，继续发酵36h，停止发酵，收集苏氨酸发酵液；

步骤2）制备蛋白粉：苏氨酸发酵液首先经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和菌体蛋白沉淀，将菌体蛋白沉淀烘干，粉碎，制备蛋白粉；

步骤3）制备苏氨酸：上层液体经过陶瓷膜过滤，收集滤过液和截留物，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液和沉淀物；然后经过超滤膜过滤，收集滤过液；将滤过液浓缩结晶，离心收集晶体和母液，然后将晶体干燥，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；流化床干燥，再经破碎整粒，即得苏氨酸；

步骤4）收集苏氨酸发酵废液：将步骤3）所得截留物、沉淀物以及母液混合，得到苏氨酸发酵废液；

步骤5）制备生物有机质：将苏氨酸发酵废液加热至100℃，保温条件下处理10min，然后冷却至室温，加入氨水调整pH为6-7，然后依次接种枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌进行发酵处理，接种量均为3-5%，发酵温度为30-35℃，发酵时间为3天，结束发酵，往发酵液中按添加磷酸二氢钾、腐殖酸和尿素，搅拌混合均匀后过滤，收集滤液，即得到生物有机质。

进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油15g/L，玉米浆15g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5。

进一步地，所述发酵条件为：温度30℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.5vvm，转速为100rpm。

进一步地，所述陶瓷膜的截留分子量为1万Da。

进一步地，所述超滤膜的截留分子量为300Da。

进一步地，所述步骤5）中，发酵液、磷酸二氢钾、腐殖酸和尿素的比例为1L:5g:3g:2g。

本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明发酵碳源选择葡萄糖和甘油，发酵前期，菌体密度低，供氧量充足，大肠杆菌优先利用葡萄糖作为碳源，可以促进菌体增殖和苏氨酸的产生；发酵中后期，葡萄糖被耗尽，此时大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，进入糖酵解的碳流下降，从而降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量；

本发明通过在发酵接种莱茵衣藻，能够利用发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，而较难利用甘油作为碳源，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用。通过添加莱茵衣藻，不但能够提高苏氨酸的产量，并且菌体蛋白产量也相应提高；

本发明发酵过程中同时制备出苏氨酸、菌体蛋白以及生物有机质，省略了中间预处理步骤，实现污水的直接生物利用，变废为宝的同时还减少了排放，经济效益显著；

本发明在制备生物有机质过程中，采用复合菌液对发酵废液进行处理，对COD、氨氮进行了降解，并产生活性物质，有利于植物生长，对病虫害也有一定的防治作用；腐植酸含有羧基、酚羟基等官能团，有较强的离子交换能力和吸附能力，对尿素有明显的增效作用，可与尿素生成络合物，能够减缓尿素分解，减少挥发，延长肥效。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法，其包括如下步骤：

步骤1）将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照8%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.5vvm，转速为100rpm，发酵时间为36h，然后按照10%的接种量接入莱茵衣藻（莱茵衣藻的浓度为1×10⁵cfu/mL），继续发酵培养36h，停止发酵，收集发酵液；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油15g/L，玉米浆15g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5；

步骤2）发酵液首先经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和菌体蛋白沉淀，将菌体蛋白沉淀烘干，粉碎，制备蛋白粉；

步骤3）上层液体经过陶瓷膜（1万Da截留分子量）过滤，收集滤过液和截留物，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液（蛋白含量小于0.5%）和沉淀物；然后经过超滤膜过滤，收集滤过液，超滤膜截留分子量为300Da；将滤过液用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，离心收集晶体和母液，然后将晶体置于120℃干燥至水分含量为0.8％，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；65℃流化床干燥，再经破碎整粒，即得苏氨酸；

步骤4）将步骤3）所得截留物、沉淀物以及母液混合，得到苏氨酸发酵废液；

步骤5）将苏氨酸发酵废液加热至100℃，保温条件下处理10min，然后冷却至室温，加入氨水调整pH为6.5，然后依次接种枯草芽孢杆菌（浓度为1×10⁸cfu/mL）和绿色木霉菌（浓度为1×10⁸cfu/mL）进行发酵处理，接种量均为5%，发酵温度为32℃，发酵时间为3天，结束发酵，往发酵液中按添加磷酸二氢钾、腐殖酸和尿素，搅拌混合均匀后过滤，收集滤液，即得到生物有机质；所述发酵液、磷酸二氢钾、腐殖酸和尿素的比例为1L:5g:3g:2g。

实施例2

本发明发酵方法中不同因素对苏氨酸产量和乙酸产量的影响：

设置组别：

实验组：实施例1；

对照组1：不添加莱茵衣藻，其余同实施例1；

对照组2：将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1；

对照组3：不添加莱茵衣藻，同时将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1。

各组别最终发酵液中苏氨酸和乙酸的含量见表1所示：

表1

组别	苏氨酸g/L	乙酸g/L
			实验组	127.9	0.7
对照组1	103.5	12.6
			对照组2	115.7	4.9
对照组3	97.1	14.8

结论：实验组通过对莱茵衣藻进行辅助发酵处理，能够在利用苏氨酸发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用；同时通过甘油替代部分葡萄糖，随着葡萄糖的消耗，大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量，通过各组别比较试验发现，本发明实验组的苏氨酸产量最高，而乙酸含量最低。

实施例3

本发明制备的生物有机质的肥效试验：

以番茄为例，检测番茄产量和品质。

实验组：喷洒本发明生物有机质；

对照组：喷洒等量清水。

地点选择内蒙地区的温室大棚；每小区种植面积为10m×10m，设置3次重复，共设6个试验小区，随机区组排列。番茄品种为粉利1号，每亩喷洒液体肥料100kg，其他种植条件相同。结果如表2所示：

表2

组别	单果重g	可溶性固形物%	可溶性糖%	可滴定酸%
					实验组	168.9	4.73	4.03	0.36
对照组	162.4	4.55	3.89	0.41

结论：如表2所示，与对照组不施加有机质相比，实验组的有机质能够提高单果重，还能够提高可溶性固形物和可溶性糖的比重，降低可滴定酸的比重，提升了番茄品质。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.利用苏氨酸发酵废液生产生物有机质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）制备苏氨酸发酵液：将产苏氨酸的大肠杆菌工程菌按照8%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为36h，然后按照10%的接种量接入莱茵衣藻，继续发酵36h，停止发酵，收集苏氨酸发酵液；

步骤2）制备蛋白粉：苏氨酸发酵液经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和菌体蛋白沉淀，将菌体蛋白沉淀烘干，粉碎，制备蛋白粉；

步骤3）制备苏氨酸：步骤2）所得上层液体经过陶瓷膜过滤，收集滤过液和截留物，将滤过液经卧螺离心机分离，收集上清液和沉淀物；上清液经过超滤膜过滤，收集超滤液；将超滤液浓缩结晶，离心收集晶体和母液，然后将晶体干燥，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；流化床干燥，再经破碎整粒，即得苏氨酸；

步骤4）收集苏氨酸发酵废液：将步骤3）所得截留物、沉淀物以及母液混合，得到苏氨酸发酵废液；

步骤5）制备生物有机质：将苏氨酸发酵废液加热至100℃，保温条件下处理10min，然后冷却至室温，加入氨水调整pH为6-7，然后依次接种枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌进行发酵处理，接种量均为3-5%，发酵温度为30-35℃，发酵时间为3天，结束发酵，往发酵液中按添加磷酸二氢钾、腐殖酸和尿素，搅拌混合均匀后过滤，收集滤液，即得到生物有机质；

所述步骤5）中，发酵液、磷酸二氢钾、腐殖酸和尿素的比例为1L:5g:3g:2g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油15g/L，玉米浆15g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中的发酵条件为：温度30℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.5vvm，转速为100rpm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的截留分子量为1万Da。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为300Da。