CN110468051A - 一种k252a发酵培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种K252A发酵培养基及其制备方法,该发酵培养基通过优化的组分搭配,外加氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸等功能因子,既能为拟诺卡氏菌种生长、代谢提供营养,经代谢转化后又能为K252A生物合成提供中间体,最终获得高产K252A的发酵液。使用本发明所述发酵培养基,摇瓶发酵9天,K252A效价高于2.60g/L。通过控制pH、溶氧两个关键工艺条件,同时优化葡萄糖和功能因子的补料控制策略,培养至约264h,K252A效价可达5.79g/L,较文献报道的水平显著提高,具备了工业化生产的基础。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物发酵技术领域,具体涉及一种K252A发酵培养基及由该发酵培养基制备K252A的方法。
背景技术
K252A,CAS号99533-80-9,是1986年由HIROSHI KASE等人从拟诺卡氏菌培养物中分离得到的代谢产物,之后完成结构鉴定,最终确认是星形孢菌素的类似物,是一种强效的蛋白激酶C和酪氨酸激酶的抑制剂,IC50值为32.9nM。目前,大量文献报道了抗生素K252A具备有效的抗肿瘤活性,但是在体外研究显示没有抗微生物活性或啮齿类动物的体内毒性。更广泛的研究已证明抗生素K252A是一种有效的Ca2+/钙调蛋白激酶II抑制剂,它也能抑制其他的激酶活性,特别是肌球蛋白轻链激酶,环磷酸腺苷依赖蛋白激酶(PKA),蛋白激酶C(PKC)和cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)。
已知拟诺卡氏菌种(Nocardiopsis sp.)可以生产K252A,HIROSHI KASE于1986年进行了简要的报道外,但其得到的发酵液中K252A含量仅约为110μg/ml(Hiroshi Kase,Kazuyuki Iwahashi,Yuzuru Matsuda.K-252a,a Potent Inhibitor of Protein KinaseC from Microbial Origin[J].The Journal of Antibiotics,1986,39(8):1059-1065.)。Mitsutaka Kino曾报道其在发酵罐中K252A的发酵水平达到2g/L,但至今未见其有后续文献公开(Mitsutaka Kino,Kenzo Shono,Tetsuo Nishinura,et al.PracticalPreparation of K-252a from a Fermentation Solution[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,1998,62(8):1627-1629.)。Sanjay R.Chemburkar等在专利US20090239271A1中报道其K252A发酵水平为1~4g/L,并对K252A的分离方法进行了保护,但未公开其具体的发酵培养基配方和发酵培养方法。
发明内容
为了提高K252A的产量,本发明以拟诺卡氏菌种(Nocardiopsis sp.)作为生产菌种,对发酵培养基和发酵方法进行研究优化,最终获得一种发酵培养基及由该发酵培养基制备K252A的方法。该培养基和方法为拟诺卡氏菌种生长提供充足的营养的同时,能促进拟诺卡氏菌种的代谢速度,通过功能因子的代谢转化,为K252A的生物合成提供了中间体,最终大幅度提升了K252A的发酵产量。
一种K252A的发酵培养基,所述发酵培养基包括以下重量百分含量的组分:
其中,所述功能因子为:
氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸三者的组合,其中氯化胆碱含量为发酵培养基重量的0.01~0.05%,丁二酸二钠含量为发酵培养基重量的0.08~0.4%,蛋氨酸含量为发酵培养基重量的0.26~1.3%。
优选的,所述碳源为下列中的一种或两种或多种的组合:甘油、糊精、可溶性淀粉、麦芽糖、油酸甲酯。所述碳源包括速效、缓效碳源,主要用于不同时期为菌体生长、繁殖提供所需能量和合成菌体所需的碳成分,刺激菌丝生长,同时为产物合成提供碳骨架。
作为进一步优选,其中所述碳源优选为油酸甲酯或优选为含有油酸甲酯的组合。油酸甲酯具有多重功效,在消毒阶段,容易起泡顶罐,油酸甲酯由于具有消泡作用,故可以减少底物消泡剂的用量,从而降低消泡剂对菌体生长的抑制作用;在培养阶段,既可以作为基础碳源被菌体缓慢利用,又可以加速产物从细胞内向细胞外扩散,从而降低反馈抑制效应。
优选的,所述氮源为下列中的一种或两种或多种的组合:黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉、酵母抽提物、玉米浆干粉。所述氮源包括速效、缓效氮源,主要用于不同时期构建菌体氨基酸、蛋白质和核酸等细胞物质,以及产物合成的氮骨架。
优选的,所述无机盐为下列中的一种或两种或多种的组合:铵盐、钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐,优选为硝酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙的组合。所述无机盐可以构成菌体细胞成分,同时作为微生物酶的重要组成部分,也可以作为某些酶的激活剂或者抑制剂从而调节产物合成的途径和效率。所述无机盐还可以对培养基的pH值进行缓冲调节,构建适当的缓冲体系,还有可能维持适当的渗透压和氧化还原电位等,参与生物代谢过程的电子传递。
优选的,所述消泡剂为THIX-298消泡剂。
作为进一步优选,所述发酵培养基包括以下重量百分含量的组分:
所述发酵培养基消毒前pH值为6.4~8.0。
本发明所述的发酵培养基不仅含有碳源,还含有氮源、无机盐、功能因子等组分,既能够为拟诺卡氏菌种(Nocardiopsis sp.)提供充足的营养,又能促进拟诺卡氏菌种的代谢速度,为K252A生物合成提供中间体,最终大幅提升了K252A的发酵产量。
本发明还提供了一种应用所述的发酵培养基制备K252A的方法,其包括以下步骤:
摇瓶发酵方法:将摇瓶种子培养液按照5~15%的体积比接种至上述发酵培养基中,在26~32℃、150~500rpm条件下培养,培养周期220~240h,得到含有K252A的发酵液;
或者
罐发酵方法:将罐种子培养液按照发酵培养基体积5~10%的比例接种至上述发酵培养基中,在26~32℃条件下培养,通过搅拌与通气联动控制,使溶氧始终维持在15~30%。接种24h后开始至培养结束,用氨水进行pH使其控制在6.8±0.2;接种36h后开始,期间流加葡萄糖溶液和功能因子混合液,至培养结束前1天停止流加,培养周期220~264h,得到含有K252A的发酵液。
优选的,所述罐发酵方法中流加葡萄糖溶液的控制策略是维持发酵液中葡萄糖浓度在1~5g/L范围内,所述流加的葡萄糖溶液的浓度为500g/L。
优选的,所述罐发酵方法中流加的功能因子混合液成分为:氯化胆碱5g/L、丁二酸二钠40g/L、蛋氨酸130g/L,余量为水,所述流加功能因子混合液的速度控制在每小时流加体积为初始发酵培养基体积的0.05~0.1%。
作为优选,所述摇瓶种子培养液通过下述步骤获得:
1)筛选拟诺卡氏菌种:采用固体平板培养基,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落,接种固体斜面培养基上,在26~32℃,55~65%相对湿度下静置培养5天,收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的种源接种至种子培养基中,在26~32℃,150~330rpm条件下培养24~72h,获得摇瓶种子培养液;
所述罐种子培养液通过下述步骤获得:将摇瓶种子培养液,先接种到种子罐中的种子培养基中,在26~32℃、50~300rpm、0.35vvm条件下扩大培养18~96h,获得罐种子培养液。
进一步优选的,步骤1)中所述固体平板培养基和步骤2)中所述固体斜面培养基包括以下重量百分含量的组分:
所述固体培养基消毒前pH值为6.5~7.5,步骤1)中采用玉米淀粉为碳源进行菌种筛选,可以通过菌落对淀粉水解圈的大小,直观地判断出菌种的代谢能力,淘汰代谢能力相对较差的菌种,该培养基培育的菌落直径≥5mm,菌落高耸,菌苔丰满。
优选的,步骤3)中所述种子培养基包括以下重量百分含量的组分:
所述种子培养基消毒前pH值为6.5~7.5,该种子培养基可以提供刺激菌丝生长,提供充足的碳氮源营养,使菌丝发散、粗壮、活力旺盛且不易衰老。
使用本发明所述发酵培养基及其制备K252A的方法,摇瓶发酵9天,K252A效价高于2.60g/L,是不含功能因子的发酵培养基的5.26倍。通过发酵罐工艺条件和补料控制,培养至约264h,K252A效价最高可达5.79g/L,较目前文献报道的水平显著提高。
与现有技术相比,本发明有如下一些优点:
1、本发明提供的发酵培养基既能为拟诺卡氏菌种生长、代谢提供营养,通过氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸组合功能因子的添加,K252A效价高于2.6g/L。
2、本发明罐发酵培养中通过控制pH、溶氧两个关键工艺条件,优化葡萄糖和功能因子的补料控制策略,发酵液中K252A的含量进一步大幅提高,达到5.7g/L以上,较文献报道水平显著提高。
3、本发明所述K252A发酵培养基及其制备方法经500L规模发酵罐进行工艺放大验证,发酵液中K252A的含量可以达到5.7g/L以上,具备了工业化生产的基础。
具体实施方式
为了详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果,以下结合具体实施案例进行详细说明。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下面实施例所用的培养基组分如下:
固体平板培养基组成:玉米淀粉1%,水解酪蛋白0.2%,牛肉膏0.2%,酵母抽提物0.2%,琼脂2%,余量为水,所述培养基消毒前pH值为6.5~7.5。
固体斜面培养基组成:玉米淀粉1%,水解酪蛋白0.2%,牛肉膏0.2%,酵母抽提物0.2%,琼脂2%,余量为水,所述培养基消毒前pH值为6.5~7.5。
种子培养基组成:甘油0.5%,玉米淀粉3%,黄豆饼粉2%,酵母抽提物0.5%,玉米浆干粉0.5%,碳酸钙0.3%,余量为水,所述种子培养基消毒前pH值为6.5~7.5。
本发明中的菌种来源:购自美国农业研究菌种保藏中心,Nocardiopsis sp.K-252,NRRL 15532。
对比例1:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基上,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养72h,获得摇瓶种子培养液;
4)摇瓶发酵培养:将步骤3)的种子培养液按照5%的体积比接种至不含油酸甲酯和功能因子的发酵培养基中,在28℃、200rpm条件下培养至9天,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(不含功能因子)组成为:甘油0.4%,麦芽糖1%,麦芽糊精9%,可溶性淀粉4%,黄豆饼粉0.2%,玉米粉1%,棉籽饼粉1%,酵母抽提物3%,玉米浆干粉0.5%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入5ml无水甲醇,混匀,超声1h,再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量0.504g/L。
实施例1:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基上,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养72h,获得摇瓶种子培养液;
4)摇瓶发酵培养:将步骤3)的种子培养液按照5%的体积比接种至添加功能因子的不含油酸甲酯发酵培养基中,在28℃、200rpm条件下培养至9天,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(含功能因子)组成为:甘油0.4%,麦芽糖1%,麦芽糊精9%,可溶性淀粉4%,黄豆饼粉0.2%,玉米粉1%,棉籽饼粉1%,酵母抽提物3%,玉米浆干粉0.5%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,氯化胆碱0.05%,丁二酸二钠0.4%,蛋氨酸1.3%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入5ml无水甲醇,混匀,超声1h,再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量2.651g/L。
实施例2:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基上,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养72h,获得摇瓶种子培养液;
4)摇瓶发酵培养:将步骤3)的种子培养液按照5%的体积比接种至含有油酸甲酯且添加功能因子的发酵培养基中,在28℃、200rpm条件下培养至9天,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(含功能因子及油酸甲酯)组成为:油酸甲酯1.5%,甘油0.4%,麦芽糖1%,麦芽糊精9%,可溶性淀粉4%,黄豆饼粉0.2%,玉米粉1%,棉籽饼粉1%,酵母抽提物3%,玉米浆干粉0.5%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,氯化胆碱0.05%,丁二酸二钠0.4%,蛋氨酸1.3%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入5ml无水甲醇,混匀,超声1h,再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量2.773g/L。
对比例2:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基中,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养68h,获得摇瓶种子培养液;
4)罐发酵培养:将步骤3)的摇瓶种子培养液,按培养基体积0.25%的比例接种至10L种子培养基中,在29℃、150rpm、0.35vvm条件下扩大培养至48h,获得罐种子培养液;再将罐种子培养液按照发酵培养基体积8%的比例接种至不含油酸甲酯的发酵培养基中,在28℃、150~500rpm、0.35vvm条件下培养,不进行pH及溶氧控制,不补料,培养至256h,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(含功能因子)组成为:甘油0.4%,麦芽糖1%,麦芽糊精5%,可溶性淀粉3%,黄豆饼粉0.6%,玉米粉1.5%,棉籽饼粉1.5%,酵母抽提物2.5%,玉米浆干粉0.75%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,氯化胆碱0.05%,丁二酸二钠0.4%,蛋氨酸1.3%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入5ml无水甲醇,混匀,超声1h,再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量2.746g/L。
对比例3:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养68h,获得摇瓶种子培养液;
4)罐发酵培养:将步骤3)的摇瓶种子培养液,按培养基体积0.25%的比例接种至10L种子培养基中,在29℃、150rpm、0.35vvm条件下扩大培养至48h,获得罐种子培养液;再将罐种子培养液按照发酵培养基体积8%的比例接种至包含1.5%油酸甲酯的发酵培养基中,在28℃、150~500rpm、0.35vvm条件下培养,不进行pH及溶氧控制,不补料,培养至260h,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(含功能因子及油酸甲酯)组成为:油酸甲酯1.5%,甘油0.4%,麦芽糖1%,麦芽糊精5%,可溶性淀粉3%,黄豆饼粉0.6%,玉米粉1.5%,棉籽饼粉1.5%,酵母抽提物2.5%,玉米浆干粉0.75%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,氯化胆碱0.05%,丁二酸二钠0.4%,蛋氨酸1.3%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入5ml无水甲醇,混匀,超声1h,再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量2.918g/L。
实施例3:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基中,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养68h,获得摇瓶种子培养液;
4)罐发酵培养:将步骤3)的摇瓶种子培养液,按培养基体积0.25%的比例接种至10L种子培养基中,在29℃、150rpm、0.35vvm条件下扩大培养至48h,获得罐种子培养液;再将罐种子培养液按照发酵培养基体积8%的比例接种至包含3%油酸甲酯、低浓度功能因子的发酵培养基中,在28℃条件下,通过搅拌与通气联动控制,维持溶氧15~30%。接种24h后开始至培养结束,用氨水将pH自动控制在6.8±0.2范围内。接种36h后开始,流加500g/L葡萄糖溶液和功能因子混合液,维持发酵液中葡萄糖浓度1~5g/L,直至240h停止流加葡萄糖溶液和功能因子混合液,继续培养至264h,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(含功能因子及油酸甲酯)组成为:甘油0.4%,麦芽糖0.5%,麦芽糊精5%,可溶性淀粉3%,油酸甲酯3%,黄豆饼粉0.6%,玉米粉1.5%,棉籽饼粉1.5%,酵母抽提物2.5%,玉米浆干粉0.75%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,氯化胆碱0.01%,丁二酸二钠0.08%,蛋氨酸0.26%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
功能因子混合液组成为:氯化胆碱5g/L、丁二酸二钠40g/L、蛋氨酸130g/L,余量为水;
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入9ml无水甲醇,混匀,超声1h,再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量5.702g/L。
实施例4:
1)筛选拟诺卡氏菌种:取工作菌种冻存管,分离点种到固体平板培养基上,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落1颗,接种到固体斜面培养基中,在28℃,60%相对湿度下静置培养5天,立即收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的固体斜面菌苔约1cm2接种至50ml种子培养基中,在28℃,200rpm条件下培养68h,获得摇瓶种子培养液;
4)罐发酵培养:将步骤3)的摇瓶种子培养液,按培养基体积0.25%的比例接种至30L种子培养基中,在29℃、150rpm、0.35vvm条件下培养至52h,获得罐种子培养液;再将罐种子培养液按照发酵培养基体积6%的比例接种至包含3%油酸甲酯、低浓度功能因子的发酵培养基中,在28℃条件下,通过搅拌与通气联动控制,维持溶氧15~30%。接种24h后开始至培养结束,用氨水将pH自动控制在6.8±0.2范围内,接种36h后开始,流加500g/L葡萄糖溶液和功能因子混合液,维持发酵液中葡萄糖浓度1~5g/L,直至240h停止流加葡萄糖溶液和功能因子混合液,继续培养至264h,得到含有K252A的发酵液;
发酵培养基配方(含功能因子及油酸甲酯)组成为:油酸甲酯3%,甘油0.4%,麦芽糖0.5%,麦芽糊精5%,可溶性淀粉3%,黄豆饼粉0.6%,玉米粉1.5%,棉籽饼粉1.5%,酵母抽提物2.5%,玉米浆干粉0.75%,硝酸铵0.1%,硫酸镁0.5%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.1%,氯化胆碱0.01%,丁二酸二钠0.08%,蛋氨酸0.26%,余量为水,培养基消毒前的pH值为6.5。
功能因子混合液组成为:氯化胆碱5g/L、丁二酸二钠40g/L、蛋氨酸130g/L,余量为水;
5)样品处理与检测:取发酵液1ml,加入9ml无水甲醇,混匀,超声1h再次混匀,离心或过滤后取上清用HPLC分析测定,发酵液中K252A的含量5.790g/L。
从对比例1和实施例1的对比数据可以看出,通过氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸组合功能因子的添加,K252A的效价明显提高,达到2.6g/L,约为不添加的5.26倍。
从实施例1和实施例2的对比,对比例2和对比例3的对比,可以看出,本发明发酵培养基中添加油酸甲酯,尤其是罐发酵培养基中添加油酸甲酯有利于K252A产量的提高产量。
从对比例3和实施例3~4的对比数据可以看出,本发明通过控制pH、溶氧两个关键工艺条件,优化葡萄糖和功能因子混合液的补料控制策略,发酵液中K252A的含量进一步大幅提高,中试放大后仍可以达到5.79g/L,较文献报道水平显著提高,具备了工业化生产的基础。
需要说明的是,尽管在本文中已经对上述各实施案例进行了描述,但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此,基于本发明的创新理念,对本文所述实施案例进行的变更和修改,或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关技术领域,均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (12)
1.一种K252A的发酵培养基,其特征在于:所述发酵培养基包括以下重量百分含量的组分:
其中,所述功能因子为:
氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸三者的组合,其中氯化胆碱含量为发酵培养基重量的0.01~0.05%,丁二酸二钠含量为发酵培养基重量的0.08~0.4%,蛋氨酸含量为发酵培养基重量的0.26~1.3%。
2.根据权利要求1所述的K252A的发酵培养基,其特征在于:所述碳源为下列中的一种或两种或多种的组合:甘油、糊精、可溶性淀粉、麦芽糖、油酸甲酯,其中所述碳源优选为油酸甲酯或优选为含有油酸甲酯的组合。
3.根据权利要求1所述的K252A的发酵培养基,其特征在于:所述氮源为下列中的一种或两种或多种的组合:黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉、酵母抽提物、玉米浆干粉。
4.根据权利要求1所述的K252A的发酵培养基,其特征在于:所述无机盐为下列中一种或两种或多种的组合:铵盐、钙盐、镁盐、钾盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐,优选为硝酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙的组合。
5.根据权利要求1所述的K252A的发酵培养基,其特征在于:所述消泡剂为THIX-298消泡剂。
6.根据权利要求1-5任一项所述的K252A的发酵培养基,其特征在于,所述发酵培养基包括以下重量百分含量的组分:
所述发酵培养基消毒前pH值为6.4~8.0。
7.根据权利要求1~6任一项所述的发酵培养基制备K252A的方法,其特征在于:其包括,
摇瓶发酵方法:将摇瓶种子培养液按照5~15%的体积比接种至权利要求1~6中任一项所述的发酵培养基中,在26~32℃、150~500rpm条件下培养,培养周期200~240h,得到含有K252A的发酵液;
或者
罐发酵方法:将罐种子培养液按照发酵培养基体积5~10%的比例接种至权利要求1~6中任一项所述的发酵培养基中,在26~32℃条件下培养,通过搅拌与通气联动控制,使溶氧始终维持在15~30%;接种24h后开始至培养结束,用氨水调节pH使其控制在6.8±0.2;接种36h后开始,期间流加葡萄糖溶液和功能因子混合液,至培养结束前1天停止流加,培养周期220~264h,得到含有K252A的发酵液。
8.根据权利要求7所述的发酵培养基制备K252A的方法,其特征在于:所述罐发酵方法中流加葡萄糖溶液的控制策略是维持发酵液中葡萄糖浓度在1~5g/L范围内,所述流加的葡萄糖溶液的浓度为500g/L。
9.根据权利要求7所述的制备K252A的方法,其特征在于:所述罐发酵方法中流加的功能因子混合液成分为:氯化胆碱5g/L、丁二酸二钠40g/L、蛋氨酸130g/L,余量为水;所述流加功能因子混合液的速度控制在每小时流加体积为初始发酵培养基体积的0.05~0.1%。
10.根据权利要求7所述的发酵培养基制备K252A的方法,其特征在于所述摇瓶种子培养液通过下述步骤获得:
1)筛选拟诺卡氏菌种:采用固体平板培养基,挑选淀粉水解圈大的菌落;
2)制备有效的接种源:挑取优良的菌落,接种到固体斜面培养基上,在26~32℃,55~65%相对湿度下静置培养5天,收集新鲜、成熟的菌苔用作有效的接种源;
3)摇瓶种子培养:将步骤2)的种源接种至种子培养基中,在26~32℃,150~330rpm条件下培养24~72h,获得摇瓶种子培养液;
所述罐种子培养液通过下述步骤获得:将摇瓶种子培养液,先接种到种子罐中的种子培养基中,在26~32℃、50~300rpm、0.35vvm条件下扩大培养18~96h,获得罐种子培养液。
11.根据权利要求10所述的发酵培养基制备K252A的方法,其特征在于:步骤1)中所述固体平板培养基和步骤2)中所述固体斜面培养基包括以下重量百分含量的组分:
所述固体培养基消毒前pH值为6.5~7.5。
12.根据权利要求10所述的发酵培养基制备K252A的方法,其特征在于:步骤3)中所述的种子培养基包括以下重量百分含量的组分:
所述种子培养基消毒前pH值为6.5~7.5。
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