CN110669736A - 一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株cbd及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明经筛选得到一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18511。并将其用于食品中安乃近及其代谢物残留物的检测。此细胞株分泌的单克隆抗体，对安乃近四种主要代谢物具有较好的亲和力和检测灵敏度，（MAA：IC50=8.1 ng/mL，AA：IC50=8.8 ng/mL，FA：IC50=0.9 ng/mL，AAA：IC50=0.6 ng/mL），可实现对肉制品、奶制品等中安乃近代谢物残留量的检测，为食品中安乃近代谢物残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD及其应用
技术领域
本发明涉及一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
安乃近(dipyrone，简写为Dip)为临床常用的解热镇痛药之一，属于吡唑酮类解热镇痛药，自投入临床用于治疗以来已有百年的历史。安乃近在体内可迅速水解成活性产物4-甲氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine，MAA)，再进入体循环；MAA在体内代谢为4-甲酰氨基安替比林(4-formylaminoantipyrine，FA)和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，AA)；AA可以继续代谢为4-乙酰氨基安替比林(4-acetylaminoantipyrine，AAA)，具体机理如图1所示。
安乃近具有较强的解热和镇痛作用，目前在许多国家被广泛使用，但该药能导致粒细胞减少、再生障碍性贫血、严重的过敏和休克虚脱等严重反应。由于其毒副作用和尚不确切的药效作用机理，世界上一些发达国家已经对安乃近作出了停止或限制使用的规定，如美国、瑞典禁止该药物用于食源性动物中，日本的肯定列表亦将其列入一律标准，而欧盟对安乃近在牛奶中的限量要求为 50 µg/kg(以MAA含量计算)。
目前报道的用于安乃近或其类似物的测定方法有分光光度法、流动注射化学发光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等，然而，这些仪器分析法都需要复杂的前处理，耗时，耗力，不适合大量样品的快速检测。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对安乃近的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对安乃近的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的目的是提供一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD及其应用，并在此基础上建立ELISA方法。
本发明的技术方案，一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18511。
安乃近单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.18511的安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD分泌产生。
安乃近单克隆抗体的应用，用于食品中安乃近及其代谢物残留物的检测。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于牛奶中安乃近代谢物残留物的分析检测。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是制备ELISA竞争法检测安乃近代谢物的试剂或检测试剂盒。
所述安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD的制备方法，合成安乃近完全抗原，再将完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫小鼠，取高亲和力(OD450>1.5)，高灵敏度（IC50 <200 ng/mL)的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA检测血清，筛选亚克隆获得杂交瘤细胞。
由于安乃近及其代谢物属于小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将安乃近或其代谢物偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于制备一种抗体能同时检测安乃近四种代谢物，因此需要设计半抗原，使其结构与四种代谢物有最大程度的相似性，同时又含有活泼基团。分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
在本发明的一种实施方式中，以4-氨基安替比林(H1)和丁二酸酐为起始原料，合成了半抗原，记为H1-HS。合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
步骤为：以4-氨基安替比林(H1)和丁二酸酐为起始原料，合成了半抗原，记为H1-HS。称取H1 50 mg，4-二甲氨基吡啶175 mg，丁二酸酐300 mg，溶于20 mL无水吡啶，60℃ 回流12 h。反应液蒸发浓缩，残留物溶解在10 mL水中，并用5 mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相。有机相经氮气吹干后，得到白色固体，即为H1-HS，采用核磁和质谱鉴定其结构。
在本发明的一种实施方式中，包被原H1-BSA的合成路线如下：
Figure 460201DEST_PATH_IMAGE002
包被原制备步骤具体为：称取H1 2.03 mg，溶解在500 μL超纯水中，再加入60 μL 2.5%戊二醛溶液，冰浴搅拌15 min，得反应液A液。称取5 mg BSA，用1 mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）溶解，得B液。将A液逐滴加入到B液中，边加边搅拌，室温搅拌反应2 h，得偶联混合液。取10 cm透析袋 (蛋白截留：3kDa)，煮沸5 min，冷却至室温后，将偶联混合液加入透析袋中，并用pH=7.4、0.01M PBS透析3天，每6 h更换一次透析液，除去多余的小分子化合物，得到人工抗原H1-BSA，采用紫外吸收扫描方法鉴定。
免疫原的合成路线如下：
免疫原制备步骤具体为：称取半抗原H1-HS 1.1 mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 1.3 mg，溶解于300 μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 2.2 mg，用50 μL pH = 4.6, 0.01 M 2-(n-吗啉)乙基磺酸缓冲溶液（MES）充分溶解后，加入到上述H1-HS溶液中，室温搅拌反应6-8 h，得A液；取5mg KLH，用0.01 M PBS溶解，得B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温搅拌反应过夜，得偶联物混合液。混合液在0.01M PBS 溶液中透析三天，最终得到人工抗原H1-HS-KLH，采用紫外吸收扫描方法鉴定。
小鼠的免疫：将安乃近完全抗原H1-HS-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）;首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过ic-ELISA检测小鼠血清的亲和力和灵敏度；
细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 1500）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得安乃近的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株CBD；
杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明还提供含有所述单克隆抗体的检测试剂或检测试剂盒。
本发明的有益效果：本发明提供的安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD分泌的单克隆抗体，对安乃近四种主要代谢物具有较好的亲和力和检测灵敏度（MAA：IC50 = 8.1 ng/mL，AA：IC50 = 8.8 ng/mL，FA：IC50 = 0.9 ng/mL，AAA：IC50 = 0.6 ng/mL），可实现对肉制品、奶制品等中安乃近代谢物残留量的检测，为食品中安乃近代谢物残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18511。
附图说明
图1安乃近体内水解机理图。
图2-a是CBD单克隆抗体对AA和MAA的标准检测曲线。
图2-b是CBD单克隆抗体对FA和AAA的标准检测曲线。
具体实施方式
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43 g，柠檬酸 9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
实施例1 安乃近完全抗原的合成
（1）半抗原的衍生：用4-氨基安替比林和丁二酸酐衍生得到含活泼基团（-COOH）的半抗原H1-HS。称取H1 50 mg，4-二甲氨基吡啶175 mg，丁二酸酐300 mg，溶于20 mL无水吡啶，60℃ 回流12 h。反应液蒸发浓缩，残留物溶解在10 mL水中，并用5 mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相。有机相经氮气吹干后，得到白色固体，即为H1-HS，采用核磁和质谱鉴定其结构；
（2）完全抗原的制备：
包被原：称取H1 2.03 mg，溶解在500 μL超纯水中，再加入60 μL 2.5% 戊二醛溶液，冰浴搅拌15 min，得反应液A液。称取5 mg BSA，用1 mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）溶解，得B液。将A液逐滴加入到B液中，边加边搅拌，室温搅拌反应2 h，得偶联混合液。取10cm透析袋 (蛋白截留：3kDa)，煮沸5 min，冷却至室温后，将偶联混合液加入透析袋中，并用pH=7.4、0.01M PBS透析3天，每6 h更换一次透析液，除去多余的小分子化合物，得到人工抗原H1-BSA，采用紫外吸收扫描方法鉴定；
免疫原：称取步骤（1）获得的半抗原H1-HS 1.1 mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 1.3 mg，溶解于300 μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 2.2 mg，用50 μL pH = 4.6, 0.01 M 2-(n-吗啉)乙基磺酸缓冲溶液（MES）充分溶解后，加入到上述H1-HS溶液中，室温搅拌反应6-8 h，得A液；取5mg KLH，用0.01 M PBS溶解，得B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温搅拌反应过夜，得偶联物混合液。混合液在0.01M PBS 溶液中透析三天，最终得到人工抗原H1-HS-KLH，采用紫外吸收扫描方法鉴定。
实施例2 安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD的制备
（1）小鼠的免疫：将安乃近完全抗原H1-HS-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过ic-ELISA检测小鼠血清的亲和力和灵敏度；
（2）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1500）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200xg，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前7-10天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。 融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 （1-4）*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800 x g，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/ 孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（3）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用安乃近为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对安乃近代谢物MAA标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得安乃近单克隆抗体细胞株CBD。
（4）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 安乃近杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例3 安乃近单克隆抗体灵敏度测定
（1）包被：将包被原H1-BSA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
（4）加样：将单克隆抗体稀释一定倍数，加入到包被有H1-BSA的板中，100μL/孔，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入一定稀释倍数的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30min。
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37 ℃避光反应15min。
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
采用OriginPro 8.5做图，获得CBD对四种安乃近代谢物的标准抑制曲线。
制备所得单克隆抗体对安乃近代谢物的交叉具体如表1所示。
表1 单克隆抗体对安乃近代谢物的交叉
Figure 157079DEST_PATH_IMAGE005
检测MAA，y = 0.17 ± 0.007 + (1.68 ± 0.016 − 0.17 ± 0.007)/[1 + (x/8.08± 0.116) 1.25±0.029]，R2 = 0.999，IC50为8.1 ng/mL，检测限（抑制率20%-80%对应的加标量）为2.66–24.51 ng/mL。
检测AA，y = 0.17 ± 0.017 + (1.77 ± 0.017 − 0.17 ± 0.017)/[1 + (x/8.67 ± 0.334) 1.14±0.049]，R2 = 0.999，IC50为8.8 ng/mL，检测限为2.58–29.13 ng/mL。
单克隆抗体对AA和MAA的标准检测曲线如图2-a所示。
检测FA，y = 0.266 ± 0.021 + (1.77 ± 0.007 − 0.266 ± 0.021)/[1 + (x/0.98 ± 0.0279)1.19±0.041]，R2 = 0.989，IC50为0.9 ng/mL，检测限为0.30–3.12。
检测AAA，y = 0.21 ± 0.039 + (1.91 ± 0.021 − 0.21 ± 0.039)/[1 + (x/0.82 ± 0.0360)1.35±0.097]，R2 = 0.999，IC50为0.6 ng/mL，检测限为0.29–2.3 ng/mL。
单克隆抗体对FA和AAA的标准检测曲线如图2-b所示。
说明由单克隆细胞株CBD分泌的单克隆抗体对安乃近代谢物有很好的灵敏度，可用于安乃近代谢物免疫分析检测。
实施例4以牛奶为列，检测其中的安乃近代谢物的残留量
阴性牛奶样品分别添加安乃近四种代谢物及添加四种代谢物的混合物，混匀后用PBS稀释10倍，按照实施例3的步骤，拉标和实际检测同时进行，结果如表2所示。回收率在80.4%-108.8%，基质干扰较小，结果较理想。
表2 牛奶添加样检测
Figure 614605DEST_PATH_IMAGE007
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18511。
2.安乃近单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.18511的安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株CBD分泌产生。
3.权利要求2所述安乃近单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品中安乃近及其代谢物残留物的检测。
4.根据权利要求3所述安乃近单克隆抗体的应用，其特征在于：将安乃近单克隆抗体应用于ELISA竞争法检测安乃近及其代谢物的试剂中。
5.含有权利要求2所述安乃近单克隆抗体的检测试剂或检测试剂盒。
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CN109022367A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 江南大学 一株分泌抗***特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

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CN105439955A (zh) * 2015-12-29 2016-03-30 深圳市易瑞生物技术有限公司 一种安乃近代谢物检测用半抗原及其快速检验装置及其制备方法

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