JP2002265500A - 抗アコニチンモノクローナル抗体 - Google Patents
抗アコニチンモノクローナル抗体Info
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- JP2002265500A JP2002265500A JP2001113279A JP2001113279A JP2002265500A JP 2002265500 A JP2002265500 A JP 2002265500A JP 2001113279 A JP2001113279 A JP 2001113279A JP 2001113279 A JP2001113279 A JP 2001113279A JP 2002265500 A JP2002265500 A JP 2002265500A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】アコニチンをカルボジイミド法により、キャリ
ヤー蛋白として牛血清アルブミンを添加抱合させる。こ
のものを抗原としてマウスに免疫する。免疫後ひ臓細胞
を単離し、ポリエチレングリコールを用いてミエローマ
細胞と融合する。ＨＡＴ培地で融合細胞（ハイブリドー
マ）のみを選抜する。ハイブリドーマを限界希釈法でク
ローニングする。これらの中から、アコニチン−卵白ア
ルブミン（ＥＡ）複合体を用いて選抜し、抗アコニチン
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを単離す
る。 【効果】本抗体は極めて特異性が高いので通常のＥＬＩ
ＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感度、かつ
前処理が不要な定量が可能である。
ヤー蛋白として牛血清アルブミンを添加抱合させる。こ
のものを抗原としてマウスに免疫する。免疫後ひ臓細胞
を単離し、ポリエチレングリコールを用いてミエローマ
細胞と融合する。ＨＡＴ培地で融合細胞（ハイブリドー
マ）のみを選抜する。ハイブリドーマを限界希釈法でク
ローニングする。これらの中から、アコニチン−卵白ア
ルブミン（ＥＡ）複合体を用いて選抜し、抗アコニチン
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを単離す
る。 【効果】本抗体は極めて特異性が高いので通常のＥＬＩ
ＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感度、かつ
前処理が不要な定量が可能である。
Description
【０００１】 「発明に属する技術分野」本発明はアコ
ニチンに対する抗アコニチンモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマに関する。
ニチンに対する抗アコニチンモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマに関する。
【０００２】細胞融合技術は、ケーラーとミルスタイン
の報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５−４９７頁、１９７５
年）以来急速に発展した。哺乳動物のひ細胞と癌細胞で
あるミエローマ細胞を融合させた雑種細胞をハイブリド
ーマと称する。ハイブリドーマは用いたひ細胞が産生す
る抗体産生能を有することから、多くの蛋白質やペプチ
ドの様な高分子化合物に対する抗体の生産に用いられて
きた。
の報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５−４９７頁、１９７５
年）以来急速に発展した。哺乳動物のひ細胞と癌細胞で
あるミエローマ細胞を融合させた雑種細胞をハイブリド
ーマと称する。ハイブリドーマは用いたひ細胞が産生す
る抗体産生能を有することから、多くの蛋白質やペプチ
ドの様な高分子化合物に対する抗体の生産に用いられて
きた。
【０００３】一方、本出願人は通常は抗原とは成りえな
いアコニチンに対する抗アコニチンモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを作製する。
いアコニチンに対する抗アコニチンモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを作製する。
【０００４】アコニチンの植物中の含有量は少なく、そ
の検出は容易ではない。このため前処理を必要とせず、
再現性があり、かつ高感度なアッセイ系が要求される。
これに対応出来うるのは抗アコニチンモノクローナル抗
体以外にない。
の検出は容易ではない。このため前処理を必要とせず、
再現性があり、かつ高感度なアッセイ系が要求される。
これに対応出来うるのは抗アコニチンモノクローナル抗
体以外にない。
【０００５】本発明者等は、上述の問題点を解決すべく
研究を重ねた結果、細胞融合によりアコニチンに対する
抗アコニチンモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを得、本ハイブリドーマを培養することによって抗
アコニチン抗体を大量に生産することに成功した。本抗
体を用いることによって高感度、再現性良好な、かつ前
処理を必要としないアッセイ系を完結した。
研究を重ねた結果、細胞融合によりアコニチンに対する
抗アコニチンモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを得、本ハイブリドーマを培養することによって抗
アコニチン抗体を大量に生産することに成功した。本抗
体を用いることによって高感度、再現性良好な、かつ前
処理を必要としないアッセイ系を完結した。
【０００６】抗アコニチン抗アコニチンモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマは以下の様に作成する。
すなわち、（１）抗原としてアコニチン−ＢＳＡ複合体
を免疫した動物の抗体産生ひ臓細胞を作成する。（２）
ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。（３）上記２
種の細胞をポリエチレングリコールを媒体として融合す
る。（４）得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地にて選
抜する。（５）抗アコニチン−抗アコニチンモノクロー
ナル抗体生産ハイブリドーマを選抜する。（６）選抜ハ
イブリドーマをクローニングする。これらの行程につい
て詳細に説明する。
抗体を生産するハイブリドーマは以下の様に作成する。
すなわち、（１）抗原としてアコニチン−ＢＳＡ複合体
を免疫した動物の抗体産生ひ臓細胞を作成する。（２）
ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。（３）上記２
種の細胞をポリエチレングリコールを媒体として融合す
る。（４）得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地にて選
抜する。（５）抗アコニチン−抗アコニチンモノクロー
ナル抗体生産ハイブリドーマを選抜する。（６）選抜ハ
イブリドーマをクローニングする。これらの行程につい
て詳細に説明する。
【０００７】 （１）抗体産生細胞の調整 アコニチン−ＢＳＡ複合体を動物に免疫する。免疫法と
してはフロイントのコンプリートアジュバンドを併用す
る手法がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサ
ギ、モルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細
胞としてはひ臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細
胞が使用される。
してはフロイントのコンプリートアジュバンドを併用す
る手法がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサ
ギ、モルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細
胞としてはひ臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細
胞が使用される。
【０００８】 （２）骨髄腫細胞の調整 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は特に限定されず、各種
の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生細胞
の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ま
しい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合の骨髄腫
細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増
殖可能なようにすることによって、未融合細胞と融合細
胞を選別することを考慮して、特定の薬剤抵抗性をゆう
するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗性の
細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため
好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株、
ＰＡＩ，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
−ＵＩ，Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１，Ｘ６３−Ａｇ
８−６．５．３．，ＳＰ２／０−Ａｇ１４，ＦＯ，Ｓ１
９４／５ＸＸＯ，ＢＵ．１，ＭＰＣ１１−４５．６．，
ＴＧ．１．７等が用いられる。
の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生細胞
の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ま
しい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合の骨髄腫
細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増
殖可能なようにすることによって、未融合細胞と融合細
胞を選別することを考慮して、特定の薬剤抵抗性をゆう
するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗性の
細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため
好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株、
ＰＡＩ，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
−ＵＩ，Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１，Ｘ６３−Ａｇ
８−６．５．３．，ＳＰ２／０−Ａｇ１４，ＦＯ，Ｓ１
９４／５ＸＸＯ，ＢＵ．１，ＭＰＣ１１−４５．６．，
ＴＧ．１．７等が用いられる。
【０００９】 （３）融合細胞 細胞融合は通常ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｉ
ＭＤＭ培地等のｅ−ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体
産生細胞を混合（混合比は通常１：４−１：１０）する
ことにより行われる。融合促進剤としては平均分子量１
０００−６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０−５０％で
ある。
ＭＤＭ培地等のｅ−ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体
産生細胞を混合（混合比は通常１：４−１：１０）する
ことにより行われる。融合促進剤としては平均分子量１
０００−６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０−５０％で
ある。
【００１０】 （４）ハイブリドーマの選択的増殖 融合を終えた細胞は、１０％ＦＣＳ含有ｅ−ＲＤＦ培地
などで適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地
（例えばＨＡＴ培地）で浮遊し、９６穴ウエルマイクロ
プレートに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養
する。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマで
ある。
などで適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地
（例えばＨＡＴ培地）で浮遊し、９６穴ウエルマイクロ
プレートに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養
する。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマで
ある。
【００１１】 （５）抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特
に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養
液を採取し、アコニチン−卵白アルブミンと反応させ、
酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした２次抗体と
の反応により検索できる。
に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養
液を採取し、アコニチン−卵白アルブミンと反応させ、
酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした２次抗体と
の反応により検索できる。
【００１２】 （６）クローニング抗体産生ハイブリド
ーマを含むことを確認した培養ウエル中の細胞を限界希
釈法などによりクローニングを行い、抗アコニチンモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。以上の操作
により抗アコニチンモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ１Ｂ３を得た。このハイブリドーマはアコニチンに
対する抗アコニチンモノクローナル抗体を産生する新規
な細胞である。
ーマを含むことを確認した培養ウエル中の細胞を限界希
釈法などによりクローニングを行い、抗アコニチンモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。以上の操作
により抗アコニチンモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ１Ｂ３を得た。このハイブリドーマはアコニチンに
対する抗アコニチンモノクローナル抗体を産生する新規
な細胞である。
【００１３】抗アコニチンモノクローナル抗体の調整 上記で得られたハイブリドーマを適切な培地中で培養す
ることにより、その培養上清から本発明抗アコニチンモ
ノクローナル抗体が得られる。大量に生産する方法とし
ては骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の
鉱物油を腹腔内投与後、ハイブリドーマを接種する。接
種後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作により抗アコ
ニチンモノクローナル抗体を得る。また、無血清培地で
培養し、通常の手法で抗アコニチンモノクローナル抗体
を得る。
ることにより、その培養上清から本発明抗アコニチンモ
ノクローナル抗体が得られる。大量に生産する方法とし
ては骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の
鉱物油を腹腔内投与後、ハイブリドーマを接種する。接
種後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作により抗アコ
ニチンモノクローナル抗体を得る。また、無血清培地で
培養し、通常の手法で抗アコニチンモノクローナル抗体
を得る。
【００１４】抗アコニチンモノクローナル抗体のキャラ
クタリゼーション精製した抗アコニチンモノクローナル
抗体のサブクラス、軽鎖等を通常の方法で決定した。ま
た、分子量をシナピン酸をマトリックスとする方法によ
りマルデイトフマスにて測定し、１４８、５００と決定
した。
クタリゼーション精製した抗アコニチンモノクローナル
抗体のサブクラス、軽鎖等を通常の方法で決定した。ま
た、分子量をシナピン酸をマトリックスとする方法によ
りマルデイトフマスにて測定し、１４８、５００と決定
した。
【００１５】本抗体は極めて特異性が高いので通常のＥ
ＬＩＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感度、
かつ前処理が不要な定量が可能である。
ＬＩＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感度、
かつ前処理が不要な定量が可能である。
【実施例】実施例１
【００１６】抗アコニチンモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマの製造 （１）抗原の調整： アコニチン５ｍｇを無水ピリジン
１．２ｍｌに溶かした溶液を、５ｍｇの牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に
溶かした溶液に撹拌しながら添加する。反応溶液にＥＤ
Ｃ１５ｍｇを加え，１５時間撹拌反応する。反応後透析
して４．８ｍｇのアコニチン−ＢＳＡ抱合体を得た。 （２）抗原中のハプテン数の検討： 得られたアコニチ
ン−ＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のシナピン酸を添
加して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入
れ、マルデイトフマスにて測定する。 （３）免疫ひ細胞の調整：アコニチン−ＢＳＡ抱合体５
０μｇをフロイントーコンプリート−アジュバントに乳
濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。
以後、２週間の間隔で５０μｇのアコニチン−ＢＳＡ抱
合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にアコ
ニチン−ＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完
了した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、ひ臓を摘出し
た。ひ臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網で
ろ過し、ひ臓の単離細胞を得た。 （４） ハイブリドーマの調整：単離した免疫ひ細胞に
低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニューム）を加えて赤血
球を溶血した後、ｅ−ＲＤＦ培地で細胞を３回洗う。マ
ウス骨髄腫細胞もｅ−ＲＤＦ培地で３回洗浄した。両細
胞数を計測しひ細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合とし
て遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほ
ぐし、ＰＥＧ４、０００を培地で希釈した５０％液を
１．０ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静
置した後、ｅ−ＲＤＦ培地５ｍｌを５分間かけて添加し
た。１、０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０
％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨て
た。ヒポキサンチン１０−２Ｍ、アミノプテリン４ｘ１
０−７Ｍおよびチミジン１．５ｘ１０−５Ｍを加えた
（ＨＡＴ）１０％ＦＣＳ添加ｅ−ＲＤＦ培地を用いて沈
殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１０
０μｌずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μｌ追加
し、細胞の増殖を確認した。 （５）抗体産生ハイブリドーマの検索：ハイブリドーマ
が増殖したウエルの液を採取し、アコニチン−ＥＡ抱合
体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡに
よりアコニチンに対する抗アコニチンモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを検索した。即ち、９６ウエルマ
イクロプレートにアコニチン−ＥＡ抱合体５μｇ／１０
０μｌ／ウエルを分注し、３７℃で１時間インキュベー
トしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１
００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行った。０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（Ｔ−ＰＢＳ）で
３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μｌ添加
し、１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸
化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液
を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用
いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウ
エルの細胞を採取した。 （６）抗アコニチンモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマのクローニング：抗体産生ハイブリドーマを限界希
釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖
したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクロ
ーンを得た。 （７）抗アコニチンモノクローナル抗体の調整：上記の
抗体産生ハイブリドーマを無血清培地（１０μｇ／ｍｌ
インスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μ
Ｍエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅ−Ｒ
ＤＦ培地）で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清
をプロテインＧＦＦカラムを用いて精製した。即ち、上
清をトリス緩衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カ
ラムを１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗
体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗
体溶液はＰＢＳに対して３回透析し、最後に凍結乾燥し
て精製抗体をえた。 （８）精製した抗アコニチンモノクローナル抗体を微量
とり、シナピン酸を添加し混合する。この混合物をマル
デイトフマスにて測定し、純度を確認した。 （９）競合的ＥＬＩＳＡによる定量：アコニチン−ＥＡ
抱合体溶液（５μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつウエルに
添加し１時間反応し吸着させる。非特異的結合を除去す
るためにスキンミルク添加ＰＢＳ溶液３００μｌを加え
１時間反応してブロッキングする。５０μｌの各種濃度
のアコニチン１０％エタノール溶液を加え、さらに抗ア
コニチンモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍｌ）５０
μｌを添加して１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで
３回洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識
抗マウス抗体１００μｌを加え１時間反応した。１時間
後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、Ａ
ＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して
発色させた。２０分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃
度のアコニチンの吸光度から検量線を作成した。 （１０）交差反応性の調査：アコニチンおよび各種関連
化合物を測定した。その結果，アコニチンと構造の類似
したアコニチン系アルカロイドには反応性を示したが，
その他のアルカロイドについては殆ど反応性を示さなか
った。
ブリドーマの製造 （１）抗原の調整： アコニチン５ｍｇを無水ピリジン
１．２ｍｌに溶かした溶液を、５ｍｇの牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に
溶かした溶液に撹拌しながら添加する。反応溶液にＥＤ
Ｃ１５ｍｇを加え，１５時間撹拌反応する。反応後透析
して４．８ｍｇのアコニチン−ＢＳＡ抱合体を得た。 （２）抗原中のハプテン数の検討： 得られたアコニチ
ン−ＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のシナピン酸を添
加して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入
れ、マルデイトフマスにて測定する。 （３）免疫ひ細胞の調整：アコニチン−ＢＳＡ抱合体５
０μｇをフロイントーコンプリート−アジュバントに乳
濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。
以後、２週間の間隔で５０μｇのアコニチン−ＢＳＡ抱
合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にアコ
ニチン−ＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完
了した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、ひ臓を摘出し
た。ひ臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網で
ろ過し、ひ臓の単離細胞を得た。 （４） ハイブリドーマの調整：単離した免疫ひ細胞に
低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニューム）を加えて赤血
球を溶血した後、ｅ−ＲＤＦ培地で細胞を３回洗う。マ
ウス骨髄腫細胞もｅ−ＲＤＦ培地で３回洗浄した。両細
胞数を計測しひ細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合とし
て遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほ
ぐし、ＰＥＧ４、０００を培地で希釈した５０％液を
１．０ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静
置した後、ｅ−ＲＤＦ培地５ｍｌを５分間かけて添加し
た。１、０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０
％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨て
た。ヒポキサンチン１０−２Ｍ、アミノプテリン４ｘ１
０−７Ｍおよびチミジン１．５ｘ１０−５Ｍを加えた
（ＨＡＴ）１０％ＦＣＳ添加ｅ−ＲＤＦ培地を用いて沈
殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１０
０μｌずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μｌ追加
し、細胞の増殖を確認した。 （５）抗体産生ハイブリドーマの検索：ハイブリドーマ
が増殖したウエルの液を採取し、アコニチン−ＥＡ抱合
体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡに
よりアコニチンに対する抗アコニチンモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを検索した。即ち、９６ウエルマ
イクロプレートにアコニチン−ＥＡ抱合体５μｇ／１０
０μｌ／ウエルを分注し、３７℃で１時間インキュベー
トしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１
００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行った。０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（Ｔ−ＰＢＳ）で
３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μｌ添加
し、１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸
化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液
を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用
いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウ
エルの細胞を採取した。 （６）抗アコニチンモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマのクローニング：抗体産生ハイブリドーマを限界希
釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖
したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクロ
ーンを得た。 （７）抗アコニチンモノクローナル抗体の調整：上記の
抗体産生ハイブリドーマを無血清培地（１０μｇ／ｍｌ
インスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μ
Ｍエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅ−Ｒ
ＤＦ培地）で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清
をプロテインＧＦＦカラムを用いて精製した。即ち、上
清をトリス緩衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カ
ラムを１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗
体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗
体溶液はＰＢＳに対して３回透析し、最後に凍結乾燥し
て精製抗体をえた。 （８）精製した抗アコニチンモノクローナル抗体を微量
とり、シナピン酸を添加し混合する。この混合物をマル
デイトフマスにて測定し、純度を確認した。 （９）競合的ＥＬＩＳＡによる定量：アコニチン−ＥＡ
抱合体溶液（５μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつウエルに
添加し１時間反応し吸着させる。非特異的結合を除去す
るためにスキンミルク添加ＰＢＳ溶液３００μｌを加え
１時間反応してブロッキングする。５０μｌの各種濃度
のアコニチン１０％エタノール溶液を加え、さらに抗ア
コニチンモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍｌ）５０
μｌを添加して１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで
３回洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識
抗マウス抗体１００μｌを加え１時間反応した。１時間
後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、Ａ
ＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して
発色させた。２０分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃
度のアコニチンの吸光度から検量線を作成した。 （１０）交差反応性の調査：アコニチンおよび各種関連
化合物を測定した。その結果，アコニチンと構造の類似
したアコニチン系アルカロイドには反応性を示したが，
その他のアルカロイドについては殆ど反応性を示さなか
った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA41 DA02 GA03 HA01 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4B065 AA92X AB05 AC16 BA08 CA25 4H045 AA11 CA30 DA75 DA76 EA50 FA74
Claims (3)
- 【請求項１】アコニチンに対する抗体
- 【請求項２】アコニチンをタンパク質と共有結合させた
ものを抗原として抗体を作成する抗体の製造方法。 - 【請求項３】タンパク質と共有結合したアコニチンを吸
着させたウェルにアコニチン溶液を添加し、さらに請求
項１に記載の抗体を加えてインキュベートした後にウェ
ルを洗浄し、標識化免疫定量法を用いてアコニチン溶液
中のアコニチン含有量を定量する抗体を用いた抗原の定
量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001113279A JP2002265500A (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | 抗アコニチンモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001113279A JP2002265500A (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | 抗アコニチンモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002265500A true JP2002265500A (ja) | 2002-09-18 |
Family
ID=18964527
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001113279A Pending JP2002265500A (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | 抗アコニチンモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002265500A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110616194A (zh) * | 2019-10-11 | 2019-12-27 | 江南大学 | 一株乌头碱单克隆抗体细胞株sj及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0272894A (ja) * | 1988-09-06 | 1990-03-13 | Sendai Biseibutsu Kenkyusho | 単クローン性抗体及びこれを用いるアコニチン系アルカロイドの測定法 |
| JPH10248565A (ja) * | 1997-03-18 | 1998-09-22 | Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho:Kk | ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP2000270862A (ja) * | 1999-03-26 | 2000-10-03 | Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho:Kk | プレチラクロールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
-
2001
- 2001-03-06 JP JP2001113279A patent/JP2002265500A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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