CN111235116B

CN111235116B - 一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株sm 8g3及其应用

Info

Publication number: CN111235116B
Application number: CN202010290082.3A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 曾露; 匡华; 徐丽广; 孙茂忠; 刘丽强; 吴晓玲; 宋珊珊; 胡拥明; 郝昌龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111235116A

Abstract

一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18519。首先合成泛酸半抗原，再制备泛酸完全抗原，并将它免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC₅₀小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对泛酸具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀为210.85 ng/mL）。本发明成果可用于建立婴幼儿食品、乳品和其他含有泛酸的食品中泛酸含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

Description

一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3及其应用

技术领域

本发明涉及一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

泛酸属于B族维生素，也称为维生素B₅，在体内转变成辅酶A或者酰基载体蛋白，参与糖、脂肪、蛋白质和能量代谢。泛酸是神经和大脑必需的营养物质，是脂肪酸合成类固醇必须物质，泛酸有助于体内类固醇的分泌，保持皮肤和头发的健康。同时，泛酸也可参与类固醇脂质、褪黑激素和亚铁血红素的合成。泛酸亦帮助细胞的形成，维持正常发育和中枢神经***的发育。再者，泛酸具有抗体制造功能，能帮助抵抗传染病，缓和多种抗生素副作用及毒性，并有助于减轻过敏症状。泛酸缺乏时，会导致低血糖、皮肤异常、疲倦失眠、食欲不振及消化不良等症状。术后病人、营养不良、妊娠哺乳期妇女需要补充泛酸。每日推荐的泛酸摄入量为成人通常为4-7 mg，妊娠妇女及哺乳期妇女为5-9 mg。泛酸广泛存在于多种食品，同时也是许多食品的添加剂。因此，有必要建立快速、高效的食品中泛酸的检测方法。

泛酸含量分析方法有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用 (LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的泛酸检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为泛酸检测提供了一种新的检测途径。

发明内容

本发明的目的是提供一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3及其应用，由该细胞株制备的抗体对泛酸具有较高的检测灵敏度，可以用来建立泛酸的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18519。

泛酸单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.18519的泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3分泌产生。

所述泛酸免疫原的合成路线如下：

（1）泛酸半抗原的制备：称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯 (化合物2) 1000mg (2.89 mmol), 将其溶解于20 mL的DMF溶液中，称取泛酸 (化合物1) 632 mg (2.89mmol)加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾 (670 mg, 11.56 mmol), 并于室温下搅拌2 h。合并有机相，并用40 mL水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经Na₂SO₄干燥，浓缩。得到黄色油状化合物3 (1 g)。化合物3（1000 mg， 2.06 mmol）溶解于10 mL CH₃COOH 溶液中，向其中加入锌粉，室温搅拌过夜。浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色油状化合物4 (250mg)，即泛酸半抗原。

（2）免疫原泛酸-BSA的制备：称取1.64 mg的泛酸半抗原将其溶解在800μL DMF中，然后加入2.58 mg EDC，1.55 mg NHS，该混合物在室温搅拌6 h，得到反应液A；称取5 mgBSA，溶解于0.1 M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8 h，即得偶联物泛酸-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原泛酸-BSA。

本发明的泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3的筛选方法，主要包括以下步骤：

（1）小鼠的免疫：将免疫原泛酸-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用泛酸-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；

（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3；

（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株SM 8G3分泌的单克隆抗体，对泛酸具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀为210.85 ng/mL），可实现对果蔬、谷物中泛酸残留量的检测，为食品中泛酸残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18519。

附图说明

图1 SM 8G3单克隆抗体对泛酸的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将泛酸完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对泛酸有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株SM 8G3的制备

（1）完全抗原的制备：

a、半抗原合成路线如下：

泛酸半抗原的制备：称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯 (化合物2) 1000 mg(2.89 mmol), 将其溶解于20 mL的DMF溶液中，称取泛酸 (化合物1) 632 mg (2.89 mmol)加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾 (670 mg, 11.56 mmol), 并于室温下搅拌2 h。合并有机相，并用40 mL水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经Na₂SO₄ 干燥，浓缩。得到黄色油状化合物3 (1 g)。化合物3（1000 mg， 2.06 mmol）溶解于10 mL CH₃COOH 溶液中，向其中加入锌粉，室温搅拌过夜。浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色油状化合物4 (250mg)。

b、免疫原泛酸-BSA的制备：称取1.6 mg泛酸半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.58mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.55 mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反应6 h。取牛血清蛋白BSA 5 mg（泛酸半抗原与BSA摩尔比为60:1)，用2 mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液溶解，得到B1液，在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应8 h，即得偶联物泛酸-BSA（60:1）混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物泛酸-BSA（60:1）。

（2）包被原泛酸-OVA的制备：

称取2.45 mg 泛酸半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.84 mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.30 mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6 h。称取5 mg鸡卵清白蛋白OVA（泛酸半抗原与OVA摩尔比为60:1），溶解于2 mL 0.1 M硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应8 h，即得偶联物泛酸-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠免疫，是制备单抗必需的。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的泛酸完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血（小鼠断尾采血5μL + 995μL抗体稀释液=抗血清），使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心（1200 rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1~ 4)×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7 min。第1 min，将1 mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2 min，静置。第3 min和第4 min，在1 min内滴加1 mL RPMI-1640培养基；第5 min和第6 min，在1min内滴加2 mL RPMI-1640培养基；第7 min，每10 s滴加1 mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5 min。离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用泛酸为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对泛酸标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株SM 8G3。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液（pH 7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

实施例2 泛酸单克隆抗体的IC₅₀的测定

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.0 g NaCl，0. 2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄•12H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

洗涤液（PBST）： 1000 mL的0.01 mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5 mL的Tween–20；

PBST：含0.05 % Tween–20的PBS；

抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄•12H₂O 18.43 g，柠檬酸9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB；

显色液，现用现混。

（1）包被：将包被原泛酸-OVA用0.05 M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1 µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2 h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；

（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2 h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30 min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃反应30 min；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37 ℃避光反应15 min；

（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

用ic-ELISA测定泛酸单克隆抗体的IC₅₀为210.85 ng/mL，说明对泛酸有很好的灵敏度，可用于泛酸免疫分析检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18519。

2.泛酸单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.18519的泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3分泌产生。

3.泛酸半抗原的合成方法，其特征在于步骤为：称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯1000 mg, 将其溶解于20 mL的DMF溶液中；称取泛酸632 mg加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾 670 mg, 并于室温下搅拌2 h；合并有机相，并用40mL水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经Na₂SO₄干燥，浓缩，得到黄色油状化合物；将所得化合物溶解于10mL CH₃COOH 溶液中，向其中加入锌粉，室温搅拌过夜；浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到泛酸半抗原；

所述黄色油状化合物具体结构式如下所示：

；

所述泛酸半抗原具体结构式如下所示：

。

4.泛酸完全抗原的合成方法，其特征在于步骤为：称取1.64mg的权利要求3所述合成方法制备所得的泛酸半抗原，将其溶解在800μL DMF中，然后加入2.58 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，1.55 mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，该混合物在室温搅拌6 h，得到反应液A；称取5mg BSA，溶解于0.1 M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8 h，即得偶联物泛酸-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原泛酸-BSA。

5.权利要求2所述泛酸单克隆抗体的应用，其特征在于：建立泛酸含量的免疫检测方法，应用于食品中泛酸含量的检测。

6.根据权利要求5所述泛酸单克隆抗体的应用，其特征是：所述食品具体为婴幼儿食品或乳品。