CN112813036B - 一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD 6B11，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20783。此细胞株分泌的单克隆抗体，对曲安奈德具有较好的特异性和检测灵敏度。本发明合成了曲安奈德半抗原，制备了曲安奈德完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株STD 6B11。此细胞株分泌的单克隆抗体，对曲安奈德具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50为0.49ng/mL)。本发明成果可用于建立猪肉和其他含有曲安奈德的食品中曲安奈德含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

Description

一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
曲安奈德是一种常见的糖皮质类激素，具有抗过敏、抗炎症、治疗皮肤病等作用。同时，糖皮质类激素还可以大幅提高动物的生长速度，因此常被不法养殖户大量用于经济动物的养殖，这些滥用行为会致使曲安奈德在动物体内存在不同程度的残留。研究表明，曲安奈德在食源性动物组织中的残留对消费者造成的健康风险很大，长期食用含有曲安奈德残留动物源食品会导致机体代谢紊乱。因此，建立有效的曲安奈德残留检测方法，对有效控制猪肉等产品中曲安奈德的残留以及保障广大人民群众的身体健康具有深远的意义。
对于兽药曲安奈德残留，目前缺少对其残留检测方法，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对曲安奈德的高效、快速的检测方法。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在兽药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测曲安奈德的前提是得到对曲安奈德具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对曲安奈德具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明内容
本发明的目的是提供曲安奈德单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD6B11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20783。
本发明的第二个目的是提供一种曲安奈德单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCCNo.20783的杂交瘤细胞株STD 6B11分泌产生。
本发明的第三个目的是提供曲安奈德单克隆抗体的应用，建立曲安奈德含量的免疫检测方法，应用于食品中曲安奈德的检测。
本发明的一种实施方式中，所述应用是用于猪肉和其他含有曲安奈德的食品检测。
本发明的第四个目的是提供曲安奈德半抗原的制备方法：将曲安奈德加入溶于无水吡啶的琥珀酸酐中，水浴反应；停止加热后冷却至室温，将反应物转移到提前放入冷却的盐酸中，有大量白色沉淀析出；用去离子水洗涤数次，干燥后得到白色的固体，即为曲安奈德的半抗原。
进一步地，具体步骤如下：将570mg曲安奈德加入溶解有600mg琥珀酸酐的5mL无水吡啶中，60℃水浴反应6h；停止加热后冷却至室温，将反应物转移到提前冷却至4℃的20mL质量浓度为10％的盐酸中，有大量白色沉淀析出；用去离子水洗涤数次，干燥后得到白色的固体，即为曲安奈德的半抗原。
曲安奈德完全抗原的制备方法，包括曲安奈德免疫原：称取曲安奈德半抗原，将其溶解在二甲基甲酰胺DMF中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温搅拌，得到反应液A1；称取BSA，溶解于硼酸盐缓冲液中，得到溶液B1；随后，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应，即得偶联物曲安奈德-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，即得到免疫原曲安奈德-BSA。
进一步地，具体制备步骤为：称取1.89mg的曲安奈德半抗原，将其溶解在450μLDMF中，然后加入2.92mg EDC和1.75mg NHS，该混合物在室温下搅拌6h，得到反应液A1；称取5mg BSA，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B1；随后，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应8h，即得偶联物曲安奈德-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，即得到免疫原曲安奈德-BSA。
曲安奈德完全抗原的制备方法，包括曲安奈德包被原：取曲安奈德半抗原、1-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6h；称取鸡卵清白蛋白OVA，溶解于硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应，即得偶联物曲安奈德-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原，即得到包被原曲安奈德-OVA。
进一步地，具体制备方法如下：称取2.68mg曲安奈德半抗原、1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.94mg和N-羟基琥珀酰亚胺2.50mg，用450μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6h；称取5mg鸡卵清白蛋白OVA，溶解于3mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应8h，即得偶联物曲安奈德-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原，即得到包被原曲安奈德-OVA。
本发明所述曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD 6B11的筛选方法，主要包括以下步骤：
(1)小鼠的免疫：将免疫原曲安奈德-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用曲安奈德-BSA完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；
(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD6B11；
(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD6B11分泌的单克隆抗体，对曲安奈德具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.49ng/mL)，为检测猪肉和其他含有曲安奈德的食品中曲安奈德含量提供了免疫学方法。本发明提供的曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测曲安奈德的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD 6B11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20783。
附图说明
图1STD 6B11曲安奈德单克隆抗体对曲安奈德的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将曲安奈德完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对曲安奈德有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株STD 6B11。
实施例1杂交瘤细胞株STD 6B11的制备
(1)完全抗原的制备：
a、半抗原合成路线如下式所示：
Figure BDA0003007295950000031
将570mg曲安奈德加入溶于无水吡啶(5mL)的600mg琥珀酸酐中，60℃水浴反应6h。停止加热后冷却至室温，将反应物转移到提前放入冰箱中冷却的20mL 10％的盐酸中，有大量白色沉淀析出，用去离子水洗涤数次，干燥后得到白色的固体，即为曲安奈德的半抗原；
b、免疫原曲安奈德-BSA的制备：称取1.89mg的曲安奈德的半抗原将其溶解在450μL DMF中，然后加入2.92mg EDC，1.75mg NHS，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A1；称取5mg BSA，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B1；随后，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应8h，即得偶联物曲安奈德-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原曲安奈德-BSA。
(2)包被原曲安奈德-OVA的制备：
称取2.68mg曲安奈德半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.94mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.50mg，用450μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6h。称取5mg鸡卵清白蛋白OVA，溶解于3mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应8h，即得偶联物曲安奈德-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原，即得到包被原曲安奈德-OVA；
包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠免疫，而是制备单抗必需的。
(3)动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的曲安奈德-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入体积浓度为75％的酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min，离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用曲安奈德为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对曲安奈德标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株STD 6B11。
(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例2曲安奈德单克隆抗体的IC50的测定
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween–20；PBST：含0.05％Tween–20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
具体步骤如下：
(1)包被：将包被原曲安奈德-OVA用0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
STD 6B11曲安奈德单克隆抗体对曲安奈德的标准抑制曲线如图1所示，用ic-ELISA测定单克隆抗体对曲安奈德的IC50为0.49ng/mL，说明对曲安奈德有很好的灵敏度，可用于曲安奈德免疫分析检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1. 一株曲安奈德单克隆抗体杂交瘤细胞株STD 6B11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20783。
2. 一种曲安奈德单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.20783的杂交瘤细胞株STD 6B11分泌产生。
3.权利要求2所述曲安奈德单克隆抗体的应用，其特征在于：建立曲安奈德含量的免疫检测方法，应用于食品中曲安奈德的检测。
4.根据权利要求3所述曲安奈德单克隆抗体的应用，其特征在于：所述食品具体为猪肉。
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