CN108624528B - 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用 - Google Patents

一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108624528B
CN108624528B CN201810454089.7A CN201810454089A CN108624528B CN 108624528 B CN108624528 B CN 108624528B CN 201810454089 A CN201810454089 A CN 201810454089A CN 108624528 B CN108624528 B CN 108624528B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus megaterium
hzp1
rhizobium
bacillus
microbial inoculum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810454089.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108624528A (zh
Inventor
李友国
李慧明
陈大松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201810454089.7A priority Critical patent/CN108624528B/zh
Publication of CN108624528A publication Critical patent/CN108624528A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108624528B publication Critical patent/CN108624528B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/11—Bacillus megaterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05B—PHOSPHATIC FERTILISERS
    • C05B17/00—Other phosphatic fertilisers, e.g. soft rock phosphates, bone meal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05D—INORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C; FERTILISERS PRODUCING CARBON DIOXIDE
    • C05D9/00—Other inorganic fertilisers
    • C05D9/02—Other inorganic fertilisers containing trace elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/02—Other organic fertilisers from peat, brown coal, and similar vegetable deposits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/80—Soil conditioners
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用。本发明提供的复合微生物菌剂，包括巨大芽孢杆菌和根瘤菌，所述的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium HZP1，保藏编号为CCTCC NO：M 2018061。该菌株具有自生固氮、溶磷、产植物生长激素等生物学特性，与根瘤菌配合使用在土壤中对豆科作物生长具有良好的促进效果；可提高豆科作物在氮磷等养分限制条件下的植物生长，提高作物产量，减少农业生产中的氮肥施用，将产生巨大经济和生态效益。本发明的新型接种剂在微生物肥料领域具有可观的市场价值。

Description

一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用
技术领域
本发明属于农用微生物菌剂技术领域，具体涉及一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用。
背景技术
微生物组(microbiome)是指一个特定环境或者生态***中全部微生物及其遗传信息，包括其细胞群体和数量、全部遗传物质(基因组)，它界定了涵盖微生物群及其全部遗传与生理功能，其内涵包括了微生物与其环境和宿主的相互作用，与农作物相依相生的微生物组是影响作物生长、产量和品质的重要因素。豆科植物根际微生态***中共同繁衍着大量的芽孢杆菌和根瘤菌，它们在长期进化过程中与豆科植物形成了共生关系。2016年Zgadzaj等报道了在模式豆科植物百脉根根际中的研究成果，发现根瘤形成也决定了共生相关、独特的根际、根和根瘤细菌群落结构的建立(Zgadzaj,et al.PNAS,2016)。这个结果显示了共生固氮对于豆科植物根际微生物组的建立具有关键调控作用(Science Daily,2016)。这些重要研究成果拓展了传统共生固氮基础研究的领域和思想。从应用角度看来，研究者进一步推断仅在豆科植物接种根瘤菌是不够的，而应该同时接种豆科植物根际微生物组中的相关细菌以提高固氮效率。利用根瘤共生相关细菌与根瘤菌组合构建新型接种剂，提高豆科作物在氮磷等养分限制条件下的植物生长，提高作物产量，从而减少农业生产中的氮肥施用。
经检索，2014年陈龙男等研究的复合微生物拌种剂作为基肥对非豆科植物有良好的增产效果。2017年朱瑞芬公开的紫花苜蓿上有增产效果的固氮菌肥具有较好的固氮能力和促生效果。但根瘤菌+巨大芽孢杆菌双接种作为专用的豆科植物接种剂却无报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂，所述的复合菌剂包括根瘤菌和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1，所述的巨大芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2018061，该菌株具有自生固氮、分泌吲哚乙酸和高效解磷等功能。
本发明的另一个目的在于提供对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂的应用，该复合菌剂尤其适合在低磷土壤应用；所述菌剂可用于制备拌种剂，或是豆科作物增产剂，或是氮肥部分替代剂。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
申请人自豆科植物根瘤微生物组，经分离筛选培养基得到具有高效解磷能力的单菌落，该菌株已于2018年1月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2018061。
所述巨大芽孢杆菌HZP1的形态特征包括：短杆状、革兰氏阳性、菌落圆形、边缘整齐、产芽孢。
所述巨大芽孢杆菌HZP1的培养特性包括：pH为5.0-9.0，最适pH为6.0-7.0；温度为22-48℃，最适温度为37-39℃；耐盐性达到8％NaCl。
所述巨大芽孢杆菌HZP1的促生特性包括：自生固氮、产生长激素、溶磷等功能。
所述巨大芽孢杆菌HZP1的自生固氮酶活性为208.5nmol/(mL·h)，吲哚乙酸的分泌量为214.84mg/L，溶磷量为195.80mg/L。
一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂，所述的复合菌剂包括根瘤菌和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1，目前已公开的根瘤菌均可完成本发明；
以上所述的复合菌剂中，优选的，所述的根瘤菌为紫云英根瘤菌7653R或费氏中华根瘤菌菌株HH103。
以上所述的复合菌剂中，优选的，所述的根瘤菌和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)HZP1的有效菌浓度比值为10～5:1。
对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂的应用，包括利用本发明提供的菌剂制备成拌种剂，接种剂；或是豆科作物增产剂，或是氮肥部分替代剂。
以上所述的应用中，优选的，当制备为拌种剂时，其配方包括：
Figure BDA0001659185880000021
所述的根瘤菌有效菌含量为20×108-50×108cfu/ml；所述巨大芽孢杆菌HZP1菌液有效菌含量为5×108-10×108cfu/ml；
所述的微量元素液的配方为：H3BO3 5g，Na2MoO4 5g，水1000ml。
与现有的技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明针对性地分离豆科植物根瘤共生相关PGPR细菌，其与根瘤菌长期共生。利用根瘤共生相关细菌与根瘤菌组合构建新型接种剂，具有氮磷协同效应功能，能提高豆科作物在氮磷等养分限制条件下的植物生长、固氮效率，从而提高作物产量。本发明中的新型接种剂主要针对豆科作物，适合低磷土壤，其应用使紫云英地上生物量显著提高，大豆增产，是良好的豆科作物接种剂。
附图说明
图1为菌株HZP1解磷效果示意图。
图2为菌株HZP1革兰氏染色显微镜下观察(×1000)示意图。
图3为菌株HZP1芽孢染色显微镜下观察(×400)示意图。
图4为菌株HZP1 16S rDNA片段凝胶电泳检测示意图。
图5为pH对菌株HZP1生长的影响示意图。
图6为盐胁迫对菌株HZP1生长的影响示意图。
图7为磷溶液标准曲线示意图。
图8为菌株HZP1分泌吲哚乙酸(IAA)测定示意图。
图9为芽孢杆菌HZP1和根瘤菌双接种后显著提高紫云英地上生物量示意图。
图10为复合菌剂在田间应用中显著促进大豆根系发育与结瘤固氮示意图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。应指出的是以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，在不脱离本发明构想的前提下，可以做出改进和扩展。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：
巨大芽孢杆菌HZP1分离与筛选：
自豆科植物根瘤微生物组，经分离筛选培养基得到具有解磷能力的菌落。将捣碎后的根瘤样品10g加入90ml无菌水，充分震荡混匀后稀释成不同浓度梯度的含菌悬液，取100ul涂布到NBRIY培养基上，待长出菌落后反复划线直至分离出单菌落。得到的新分离物摇瓶LB培养，将无菌圆形滤纸片浸入菌液然后贴至NBRIY固体培养基，待长出菌苔观察解磷圈大小，与已有的具有解磷能力菌株对比，最终获得了一株解磷效果最佳的菌株(图1)。
以上所述分离筛选培养基为一种解磷培养基-NBRIY培养基，其配方如下:葡萄糖,10g；Ca3(PO4)2，5g；(NH4)2SO4，0.5g；NaCl，0.2g；MgSO4·7H2O，0.1g；KCl,0.2g；MnSO4·H2O，0.002g；FeSO4·7H2O,0.002g，dH2O至1000mL，pH 7.0。
将得到的新分离物进行革兰氏染色(图2)和芽孢染色(图3)，结果表明其是***；PCR扩增菌株的16S rDNA，凝胶电泳检测(图4)并测序进行鉴定，经BLAST分析和构建进化树得出该菌株是Bacillus megaterium。
所述菌株已于2018年1月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2018061。
HZP1在不同pH和盐浓度下的生长特性：对该芽孢杆菌对酸碱性和盐耐受能力进行测定，并且绘制生长趋势图，发现其最适pH为6.0-7.0(见图5)，耐盐浓度达到8％NaCl(见图6)。具体方法如下：
从活化固体培养基上挑取巨大芽孢杆菌HZP1单菌落接种于5ml LB液体培养基，12h后按1％接种量接种到含有不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和NaCl(4％、5％、6％、7％、8％)LB液体培养基250ml，200rpm，37℃摇床培养，每隔6h测定一次OD600，以不接菌培养基作对照，重复三次。
测定结果1：在pH值4～9范围内，巨大芽孢杆菌HZP1在6～7时生长最佳。
Figure BDA0001659185880000041
测定结果2：巨大芽孢杆菌HZP1随着NaCl浓度增高生长量下降，8％时仍能生长。
Figure BDA0001659185880000042
溶磷量的测定：钼锑抗比色法测定该巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1溶磷量为195.80mg/L，测定步骤如下：
挑取一环菌于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为一级种子液。取0.5ml一级种子液于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为二级种子液。以4％接种量接种于装有100ml牛肉膏蛋白胨培养基的500ml三角瓶中，37度，220r/min，培养72h(以加入等量无菌水的牛肉膏蛋白胨培养基为空白对照)。
分别吸取磷标准溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于50ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至30ml，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠溶液或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色。加入钼锑抗显色剂5ml，摇匀，定容，即得磷浓度0.0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L的标准溶液。室温下静置30min，在700nm波长下，以0.0mg/L标准溶液为空白对照调零点，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，磷浓度为横坐标，绘制标准曲线(图7)。
将样品4000r/min离心20min，吸取上清液5～10ml于50ml容量瓶中，加水稀释至30ml，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠溶液或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色。然后加入钼锑抗显色剂5ml，摇匀，定容。室温下静置30min，在700nm波长下，以空白试液作参比调零点，测定吸光度。
结果计算
培养液中磷的含量(mg/L)＝(P×V1×K)/V2
P—标准曲线查得磷的浓度(mg/L)
K—稀释倍数
V1—显色液体积(ml)
V2—吸取上清液体积(ml)
测定结果：巨大芽孢杆菌HZP1培养溶液中的水溶性含磷量是空白试液的10.70倍。
Figure BDA0001659185880000051
不同磷浓度下解磷率测定：在不同初始磷浓度培养基培养该巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1后测定其解磷率，步骤如下：
挑取一环菌于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，4000r/min离心10min，去上清后接种于不同初始磷浓度(0mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L)的NBRIY液体培养基于500ml三角瓶中，37度，220r/min，培养72h。
参照实施例1中钼锑抗比色法测定培养液中磷含量，然后计算最大解磷率(磷减少量占起始磷浓度的百分比)，结果如下：
Figure BDA0001659185880000061
结论：巨大芽孢杆菌HZP1在低磷培养液中解磷效率高达71.3％，表明HZP1适合在溶磷含量较低环境中发挥解磷效应。
产生IAA定量测定：将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1测定产IAA(图7)，结果发现在含有200mg/L Trp的LB培养液中，该巨大芽孢杆菌12h吲哚乙酸的分泌量为214.84mg/L，测定步骤如下：
1)Salkowski比色液的配制：10g FeCl3·6H2O溶于7.9mol/LH2SO4于500ml。
2)选用标准品IAA配制IAA标准溶液两组，配置浓度一组为2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μg/ml，另一组为25、50、75、100、125、150、175、200μg/ml。每份取4ml，各入4ml比色液，重复三次，黑暗静置30min，测定OD530，制作标准曲线。
在含200mg/L Trp的LB培养液摇接种HZP1，12h后6000r/min离心取上清液4ml，加入等体积比色液，黑暗静置30min，测定OD530，以标准曲线上的标准品OD530估测IAA含量。以空白培养基CK和不加Trp的HZP1菌液作为对照处理(图8)，结果测定如下表：
Figure BDA0001659185880000062
固氮酶活性测定：采用乙炔还原法，对菌株HZP1的自生固氮酶活性进行测定，结果发现该菌株的自生固氮酶活性12h后达到208.5nmol/(mL·h)，具体步骤如下：
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1在LB固体平板上活化，接种于4mlK.oxytoca有氮液体培养基试管，培养12h，转接至50ml K.oxytoca有氮液体培养基摇瓶中30℃，200rpm培养15h，此时氮源基本耗尽，取全部培养液，离心去上清。用50ml K.oxytoca无氮液体培养基重悬，接种至无氮半固体K.oxytoca培养基，30℃震荡培养，每隔4h后测定其还原乙炔的能力。保证瓶中OD600在0.2时有较好测量效果。细胞固氮酶比活按以下公式计算：
细胞还原乙炔活性(nmolC2H2·ml-1·h-1)＝乙烯峰面积×90/(1nmol乙烯标准峰面积×1ml×0.5h)
上述K.oxytoca有氮培养基配方如下：蔗糖40g，NaCl 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NH4Ac1.54g，柠檬酸铁36mg，Na2HPO4·12H2O 9.84g，Na2MoO4·2H2O 7.6mg，KH2PO4 1.7g。其中Na2HPO4·12H2O和KH2PO4单独灭菌，NH4Ac单独灭菌。
有氮K.oxytoca除去NH4Ac即为无氮培养基。
不同接种时间巨大芽孢杆菌HZP1接种无氮K.oxytoca后还原乙炔数据：
Figure BDA0001659185880000071
实施例2：
复合微生物拌种剂的制备：
经活化的巨大芽孢杆菌HZP1和根瘤菌分别接种于NB培养基和YMA培养基中得种子液，再分别转接至发酵培养基BSE进行发酵培养得发酵液。
所述NB培养基，其配方如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000ml，pH7.4-7.6。
所述YMA培养基，其配方如下：蔗糖10.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 0.5g，NaCl0.1g，CaCl2·5H2O 0.1g，Rh微量元素液4ml，dH2O1000ml。
所述BSE培养基，其配方如下：蔗糖10.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 0.5g，NaCl0.1g，CaCl2·5H2O 0.1g，Rh微量元素液4ml，豆芽汁1000ml(500g豆芽+1500ml H2O煮沸30分钟后用纱布过滤两次)，pH 6.8-7.0。
将50ml巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1发酵液与50ml根瘤菌发酵液混合装有已灭菌的450g草炭和50g磷矿粉的无菌袋，再加入1ml无菌微量元素液制备得复合固体菌剂。于室温下放置，按照国家标准关于《农用微生物菌剂产品的技术指标》规定方法测定活菌数为：根瘤菌7.55-8.16亿/g，巨大芽孢杆菌0.82-0.86亿/g。活菌数及杂菌数测定结果如下：
Figure BDA0001659185880000081
所述菌剂1为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1和紫云英根瘤菌7653R混合后的复合菌剂，菌剂2为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HZP1和费氏中华根瘤菌菌株HH103混合后的复合菌剂。
所述的费氏中华根瘤菌菌株HH103菌液有效菌含量为20×108-50×108cfu/ml；所述巨大芽孢杆菌菌液有效菌含量为5×108-10×108cfu/ml，二者菌数比例约为10:1；
所述的紫云英根瘤菌7653R菌液有效菌含量为20×108-50×108cfu/ml；所述巨大芽孢杆菌菌液有效菌含量为5×108-10×108cfu/ml，二者菌数比例约为10:1；
所述腐殖酸为市售原料，又称草炭，其含水量为12％，K含量为13.18mg/kg，P含量为0.94mg/kg，有机质428.12g/kg，全氮含量为0.52％，pH为5.30。
所述磷矿粉为市售试剂，又称磷灰石，难溶性酸性磷酸盐，主要成分是Ca5(PO4)3Cl，含有3％有效磷成分。
所述的微量元素液的配方为：H3BO3 5g，Na2MoO4 5g，水1000ml。
实施例3：
复合微生物菌剂在对豆科植物促生、增产方面的田间应用，其应用过程如下：
土培和小区试验供试土壤均为同一种低磷土壤，来源于湖北石首大田。其理化性质测定如下：有机质12.66g/kg，全氮0.87g/kg，速效钾101.34mg/kg，速效磷6.36mg/kg，pH6.70，土著大豆根瘤菌数量7.9×103cfu/g。
复合微生物菌剂对紫云英促生效应的测定：
(1)选颗粒饱满、大小的均匀的紫云英种子，用75％乙醇处理5min，再用次氯酸钠灭菌3min，然后用无菌水洗涤8-10次。均匀铺于1％水琼脂平板上，28℃正置催芽2-3d。
(2)催芽后的种子播种于含有无氮植物营养液的土钵中，每钵2颗，1周后踢苗留长势类似的苗。等到植物长出第一片复叶后，于根系接种2ml菌液，双接种时根瘤菌与芽孢杆菌各1ml；一天一次蒸馏水浇灌，后期两天一次，保持土壤田间持水量。且在播种时和播种后第3周浇灌标准营养液，每次10ml。在光照室培养25-30d后观察结瘤情况，并测定植物地上部分鲜重、地下部分鲜重、根瘤数、根瘤鲜重、固氮酶活等指标。
处理方案如下：
CK：不接菌，接无菌水/2ml；
处理1：接紫云英根瘤菌7653R/2ml；
处理2：接巨大芽孢杆菌HZP1/2ml；
处理3：双接种(7653R+HZP1)/2ml；
巨大芽孢杆菌HZP1菌液浓度OD600为0.2，紫云英根瘤菌7653R菌液OD600为0.5。
测定结果如下：
Figure BDA0001659185880000091
结论：双接种对比单接巨大芽孢杆菌HZP1或单接紫云英根瘤菌7653R在地上部分(图9)和地下部分生物量、固氮酶活、瘤重均有所增多。复合菌剂对紫云英生物量有显著性(不同字母表示在p<0.05水平下具有显著性)增产效果。
复合微生物拌种剂在田间对大豆增产效应的测定：将实施例2制备的复合微生物拌种剂(巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumHZP1和费氏中华根瘤菌HH103)与大豆种子拌种后播种，花期进行性状考察，成熟期完成小区产量测定。具体设计和实施如下：
该小区试验是在湖北石首大埦镇当地农科所实验地(大田土壤的前茬作物是小麦)进行和完成。每小区4.8米宽，5米长，小区间留0.4米长走道，试验田四周至少1米宽的保护行，试验田实际面积：4.8米*5米*6小区＝144平方米。此次播种1个品种：中黄13；每小区播种200g，待出苗后，按每10CM保留一株的标准间苗。按照以下2个处理，每个处理3个小区。由当地农科所的工作人员，严格按照各个处理方案进行田间管理，进行花期调查和成熟期测产。
田间小区处理如下：
处理1：不与菌剂拌种，中黄13常规播种，播200克/小区；
处理2：菌剂拌种，中黄13常规播种，200克大豆拌种2000g复合菌剂/小区；
拌种步骤包括：每100克复合微生物拌种剂加入20ml 20％的***胶水溶液，反复搅拌均匀，调成糊状。若菌剂本身含水量较小，调不成糊状，可稍增加***胶水溶液的量。调成糊状后，再按照100克原始复合微生物拌种剂拌种1000克大豆的量加入豆种，反复搅拌，使草炭菌剂均匀粘附在种子表面。拌好的大豆在报纸或塑料布上摊开，约30-60分钟可晾干。
花期田间小区调查及成熟期测产结果如下：
Figure BDA0001659185880000101
由此可见：处理2对比处理1地上鲜重，地下根瘤数量(图10)和根瘤重量均增多。产量比较测定结果显示，接种复合菌剂的大豆产量提高16.9％。
实施例4：
复合微生物菌剂在减少氮肥施用的田间应用，其应用过程如下：
小区试验基地设在哈尔滨郊区农科院实验基地。小区试验地面积一共是1400m2，每一个小区39m2，小区6垄区，10米行长，一共36小区。此次小区设计包含两个大豆品种(龙哈10-4139和黑龙61)以及复合菌剂(实施例2中的菌剂2)，随机排列。6种不同处理，每一种处理，采用3个重复。大豆于2017年5月播种，2017年9月收获考种及测产。
试验处理设计：
处理1：常规施肥，不施复合菌剂。
处理2：50％施氮肥，不施复合菌剂。
处理3：完全不施氮肥，不施复合菌剂。
处理4：常规施肥+接种复合菌剂。
处理5：50％施氮肥+接种复合菌剂。
处理6：完全不施氮肥+接种复合菌剂。
大豆与菌剂拌种步骤参见实施例3。常规施肥的肥料使用如下：每小区尿素38克+重过磷酸钙97克+硫酸钾58克，50％施氮肥量是尿素减少70％，完全不施氮肥是不施尿素。
龙哈10-4139考种及测产分析结果如下:
Figure BDA0001659185880000102
Figure BDA0001659185880000111
黑龙61考种及测产分析结果如下：
Figure BDA0001659185880000112
由此可见：两个大豆品种考种分析显示处理4，5，6相对于处理1，2，3大豆荚数，节数，单株粒重，百粒重均有所增加，表明添加复合菌肥对大豆生育生长产生了积极效果。在只施加50％氮肥情况下接种复合菌剂两个品种均有增产效果：在减少总氮肥50％，相当于减少尿素70％的条件下，可使龙哈10-4139增产14.0％，黑龙61增产21.6％。

Claims (9)

1.一株分离的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌HZP1，保藏编号为CCTCC NO：M 2018061。
2.一种复合微生物菌剂，包括巨大芽孢杆菌和根瘤菌，所述的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌HZP1，保藏编号为CCTCC NO：M 2018061。
3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，所述的根瘤菌为紫云英根瘤菌（Rhizobium astragali）7653R或费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）菌株HH103。
4.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，所述的根瘤菌和巨大芽孢杆菌HZP1的有效菌浓度比值为10~5:1。
5.权利要求2所述的复合生物菌剂在制备拌种剂中的应用。
6.根据5所述的应用，所述的拌种剂的配方：
组分 含量
根瘤菌菌液 50~60 ml
巨大芽孢杆菌HZP1菌液 50~60 ml
草炭 440~460 g
磷矿粉 45~55g
微量元素液 0.1~1 ml
所述的根瘤菌菌液有效菌含量为20×108 - 50×108 cfu/ml；所述巨大芽孢杆菌HZP1菌液有效菌含量为5×108 - 10×108 cfu/ml；
所述的微量元素液的配方为：H3BO3 5 g，Na2MoO4 5 g，水1000 ml。
7.权利要求2所述的复合生物菌剂在制备根系接种剂中的应用。
8.权利要求2所述的复合生物菌剂在制备豆科作物增产剂中的应用。
9.权利要求2所述的复合生物菌剂在制备氮肥部分替代剂中的应用。
CN201810454089.7A 2018-05-14 2018-05-14 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用 Active CN108624528B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810454089.7A CN108624528B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810454089.7A CN108624528B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108624528A CN108624528A (zh) 2018-10-09
CN108624528B true CN108624528B (zh) 2021-01-29

Family

ID=63692979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810454089.7A Active CN108624528B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108624528B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109769615A (zh) * 2019-01-25 2019-05-21 广西壮族自治区农业科学院 一种促进花生根瘤固氮的方法
CN113693082A (zh) * 2021-08-30 2021-11-26 深圳市芭田生态工程股份有限公司 促进豆科种子在盐碱地萌发成苗的种衣剂及其制备方法
CN114009449B (zh) * 2021-10-19 2023-06-20 中国农业科学院油料作物研究所 增加豆科作物根部具固氮酶活性根瘤数量的方法及其在豆科作物上的应用
CN114015629B (zh) * 2021-12-20 2022-04-29 南京林业大学 一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂
CN115287227B (zh) * 2022-07-26 2023-11-10 中国农业大学 一种促进植物氮营养和生长的芽孢杆菌及其应用
CN116375519A (zh) * 2022-12-15 2023-07-04 领先生物农业股份有限公司 一种大豆根瘤菌生物保护剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1296474C (zh) * 2005-07-25 2007-01-24 中国林业科学研究院热带林业研究所 根瘤菌与解磷芽孢杆菌共培养发酵方法
CN102826895B (zh) * 2012-08-01 2014-04-23 邓振山 一种多元复合微生物菌肥及其制备方法
HU231353B1 (hu) * 2014-02-10 2023-03-28 BioFil Mikrobiológiai, Géntechnológiai és Biokémiai Kft Stressztalajok oltására szolgáló talajbaktériumok
CN104263677B (zh) * 2014-09-02 2017-04-19 华中农业大学 一种复合微生物拌种剂及其制备方法和应用
CN104609992B (zh) * 2014-12-31 2017-06-09 天津北洋百川生物技术有限公司 一种盐碱地专用复合菌肥及其制备方法
CN106011004B (zh) * 2016-05-20 2020-01-17 东莞市保得生物工程有限公司 一种固氮微生物g96及其菌剂制备方法和应用
CN105950520B (zh) * 2016-07-18 2019-05-10 武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所 一种高效解磷的根瘤菌及其应用
CN107881130B (zh) * 2017-11-10 2021-02-19 黑龙江省农业科学院草业研究所 具有高效解磷能力的根瘤菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108624528A (zh) 2018-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624528B (zh) 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用
CN102936574B (zh) 一种耐重金属的根瘤菌及其促进尾矿区植物修复的方法
CN113337418B (zh) 具有降低蔬菜重金属含量、提高蔬菜质量的功能菌株w25及应用
CN111019856B (zh) 玫瑰色考克氏菌sdb9及其制备方法和应用
CN106164247A (zh) 用于应力土壤的接种菌剂
CN110564637B (zh) 一种促进小麦生长的复合菌剂及应用
CN107164261B (zh) 一株促进毛叶苕子增长的根瘤菌及其应用
CN111484946B (zh) 一种产iaa的耐高温芽孢杆菌及其应用
CN109439570A (zh) 一株解磷假单胞菌及其应用
CN104762228A (zh) 一种源于象草的巨大芽孢杆菌及其用途
CN104263684A (zh) 一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用
CN108893421B (zh) 一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及其在矿区复垦生态重建中的应用
CN102391973B (zh) 一种耐重金属的植物内生细菌及其应用
CN109456915A (zh) 一种沙福芽孢杆菌株x3及其应用
CN110438036B (zh) 一株具有固氮作用的固氮菌n24及其应用
CN113528398B (zh) 一种具有解磷解钾作用的枯草芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
CN102391972B (zh) 一株樱桃根际促生假单胞菌及其应用
CN109182194A (zh) 一株促进小冠花生长的杨凌根瘤菌及其培养方法与应用
CN110791459B (zh) 一株用于防控连作百合土传枯萎病的枯草芽孢杆菌及其应用
CN111484947B (zh) 一种耐高温的解磷固氮芽孢杆菌及其应用
CN115651846A (zh) 一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用
CN111560322A (zh) 一种促生根的耐热芽孢杆菌及其应用
CN108841761A (zh) 促进三叶草生长和/或提高三叶草产量的方法及其所用菌剂
CN110257283B (zh) 一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用
CN111909863B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant