CN113564086A - 具有溶磷功能并促进园林植物生长的根瘤菌及其应用 - Google Patents

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CN113564086A CN202110974466.1A CN202110974466A CN113564086A CN 113564086 A CN113564086 A CN 113564086A CN 202110974466 A CN202110974466 A CN 202110974466A CN 113564086 A CN113564086 A CN 113564086A
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Abstract

本发明公开了具有溶磷功能并促进园林植物生长的根瘤菌及其应用。该根瘤菌为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21507。百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7能够分泌IAA，且具有溶无机磷功能，可作为微生物有机肥，用以改善土壤肥力。

Description

具有溶磷功能并促进园林植物生长的根瘤菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中具有溶磷功能并促进园林植物生长的根瘤菌及其应用。
背景技术
传统上，根瘤菌属的种被认为是豆科内共生菌，并且大多数是从豆科植物的根瘤中分离出来的。一些研究也已经表明，非共生根瘤菌也可从其他来源(如土壤，植物根际)中分离出来。根瘤菌在农业实践中，特别是对于豆类作物，具有重要意义。除了具有共生固氮能力外，根瘤菌菌株还可以促进非豆科植物的生长。
磷是植物必需的营养元素之一，土壤中的磷主要以难溶性的磷酸盐的形式存在，植物对其利用率通常极低。解磷菌能通过产生有机酸类等物质溶解土壤中植物不易吸收的无机磷化合物，具有提高土壤有效磷含量，减少磷肥使用量，促进植物生长。植物根际微生物还能分泌植物激素类物质，促进植物根系生长，提高植物对养分的吸收利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何促进植物生长和/或促进植物种子萌发和/或溶磷。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种根瘤菌。
本发明所提供的根瘤菌为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)。
本发明所提供的百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)具体可为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21507，下文简称百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7。
百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7为革兰氏染色阴性细菌、呈杆状、无芽孢形成。3T7在YMA平板上的菌落为白色，圆形，凸起，半透明和有粘液。百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的16S rRNA基因具有序列表中序列1所示DNA片段。
为解决上述技术问题，本发明还提供了根瘤菌的培养物。
本发明所提供的根瘤菌的培养物，是将百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7在微生物培养基中培养得到的物质(即发酵产物，如含有百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7和分泌到固体培养基内的物质即固体发酵物)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。
本发明所提供的菌剂含有百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7或/和百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的代谢物或/和上述培养物。
上述菌剂中，所述菌剂具有下述至少一种功能：
M1)促进植物生长；
M2)促进植物种子萌发；
M3)分泌IAA；
M4)溶解无机磷。
上述菌剂的活性成分可为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7或/和百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的代谢物或/和上述培养物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料可为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7或/和百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
为解决上述技术问题，本发明还提供了微生态制剂或生物肥料。
本发明所提供的微生态制剂或生物肥料含有所述根瘤菌、所述培养物或/和所述菌剂上文中，所述产品可为菌剂、微生态制剂或生物肥料。
上述根瘤菌、上述培养物、上述菌剂或上述生物肥料的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
N1、在促进植物种子萌发中的应用；
N2、在制备促进植物种子萌发的产品中的应用；
N3、在促进植物生长中的应用；
N4、在制备促进植物生长的产品中的应用；
N5、在分泌IAA中的应用；
N6、在制备分泌IAA的产品中的应用；
N7、在溶解磷中的应用；
N8、在制备溶解磷的产品中的应用。
本文中，所述植物可为下述任一种植物：
P1)双子叶植物或单子叶植物，
P2)菊亚纲植物，
P3)菊目植物或莎草目植物，
P4)菊科植物或禾本科植物，
P5)禾亚科植物，
P6)万寿菊属植物或稻属植物，
P7)万寿菊或水稻。
本发明还提供了制备所述菌剂的方法。
本发明所提供的制备所述菌剂的方法，包括将百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7或/和百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的代谢物或/和上述培养物作为菌剂的成分，得到所述菌剂的步骤。
本文中，所述百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的代谢物可从百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的发酵液中获得。所述百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的代谢物可为百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7的无菌代谢物或百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的含菌代谢物。百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7，过滤除去液体培养物(发酵液)中的百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7即得到百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的无菌代谢物。百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7，收集发酵液(含有百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的含菌代谢物。
本文中，所述溶解磷可为溶解无机磷。
本文中，所述促进植物生长可为促进水稻幼苗生长和/或促进万寿菊幼苗的生长。所述促进植物种子萌发可为提高万寿菊种子发芽率。
本发明经分泌IAA试验，溶磷试验及种子发芽试验证明，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7在无机磷平板上溶磷圈与菌落直径比为1.34±0.06。与未接种的阴性对照组相比，能显著提高万寿菊种子发芽率、水稻及万寿菊幼苗的生长，使万寿菊种子发芽率提高了1倍以上。百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7能够分泌IAA，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的单位IAA含量为38.88mg/L发酵液，且具有溶无机磷功能，可作为微生物有机肥，用以改善土壤肥力。
保藏说明
菌种名称：百子莲根际根瘤菌
拉丁名：Rhizobium rhizagapanthus
菌株编号：3T7
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年12月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21507
附图说明
图1为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7在YMA平板上培养3d后菌落图片。
图2为根据16S rRNA基因序列构建的百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7与相关模式菌的***进化树。括号内为菌株的GenBank序列号；图中参比菌株均为所在种的标准菌株。Neorhizobium huautlense S02T作为外群。
图3为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7与Rhizobium属内近缘物种的全基因组构建基因组BLAST距离***发育树(GBDP)树。其中，3T7为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7。
图4为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7在无机磷培养基上培养3d后形成溶磷圈的照片。
图5为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7分泌生长素的定性检测照片。图中，IAA为阳性对照，R2A为阴性对照，3T7为百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7处理。
图6为水稻幼苗移栽后1个月的照片。左侧4个花盆为对照组，右侧4个花盆为试验组。
图7为万寿菊幼苗移栽后1个月的照片。左侧3个花盆为对照组，右侧3个花盆为试验组。
具体实施方式
本研究采用多相分类方法确定百子莲根际细菌3T7的分类地位，对其产IAA、溶磷功能进行研究，并通过种子发芽试验及盆栽试验检测其促生功能。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1/100TSA固体培养基:胰蛋白胨0.15g，大豆胨0.05g，氯化钠0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水1 000mL，调节pH 7.3±0.2，121℃灭菌20min。
YMA培养基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.2g，琼脂15.0g，蒸馏水1 000mL，调节pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。
YMA液体培养基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.2g，蒸馏水1 000mL，调节pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。
无机磷培养基：氯化钠0.3g，葡萄糖10g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，七水合硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，蒸馏水1 000mL，调节pH 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
产IAA液体发酵培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.03g，七水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，L-色氨酸0.2g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH 7.2±0.2，121℃灭菌15min。
实施例1、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的分离与鉴定
1、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的分离
在上海市园林科学规划研究院邬桥基地(30°58'N，121°25'E)采集百子莲的根际土壤样品，带回实验室4℃保存。抖落附着于植物根上的土壤，仅保留紧密粘附在根表面的根际土，称取2g带有根际土的植物根至于无菌研钵研磨，充分研磨后转至装有玻璃珠和50ml无菌水的150ml锥形瓶中，室温150r/min振荡30min，取1mL稀释液用无菌水进行系列稀释，取100μL系列稀释液涂布于1/100TSA平板，30℃倒置培养1周，根据生理形态特点，用竹签将挑取单菌落，接在平板上纯化，确定为纯菌后，转入斜面4℃短期保存，转入25％甘油管，-80℃长期保存。将其中一株分离纯化的菌株命名为3T7。
2、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的鉴定
2.1菌株形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的菌株3T7进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态、菌落边缘状态。根据制造商的说明使用索莱宝公司革兰氏染色试剂盒对3T7进行涂片革兰氏染色，采用光学显微镜观察菌体的形态。
3T7在YMA平板上的菌落为白色，圆形，凸起，半透明和有粘液(图1)。细胞革兰氏染色阴性，呈杆状，无芽孢形成。
2.2分子鉴定
按说明书方法操作，用天根公司TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rRNA基因扩增。25μL PCR扩增体系：2×Taq PCR Mix12.5μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，ddH2O8.5μL，2μL DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段为1400bp左右，电泳验证后，将阳性结果PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序得到的序列上传到Ezbiocloud(www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行序列比对。
菌株3T7的16S rRNA基因的测序长度为1,403bp，与EzBioCloud数据库比对结果显示菌株3T7是Rhizobium属的成员，与Rhizobium altiplani HAMBI 3664T(99.43％)，Rhizobium tibeticum CGMCC 1.7071T(99.36％)、Rhizobium favelukesii LPU83T(99.29％)和Rhizobium mesoamericanum HAMBI 3151T(98.89％)的序列具有高度相似性，与Rhizobium属的其他物种的模式菌序列相似性＜98.7％。从EzBioCloud服务器检索了那些密切相关的16S rRNA基因序列，并使用clustal_W程序进行了比对。使用MEGA 7软件通过邻近法(Neighbour-Joining)构建***发育树。使用Kimura two-parameter模型计算NJ法的进化距离，Bootstrap值为1000次时，形成的发育树如图2所示。菌株3T7与Rhizobiummesoamericanum聚在同一个分支。
2.3基因组分析
基因组DNA送至安诺优达基因科技(北京)有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000测序***对菌株3T7进行基因组草图测序。使用Unicycler v0.4.7软件进行组装，得到80个重叠群，覆盖率约为185×，N50长度为232080bp。基因组5.94Mb，G+C含量为59.9％,用ChunLab的直系同源平均核苷酸鉴定工具(OAT)v0.93.1软件进行菌株3T7与Rhizobium属相近菌株的全基因组平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，OrthoANI)分析。使用基因组到基因组距离计算器(GGDC)2.0服务器(http：//ggdc.dsmz.de/distcalc.php)比较计算菌株3T7与参考菌株之间的数字DNA-DNA杂交(dDDH)值。
如表1所示，与其他具有公开基因组序列的Rhizobium属物种的菌株相比，OrthoANI的值为78.6-88.5％，低于先前为物种划界提出的临界值95-96％，3T7及其模式菌株的dDDH值在22.5-37.5％之间，远低于70％的物种划分阈值。ANI和dDDH的结果都支持菌株3T7为Rhizobium属的一个新种。
表1.菌株3T7与其近缘菌株ANI及dDDH值
3T7 OrthoANI(％) dDDH(％)
R.tibeticum GCA_900110205 88.5 37.5
R.favelukesii GCA_000577275 88.3 37.2
R.altiplaRi GCA_001542405 86.7 33.4
R.mesoamericanum IMG_2738541345 86.5 32.6
R.grahamii GCA_000298315.2 85.4 31.3
R.metallidurans GCA_014196505 79.9 23.2
R.phaseoli GCA_003985125 79.0 22.7
R.sophoriradicis GCA_003939025 78.8 22.8
R.aethiopicum GCA_900094625 78.6 22.5
将3T7的全基因组序列提交至模式菌基因组服务器TYGS网站上比对，结果显示菌株3T7不属于TYGS数据库中发现的任何物种，为潜在的新物种。基于全基因组的分类学分析表明，3T7与Rhizobium tibeticum和Rhizobium favelukesii密切相关，并在***发育树中与这两株模式菌聚集在一起，如图3所示。
2.4生理学和化学分类鉴定
使用法国梅里埃公司API 20NE和API ZYM试剂盒(bioMérieux)确定菌株3T7和相关模式菌株的生理生化特性。美国BIOLOG公司的GEN III MicroPlates用于确定碳源的氧化和对抑制性化合物的敏感性。
20NE试验结果显示菌株3T7的硝酸盐还原反应呈阳性，能产生吲哚，能水解七叶灵和脲素，不能水解明胶。葡萄糖、***糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖及葡萄糖酸盐同化反应阳性，苹果酸同化反应弱阳性，半乳糖苷酶阳性，葡萄糖酸化阴性，精氨酸双水解酶阴性，癸酸、己二酸、柠檬酸和苯乙酸同化反应阴性。ZYM酶活鉴定试验中，白氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶和β-葡萄糖甙酶阳性。BIOLOG结果显示3T7可以利用L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸、D-葡糖-6-磷酸D-果糖-6-磷酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、奎宁酸、L-乳酸、D-苹果酸、溴-丁二酸、乙酰乙酸、果胶、L-组胺、粘液酸、丙酮酸甲酯、甲酸、龙胆二糖、蜜三糖、α-D-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-果糖、L-果糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-甘露醇、D-***醇、肌醇、甘油、L-天冬氨酸、D-半乳糖醛酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、L-苹果酸、乙酸、D-麦芽糖、D-纤维二糖和蔗糖作为碳源，可以在四唑蓝、萘啶酮酸、亚碲酸钾和氨曲南存在条件下生长。菌株3T7与相关模式菌种的差异特征见表2。
菌株3T7与模式菌株西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)CGMCC 1.7071(＝LMG24453)在如下32项生理生化特征方面存在明显差别：1)菌株3T7能同化N-乙酰-葡萄糖胺和葡萄糖酸盐，而模式菌株CGMCC 1.7071T不能；2)菌株3T7胞外酶谱中不含β-半乳糖甙酶和α-葡萄糖甙酶，而CGMCC 1.7071T胞外酶谱中含这两种酶；3)菌株3T7能以L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸、D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、奎宁酸、L-乳酸、D-苹果酸、溴-丁二酸、乙酰乙酸、果胶、L-组胺、粘液酸、丙酮酸甲酯和甲酸等18种物质作为碳源，而模式菌株CGMCC 1.7071T不能利用这些物质，菌株3T7不能利用D-松二糖、水苏糖、N-乙酰神经氨酸、肌苷和D-葡糖酸作为碳源，而CGMCC 1.7071T可以利用这5种物质作为碳源；4)在溴酸钠、1％乳酸钠、醋竹桃霉素、利福霉素SV和洁霉素存在条件下3T7可以生长，而CGMCC 1.7071T不能生长。
菌株3T7与模式菌株Rhizobium mesoamericanum HAMBI 3151T在如下19项生理生化特征方面存在明显差别：1)菌株3T7能同化N-乙酰-葡萄糖胺和葡萄糖酸盐，不能同化柠檬酸，精氨酸双水解酶阴性，HAMBI 3151T不能同化N-乙酰-葡萄糖胺和葡萄糖酸盐，能同化柠檬酸，精氨酸双水解酶阳性；2)菌株3T7胞外酶谱中不含碱性磷酸盐酶和α-葡萄糖甙酶，而HAMBI 3151T胞外酶谱中含这两种酶；3)菌株3T7不能以柠檬酸和D-松二糖作为碳源，HAMBI 3151T可以利用柠檬酸和D-松二糖，菌株3T7能以L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸、L-组胺、粘液酸、丙酮酸甲酯、甲酸和龙胆二糖作为碳源，HAMBI 3151T不能利用；4)在氯化锂和1％乳酸钠存在条件下3T7可以生长，而HAMBI 3151T不能生长，丁酸钠能抑制3T7生长，而不能抑制HAMBI 3151T生长。
菌株3T7与模式菌株Rhizobium altiplani HAMBI 3664T在如下17项生理生化特征方面存在明显差别：1)菌株3T7能水解脲素，HAMBI 3664T不能；
2)菌株3T7的N-乙酰-葡萄糖胺同化反应为阳性，模式菌株HAMBI3664T的N-乙酰-葡萄糖胺同化反应为阴性；
3)菌株3T7胞外酶谱中不含酯酶(C4)和胰蛋白酶，而HAMBI 3664T胞外酶谱中含这两种酶；
4)菌株3T7不能以L-半乳糖醛酸内酯、丙酸、柠檬酸、D-松二糖、水苏糖和N-乙酰神经氨酸作为碳源，模式菌株HAMBI 3664T可以，菌株3T7能以L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸和D-葡糖-6-磷酸作为碳源，HAMBI 3664T不能利用；
5)在氯化锂和溴酸钠存在条件下3T7可以生长，而HAMBI 3664T不能生长，万古霉素能抑制3T7生长，而不能抑制HAMBI 3664T生长。
表2.菌株3T7与相关模式菌种的差异特征
Figure BDA0003226806980000091
Figure BDA0003226806980000101
注：+，阳性或可利用；-，阴性或不可利用；w，弱阳性。
使用Sherlock微生物鉴定***(MIDI)测定从菌株3T7及3个近缘菌的细胞。MIDI分析结果见表2，菌株3T7的主要脂肪酸(＞5％)是第8特征类型(C18：1ω6c和/或C18：1ω7c)、第2特征类型(C12：0醛和/或等效碳链长度为10.9525的未知脂肪酸)、C16：0、C18：0和C19：0cycloω8c。结果支持菌株3T7为根瘤菌属。表3中显示了四种菌株之间脂肪酸谱的细微差异。
表3.菌株3T7以及其类型菌株的细胞脂肪酸组成
脂肪酸 3T7 CGMCC 1.7071 HAMBI 3664 HAMBI 3151
C<sub>16：0</sub> 7.63 9.33 7.47 4.84
C<sub>15：0</sub>-2OH 0.79 1.35 1.59 1.66
C<sub>17：0</sub> cyclo 0.66 1.04 0.50 0.54
C<sub>16：0</sub>-3OH 1.74 1.70 1.38 1.19
C<sub>18：0</sub> 5.64 6.51 8.83 6.97
11-methyl C<sub>18：1</sub>ω7c 0.22 1.15 0.56 0.74
C<sub>19：0</sub> cycloω8c 14.60 20.03 18.52 16.37
C<sub>18：0</sub> 3-OH - - 2.57 -
第2特征类型 6.81 4.66 4.93 4.32
第3特征类型 1.15 1.69 0.87 0.69
第8特征类型 58.62 49.95 51.46 60.87
注：所示数值为总脂肪酸的百分比。-：没有检测到，特征类型是由MIDI***无法通过GLC分离的两种或三种脂肪酸组成的混合物，第2特征类型包括C14：0 3OH和/或C16：1 isoI，第3特征类型包括C16：1ω6c和/或C16：1ω7c，第8特征类型包括C18：1ω6c和/或C18：1ω7c。
根据同源性比对，***发育树的构建，结合形态学、生理生化鉴定、脂肪酸成分及基因组分析结果，可以确定菌株3T7为Rhizobium属的新种，建议的分类命名为Rhizobiumrhizagapanthus，中文名称为百子莲根际根瘤菌。百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7已于2020年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.21507。以下简称为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7。
实施例2、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的溶磷能力的检测
将取10μL百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7菌液接种于无机磷培养基上，30℃培养4d，观察有无溶磷圈产生，测量溶磷圈直径(d2)和菌落直径(d1)，计算溶磷圈与菌落直径比(d2/d1)。比值越大，表示溶磷能力越强。结果表明在无机磷培养基上生长4d后，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的溶磷圈与菌落直径比为1.34±0.06(图4)。表明百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7可以溶解无机磷。
实施例3、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的分泌生长素的定性检测和定量分析
1、定性检测
将百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7活化后接种于产IAA液体发酵培养基中，35℃、180r/min震荡培养2d，12 000rpm离心10min后取100μL百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7发酵液的上清液滴在在白瓷板上，加入等体积Salkowski比色液进行显色反应(百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7处理)。分别以100μL IAA水溶液(100mg/L)和不加菌的产IAA液体发酵培养基作为阳性对照和阴性对照。白瓷板于室温下，避光条件下放置30min后观察，若出现粉红色则为阳性，说明该菌株能够分泌IAA。实验设三次重复。
定性检测结果显示，在百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7发酵液的上清液中滴加Salkowski比色液后，菌液颜色变粉红色(图5)，表明百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7能够分泌植物生长激素(IAA)。
2、定量分析
标准曲线的制作：取适量IAA加少量乙醇溶解后，用蒸馏水稀释，配置浓度为0、25、50、100、200、250mg/L的IAA标准溶液，并按体积比1∶1与Salkowski比色液混合，室温避光放置30min，然后分别测定各浓度的OD530nm(以蒸馏水与Salkowski比色液的1∶1混合溶液为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD530nm为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。
菌液中IAA浓度的测定：百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7活化后在产IAA液体发酵培养基中35℃、180r/min震荡培养48h后测定发酵液的OD600nm值，12000rpm离心10min，取上清液与等体积的Salkowski比色液混合。室温下避光放置30min，测定其OD530nm值(以未接菌的产IAA液体发酵培养基与等体积Salkowski比色液的混合溶液为对照)。通过IAA浓度与OD530nm的标准关系曲线计算相应的IAA浓度。并根据OD600值，按照公式计算单位IAA产量:
单位IAA产量(mg/L)＝发酵液中IAA含量/发酵液OD600nm值。
经检测IAA含量标准曲线回归方程为:y＝0.013x+0.0672，相关系数R2＝0.9934，培养72h后百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的OD600nm值为0.52，其上清液与Salkowski比色液混合OD530nm为0.33，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7发酵液的单位IAA含量为38.88mg/L。
实施例4、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7促进植物生长
1、促进万寿菊种子萌发
挑取百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7单菌落接种于装有100mL YMA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃培养48h。10000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水制成OD600nm＝0.1的菌悬液(以无菌水作为空白对照)。挑选粒大饱满的万寿菊种子置于底部铺置滤纸的9cm平板中，每个平板放10粒种子，加10ml菌悬液，阴性对照加10ml无菌水，每个处理3个平板。将其置于30℃恒温培养箱。跟踪观察万寿菊发芽情况，记录发芽数，分析试验菌对万寿菊种子发芽的促进效果。
发芽率％＝(指定天数的发芽种子数/供试种子数)×100％。
培养7d后，阴性对照种子发芽率为20％，试验组种子发芽率为45％，表明百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7能显著提高万寿菊种子发芽率。
2、促进水稻及万寿菊幼苗生长
挑取百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7单菌落接种于装有100mL YMA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃培养48h。10000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水制成OD600nm＝0.1的菌悬液(以无菌水作为空白对照)。挑选长势相近的水稻及万寿菊幼苗，移栽于花盆中，每盆4-5株。设置试验组及对照组CK各4盆(分别称为试验组1-4和对照组1-4)。进行菌悬液灌根处理，每周每盆浇灌菌悬液(试验组)或无菌水(对照组)25mL。植物生长期间每2-3d浇水一次。实验在智能温室中进行。日夜温度分别为25℃/20℃，日照时间为14h。
在移栽1个月后测定地上部鲜重和干重、植株高度(植株茎基部至叶片顶端高度)、根长、根重等。最终实验数据为每盆植株的平均值。
水稻幼苗盆栽结果如表4和图6所示，实验组茎鲜重、根长、根和茎干重与对照组相比分别增长了80.0％、17.8％、33.3％和53.2％,显著优于对照组，试验结果表明3T7对水稻幼苗具有明显促生作用。
表4.水稻幼苗盆栽实验测定结果
组别 根鲜重/g 茎鲜重/g 根长/cm 株高/cm 地下部干重/g 地上部干重/g
对照组1 0.27 0.94 17.20 37.00 0.19 0.47
对照组2 0.27 1.32 16.10 40.30 0.17 0.45
对照组3 0.24 0.78 15.60 39.50 0.17 0.45
对照组4 0.35 1.16 15.60 41.80 0.17 0.52
对照组 0.28±0.05a 1.05±0.24b 16.13±0.75b 39.65±2.01a 0.18±0.01b 0.47±0.03b
试验组1 0.36 2.27 19.30 44.60 0.27 0.89
试验组2 0.38 2.04 18.50 43.90 0.28 0.79
试验组3 0.35 1.53 20.10 45.20 0.22 0.66
试验组4 0.31 1.71 18.10 39.20 0.19 0.55
试验组 0.35±0.03a 1.89±0.33a 19.00±0.89a 43.23±2.74a 0.24±0.04a 0.72±0.15a
注：P＜0.05，同列小写数字不同表示差异显著。
万寿菊幼苗盆栽结果如表5和图7所示，试验组在根及茎鲜重与对照组相比，分别提高了94.7％和34.2％。试验结果表明3T7对万寿菊幼苗具有明显促生作用。
表5.万寿菊幼苗盆栽实验测定结果
组别 根鲜重/g 茎鲜重/g 根长/cm 茎长/cm 根干重/g 茎干重/g
对照组1 0.49 0.88 20.75 13.25 0.26 0.65
对照组2 0.37 0.70 22.00 11.50 0.21 0.47
对照组3 0.30 0.69 23.50 12.88 0.14 0.52
对照组 0.38±0.09b 0.76±0.11b 22.08±1.38b 12.54±0.92a 0.2±0.06a 0.55±0.09a
试验组1 0.63 1.15 15.43 17.00 0.27 0.56
试验组2 0.82 0.97 16.25 15.25 0.25 0.71
试验组3 0.77 0.94 19.33 13.83 0.31 0.72
试验组 0.74±0.10a 1.02±0.11a 17.00±2.06a 15.36±1.59a 0.28±0.03a 0.66±0.09a
注：P＜0.05，同列小写数字不同表示差异显著。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所；上海市园林科学规划研究院
<120> 具有溶磷功能并促进园林植物生长的根瘤菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1403
<212> DNA
<213> 百子莲根际根瘤菌（Rhizobium rhizagapanthus）
<400> 1
aacgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc gccccgcaag gggagcggca 60
gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtaccc tttactacgg aataacccag ggaaacttgg 120
actaataccg tatgtgccct tcgggggaaa gatttatcgg taaaggatcg gcccgcgttg 180
gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atccatagct ggtctgagag 240
gatgatcagc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggccct 360
agggttgtaa agctctttca ccggtgaaga taatgacggt aaccggagaa gaagccccgg 420
ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct agcgttgttc ggatttactg 480
ggcgtaaagc gcacgtaggc ggatcgatca gtcaggggtg aaatcccaga gctcaactct 540
ggaactgcct ttgatactgt cgatctggag tatggaagag gtgagtggaa ttccgagtgt 600
agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc gaaggcggct cactggtcca 660
ttactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 720
acgccgtaaa cgatgaatgt tagccgtcgg gcagtatact gttcggtggc gcagctaacg 780
cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg 840
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag 900
cccttgacat gcccggccag ctacagagat gtagtgttcc cttcggggac cgggacacag 960
gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020
gcaaccctcg cccttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggggac tgccggtgat 1080
aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ctgggctaca 1140
cacgtgctac aatggtggtg acagtgggca gcgagaccgc gaggtcgagc taatctccaa 1200
aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg aatcgctagt 1260
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320
caccatggga gttggtttta cccgaaggta gtgtgctaac cgcaaggagg cagctaacca 1380
cggtagggtc agcgactggg gtg 1403

Claims (10)

1.根瘤菌，其特征在于：所述根瘤菌为百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)。
2.根据权利要求1所述的根瘤菌，其特征在于：所述根瘤菌为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21507。
3.权利要求1或2所述的根瘤菌的培养物，是将权利要求1所述的根瘤菌在微生物培养基中培养得到的物质。
4.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2所述的根瘤菌或/和权利要求1或2所述根瘤菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种功能：
M1)促进植物生长；
M2)促进植物种子萌发；
M3)分泌IAA；
M4)溶解无机磷。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述植物为下述任一种植物：
P1)双子叶植物或单子叶植物，
P2)菊亚纲植物，
P3)菊目植物或莎草目植物，
P4)菊科植物或禾本科植物，
P5)禾亚科植物，
P6)万寿菊属植物或稻属植物，
P7)万寿菊或水稻。
7.制备权利要求4、5或6所述的菌剂的方法，包括将权利要求1或2所述的根瘤菌或/和权利要求1或2所述根瘤菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物作为菌剂的成分，得到所述菌剂的步骤。
8.微生态制剂或生物肥料，其特征在于：所述微生态制剂或生物肥料含有权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或/和权利要求4、5或6所述的菌剂。
9.权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料的下述任一种应用：
N1、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在促进植物种子萌发中的应用；
N2、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备促进植物种子萌发的产品中的应用；
N3、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在促进植物生长中的应用；
N4、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备促进植物生长的产品中的应用；
N5、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在分泌铁载体中的应用；
N6、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备分泌IAA的产品中的应用；
N7、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在溶解磷中的应用；
N8、权利要求1或2所述的根瘤菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备溶解磷的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种植物：
P1)双子叶植物或单子叶植物，
P2)菊亚纲植物，
P3)菊目植物或莎草目植物，
P4)菊科植物或禾本科植物，
P5)禾亚科植物，
P6)万寿菊属植物或稻属植物，
P7)万寿菊或水稻。
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