CN110546165B - 抗-pd-l1-抗-tim-3双特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及这样的抗体，其为异二聚体并且结合人PD‑L1和人TIM‑3，并且可以用于单独以及与化学疗法和其它癌症治疗剂组合治疗癌症。
Description
本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及双特异性抗体，其结合人程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）以及含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白-3（TIM-3），并且可以用于单独以及与化学疗法和其它癌症治疗剂组合治疗实体瘤和血液肿瘤。
肿瘤细胞通过多种机制逃避经由免疫***的检测和消除。免疫检查点途径用于维持自身耐受和T细胞活化的控制，但癌细胞可以使用该途径来抑制抗肿瘤应答且预防其破坏。
PD-L1/人程序性细胞死亡1（PD-1）途径是一种这样的免疫检查点。人PD-1在T细胞上发现，并且PD-L1由各种肿瘤类型异常表达；PD-L1与PD-1的结合抑制T细胞增殖和细胞因子产生。PD-1/PD-L1抑制轴已被肿瘤控制，作为在抗肿瘤免疫应答的背景下形成肿瘤进化的天然选择过程的部分。
TIM-3是被鉴定为在耗尽的T细胞的功能抑制中起关键作用的检查点受体。识别肿瘤抗原的T细胞可以从患者和小鼠模型中分离，但此类细胞可以显示出耗尽的表型，其特征在于细胞毒性功能中的损害、效应细胞因子的产生和增殖。这些T细胞可以表达高水平的检查点调节剂TIM-3。
虽然PD-1/PD-L1途径的治疗靶向在临床上得到验证，但在癌症患者中存在可变的客观应答，在PD-L1阴性和PD-L2-高阳性肿瘤中为9 - 45%，并且许多患者没有达到持久应答。两种或更多种检查点受体的组合阻断可以增加客观应答的频率，并且在可能对用PD-1或PD-L1阻断抗体的单一疗法抗拒性的癌症患者中实现功效。
用两种抗体（可以与T细胞相互作用的抗小鼠TIM-3抗体、以及可以与小鼠肿瘤细胞分开相互作用的抗小鼠PD-L1抗体），在体外处理从CT26荷瘤小鼠中收获的肿瘤浸润性淋巴细胞，导致比单独靶向任一途径更有效的小鼠肿瘤生长控制（Sakuishi等人JEM 2010，207: 2187和WO 2015/048312）。
已报道了拮抗PD-L1和TIM-3的经口小分子（Sasikumar等人AACR；Cancer Res2016；76（14 Suppl）:Abstract 4861）。这种小分子化合物据报道在同系小鼠肿瘤模型中证实了功效。
仍需要提供可以结合且抑制人PD-L1和人TIM-3，但也具有抗体的靶特异性和药代动力学的化合物。特别地，仍需要提供结合人PD-L1和人TIM-3两者的异二聚体双特异性抗体，其中所述异二聚体双特异性抗体使两条不同的重链和两条不同的轻链能够配对成单一的IgG样抗体。进一步地，存在对于目的例如低免疫原性、稳定的体内药代动力学和足够的稳定性的类似天然抗体结构的双特异性抗体的需要（如通过建模、质谱法和稳定性分析所测量的）。另外，仍需要提供具有下述特点中的一种或多种的抗人PD-L1和抗人TIM-3双特异性抗体：同时结合并桥接表达PD-L1的肿瘤细胞和表达TIM-3的T细胞，抑制PD-1和TIM-3检查点抑制剂途径，如在肿瘤模型中测量的显示出比抗PD-L1抗体和抗TIM-3抗体的组合更好的抗肿瘤活性，和缺乏抗体免疫效应子功能。
相应地，本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其包含：
a）包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区（HCVR）的第一重链（HC），
b）包含具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区（LCVR）的第一轻链（LC），
c）包含具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HCVR的第二HC，
d）包含具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的LCVR的第二LC；
并且其中第一LC与第一HC形成链间二硫键，第二LC与第二HC形成链间二硫键，并且第一HC与第二HC形成两个链间二硫键，并且第一HC和第二HC是人IgG1同种型。
本发明进一步提供了这样的抗体，其中第二HC包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HCVR，并且第二LC包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的LCVR。本发明进一步提供了这样的抗体，其中第二HC包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HCVR，并且第二LC包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的LCVR。本发明进一步提供了这样的抗体，其中第二HC包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HCVR，并且第二LC包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的LCVR。
本发明进一步提供了这样的抗体，其中：
a）第一HC包含SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22的氨基酸序列，
b）第二HC包含SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26的氨基酸序列，
c）第一LC包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和
d）第二LC包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其包含：
a）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一HC，
b）包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：27的氨基酸序列的第一LC，
c）包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的第二HC，
d）包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：28的氨基酸序列的第二LC；
并且其中第一LC与第一HC形成链间二硫键，第二LC与第二HC形成链间二硫键，并且第一HC与第二HC形成两个链间二硫键，并且第一HC和第二HC是人IgG1同种型。
本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其包含：
a）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一HC，
b）包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：27的氨基酸序列的第一LC，
c）包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的第二HC，
d）包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：28的氨基酸序列的第二LC；
并且其中第一LC与第一HC形成链间二硫键，第二LC与第二HC形成链间二硫键，并且第一HC与第二HC形成两个链间二硫键，并且第一HC和第二HC是人IgG1同种型。
本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其包含：
a）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一HC，
b）包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：27的氨基酸序列的第一LC，
c）包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的第二HC，
d）包含SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：28的氨基酸序列的第二LC；
并且其中第一LC与第一HC形成链间二硫键，第二LC与第二HC形成链间二硫键，并且第一HC与第二HC形成两个链间二硫键，并且第一HC和第二HC是人IgG1同种型。
本发明进一步提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其中：
a）第一HC包含SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的氨基酸序列，和
b）第二HC包含SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
对于SEQ ID NO：19-28，表1映射了其中序列在抗体上相关联的位置。对于SEQ IDNO：3-10，表2映射了其中序列在抗体上相关联的位置。
本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其包含两条轻链（LC）和两条重链（HC），其中：
a）第一LC具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，
b）第一HC具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列，
c）第二LC具有SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的氨基酸序列，和
d）第二HC具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
本发明提供了包含两条轻链（LC）和两条重链（HC）的抗体，其中：
a）第一LC具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，
b）第一HC具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列，
c）第二LC具有SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的氨基酸序列，和
d）第二HC具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）和人TIM-3（SEQ ID NO：2）的抗体，其包含两条轻链（LC）和两条重链（HC），其中：
a）第一LC具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，并且第一HC具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列，和
b）第二LC和第二HC分别具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17和SEQID NO：14、或SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
本发明进一步提供了这样的抗体，其中第二LC具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，并且第二HC具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。本发明进一步提供了这样的抗体，其中第二LC具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，并且第二HC具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列。本发明进一步提供了这样的抗体，其中第二LC具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且第二HC具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
本发明提供了结合人PD-L1（SEQ ID NO：1）的半抗体，其包含LC和HC，其中LC具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，并且HC具有氨基酸SEQ ID NO：11的序列。
本发明提供了结合人TIM-3（SEQ ID NO：2）的半抗体，其包含LC和HC，其中LC和HC分别具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
表1：映射至IgG1重链或轻链区域的序列
| SEQ ID NO | 区域 | 与序列相关联的抗体C的氨基酸位置 |
| 19 | CH1 | PD-L1抗体重链（SEQ ID NO: 11）的128-190 |
| 20 | CH2 | PD-L1抗体重链（SEQ ID NO: 11）的237-271 |
| 21 | CH2 | PD-L1抗体重链（SEQ ID NO: 11）的330-340 |
| 22 | CH3 | PD-L1抗体重链（SEQ ID NO: 11）的350-410 |
| 23 | CH1 | TIM-3抗体重链（SEQ ID NO: 15）的128-190 |
| 24 | CH2 | TIM-3抗体重链（SEQ ID NO: 15）的231-265 |
| 25 | CH2 | TIM-3抗体重链（SEQ ID NO: 15）的330-340 |
| 26 | CH3 | TIM-3抗体重链（SEQ ID NO: 15）的350-410 |
| 27 | CL | PD-L1抗体轻链（SEQ ID NO: 12）的131-181 |
| 28 | CL | TIM-3抗体轻链（SEQ ID NO: 18）的131-181 |
本发明提供了包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽，其中所述细胞能够表达本发明的抗体。
本发明提供了包含第一DNA分子和第二DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述第一DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽，并且其中所述第二DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽，其中所述细胞能够表达本发明的抗体。
本发明提供了包含第一DNA分子、第二DNA分子、第三DNA分子和第四DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述第一DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的多肽，所述第二DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽，所述第三DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽，并且所述第四DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽，其中所述细胞能够表达本发明的抗体。
本发明提供了用于生产本发明抗体的方法，其包括在使得抗体表达的条件下培养本发明的哺乳动物细胞，并且回收所表达的抗体。
本发明提供了通过本发明的方法产生的抗体。
本发明提供了一种抗体，其通过在使得抗体表达的条件下培养哺乳动物细胞，并且回收所表达的抗体来产生，所述哺乳动物细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽。
本发明提供了一种抗体，其通过在使得抗体表达的条件下培养哺乳动物细胞，并且回收所表达的抗体来产生，所述哺乳动物细胞包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述第一DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽，并且其中第二DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽。
本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本发明的抗体。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本发明的抗体，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌或肝细胞癌。
本发明提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是黑素瘤。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是肺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或间皮瘤。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是头颈癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是肝癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是胰腺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是胃癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是肾癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是膀胱癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是***癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是乳腺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是卵巢癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是子宫内膜癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是食道癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是软组织肉瘤。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是胆管癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
本发明进一步提供了包括与选自以下的一种或多种护理标准药物同时、分开或序贯组合施用有效量的本发明抗体的方法：顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾立布林、紫杉醇、用于注射用悬浮液的紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂）、FOLFIRI（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康）、吉西他滨、托泊替康、脂质体伊立替康、培美曲塞和西妥昔单抗。
本发明进一步提供了包括与选自以下的一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或序贯组合施用有效量的本发明抗体的方法：纳武单抗、伊匹木单抗、pidilizumab、帕博利珠单抗、曲美木单抗、urelumab、lirilumab、阿替利珠单抗、epacadostat和度伐鲁单抗。
本发明进一步提供了包括与电离辐射同时、分开或序贯组合施用有效量的本发明抗体的方法。
本发明提供了用于在治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在癌症治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在癌症治疗中使用的本发明的抗体，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌或肝细胞癌。
本发明提供了用于在黑素瘤治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在肺癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明进一步提供了本发明的抗体，其中所述肺癌是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或间皮瘤。本发明提供了用于在头颈癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在肝癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在结肠直肠癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在胰腺癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在胃癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在肾癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在膀胱癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在***癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在乳腺癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在卵巢癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在子宫内膜癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在食道癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在软组织肉瘤治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在胆管癌治疗中使用的本发明的抗体。本发明提供了用于在肝细胞癌治疗中使用的本发明的抗体。
本发明提供了与选自以下的一种或多种护理标准药物同时、分开或序贯组合用于在癌症治疗中使用的本发明的抗体：顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾立布林、紫杉醇、用于注射用悬浮液的紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂）、FOLFIRI（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康）、吉西他滨、托泊替康、脂质体伊立替康、培美曲塞和西妥昔单抗。
本发明提供了与选自以下的一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或序贯组合用于在癌症治疗中使用的本发明的抗体：纳武单抗、伊匹木单抗、pidilizumab、帕博利珠单抗、曲美木单抗、urelumab、lirilumab、阿替利珠单抗、epacadostat和度伐鲁单抗。
本发明提供了与电离辐射同时、分开或序贯组合用于在癌症治疗中使用的本发明的抗体。
本发明提供了用于在癌症治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明进一步提供了用于在癌症治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌或肝细胞癌。本发明进一步提供用于在癌症治疗中的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体，其中肺癌是非小细胞肺癌，小细胞肺癌或间皮瘤。
本发明提供了用于在黑素瘤治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在肺癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在头颈癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在肝癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在结肠直肠癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在胰腺癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在胃癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在肾癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在膀胱癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在***癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在乳腺癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在卵巢癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在子宫内膜癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在食道癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在软组织肉瘤治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在胆管癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。本发明提供了用于在肝细胞癌治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体。
本发明进一步提供了用于在癌症治疗中使用的药物组合物，其中所述药物组合物与选自以下的一种或多种护理标准药物同时、分开或序贯组合施用：顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾立布林、紫杉醇、用于注射用悬浮液的紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂）、FOLFIRI（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康）、吉西他滨、托泊替康、脂质体伊立替康、培美曲塞和西妥昔单抗。
本发明进一步提供了用于在癌症治疗中使用的药物组合物，其中所述药物组合物与选自以下的一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或序贯组合施用：纳武单抗、伊匹木单抗、pidilizumab、帕博利珠单抗、曲美木单抗、urelumab、lirilumab、阿替利珠单抗、epacadostat和度伐鲁单抗。
本发明进一步提供了用于在癌症治疗中使用的药物组合物，其中所述药物组合物与电离辐射同时、分开或序贯组合施用。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于在癌症治疗中使用的药物中的用途。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于在癌症治疗中使用的药物中的用途，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、头颈癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、软组织肉瘤、胆管癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于在癌症治疗中使用的药物中的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或间皮瘤。
本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于在癌症治疗中使用的药物中的用途，其中所述药物与选自以下的一种或多种护理标准药物同时、分开或序贯施用：顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾立布林、紫杉醇、用于注射用悬浮液的紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂）、FOLFIRI（甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康）、吉西他滨、托泊替康、脂质体伊立替康、培美曲塞和西妥昔单抗。
本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于在癌症治疗中使用的药物中的用途，其中所述药物与选自以下的一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或序贯施用：纳武单抗、伊匹木单抗、pidilizumab、帕博利珠单抗、曲美木单抗、urelumab、lirilumab、阿替利珠单抗、epacadostat和度伐鲁单抗。
本发明提供了本发明的抗体在制备用于在癌症治疗中使用的药物中的用途，其中所述药物与电离辐射同时、分开或序贯施用。
本发明的抗体是经工程改造的、非天然存在的多肽复合物。本发明的DNA分子是非天然存在的DNA分子，其包含编码具有本发明抗体中的多肽之一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。
本发明的抗体是IgG型抗体，并且具有经由链内和链间二硫键交联的“重”链和“轻链”。每条重链由N-末端HCVR和重链恒定区（“HCCR”）组成。每条轻链由LCVR和轻链恒定区（“LCCR”）组成。轻链各自与重链形成二硫键，并且两条重链在彼此之间形成两个二硫键。
重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。CH1位于HCVR之后；CH1和HCVR形成Fab的重链部分。CH2位于铰链区之后和CH3之前。CH3位于CH2之后并且在重链的羧基末端处。
轻链的恒定区含有一个结构域CL。CL位于LCVR之后；CL和LCVR形成Fab的轻链部分。
本发明的抗体是异二聚体，因为由于形成抗体的是两条不同的重链和两条不同的轻链，抗体的每个臂显示出与其同源抗原的选择性单价结合。在本发明中，抗体的一个臂结合人PD-L1（SEQ ID NO：1），且另一个臂结合人TIM-3（SEQ ID NO：2）。为了确保这些双特异性抗体的正确组装，将突变掺入CH1和CH3区域内的重链序列和轻链恒定区内的轻链序列内。CH1和LC突变制备为有利于必需的轻链和重链对的天然配对，并且不利于轻链错配。CH3突变制备为有利于两条不同重链的异二聚体配对，并且不利于同源二聚体的形成。抗体的抗PD-L1部分的CH3区域中的突变优选包括如由SEQ ID NO：11中的绝对位置编号的位置356、372、398和400（如果使用EU编号，则为位置350、366、392和394）。抗体的抗TIM-3部分的CH3区域中的突变优选包括如由SEQ ID NO：15中的绝对位置编号的位置350、351、356、405和407（如果使用EU编号，则为位置350、351、405和407）。抗体的抗PD-L1部分的CH1区域中的突变优选包括如由SEQ ID NO：11中的绝对位置编号的位置189（如果使用EU编号，则为位置183）。抗体的抗TIM-3部分的CH1区域中的突变优选地包括如由SEQ ID NO：15中的绝对位置编号的位置128、147、175和183（如果使用EU编号，则为位置128、147、175和183）。
抗体的抗PD-L1部分的CL区域中的突变优选包括如由SEQ ID NO：11中的绝对位置编号的位置179和181（如果使用EU编号，则为位置176和178）。抗体的抗TIM-3部分的CL区域中的突变优选地包括如由SEQ ID NO：15中的绝对位置编号的位置131、133、176和178（如果使用EU编号，则为位置131、133、176和178）。
在本发明的某些抗体中，重链异二聚体配对突变得到大于80℃的CH3热稳定性，这与天然抗体相当（表1和Von Kreudenstein等人，2014）。
当在某些生物***中表达时，具有Fc序列的抗体在Fc区中糖基化。通常，糖基化在抗体Fc区中高度保守的N-糖基化位点处发生。N-聚糖通常与天冬酰胺附着。抗体同样也可以在其它位置处糖基化。
任选地，本发明的某些抗体含有衍生自人IgG1的Fc部分。众所周知，IgG1与Fc-γ受体家族（FcγR）的蛋白质以及C1q结合。与这些受体的相互作用可以诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。因此，对于本发明的某些抗体，包括抗体A、B和C，将某些氨基酸取代引入IgG1Fc中，以消除免疫效应子功能。抗体的抗PD-L1部分的CH2区域中的突变可以包括如由SEQ ID NO：11中的绝对位置编号的位置240、241和271（如果使用EU编号，则为位置234、235和265）。抗体的抗TIM-3部分的CH2区域中的突变可以包括如由SEQ IDNO：15中的绝对位置编号的位置234、235和265（如果使用EU编号，则为位置234、235和265）。
通过将编码HCVR的DNA与编码重链恒定区的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码HCVR区的分离的DNA转换为全长重链基因。人以及其它哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。涵盖这些区域的DNA片段可以例如通过标准PCR扩增获得。
通过将编码LCVR的DNA与编码轻链恒定区的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码LCVR区的分离的DNA转换为全长轻链基因。人以及其它哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。涵盖这些区域的DNA片段可以例如通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。优选地，对于本发明的抗体，抗体的抗PD-L1部分的轻链恒定区是λ轻链，并且抗体的抗TIM-3部分的轻链恒定区是κ轻链。
在序列已与表达控制序列可操作地连接后，本发明的多核苷酸将在宿主细胞中表达。表达载体通常可作为附加体或宿主染色体DNA的整合部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记物，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞。
本发明的抗体可以容易地在哺乳动物细胞如CHO、NS0、HEK293或COS细胞中产生。使用本领域众所周知的技术培养宿主细胞。
含有目的多核苷酸序列（例如，编码抗体的多肽和表达控制序列的多核苷酸）的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞内，所述方法根据细胞宿主的类型而变。
可以采用各种蛋白质纯化方法，并且此类方法是本领域已知的，并且描述于例如Deutscher，Methods in Enzymology 182: 83-89（1990）以及Scopes，Protein Purification: Principles and Practice，第3版，Springer，NY（1994）中。
在本发明的另一个实施方案中，抗体或编码其的核酸以分离的形式提供。如本文使用的，术语“分离的”指蛋白质、肽或核酸，其不含或基本上不含在细胞环境中发现的任何其它大分子种类。如本文使用的，“基本上不含”指目的蛋白质、肽或核酸包含超过80%（在摩尔基础上）的存在的大分子种类，优选超过90%，且更优选超过95%。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可以通过肠胃外途径（例如，皮下和静脉内）施用。本发明的抗体可以在单剂量或多剂量中，连同与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用于患者。本发明的药物组合物可以通过本领域众所周知的方法制备（例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第22版（2012），A. Loyd等人Pharmaceutical Press），并且包含如本文所公开的抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
术语“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）指减缓、中断、阻止、缓解、停止、减少或逆转现有症状、病症、状况或疾病的进展或严重性。
除非另有说明，否则如本文使用的，在提及抗体对于人PD-L1（SEQ ID NO：1）、人TIM-3（SEQ ID NO：2）或两者的亲和力中的“结合”，意指如通过本领域已知的常见方法（包括基本上如本文所述通过在37℃下使用表面等离振子共振（SPR）生物传感器）测定的小于约1 x10-6 M，优选小于约1 x 10-9 M的KD。
“有效量”意指本发明的抗体或包含本发明的抗体的药物组合物的量，其引发对组织、***、动物、哺乳动物或人的生物学或医学应答或所需疗效，其被研究人员、医师或其它临床医生寻求。有效量的抗体可以根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及抗体在个体中引发所需应答的能力而变。有效量也是其中抗体的任何毒性或有害效应治疗有益效应超过的量。
通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例1：抗体表达和纯化
抗体A、抗体B和抗体C的重链和轻链可变区的多肽、完整重链和轻链氨基酸序列，以及编码其的核苷酸序列，在下文标题为“氨基酸和核苷酸序列”的节段中列出。另外，抗体A、B和C的轻链、重链、轻链可变区和重链可变区的SEQ ID NO显示于表2中。
本发明的抗体，包括但不限于抗体A、抗体B和抗体C，可以基本上如下制备并纯化。可以用表达***瞬时或稳定转染适当的宿主细胞如CHO用于分泌抗体，其使用四重载体、双重载体或以20HC抗TIM-3 : 10HC抗PD-L1 : 24LC抗TIM-3 : 46LC抗PD-L1比率的四个单一载体。SEQ ID NO：29至SEQ ID NO：32是抗体C的轻链和重链的DNA序列；PD-L1抗体轻链具有内部内含子，以增加相对于TIM-3轻链的表达水平。可以使用许多常用技术中的任何纯化抗体已分泌到其内的澄清培养基。例如，可以将培养基方便地施加于MabSelect柱（GEHealthcare）、或对于Fab片段施加于KappaSelect柱（GE Healthcare），所述柱已用相容的缓冲液（例如磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4））平衡。可以洗涤柱以去除非特异性结合组分。结合的抗体可以例如通过pH梯度（例如20 mM Tris缓冲液pH 7至10 mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0、或磷酸盐缓冲盐水pH 7.4至100 mM甘氨酸缓冲液pH 3.0）洗脱。可以例如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后可以合并。可以通过常见技术有效地去除可溶性聚集体和多聚体，所述技术包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换、多峰或羟磷灰石层析。抗体可以使用常见技术进行浓缩和/或无菌过滤。产物可以立即在-70℃下冷冻或可以冻干。
表2：SEQ ID NO
| 抗体A | 抗体B | 抗体C | |
| HCVR1 – 抗PD-L1 | 3 | 3 | 3 |
| HCVR2 – 抗TIM-3 | 5 | 6 | 7 |
| LCVR1 – 抗PD-L1 | 4 | 4 | 4 |
| LCVR2 – 抗TIM-3 | 8 | 9 | 10 |
| 重链1 – 抗PD-L1 | 11 | 11 | 11 |
| 重链2 – 抗TIM-3 | 13 | 14 | 15 |
| 轻链1 – 抗PD-L1 | 12 | 12 | 12 |
| 轻链2 – 抗TIM-3 | 16 | 17 | 18 |
测定
抗体的体外结合
对于异二聚体双特异性抗体，抗体的一个臂（一条轻链和一条重链）单价结合一种抗原，并且抗体的第二个臂（一条轻链和一条重链）单价结合第二抗原。当与双价结合抗原的亲本抗体相比时，本发明的抗体维持与每种抗原相当的结合的能力可以通过Biacore测定来评价。
使用BIAcore T200生物传感器仪器（GE Healthcare）在37℃下，通过表面等离振子共振（SPR）分析抗体C及其亲本抗体与相应抗原TIM-3和PD-L1的结合动力学和亲和力。使用胺偶联以7000至9000 RU的固定水平，将人Fab固定到CM5传感器芯片上。将抗体样品在HBS-EP+缓冲液中稀释，并且以30 μL/分钟的流速注射。然后注射一系列浓度的人TIM-3单臂抗原（TIM-3-SAG）和加上Fc标签的PD-L1（PD-L1-Fc）共180秒，随后为1200秒的解离时间。使用Biacore T200评估软件3.0评估传感图，并且结合（Ka）和解离（Kd）速率常数的计算是基于1：1 兰米尔结合模型拟合。由动力学速率常数Kd/Ka的比率，计算平衡解离常数（KD）或结合亲和常数。
抗体A的Fab与PD-L1的单价抗原结合为6.5 x 10-10 M，并且与PD-L1通过亲本抗PD-L1抗体的Fab的二价结合相当。抗体B和C的Fab的单价PD-L1结合也与亲本抗PD-L1抗体的Fab相当。
抗体A的Fab与TIM-3的单价抗原结合为2.53 x 10-9 M，并且比亲本抗TIM-3抗体的二价结合亲和力低大约33倍。抗体B的Fab具有针对TIM-3为1.91 x 10-10 M的Kd，并且抗体C的Fab具有针对TIM-3为1.11 x 10-10 M的Kd。抗体B的单价Fab结合的亲和力比亲本抗TIM-3抗体的二价结合亲和力低三倍，而抗体C的单价Fab结合与亲本的二价结合亲和力相当。
热稳定性
使用异二聚体双特异性抗体，需要将两条不同重链的配对和同源轻链与每条分别重链的选择性配对。可以通过DSC分析测试本发明的抗体维持与天然抗体相当的稳定性的能力。
使用MicroCal VP-Capillary DSC（Serial# 11.05083.CAP）在PBS中以1 mg/mL执行研究。所有样品都在25-100ºC的温度范围内扫描，扫描速率为60ºC/小时。在每次扫描期间，溶液在毛细管中以约60 psi进行加压。对于每种蛋白质，从缓冲液/蛋白质扫描中扣除缓冲液/缓冲液扫描，并且将热谱图对于蛋白质浓度进行标准化。进行基线校正，并且从最大峰值获得每个热变性（Tm）的中点。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，抗体C的DSC分析显示热稳定性（Tm1 67°C、Tm2 76°C、Tm3 83°C），具有与亲本抗体相当的解折叠温度（抗-PD-L1Ab： Tm1 67°C、Tm275°C、Tm3 82 °C、抗TIM-3 Ab：Tm1 64°C、Tm2 85℃）。
如通过ELISA测量的，与PD-L1和TIM-3的同时结合
关于本发明的抗体同时结合PD-L1和TIM-3的能力可以在夹心ELISA测定中测量。可以将TIM-3-Fc蛋白包被到板上，以测试本发明的抗体与TIM-3的结合，但仅当板结合的抗体也结合可溶性生物素化的PD-L1-Fc时才生成信号。
对于结合测定，将96孔（Immulon 2HB）板用50 μl/孔的1 μg/ml人TIM-3-Fc在4℃下包被过夜。然后将板用含有0.2% Tween-20的PBS洗涤三次，并且用250 μl/孔具有3% BSA的PBS在室温下阻断1小时。去除阻断缓冲液，并且将以200 nM起始的50 μl滴定抗体加入板中，并且在室温下温育1小时。然后将板用含有0.2% Tween-20的PBS洗涤三次，并且加入50μl 100 ng/ml人PD-L1生物素且在室温下温育1小时。然后将板用含有0.2% Tween-20的PBS洗涤三次，并且加入50 μl 1：5000稀释的Strep HRP（Jackson Immuno 106-030-084），且在室温下温育1小时。然后将板用含有0.2% Tween-20的PBS洗涤三次，并且使用100 μl/孔的1：1 TMB底物溶液A和B（KPL）在室温下显色10分钟。用100 μl/孔的0.1N H2SO4终止反应，并且在Spectramax板阅读器上读数。使用GraphPad Prism绘制数据。
在基本上如该测定中所述执行的实验，抗体C产生的信号随着抗体C的浓度而增加，证实抗体C在这些条件下同时结合人PD-L1和TIM-3。单独的对照TIM-3抗体仅产生背景信号。
抗体C同时结合在细胞表面上的PD-L1和TIM-3靶
关于本发明的抗体同时接合在细胞表面上的TIM-3和PD-L1蛋白的能力可以在活细胞报道分子测定中测试，以测量TIM-3：PD-L1异型受体结合（HRA）（DiscoverX，Fremont，CA）。HRA测定基于酶片段互补，并且采用两种重组β-半乳糖苷酶片段，其个别地是催化失活的并且显示对于彼此很少的亲和力。当作为融合配偶体加入的确彼此结合的蛋白质中时，可以使两个片段接近以重构功能性β-半乳糖苷酶。通过在化学发光底物的切割期间产生的光来监测酶活性。
对于测定，用编码TIM-3（1-223）-PK和PD-L1（1-259）-EA（PK =ProLink β-半乳糖苷酶片段，EA = 酶受体片段）的构建体连续转染U2OS细胞。选择U2OS细胞是因为其耐受异位膜蛋白表达的能力，并且TIM-3、PD-L1构建体设计为消除大多数细胞内结构域和潜在的复杂情况，例如受体内化和信号诱导的聚簇。
将来自稳定的U2OS TIM-3（1-223）-PK PD-L1（1-259）-EA库的细胞一式四份地铺板到384孔板（5000个细胞/孔）上。将稀释系列的抗体C与相应的亲本抗TIM-3和抗PD-L1抗体加入细胞中，并且在37℃/5% CO2下温育过夜（16小时）。然后将含有裂解缓冲液和酶底物的检测试剂加入细胞中，并且在Envision光度计上读取板。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，抗体C产生可滴定的信号增加，具有大约2 nM的EC50，而相应的单一特异性单克隆抗体对TIM-3和PD-L1是完全无活性的。这些数据指示抗体C可以在这些条件下同时接合在细胞表面上的TIM-3和PD-L1两者。
抗体C桥接表达TIM-3的细胞与表达PD-L1的细胞
关于本发明的抗体桥接TIM-3和PD-L1表达细胞的能力可以通过使用表达PD-L1的转染的CHO和表达TIM-3的DO11细胞的流式细胞术分析来确定。简言之，CHO-PD-L1和DO11-TIM-3过表达细胞可以用CFSE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）（BD Horizon）或CellTracker Deep Red（CTDR/Thermo）进行差异标记。将DO11-TIM-3和CHO-PDL1细胞与测试抗体例如抗体C（在冰上在PBS + 1% BSA + 0.09%叠氮化钠中）分开温育30分钟。可以通过洗涤去除未结合的抗体（用200 μl PBS+ 1% BSA + 0.09%叠氮化钠2X）。将CHO-PDL1细胞与45μg/ml亲本PD-L1抗体或hIgG1对照一起在冰上在PBS + 1% BSA + 0.09%叠氮化钠中温育2小时。将DO11-TIM-3细胞与45 μg/ml亲本TIM-3抗体或huIgG4-PAA一起在冰上在PBS + 1%BSA + 0.09%叠氮化钠中温育2小时。将DO11-TIM-3/抗体C细胞与CHO-PDL1 + 亲本PD-L1抗体或hIgG1以22.5 μg/ml的最终浓度混合。将CHO-PDL1/抗体C细胞与DO11-TIM-3 + TIM-3抗体的亲本或huIgG4-PAA以22.5 μg/ml的最终浓度混合。在4℃下温育大约72小时后，在适合于CFSE和CTDR的通道中，在Fortessa X20（具有HTS采样器）上测量细胞。使用FLOWJO®软件（FlowJo，LLC，Ashland，OR），门控双阳性事件（CFSE+/CTDR+），并且计算且报告总事件的百分比（对于2个重复孔）。使用非线性回归（可变斜率，4个参数），用Graphpad Prism生成拟合和统计学。
在基本上如上所述执行的实验中，抗体C介导可通过流式细胞术检测为双阳性事件的细胞桥接。抗体C分别与DO11-TIM-3或CHO-PDL1细胞的结合（伴随未结合的随后去除），以及然后与CHO-PDL1或DO11-TIM-3细胞的混合，引起双阳性事件相对于背景的剂量依赖性增加（与仅缓冲液相比高达4倍的增加）。双阳性事件中的这种增加通过在高浓度下添加过量竞争性PD-L1和/或TIM-3mAb而不是通过匹配的非特异性IgG对照来阻断，证实对靶抗原表达的特异性和依赖性。
体外功能活性
1. 基于hTIM-3 DO11细胞的测定
可以在DO11体外测定中测量本发明的抗体通过TIM-3抑制来减轻T细胞抑制的能力。
对于基于hTIM-3 DO11细胞的测定，将50 μl过表达DO11或hTIM-3的DO11细胞以2x104个细胞/孔以及50 μl A20细胞以2x104个细胞/孔铺板到96孔U形底组织培养板（Greiner Cellstar，#651180）中，使用RPMI 1640培养基（Gibco，#11875-085）。50 μl OVA（Sigma，#O1641）以0.2 μM的最终浓度（在培养基中稀释）加入。加入50 μl连续稀释的抗体（在培养基中稀释）。将培养基加入一些孔中，以使总体积达到200 μl/孔。在18-22小时后收集上清液，并且使用ELISA试剂盒（R&D，#SM2000）测量mIL-2。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，如通过渐增的mIL-2水平测量的，抗体C以剂量依赖性方式增强OVA抗原特异性T细胞活化，具有4.366 nM的EC50，但人IgG对照则不是如此。
2. 混合白细胞反应（MLR）测定
可以通过在体外MLR测定中测量在T细胞活化期间细胞因子的释放，来评估本发明的抗体阻断PD-L1信号的能力。如果通过用本发明的抗体治疗促进T细胞活化，则某些细胞因子如IFN-γ的水平预期增加。
对于MLR测定，用人单核细胞分离试剂盒II（Miltenyi，# 130-091-153）从人PBMC（Allcells，# PB001）中分离单核细胞，并且用62.5 ng/ml GM-CSF和20 ng/20 ml IL-4培养7天，以使树突状细胞分化。将100 μl用CD4 T细胞分离试剂盒（Miltenyi，目录#130-091-155）从PBMC（来自Allcells的不同供体）中分离的1x105 CD4 T细胞和1x104单核细胞衍生的人树突状细胞在具有100 μl抗体的96孔U形底板中铺板。将细胞在潮湿的37℃、5% CO2培养箱中温育，并且在三天后收集上清液。使用R&D ELISA试剂盒（# SIF50）对上清液进行人IFN-γ ELISA。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，4 nM抗体C使IFN-γ水平增加大约3倍，而8 nM抗体C使IFN-γ水平增加大约5倍。这些结果证实抗体C在该测定中增强同种异体T细胞应答的能力。
体内功能研究
1. HCC827人NSCLC异种移植模型中的抗体C
可以在HCC827人NSCLC异种移植模型中测试本发明抗体的功效，以评价通过增强对同种异体抗原的T细胞应答来延迟或破坏模型中的已建立肿瘤的能力。
对于该研究，在第0天时，用在HBSS（0.2 ml总体积）中的10 x106 HCC827细胞皮下植入来自Jackson Laboratories（7周龄，雌性，以8只小鼠的组）的NSG小鼠的胁腹内。使用Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads®，将从全血（New York Blood Center）中分离的大量人T细胞扩增10天且冷冻保存。在第36天时，将T细胞解冻、洗涤、计数且静脉内输注（0.2 ml PBS中的2.5 x106个T细胞/小鼠）到荷有HCC827肿瘤的小鼠内。从第36天开始，用人IgG（20 mg/kg）、与抗体B的亲本抗TIM-3抗体（10 mg/kg）或抗体C的亲本抗TIM-3抗体（10mg/kg）组合的抗体C的亲本抗PD-L1抗体（10 mg/kg）、抗体B（20 mg/kg）或抗体C（20 mg/kg）的i.p.注射处理小鼠，每周一次，共三周（在d36、d43、d50时给药）。每周监测至少两次动物健康和行为，包括理毛行为和走动。每周测量两次体重和肿瘤体积。如在名称为：IM-TumorGrowth Measurement的SOP中所述，使用电子卡尺从细胞植入后第4天时，开始每周测量两次肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=π/6 *长度*宽度2。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，在第50天时，当关于处理的相对于与未处理的比较肿瘤大小（T/C = 27.5%）时，抗体C的亲本抗PD-L1抗体和抗体C的亲本抗TIM-3抗体的组合使肿瘤生长减慢62.5%。抗体B的亲本抗PD-L1抗体和抗体B的亲本抗TIM-3抗体的组合减缓了肿瘤生长，具有T/C = 41.5%。在第50天时，与输注T细胞的第35天相比，抗体C处理引起肿瘤大小消退8.3%。因此，虽然HCC827模型中TIM-3抗体和PD-L1抗体的组合减缓了肿瘤生长，但抗体C导致肿瘤大小的消退。
2. 荷有L55肿瘤的人源化HSCTFL-NOG-F小鼠（NSCLC模型）中的抗体C
可以在L55人NSCLC异种移植模型中测试本发明抗体的功效，以评价通过增强对同种异体抗原的T细胞应答来延迟或破坏模型中的已建立肿瘤的能力。
来自Jackson Laboratories的雌性NOG小鼠植入有人CD34+造血干细胞。移植物植入后16周，通过流式细胞术，来确认小鼠外周血中huCD34+细胞和鼠CD34+细胞（mCD45）的存在。对于该研究，在第0天时，用L55片段皮下植入到HSCTFL-NOG-F小鼠的胁腹内。L55细胞在具有10%胎牛血清加上1 mM丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中培养，并且L55肿瘤在NSG小鼠上生长，以产生用于该研究的片段。动物在平均肿瘤体积为大约180 mm3随机分组。在第26天时起始处理，随后为在第33天和第40天时，所有抗体（Q7DX3）的每周一次施用。对于抗体C的亲本抗PD-L1抗体和抗体C的亲本抗TIM-3抗体的组合，每种抗体以10 mg/kg给药。对于双特异性抗体，抗体C以20 mg/kg给药。每周监测至少两次动物健康和行为，包括理毛行为和走动。每周测量两次体重和肿瘤体积。如在名称为：IM-Tumor GrowthMeasurement的SOP中所述，使用电子卡尺从细胞植入后第4天时，开始每周测量两次肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=π/6 *长度*宽度2。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，在第40天时，当关于处理的相对于与对照比较肿瘤大小（关于肿瘤体积的P=0.314）时，抗体C的亲本抗PD-L1抗体和抗体C的亲本抗TIM-3抗体的组合具有50%的T/C%。在第40天时，当关于处理的相对于与对照比较肿瘤大小（关于肿瘤体积的P=0.013）时，与两种亲本抗体的组合相比，抗体C处理延迟肿瘤生长，并且具有7%的T/C%。
3. 抗体C和培美曲塞在L55人NSCLC异种移植模型中的组合治疗
可以在L55人NSCLC异种移植模型中测试与培美曲塞组合的本发明抗体的功效，以评价通过增强对同种异体抗原的T细胞应答来延迟或破坏模型中的已建立肿瘤的能力。
在含有10%胎牛血清加上1mM丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中培养L55细胞。对于该研究，在第0天时，用在（50/50）基质胶：HBSS（0.2 ml总体积）中的5x106L55细胞皮下植入来自Jackson Laboratories（7周龄，雌性，以8只小鼠的组）的NSG小鼠的胁腹内。从单采血液成分术（apheresis）（BioSpec）分离大量人PBMC，并且在肿瘤达到~250mm3的第33天时，静脉内输注（0.2 ml PBS中的11 x106个PBMC细胞/小鼠）到荷有L55肿瘤的小鼠内。从第34天开始，用人IgG（20 mg/kg）、抗体C（20 mg/kg）、或与培美曲塞（50 mg/kg）组合的i.p.注射处理小鼠。培美曲塞每周进行5天，其间中断2天。抗体每周进行一次，共四周（在d34、d41、d48、d55时给药）。在第47天时，将第二批5M PBMC（与第一次输注相同的批次）注射到荷有L55肿瘤的小鼠内。每周监测至少两次动物健康和行为，包括理毛行为和走动。每周测量两次体重和肿瘤体积。如在名称为：IM-Tumor Growth Measurement的SOP中所述，使用电子卡尺从细胞植入后第4天时，开始每周测量两次肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=π/6 *长度*宽度2。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，抗体C本身或huIgG和培美曲塞的组合导致如该模型中Bliss Independence方法所定义的“无效”。在研究结束时，抗体C和培美曲塞的组合减缓了肿瘤生长，具有T/C = 48.9%。
在人PBMC中用板结合的抗体C的体外细胞因子释放研究
可以通过使用新鲜外周血单核细胞（PBMC）测量板结合测定中的细胞因子释放，来评价关于本发明的抗体引发细胞因子释放综合征的潜力。通过用抗体的治疗诱导的细胞因子释放综合征对于大多数患者是不期望的反应，并且用双特异性抗体的治疗可以提高风险。
使来自六个健康受试者的新鲜分离的PBMC与板结合的抗体C或对照抗体一起温育24小时，在0.1 μg至10 μg的宽滴定范围内。阳性对照是抗人CD3ε抗体、OKT3和CD28特异性超激动剂治疗性抗体TGN1412的同系物。这两种抗体均已知在临床中引起细胞因子风暴。阴性对照是效应子无效hIgG1（IgG1-EN）同种型抗体。总共2 x 105个细胞/孔（200 μL）一式三份加入抗体包被的板中，并且在37℃、5% CO2下温育24小时。温育后，将板以400 g离心5分钟；收集细胞培养上清液，并且在细胞因子测定前贮存于-80℃下。使用定制的5重测定MSD试剂盒（目录# K151A0H-2；Meso Scale Discovery），遵循制造商的说明书，在细胞培养上清液中测量五种细胞因子，包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，人PBMC与抗体C在宽浓度范围下的温育不导致IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的显著水平的细胞因子释放。相比之下，PBMC与抗CD3ε和TGN1412阳性对照抗体的温育导致在大多数供体中分析的所有五种细胞因子的强细胞因子产生。
可溶性抗体C在人全血中的体外细胞因子释放研究
还可以通过测量人全血中的本发明可溶性抗体的细胞因子释放，来评价本发明的抗体引发细胞因子释放综合征的潜力。
将来自10个健康供体的新鲜人全血样品与100 μg/mL的可溶性抗体C或对照抗体一起温育24小时。阳性对照包括抗人CD3ε抗体、OKT3和同系物抗人CD52（Campath）。OKT3和Campath已知在临床中引起‘细胞因子风暴’。阴性对照是临床上与细胞因子释放综合征无关的商购可得的治疗性抗体英利昔单抗和效应子无效（EN）hIgG1（IgG1-EN）同种型抗体。使用基于人血浆上清液中的Mesoscale平台的定制多重测定（目录# K15049D-1，Meso ScaleDiscovery），分析包括IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13和TNF-α的细胞因子的广泛实验对象组。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，人血液样品与Campath或OKT3的温育导致在所分析的几种细胞因子的所有供体中的强细胞因子释放，包括与CRS相关的细胞因子（IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-10）。相比之下，与抗体C或英利昔单抗的温育不在10个健康供体中触发任何显著的细胞因子释放。当与人全血以高达100 μg/ml的浓度温育高达24小时，抗体C不导致强细胞因子释放。
体外免疫原性测定
将本发明的抗体改造为异二聚体，其中每一半抗体结合不同的靶。由于异二聚体抗体的非天然组成，免疫原性是必须评价的潜在风险。
EpiScreen™ DC: T细胞测定用于确定抗体C的临床免疫原性的相对潜力。单核细胞衍生的树突状细胞由50个健康供体的群组的PBMC制备，装载有抗体C，并且诱导为成熟表型，以便将T细胞表位呈递给自体纯化的CD4+ T细胞。使用T细胞增殖（[3H]-胸苷摄取）和IL-2细胞因子分泌（ELISpot）测量T细胞应答。
具有一组已知生物制品（如英利昔单抗、阿达木单抗和贝伐珠单抗）的EpiScreen™时间过程T细胞测定，已显示EpiScreen™测定中的供体T细胞应答频率与在临床中观察到的免疫原性水平（抗蛋白质治疗性抗体应答）之间的明确相关性。在用于免疫原性抗体如阿仑珠单抗的EpiScreen™测定中已观察到高频供体应答，而对于非免疫原性抗体如奥马珠单抗和曲妥珠单抗观察到相对低频的供体应答。一般而言，在EpiScreen™测定中诱导小于或等于10%阳性应答的蛋白质治疗剂与临床中的低免疫原性风险相关。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，CD4+ T细胞应答的频率和量级的分析指示抗体C在供体群组的6-8%中诱导适度的阳性应答，并且因此显示临床免疫原性的低风险。
抗体C免疫效应子功能的体外分析
作为使用针对人PD-L1和人TIM-3的双特异性抗体在癌症中的潜在疗法，由抗体产生的免疫效应子功能是不期望的。抗体C被改造为缺乏免疫效应子功能。为了确认免疫效应子功能的缺失，在标准固相结合测定中测试抗体C与人Fc受体和C1q的结合，以及在标准的基于细胞的体外测定中测试抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）应答的诱导。
对于固相人Fcγ受体结合测定，在该测定中使用的重组Fcγ受体（FcγR）蛋白为FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa（V）。受体蛋白在PBS中稀释，并且包被（50 ng/孔）到Meso Scale板（MSD目录# L15XA-3）上。在4℃下的过夜温育后，将板用PBS/0.05% Tween-20（PBST）洗涤三次，并且在室温下用150 μL/孔在PBST中的5% MSD阻断剂A（MSD目录#R93BA-1）阻断1-2小时，然后将板用PBST洗涤三次，并且将30 μL在1% MSD阻断剂A中稀释的测试抗体或对照抗体（表3）加入每个孔中，并且允许温育2小时。温育后，将板用PBST洗涤两次，并且将30 μL二抗（MSD目录# D20TF-6）加入各孔中，并且允许在室温下伴随搅动温育1小时，然后用PBST洗涤板，并且将150 μL 1X Read Buffer（MSD目录# R92TC-1）加入每个孔中。然后在Sector Imager 2400上读取板。
对于C1q结合ELISA测定，用在PBS中浓度范围为200-0.0305 μg/mL的测试抗体和对照（利妥昔单抗-IgG1-效应子无效和另一种人IgG1-效应子无效抗体），包被96孔聚苯乙烯ELISA板（Thermo Scientific目录3855）。在4℃下的过夜温育后，将板用PBST洗涤三次，然后用300 μl酪蛋白缓冲液（Thermo Fisher目录# 37528）在室温下阻断2小时。将板用PBST洗涤3次，然后加入0.5 μg/孔的在酪蛋白阻断缓冲液中稀释的C1q（Quidel目录#A400）。在室温下2小时后，将板用PBST洗涤三次，并且向每个孔中加入50 μL二抗（1：200，Abd Serotec Inc #2221-5004P）。使板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤三次。然后将100 μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB：KPL目录#50-65-01/02）（HRP的底物）加入每个孔中，并且使板在室温下温育20分钟。使反应停止（KPL目录# 50-85-06），并且使用酶标仪在450 nM下测量吸光度。
对于ADCC测定，将PD-L1和TIM-3阳性靶细胞以及CD20阳性Wil2S细胞以10000个细胞/孔的密度接种到96孔平底板（Perkin Elmer，#600-5680）中的50 μL ADCC测定缓冲液（RPMI 1640中的0.5% BSA）中。使细胞温育30分钟（除非另有说明，否则与细胞的所有温育都在37℃和5% CO2下执行），随后为25 μL/孔在ADCC测定缓冲液中稀释的滴定测试抗体的加入。在与测试抗体的30分钟温育后，以15：1的比率（效应物：靶）加入25 μL效应细胞（具有NFAT-萤光素酶报道构建体的FcγRIIIa阳性Jurkat细胞），并且温育5-6小时。在与100 μLBright-Glo™萤光素酶底物（Promega，#G7940）的10分钟室温温育后，测量活化的效应细胞的萤光素酶活性。使用微量滴定板读数器定量发光，并且使用四参数模型分析数据，以确定关于每种抗体的EC50值。
对于ADCP测定，将PD-L1和TIM-3阳性靶细胞以及CD20阳性Wil2S细胞以10000个细胞/孔的密度接种到96孔平底板（Perkin Elmer，#600-5680）中的50 μL ADCP测定缓冲液（RPMI 1640中的0.5% BSA）中。使细胞温育30分钟（除非另有说明，否则与细胞的所有温育都在37℃和5% CO2下执行），随后为25 μL/孔在ADCP测定缓冲液中稀释的滴定测试抗体的加入。在与测试抗体的30分钟温育后，以6：1的比率（效应物：靶）加入25 μL效应细胞（具有NFAT-萤光素酶报道构建体的FcγRIIa阳性Jurkat细胞；Promega G9885），并且温育5-6小时。在与100 μL Bright-Glo™萤光素酶底物（Promega，#G7940）的10分钟室温温育后，测量活化的效应细胞的萤光素酶活性。使用微量滴定板读数器定量发光，并且使用四参数模型分析数据，以确定关于每种抗体的EC50值。
对于CDC测定，将粘附的靶细胞以25000个细胞/孔接种到96孔白色平底板（PerkinElmer，#600-5680）中的100 μL/孔的细胞生长培养基中。在过夜温育（除非另有说明，否则与细胞的所有温育都在37℃和5% CO2下执行）后，去除培养基，并且加入50 μl CDC测定缓冲液（RPMI 1640，具有0.1% BSA的10% FBS和25 mM HEPES）。悬浮细胞在测定当天以50,000个细胞/孔的密度接种到50 μL CDC测定缓冲液中。将测试和对照抗体一式两份加入板中，并且温育30分钟。温育后，然后将在5-mL测定缓冲液中稀释（1：5）的50 μL人补体（S1764；Sigma）加入每个孔中1小时。温育后，向每个孔中加入16 μL/孔的Alamar Blue试剂（Invitrogen，DAL1100）。使板温育22小时，然后从培养箱中取出，并且允许平衡至室温5分钟。在Synergy Neo2（激发：560 nm，发射：590 nm）上读取荧光，并且相对于由Triton X 100诱导的完全细胞裂解表达CDC细胞裂解。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，抗体C证实没有与任何测试的人Fc受体或C1q的特异性结合。此外，在基于细胞的ADC、ADCP或CDC测定中，使用对于抗体C的相关TIM-3和PD-L1阳性细胞系，不存在可检测的应答。这些结果证实抗体C在所执行测定的检测限内缺乏可检测的免疫效应子功能。
在猴中的药代动力学
可以使用ELISA测定中的血清药代动力学（PK）分析测试本发明的抗体在猴中的稳定性。
为了表征抗体C的血清PK，以三种不同的酶联免疫吸附测定（ELISA）形式分析血清样品。无论对TIM-3或PD-L1的结合能力如何，总免疫球蛋白（IgG）ELISA用于定量总IgG主链的存在。抗体C的标准曲线范围为125-8000 ng/mL，具有3000 ng/mL的定量上限（ULOQ）和300 ng/mL的定量下限（LLOQ）。另外，TIM-3抗原捕获ELISA和PD-L1抗原捕获ELISA用于定量血清中活性药物的存在。对于TIM-3抗原捕获ELISA，抗体C的测定范围为125-8000 ng/mL，具有3000 ng/mL的ULOQ和300 ng/mL的LLOQ。对于PD-L1抗原捕获ELISA，抗体C的标准曲线范围为125-8000 ng/mL，具有3000 ng/mL的定量上限（ULOQ）和300 ng/mL的定量下限（LLOQ）。
在基本上如该测定中所述执行的实验中，关于TIM-3和PD-L1的总IgG和功能性抗原捕获ELISA测定在所有剂量水平上定量相似，指示在体内随时间的抗体C中的稳定性和功能性结合能力的保留。
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Claims (18)
1.一种结合如SEQ ID NO: 1所示的人PD-L1和如SEQ ID NO: 2所示的人TIM-3的抗体，其包含：
a) 包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的第一重链HC，
b) 包含SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的第一轻链LC，
c) 包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的第二HC，
d) 包含SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的第二LC；
并且其中所述第一LC与所述第一HC形成链间二硫键，所述第二LC与所述第二HC形成链间二硫键，并且所述第一HC与所述第二HC形成两个链间二硫键，并且所述第一HC和所述第二HC是人IgG1同种型。
2.权利要求1的抗体，其中：
a) 第一HC包含SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列，和
b) 第二HC包含SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。
3.一种结合如SEQ ID NO: 1所示的人PD-L1和如SEQ ID NO: 2所示的人TIM-3的抗体，其包含两条轻链LC和两条重链HC，其中：
a) 第一LC具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，
b) 第一HC具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，
c) 第二LC具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，和
d) 第二HC具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
4.一种包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽，其中所述细胞能够表达权利要求3的抗体。
5.一种包含第一DNA分子和第二DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述第一DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的多肽，并且其中所述第二DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽，其中所述细胞能够表达权利要求3的抗体。
6.一种用于生产抗体的方法，其包括在使得抗体表达的条件下培养权利要求4或5的哺乳动物细胞，并且回收所表达的抗体。
7.一种结合如SEQ ID NO: 1所示的人PD-L1和如SEQ ID NO: 2所示的人TIM-3的抗体，其通过在使得抗体表达的条件下培养哺乳动物细胞，并且回收所表达的抗体来产生，所述哺乳动物细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽。
8.一种结合如SEQ ID NO: 1所示的人PD-L1和如SEQ ID NO: 2所示的人TIM-3的抗体，其通过在使得抗体表达的条件下培养哺乳动物细胞，并且回收所表达的抗体来产生，所述哺乳动物细胞包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述第一DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的多肽，并且其中第二DNA分子包含的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-3或7-8中任一项的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.权利要求1-3或7-8中任一项的抗体在制备治疗肺癌的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或间皮瘤。
12.权利要求1-3或7-8中任一项的抗体在制备治疗肝细胞癌的药物中的用途。
13.权利要求10-12中任一项的用途，其中所述药物进一步包含选自以下的一种或多种护理标准药物：顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾立布林、紫杉醇、用于注射用悬浮液的紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX、FOLFIRI、吉西他滨、托泊替康、脂质体伊立替康、培美曲塞和西妥昔单抗，其中权利要求1-3或7-8中任一项的抗体与所述护理标准药物同时、分开或序贯组合施用。
14.一种用于在癌症治疗中使用的药物组合物，其包含有效量的权利要求1-3或7-8中任一项的抗体。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述癌症是肺癌。
16.如权利要求14所述的组合物，其中所述癌症是肝细胞癌。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或间皮瘤。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其进一步包含选自以下的一种或多种护理标准药物：顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾立布林、紫杉醇、用于注射用悬浮液的紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX、FOLFIRI、吉西他滨、托泊替康、脂质体伊立替康、培美曲塞和西妥昔单抗，其中权利要求1-3或7-8中任一项的抗体与所述护理标准药物同时、分开或序贯组合施用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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