CN104024276A - Lsr抗体及其用于癌症治疗的用途 - Google Patents

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cancer
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carcinoma
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加迪·S·科约卡鲁
丽特·达萨
加利特·罗特曼
奥弗·莱维
安德鲁·波瓦
雪莉·萨米奇·格林沃尔德
朱里特·莱文
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Compugen Ltd
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Abstract

本发明涉及特异性针对LSR分子的抗体和抗原结合片段和包含这些抗体和抗原结合片段的轭合物，和/或替代支架，它们是用于特定癌症的免疫疗法和治疗的适当的药物。

Description

LSR抗体及其用于癌症治疗的用途
发明领域
本发明涉及用于癌症治疗的LSR(脂解激活脂蛋白受体)特异性抗体、抗体片段、轭合物以及包括这些抗体、抗体片段、轭合物的组合物。
发明背景
为了变得有成效地活化，原始T细胞必须接受来自抗原呈递细胞(APC)的两个独立信号。第一信号1是抗原特异性的，并且当T细胞抗原受体碰到APC上的适当的抗原-MHC复合物时发生。免疫应答的命运是由第二、抗原独立性信号(信号2)决定的，该信号被通过一种T细胞共刺激分子来递送，该T细胞共刺激分子接合其APC-表达性配体。这种第二信号可以是刺激的(正向共刺激)或抑制的(负向共刺激或共抑制)。在共刺激信号不存在的情况下，或在共抑制信号存在的情况下，T-细胞活化是受损的或中止的，这可以导致抗原特异性无反应性(称为T-细胞无反应性)的状态，或可以导致T-细胞凋亡性死亡。
共刺激分子对通常由APC上表达的配体和T细胞上表达的其同源受体组成。共刺激分子的原型配体/受体对是B7/CD28和CD40/CD40L。B7家族由结构上相关的细胞表面蛋白配体组成，这些细胞表面蛋白配体可以为免疫应答提供刺激性或抑制性输入。B7家族的成员是结构上相关的，其中细胞外结构域包含至少一个可变的或恒定的免疫球蛋白结构域。
正向和负向共刺激信号在细胞介导的免疫应答的调节中都发挥关键作用，并且已经证明介导这些信号的分子对于免疫调节是有效的靶标。基于这一知识，已经研发了若干种涉及共刺激分子的靶向的治疗途径，并且示出它们对于在癌症患者中通过开启或阻止免疫应答的关闭来预防和治疗癌症是有用的，并且对于自身免疫性疾病和炎性疾病连同同种异体移植的排斥的预防和治疗是有用的，每种都是通过在患有这些病理学病症的受试者中关闭不受控的免疫应答、或通过经由负向共刺激(或共抑制)来诱导“关闭信号”。
已经示出由B7配体递送的这些信号的处理在自身免疫、炎性疾病、以及移植排斥的治疗中是有潜力的。治疗策略包括使用针对一个共刺激对的配体或受体的单克隆抗体、或使用由可以结合并且阻断其适当配体的共刺激受体组成的可溶性融合蛋白来阻断共刺激。另一种途径是使用一种抑制性配体的可溶性融合蛋白来诱导共抑制。这些途径依赖，至少部分地依赖自体反应性T细胞或异体反应性T细胞(它们分别对自身免疫性疾病或移植中的致病过程负责)的最终缺失，大概因为在共刺激(诱导细胞存活基因)不存在的情况下，T细胞对凋亡的诱导变得高度易感。因此，能够调节共刺激信号而不使免疫***对抗病原体的能力降低的新颖试剂对于此类病理学病症的治疗和预防是高度有利的。
共刺激途径在肿瘤发展中发挥重要作用。有趣的是，已经显示出，肿瘤通过抑制在B7-CD28和TNF家族中的共刺激因子而阻抑T细胞激活、连同通过吸引对于抗癌T细胞应答进行抑制的调节T细胞而逃避免疫杀伤(见王(Wang)(2006)在癌症中出自肿瘤特异性CD4+调节T细胞的免疫抑制，《癌症生物学研究会》(Semin.Cancer.Biol.)16:73-79；格林沃尔德(Greenwald)，等人(2005)经重新审视的B7家族，《免疫学年度评论》(Ann.Rev.Immunol.)23:515-48；瓦茨(Watts)(2005)T细胞应答的共刺激中的TNF/TNFR家族成员，《免疫学年度评论》(Ann.Rev.Immunol.)23:23-68；萨杜姆(Sadum)，等人(2007)鼠类和人类癌症的免疫签名揭示肿瘤逃逸的独特机制和针对癌症免疫疗法的新靶点，临床癌症研究(Clin.Cane.Res.)13(13):4016-4025)。此类表达肿瘤的共刺激分子已经变为有吸引力的癌症生物标志物并且可以充当肿瘤相关抗原(TAA)。此外，已经鉴定共刺激途径为免疫学检验点，在起始水平和肿瘤转移酶内的效应子功能方面，这些免疫学检验点减弱T细胞依赖性免疫应答。随着工程化癌症疫苗持续改善，变得越来越清楚的是此类免疫学检验点是这些疫苗诱导治疗性抗肿瘤反应的能力的一个主要障碍。在那方面，共刺激分子可以充当用于主动(疫苗接种)和被动(抗体介导的)癌症免疫疗法的佐剂，来提供阻碍免疫耐受性并且刺激免疫***的策略。
此外，此类试剂在其他类型的癌症免疫疗法，例如过继性免疫治疗中可以是有用的，其中肿瘤特异性T细胞群体被扩大并且被引导以攻击并且杀死肿瘤细胞。能够增加此类抗肿瘤反应的试剂具有很大的治疗潜力，并且可以在克服肿瘤免疫疗法的障碍的尝试中是有价值的。最近，的确将调节若干共刺激途径的新颖试剂引入到了临床中来作为癌症免疫疗法。
使用针对不同共刺激蛋白的激动剂和/或拮抗剂来调节共刺激也已经作为治疗自身免疫性疾病、移植排斥、过敏症以及癌症的策略而被广泛地研究。这个领域已经由被批准用于RA的治疗的CTLA4-Ig(阿巴西普，奥瑞希纳)、用于预防急性肾脏移植排斥的突变的CTLA4-Ig(贝拉西普，)以及最近被批准用于黑色素瘤的治疗的抗-CTLA4抗体(易普利姆玛，)实现临床上首创。其他共刺激调节剂当前处于临床开发的高级阶段中，包括抗-PD-1抗体(BMS-936558)，该抗体处于针对治疗非小细胞肺癌和其他癌症的开发中。此外，此类药剂也处于针对病毒感染的临床开发中，例如抗PD-1Ab，MDX-1106，它正在进行针对丙型肝炎治疗的测试，以及抗CTLA-4Ab CP-675,206(曲美目单抗)，它处于在患有肝细胞癌的丙型肝炎病毒感染的患者中的一种临床试验中。
诱导性调节T细胞(iTreg)的积累常见于许多肿瘤中，并且形成了在肿瘤组织中的主要免疫抑制细胞子集。Treg创造一种免疫抑制性环境，并且调节抗肿瘤免疫，并且因此代表一种来自免疫监视的主要肿瘤耐受机制。iTreg因此被视为针对癌症疗法的重要细胞靶点。
除了它们在对效应T细胞应答进行抑制中的功能，多种免疫检验点受体，例如CTLA4和PD-1，以及其他像TIM3和LAG3之类，在iTreg的表面被高水平地表达，并且直接促进Treg细胞介导的对效应子免疫应答的抑制。作为一种增强抗肿瘤免疫的机制，在临床测试中，这些免疫检验点抗体中的许多种最有可能阻断iTreg的免疫抑制活性。确实，在通过易普利姆玛进行的CTLA4阻断的作用方式中的两种重要因子是效应T细胞活性的增强以及Treg免疫抑制活性的抑制。
单独使用或与常规治疗或免疫疗法联用的若干策略处于开发中，以便解除iTreg并且恢复效应T细胞的抗肿瘤功能。
B细胞在对外来抗原的识别中起关键作用，并且它们产生必要的抗体，以提供针对各种类型的感染因子的保护。T细胞辅助B细胞是获得性免疫应答的一个关键过程。滤泡辅助性T(Tfh)细胞是在B细胞辅助中特化的CD4+T细胞的一个子集(由克罗蒂(Crotty)，免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)29:621-663，2011综述)。Tfh细胞表达B细胞归巢趋化因子受体CXCR5，CXCR5驱使Tfh细胞以一种CXCL13-依赖性方式迁移至***中的B细胞卵泡中。B细胞辅助和T细胞依赖性抗体反应对Tfh细胞的需求表明这种细胞类型对于针对不同类型的感染因子的保护性免疫以及对于合理的疫苗设计是十分重要的。
发明简要概述
尽管有对癌症生物学和癌症治疗的理解的最新进展，癌症疗法的成功率仍然很低。因此，有一种针对以下新疗法的未满足的需求，这些新疗法能够成功地治疗癌症，例如像，特异性阻断抗体，这些特异性阻断抗体在刺激免疫***对抗肿瘤中具有一种治疗应用。
“阻断抗体”指的是结合至一种特定蛋白或一种蛋白上的一种特定表位、并且然后可任选地阻断那种蛋白与一种或多种其他结合伴侣的相互作用的任何抗体。
根据至少一些实施例，提供一种免疫分子，包括具有一种选自下组的氨基酸序列的一种抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO229，235，242-243，245-249，258，274-278，264-272，251-256，280，287，284，285，290-292，287，288，259，295，297-302，306-307，其中这些抗原结合区适应于特异性结合至一种具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白。
可任选地，该免疫分子包括SEQ ID NO227、228或229中的至少一种，以及SEQ ID NO233、234或235中的至少一种；或可替代地，SEQ IDNO245、246、247、248或249中的至少一种，以及SEQ ID NO:239、240、241、252、256、287、288、242或243中的至少一种；或可替代地，SEQID NO303、304、261、306或262中的至少一种，以及SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258或259中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO274、275、276、277或278中的至少一种，以及SEQ ID NO:264、265、266、267、268、269、270、271或272中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO274、275、276、277或282中的至少一种，以及SEQ ID NO:264、265、266、267、268、269、280、271或272中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO303、304、305、306或307中的至少一种，以及SEQ ID NO:239、240、241、252、256、287、288、284或285中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO290、291、305、306或292中的至少一种，以及SEQ ID NO:251、252、253、254、256、287、288、258或259中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO303、304、305、306或307中的至少一种，以及SEQ ID NO:294、295、296、297、298、299、300、301或302中的至少一种。可任选地，该免疫分子进一步包括SEQ ID NO:227-229、239-243、251-299、264-272、280、284-285、287-288、293-301或302中的至少一种以及SEQ ID NO233-235、245-249、261-262、274-278、282、290-292、303-306或307中的至少一种。
可任选地，该免疫分子是处于一种抗体片段的形式。
可任选地，该免疫分子包括至少两种具有选自下组的氨基酸序列的抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO239-243、245-249、251-259、261-262、264-272、274-278、280-281、282、284-285、287-288、290-292、294-307。
可任选地，该免疫分子包括至少一种具有一种选自下组的氨基酸序列的抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO227、228、229、245、246、247、248、249、261、262、274、275、276、277、278、282、303、304、305、306、307、290、291以及292。
可任选地，该免疫分子包括至少一种具有一种选自下组的氨基酸序列的抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO233、234、235、239、240、241、287、288、242、243、251、252、253、254、255、256、257、258、259、264、265、266、267、268、269、270、271、272、280、294、295、296、297、298、299、300、301、302、284、285、287、288、258以及259。
可任选地，该免疫分子包括具有SEQ ID NO:220、244、260、273、281、289、308中的任一项的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白。
可任选地，该免疫分子包括具有SEQ ID NO:218、238、250、263、279、283、286、293中的任一项的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白。
可任选地，该免疫分子包括具有SEQ ID NO:220的和SEQ ID NO:218的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:244的和SEQ ID NO:238的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:260的和SEQ ID NO:259的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:273的和SEQ ID NO:263的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:281的和SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:308的和SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:289的和SEQ ID NO:286的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:308的和SEQ ID NO:293的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO245或246中的一种；SEQ ID NO247或248中的一种；SEQ ID NO:249；SEQID NO239、240、241或252中的一种；SEQ ID NO256、287、288中的一种；以及SEQ ID NO242或243中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO303或304中的一种；SEQ ID NO261或306中的一种；SEQ ID NO:262；SEQID NO251、252、253或254中的一种；SEQ ID NO255、256或257中的一种；以及SEQ ID NO258或259中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO274或275中的一种；SEQ ID NO:276或277中的一种；SEQ ID NO:278；SEQID NO:264、265、266或267中的一种；SEQ ID NO:268、269或270中的一种；以及SEQ ID NO:271或272中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO274或275中的一种；SEQ ID NO:276或277中的一种；SEQ ID NO:282；SEQID NO:264、265、266、267中的一种；SEQ ID NO:268、269或280中的一种；以及SEQ ID NO:271或272中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO:303或304中的一种；SEQ ID NO:305或306中的一种；SEQ ID NO:307；SEQID NO:239、240、241或252中的一种；SEQ ID NO:256、287或288中的一种；以及SEQ ID NO:284或285中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO:290或291中的一种；SEQ ID NO:305或306中的一种；SEQ ID NO:292；SEQID NO:251、252、253或254中的一种；SEQ ID NO:256、287或288中的一种；以及SEQ ID NO:258或259中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO:303或304中的一种；SEQ ID NO:305或306中的一种；SEQ ID NO:307；SEQID NO:294、295、296或297中的一种；SEQ ID NO:298、299或300中的一种；以及SEQ ID NO:301或302中的一种。
根据至少一些实施例，提供了对如在此所述的该免疫分子进行编码的一种多核苷酸。
可任选地，该多核苷酸包括一种选自下组的核酸序列，该组由以下各项组成：SEQ NO224、225、226、230、231、232、217和219，以及它们的简并变体。
根据至少一些实施例，提供了包括如在此所述的该多核苷酸的一种载体。
根据至少一些实施例，提供了一种重组细胞，该重组细胞包括在此所述的该载体，能够表达如在此所述的该免疫分子。
根据至少一些实施例，提供了一种用于产生如在此所述的该免疫分子的方法，包括将该载体引入一种细胞中，以形成一种重组细胞；并且通过该重组细胞产生该免疫分子。
根据至少一些实施例，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有特异性结合至SEQ ID NO10的氨基酸30-110上、并且不会特异性结合至SEQ ID NO10的任何其他部分上的一种抗原结合区，其中所述SEQID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-29或氨基酸111至234。
可任选地，所述抗体具有特异性结合至SEQ ID NO215或SEQ ID NO216上、并且不会特异性结合至SEQ ID NO10的任何其他部分上的一种抗原结合区，其中对SEQ ID NO215来说，所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-80或氨基酸99至234，或其中对SEQ IDNO216来说，所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-117或氨基酸136至234。
可任选地，该抗体是一种完全人类抗体、嵌合抗体、人源化或灵长化抗体。
可任选地，该抗体选自下组，该组由以下各项组成：Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单位。
可任选地，该抗体被偶联至一种选自以下的治疗剂：药物、放射性核素、荧光团、酶、毒素、治疗剂、或化学治疗剂；并且其中可检测的标志物是放射性同位素、金属螫合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
根据至少一些实施例，提供了一种药物组合物，该药物组合物包括如在此所述的该免疫分子、抗体或该抗原结合片段。
根据至少一些实施例，提供了如在此所述的该免疫分子、抗体、抗体结合片段或药物组合物用于在一名对其有需要的受试者中治疗一种疾病的用途，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症、免疫病症或一种感染性疾病。
可任选地，所述抗体或片段对免疫细胞的活性进行调节、使T细胞的激活增加、使T细胞的抑制缓解、使免疫抑制性细胞因子的分泌减少、使促炎性细胞因子的分泌增加、使IL-2的分泌增加；使出自T细胞的干扰素-γ的产生增加、对癌抗原表位的扩散进行促进、使一种哺乳动物中的T细胞应答增加、使M2巨噬细胞减少或消除、使M2巨噬细胞的促致瘤活性降低、使抗原特异性记忆应答增强、使癌细胞的凋亡增强、使对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制效应增强、使对癌细胞的直接杀伤增强，对补体依赖性细胞毒作用和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用进行诱导。
可任选地，所述抗体或片段提高了针对该癌症的免疫应答。
可任选地，将该治疗与另一种用于治疗癌症的治疗剂或疗法相联合。
可任选地，该疗法包括放射疗法、冷冻疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术、激素剥夺或使用常规药物的联合疗法中的一种或多种。
可任选地，该治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、小分子、化学治疗剂、细胞毒性和细胞抑制剂、免疫调节剂、干扰素、白细胞介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、以及蛋白酶体抑制剂。
可任选地，将如在此所述的该免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物与一种或多种增效剂联合、同时或依次对一名受试者进行给药以获得一种治疗效果，其中所述一种或多种增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的常规/经典抗癌疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、治疗性癌症疫苗、过继细胞转移。
可任选地，该常规/经典抗癌剂选自：铂基化合物、具有抗癌活性的抗生素、蒽环类、蒽二酮、烷化剂、抗代谢物、抗有丝***剂、紫杉烷、紫杉烷类二萜、微管抑制剂、长春花碱、叶酸拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、抗***、抗雄激素、芳香酶抑制剂、GnRh类似物、5α-还原酶抑制剂、二膦酸盐。
可任选地，该靶向疗法药剂选自下组，该组由以下各项组成：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、mTOR途径抑制剂、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、PI3K抑制剂、蛋白激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、细胞内信号转导的抑制剂、Ras/Raf信号转导的抑制剂、MEK抑制剂、AKT抑制剂、存活信号转导蛋白的抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、治疗性单克隆抗体、TRAIL途径激动剂、抗血管生成剂、金属蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂、免疫轭合物、抗体药物轭合物、抗体片段、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
可任选地，该抗体疗法选自：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、阿仑单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳妥珠单抗(onartuzumab)、阿波单抗(apomab)、玛帕图木单抗(mapatumumab)、来沙木单抗、西他土珠单抗、替加珠单抗、卡妥索单抗、布李纳图木单抗(blinatumomab)、替伊莫单抗屈昔坦(ibritumomab triuxetan)、托西莫单抗、布伦土昔单抗威多廷(brentuximab vedotin)、吉妥珠单抗奥佐米星、克利维妥珠单抗四昔坦(clivatuzumab tetraxetan)、佩姆图木单抗(pemtumomab)、曲妥珠单抗埃姆坦西尼(emtansine)、贝伐单抗、伊瑞西珠、伏洛昔单抗、雷姆齐鲁单抗(ramucirumab)、阿柏西普。
可任选地，该靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自：抗有丝***药、环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、沙利度胺、沙利度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体而直接靶向Treg的耗减(depleting)或杀伤抗体，抗CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体定向毒素(ligand-directed toxin)、地尼白介素(Ontak)-一种人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的一种融合物、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径(adenosinergic pathway)的药剂、胞外核苷酸酶抑制剂、或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式维甲酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、西地那非、ROS抑制剂以及硝基阿司匹林(nitroaspirin)。
可任选地，该免疫刺激性抗体选自：靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一种或多种的拮抗性抗体，和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一种或多种的激动性抗体。
可任选地，该治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗，这些外源性癌症疫苗包括用于对一种肿瘤抗原发起一种免疫原性应答的蛋白或肽，编码肿瘤抗原的重组病毒或细菌载体，编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗，被靶向至树突细胞的蛋白，基于树突细胞的疫苗，全肿瘤细胞疫苗，表达GM-CSF、ICOS和/或Flt3-配体的经基因修饰的肿瘤细胞，溶瘤病毒疫苗。
可任选地，该细胞因子疗法选自以下细胞因子中的一种或多种，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNα-2b、IFNβ、IFNγ，以及它们针对递送的不同策略。
可任选地，该过继细胞转移疗法在离体治疗之后实施，该离体治疗选自患者自体的天然存在的肿瘤特异性T细胞的扩增或T细胞的遗传修饰以赋予针对肿瘤抗原的特异性。
根据至少一些实施例，提供了如在此所述的一种抗体或免疫分子或一种药物组合物的一种用途，以在一名受试者中进行以下项中的一种或多种以治疗一种疾病：(a)使细胞因子上调，(b)使T细胞增殖和/或扩增提高，(c)使出自T细胞的干扰素-γ的产生增加(d)使IL-2分泌增加(e)刺激抗体应答；(f)对癌细胞生长进行抑制，(g)促进抗原特异性T细胞免疫，(g)促进CD4+和/或CD8+T细胞激活，(i)对T细胞抑制进行缓解，(i)对癌细胞的凋亡或裂解进行缓解，(k)对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制效应。
根据至少一些实施例，提供了一种用于在一名受试者中对一种疾病进行诊断的诊断方法，其中该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症或一种自身免疫性疾病，其中该诊断方法是离体进行的，包括使来自该受试者的一种组织样品与如在此所述的该免疫分子或抗体进行离体接触，并且对与其特异性的结合进行检测。
根据至少至少一些实施例，提供了一种用于在一名受试者中对一种疾病进行诊断的诊断方法，其中该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症、自身免疫性疾病或一种感染性疾病，其中该诊断方法是在体内进行的，包括向该受试者给予如在此所述的该免疫分子或抗体，并且对如在此所述的该免疫分子或抗体与该受试者的一种组织的特异性结合进行检测。
可任选地，该诊断方法是在向该受试者给予该免疫分子或抗体或药物组合物之前进行的。
可任选地，该用途或方法进一步包括在向该受试者给予该免疫分子或抗体或药物组合物之前，确定该受试者的一种组织中的LSR水平。
可任选地，仅当所述LSR水平足够时，进行所述的将该免疫分子或抗体或药物组合物对该受试者进行给药。
可任选地，该用途或方法进一步包括根据所述LSR的表达水平确定所述LSR水平。
可任选地，所述的确定所述表达水平包括对该受试者的一种组织应用一种IHC(免疫组织化学)测定或一种基因表达测定。
可任选地，所述的应用所述IHC测定包括确定在一种0至3的级别体系上一种表达水平是否至少是1。
可任选地，所述组织包括癌细胞或免疫渗液。
可任选地，所述在所述组织中确定所述LSR水平包括使该组织与如在此所述的该抗体或免疫分子接触，并且对与其特异性的结合进行检测。
根据至少一些实施例，提供了一种用于在一种取自一名受试者的组织样品中对一种疾病进行诊断的测定，包括如在此所述的该免疫分子或抗体，以及用于对一种疾病进行诊断的至少一种试剂，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病。
根据至少一些实施例，提供了如在此所述的用于以下项的用途：筛选一种疾病，检测一种疾病的存在或严重性，提供一种疾病的预后，监测疾病的进展或复发，连同对一种疾病、失调或病症的疗效和/或复发的评估，连同为一种疾病选择一种疗法和/或一种治疗，一种给定的疾病疗法的优化，监测一种疾病的治疗，和/或预测一种针对特定患者或亚群的疗法的适合性或确定一种治疗产品在患者或亚群中的适当配量。
可任选地，所述癌症、所述渗入肿瘤的免疫细胞、或两者都表达一种足够水平的LSR，并且其中所述癌症选自下组，该组由以下各项组成：乳腺癌、***、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、***癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、骨髓性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、皮肤的良性瘤、角化棘皮瘤、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、滤泡树突细胞癌、肠癌、肌肉浸润性癌、精囊肿瘤、表皮癌、脾癌、膀胱癌、头颈癌、胃癌、肝癌、骨癌、脑癌、视网膜癌、胆道癌、小肠癌、唾液腺癌、子宫癌、睾丸癌、***癌、***肥大、脊髓发育不良、瓦尔登斯特巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、鼻咽癌、神经内分泌癌、骨髓增生异常综合征、间皮瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、良性肿瘤、食管癌、输卵管癌、腹膜癌、***状浆液性勒氏癌、恶性腹水、胃肠道间质瘤(GIST)、李弗劳明综合征以及希佩尔-林道综合征(VHL)；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
可任选地，所述癌症选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、乳腺小叶癌、乳腺粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化至低分化型腺癌、升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、结肠浸润性腺癌、直肠腺癌、直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、肺中分化至低分化型鳞状细胞癌、肺中高分化型角化型鳞状细胞癌、肺大细胞腺癌、***腺癌格利森(Gleason)分级7至9级、***浸润性腺癌、***中分化型腺癌、卵巢浆液性***状囊性癌、卵巢浆液性囊腺癌、4级星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、以及低级别肝细胞癌；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
可任选地，所述乳腺癌选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌。
可任选地，所述乳腺癌是硬腺癌。
可任选地，所述结肠癌选自下组，该组由以下各项组成：盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌、优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、以及直肠中分化型粘液腺癌。
可任选地，所述肺癌选自下组，该组由以下各项组成：高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌、优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌以及小细胞肺癌。
可任选地，所述***癌选自下组，该组由以下各项组成：腺癌格利森分级5-9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、以及未分化癌。
可任选地，所述胃癌是中分化型胃腺癌。
可任选地，所述卵巢癌选自下组，该组由以下各项组成：浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、以及浸润性浆液性***状癌。
可任选地，所述脑癌选自下组，该组由以下各项组成：多形性成胶质细胞瘤以及除星形细胞瘤2级以外的星形细胞瘤。
可任选地，所述星形细胞瘤是4级星形细胞瘤。
可任选地，所述肾癌是透明细胞性肾细胞癌。
可任选地，肝癌是肝细胞癌。
可任选地，所述肝细胞癌是低级别肝细胞癌或纤维板层型肝细胞癌。
可任选地，所述血液癌选自下组，该组由以下各项组成：大细胞淋巴瘤以及高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤。
可任选地，所述疾病是免疫病症，并且其中所述免疫病症选自下组，该组由以下各项组成：自身免疫性疾病、移植排斥、以及移植物抗宿主疾病。
可任选地，所述自身免疫性疾病选自下组，该组由以下各项组成：其中该自身免疫性疾病选自下组，该组由以下各项组成：多发性硬化症，银屑病；类风湿性关节炎；银屑病关节炎，***性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞脉管炎，血小板减少性紫癜，自发性血小板减少，自发性自身免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生失调，修格兰氏综合征，风湿性疾病，***疾病，炎症性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿关节炎，痛风性关节炎(arthritis uratica)，肌肉性风湿病，慢性多关节炎，冷球蛋白血症性脉管炎(cryoglobulinemicvasculitis)，ANCA-关联性脉管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征，慢性免疫多神经病，自身免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森病，膜性肾小球性肾病，古德帕斯丘病(Goodpasture's disease)，自身免疫性胃炎，自身免疫性萎缩性胃炎，恶性贫血，天疱疮，寻常型天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多肌炎，纤维肌炎，肌硬化，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，过敏性紫癜，埃文斯综合征(Evans syndrome)，异位性皮炎，银屑病，关节病性银屑病(psoriasis arthropathica)，格雷夫斯氏病，格雷夫斯氏眼病，硬皮病，***性硬皮病，进行性***性硬皮病，哮喘，过敏症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自身免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病，显微镜下多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克病(Devic's disease)，儿童自身免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自身免疫性血细胞减少，在获得性A型血友病中阻止自身免疫性抗VIII因子抗体的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵人综合征，牙龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及炎性皮肤失调，正常补体血症性荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，贝凯特综合征，PAPA综合征，布劳综合征，痛风，成年和少年斯蒂尔氏病(adult and juvenile Still'sdisease)，冷吡呤病(cryropyrinopathy)，穆克勒-威尔斯综合征(Muckle-Wellssyndrome)，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多***炎性疾病，家族性地中海热，慢性小儿神经***、皮肤和关节综合征，***性幼年自发性关节炎，超IgD综合征(Hyper IgD syndrome)，施尼茨勒综合征(Schnitzler's syndrome)，自身免疫性视网膜病，年龄相关性黄斑变性，动脉硬化，慢性***炎以及TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPS)。
可任选地，将该治疗与另一种用于治疗免疫相关病症的部分相联合。
可任选地，所述疾病是感染性疾病，并且其中所述感染性疾病选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染和/或其他寄生物感染所导致的疾病。
可任选地，该感染性疾病选自乙型肝炎、丙型肝炎、感染性单核细胞增多症、EBV、巨细胞病毒、AIDS、HIV-1、HIV-2、结核病、疟疾以及血吸虫病。
可任选地，将该治疗与另一种用于治疗感染性疾病的部分相联合。
根据至少一些实施例，提供了特异性结合至SEQ ID NO:10的一种抗体或一种片段对患有一种疾病的一名受试者进行治疗或诊断的用途，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、硬腺癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌、优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌、优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、小细胞肺癌、腺癌格利森分级5至9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、未分化癌、中分化型胃癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、浸润性浆液性***状癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、星形细胞瘤4级、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、低级别肝细胞癌、纤维板层型肝细胞癌、大细胞淋巴瘤、以及高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
根据至少一些实施例，提供了一种药物组合物，包括特异性结合至SEQID NO:10的一种抗体或一种片段，以对患有一种疾病的一名受试者进行治疗，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、硬腺癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌、优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌、优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、小细胞肺癌、腺癌格利森分级5至9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、未分化癌、中分化型胃癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、浸润性浆液性***状癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、星形细胞瘤4级、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、低级别肝细胞癌、纤维板层型肝细胞癌、大细胞淋巴瘤、以及高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
可任选地，该癌症选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、乳腺小叶癌、乳腺粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化至低分化型腺癌、升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌：中分化型、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、腺癌格利森分级7至9级、浸润性腺癌、中分化型腺癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、4级星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、以及低级别肝细胞癌；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
可任选地，将该治疗与另一种用于治疗癌症的治疗剂或疗法相联合。
可任选地，该疗法包括放射疗法、冷冻疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术、激素剥夺或使用常规药物的联合疗法中的一种或多种。
可任选地，该治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、小分子、化学治疗剂、细胞毒性和细胞抑制剂、免疫调节剂、干扰素、白细胞介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、以及蛋白酶体抑制剂。
可任选地，将该抗体或组合物与一种或多种增效剂联合、同时或依次对一名受试者进行给药以获得一种治疗效果，其中所述一种或多种增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的常规/经典抗癌疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、过继细胞转移。
可任选地，该常规/经典抗癌剂选自：铂基化合物、具有抗癌活性的抗生素、蒽环类、蒽二酮、烷化剂、抗代谢物、抗有丝***剂、紫杉烷、紫杉烷类二萜、微管抑制剂、长春花碱、叶酸拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、抗***、抗雄激素、芳香酶抑制剂、GnRh类似物、5α-还原酶抑制剂、二膦酸盐。
可任选地，该靶向疗法药剂选自下组，该组由以下各项组成：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、mTOR途径抑制剂、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、PI3K抑制剂、蛋白激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、细胞内信号转导的抑制剂、Ras/Raf信号转导的抑制剂、MEK抑制剂、AKT抑制剂、存活信号转导蛋白的抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、治疗性单克隆抗体、TRAIL途径激动剂、抗血管生成剂、金属蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂、免疫轭合物、抗体药物轭合物、抗体片段、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
可任选地，该抗体选自：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、阿仑单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳妥珠单抗、阿波单抗、玛帕图木单抗、来沙木单抗、西他土珠单抗、替加珠单抗、卡妥索单抗、布李纳图木单抗、替伊莫单抗屈昔坦、托西莫单抗、布伦土昔单抗威多廷、吉妥珠单抗奥佐米星、克利维妥珠单抗四昔坦、佩姆图木单抗、曲妥珠单抗埃姆坦西尼、贝伐单抗、伊瑞西珠、伏洛昔单抗、雷姆齐鲁单抗、阿柏西普。
可任选地，该靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自：抗有丝***药、环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、沙利度胺、沙利度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体而直接靶向Treg的耗减(depleting)或杀伤抗体，抗CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体定向毒素(ligand-directed toxin)、地尼白介素(Ontak)-一种人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的一种融合物、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径(adenosinergic pathway)的药剂、胞外核苷酸酶抑制剂、或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式维甲酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、西地那非、ROS抑制剂以及硝基阿司匹林(nitroaspirin)。
可任选地，该免疫刺激性抗体选自：靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一种或多种的拮抗性抗体，和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一种或多种的激动性抗体。
可任选地，该治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗，这些外源性癌症疫苗包括用于对一种肿瘤抗原发起一种免疫原性应答的蛋白或肽，编码肿瘤抗原的重组病毒或细菌载体，编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗，被靶向至基于树突细胞的疫苗的蛋白，全肿瘤细胞疫苗，表达GM-CSF、ICOS和/或Flt3-配体的经基因修饰的肿瘤细胞，溶瘤病毒疫苗。
可任选地，该细胞因子疗法选自以下细胞因子中的一种或多种，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNα-2b、IFNβ、IFNγ，以及它们针对递送的不同策略。
可任选地，该过继细胞转移疗法在离体治疗之后实施，该离体治疗选自患者自体的天然存在的肿瘤特异性T细胞的扩增或T细胞的遗传修饰以赋予针对肿瘤抗原的特异性。
根据至少一些实施例，提供了一种用于确定是否将如在此所述的该用途进行实施或是否将如在此所述的该组合物进行给药的诊断方法，包括如在此所述的实施该诊断方法。
可任选地，该癌症是非转移性的。
可任选地，该癌症是浸润性的。
可任选地，该癌症是转移性的。
附图简要说明
图1展示了对在稳定转染的重组HEK293T细胞中LSR_P5a_标签_m蛋白(SEQ ID:144)的表达的蛋白质印迹分析，用抗标签(西格玛(Sigma)cat#A8592)(图1A)和如下抗LSR抗体进行检测：亚诺法(Abnova)，cat#H00051599-B01P(图1B)、艾碧康(Abcam)，cat ab59646(图1C)以及西格玛cat#HPA007270(图1D)。泳道1:HEK293T_pIRESpuro3；泳道2：HEK293T_pIRESpuro3_LSR_P5a_标签。
图2呈现了用3种不同的针对LSR的商业Ab对人LSR_WT进行的检测:2A指的是西格玛Ab，而2B指的是艾碧康Ab，并且2C指的是亚诺法Ab(如在表1中所详细说明的)。泳道#1表示被用作一种阴性对照的经HEK293T_pIRESpuro3空载体转染的细胞，而泳道#2表示经HEK293T_pIRESpuro3_人WT LSR_标签转染的细胞。
图3呈现了使用艾碧康Ab对人LSR_skip4蛋白进行的检测。泳道#1表示被用作一种阴性对照的经HEK293T_pIRESpuro3空载体转染的细胞，而泳道#2表示经HEK293T_pIRESpuro3_人LSR skip4_标签转染的细胞。
图4呈现了对在经HEK293T_pIRESpuro3_cyno WT LSR_标签转染的细胞中的cyno LSR_WT蛋白(泳道2)和在经HEK293T_pIRESpuro3_cynoskip4LSR_标签转染的细胞中的LSR_skip4蛋白(泳道3)进行的检测，两者都与经空载体HEK293T_pIRESpuro3转染的细胞的裂解物(泳道1)相比较。该检测是使用抗LSR抗体(艾碧康1:4000)完成的。
图5呈现了在用pcDNA3.1_小鼠WT LSR_标签转染的CHO-K1细胞中(泳道2)以及在用pcDNA3.1_小鼠WT LSR_标签转染的HEK293细胞中(泳道4)通过抗标签Ab对小鼠LSR_WT蛋白进行的检测，与经相应的空载体转染的细胞的裂解物(分别为泳道1和3)相比较。
图6展示了在不同细胞系中的LSR的内源表达。在以下的细胞提取物中用抗LSR抗体检测到了对应于LSR的72kDa的一个条带：(1)Caov3，(2)ES2，(3)OV-90，(4)OVCAR3，(5)SK-OV3，(6)TOV112D，(7)CaCo2，(8)海拉细胞，(9)Hep G2，(10)MCF-7，(11)SkBR3以及(12)293T_LSR_P5a_标签(图3A)。抗GAPDH(艾碧康cat#ab9484)充当一种上样对照(图3B)。
图7显示了与乱序的siRNA(赛默科学Cat#D-001810-01-05)(泳道1)相比较，在用LSR特异性siRNA(赛默科学(Thermo Scientific)Cat#M-009672-00-0005)(泳道2)对用pIRESpuro3_人WT LSR_标签稳定转染的HEK293T细胞进行转染之后，对人WT LSR-标签蛋白的异位表达的一种特异性敲低，该特异性敲低通过与人WT LSR-标签蛋白相对应的～70kDa条带的信号强度的急剧下降所展示。
图8展示了LSR_P5a_标签_m的亚细胞定位。LSR_P5a_标签_m(SEQID NO:144)主要定位于细胞的细胞质，但是也能够在细胞表面被检测到，如用抗标签(西格玛cat#A9594)(图8A)和如下抗LSR抗体进行的检测：艾碧康，cat ab59646(图8B)，亚诺法，cat#H00051599-B01P(图8C)以及西格玛cat#HPA007270(图8D)。
图9呈现了对在人LSR WT HEK293T经转染的细胞中的人LSR_WT蛋白(SEQ ID NO:11)的亚细胞定位进行展示的共聚焦显微镜图像。
图10呈现了对在cyno LSR_WT HEK293T经转染的细胞中的cynoLSR_WT蛋白(SEQ ID NO:211)的亚细胞定位进行展示的共聚焦显微镜图像。
图11呈现了对在经小鼠LSR_WT转染的HEK293细胞中的小鼠LSR_WT蛋白(SEQ ID NO:31)的亚细胞定位进行展示的共聚焦显微镜图像。
图12呈现了对在HEK293T经转染的细胞中的cyno LSR skip4蛋白(SEQ ID NO:212)的亚细胞定位进行展示的共聚焦显微镜图像。
图13呈现了对在经小鼠LSR_WT转染的CHO-K1细胞中的小鼠LSR_WT蛋白(SEQ ID NO:31)的亚细胞定位进行展示的共聚焦显微镜图像。
图9A、10A、11A、12A和13A呈现了使用抗标签抗体(西格玛cat#A9594)的LSR蛋白定位。在图9C(艾碧康，cat ab59646)以及图9B、10B、11B、12B和13B(西格玛cat#HPA007270)中呈现了使用抗LSR抗体的LSR蛋白定位。图9-13中的图A-1、B-1和C-1表示被用作一种阴性对照的经空载体转染的细胞的结果。箭头指示了膜染色。图9-13中的图A-2、B-2和C-2呈现了在表达LSR蛋白的重组细胞中人、cyno和小鼠LSR_WT蛋白的亚细胞定位的结果。
图14呈现了不同浓度(1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml和10ug/ml)的8C8mAb与稳定表达人WT LSR蛋白(SEQ ID NO:11)、cyno WT LSR蛋白(SEQ ID NO:211)、小鼠WT LSR蛋白(SEQ ID NO:31)、人Skip4LSR变体(SEQ ID NO:13)以及cyno Skip4LSR变体(SEQ ID NO:212)的细胞的结合的结果。
图15展示了在不同细胞系中LSR蛋白(对应于～70kDa条带)的内源表达，详细说明如下。泳道1和14表示阳性对照细胞，对应于用pIRESpuro3_人WT LSR_标签稳定转染的HEK293T细胞。泳道2对应于SKBR3；泳道3对应于MCF7，泳道4对应于HepG2，泳道5对应于海拉细胞，泳道6对应于CaCO2，泳道7对应于TOV112D，泳道8对应于SKOV3，泳道9对应于OvCar3，泳道10对应于OV-90，泳道11对应于ES2，泳道12对应于CaOV3，泳道13对应于HEK293T_pIRESpuro3阴性对照，泳道15对应于HepG2，泳道16对应于HepG2C3A，泳道17对应于Hep3B，泳道18对应于SNU182，泳道19对应于SkHep1，泳道20对应于PLC/PRF5，泳道21对应于张氏肝，泳道22对应于HT29细胞系。
图16呈现了对内源性LSR(SEQ ID NO:11)蛋白表达的一种特异性敲低进行展示的蛋白质印迹结果。
图17展示了在用LSR特异性siRNA(赛默科学Cat#M-009672-00-0005)进行瞬时转染之后，HT29(图17A)和HepG2/C3A(图17B)细胞的FACS分析结果。
图18显示了该8C8抗体的重链(图18A)和轻链(图18B)的DNA序列和氨基酸序列。该前导序列以斜体字体显示；CDR1、CDR2、CDR3的序列以粗体显示。恒定区FR1、FR2、FR3和FR4以一种常规字体显示。
图19描述了在pH9.0抗原修复(X60)之后，LSR阳性细胞的切片。画面A显示了使用以2ìg/ml应用的LSR抗体进行孵育的这些载玻片。画面B显示了这些相邻的“无一抗的”经孵育的切片。阳性LSR免疫反应性见于画面A中，表明有效的抗体工作条件。该相邻的无一抗的切片(画面B)没有显示出明显的免疫反应性。
图20展示了与小鼠IgG2a Fc(SEQ ID NO:221)融合的小鼠LSR ECD(以2g/50l/孔)与经抗CD3/CD28或Con A激活的鼠类T细胞的结合测定结果。SEQ ID NO:223对应于被用作阳性对照的蛋白。
图21显示了2ug、3ug、4ug或5ug的与小鼠IgG2a Fc(SEQ ID NO:221)融合的经生物素标记的小鼠LSR-ECD或5ug经生物素标记的对照mIgG2a与卡尔帕斯(KARPAS)-299细胞的结合。图23A呈现了对中位数荧光强度(MFI)进行显示的直方图。图23B呈现了与小鼠IgG2a Fc(SEQID NO:221)融合的LSR-ECD与卡尔帕斯(Karpas)-299细胞的剂量依赖性结合。Y轴表示与小鼠IgG2a Fc(SEQ ID NO:221)融合的小鼠LSR-ECD相比于对照-mIgG2a在不同蛋白浓度下的MFI比值。
图22呈现了在三次独立实验重复(实验1、实验2和实验3)中在这些不同的刺激条件下所评估的INOS(它是一种原型M1标志物)的mRNA水平。轴Y表示mRNA表达的绝对值。轴X表示如在实例12中所详细说明的这些不同的刺激条件(IFNg、LPS、IFNg+LPS、IL4、TGFb、PGE2、TSNT(肿瘤上清液))。NS表示未经刺激的。
图23呈现了在三次独立实验重复(实验1、实验2和实验3)中在这些不同的刺激条件下所评估的诱导性ALOX15(它是一种原型M2标志物)的mRNA水平，轴Y表示mRNA表达的绝对值。轴X表示如在实例12中所详细说明的这些不同的刺激条件(IFNg、LPS、IFNg+LPS、IL4、TGFb、PGE2、TSNT(肿瘤上清液))。NS表示未经刺激的。
图24呈现了在三次独立实验重复(实验1、实验2和实验3)中在这些不同的刺激条件下所评估的LSR的mRNA水平，轴Y表示mRNA表达的绝对值。轴X表示如在实例12中所详细说明的这些不同的刺激条件(IFNg、LPS、IFNg+LPS、IL4、TGFb、PGE2、TSNT(肿瘤上清液))。NS表示未经刺激的。使用小鼠LSR Taqman探针(应用生物***(AppliedBiosystems；cat#:Mm00660290_m1)对LSR的mRNA水平进行检测。
图25呈现了抗LSR人IgG1抗体展示出针对表达LSR的HEK293的CDC活性。在补体的存在下，将表达cyno LSR(Cyno LSR Hek)或GFP(GFP MT Hek)的HEK293细胞系用针对LSR的抗体或同种型对照hIgG1(ET901)或mIgG2a(Mopc173)进行孵育，并且在1hr之后测量活力，以评价％CDC活性。图26呈现了在异位表达LSR的HEK293细胞上的抗LSR抗体的FACS染色。
图26A呈现了抗LSR小鼠IgG2a单克隆抗体8C8的结合，图26B、C、D、E、F、G、H分别表示抗LSR人IgG1单克隆抗体S32-03.G11、S11-01.E02、S11-01.F08、S11-04.C11、S11-04.D11、S11-04.H07、S11-04.H09的结合。这些曲线图显示了这些不同的抗体与表达cyno LSR的HEK293细胞(“cyno”，圆)或用空载体转染的HEK293细胞(“MT”，方块)的结合的MFI值。该Ig同种型对照(huIgG1)与两种类型的细胞的结合以三角形显示。
图27显示了在HEK-293T细胞上表达的LSR抑制了尤尔卡特(Jurkat)细胞的激活。
图28显示了与表达CD20的HEK-293T细胞相反，表达LSR的HEK-293T细胞抑制了用抗CD3激活的尤尔卡特细胞。
发明详细说明
本发明在至少一些实施例中涉及多克隆和单克隆抗体以及它们的片段和/或轭合物，和/或包括上述事物的药物组合物，和/或包括上述事物的诊断组合物，其中这些抗体特异性地结合LSR蛋白，并且其中所述抗体适应于用作治疗剂和/或诊断剂，特别是用于对如在此所述的特定癌症进行治疗和/或诊断，特别是人、人源化或嵌合单克隆抗体，包括对由LSR所引起的活性进行促进或抑制的那些。
不希望受一种封闭的列表或受单个假说的限制，根据本发明的不同实施例的一种抗体可以可任选地具有以下性质中的一种或多种。此类中和抗体可以可任选地促进Th2至Th1的转换，从而潜在地恢复朝向在肿瘤微环境中所诱导的一种Th2/M2环境的转换，该Th2/M2环境降低了对该肿瘤的免疫应答。该抗体因此可以可任选地促进对抗该肿瘤的免疫***组分(Th1)，同时抑制促进该癌症的组分(Th2)。该抗体可以促进或抑制由LSR所引起的活性(包括涉及对免疫共刺激，例如B7相关性共刺激，进行调节的活性)，增加T细胞的激活和细胞因子的分泌，或/和诱导对癌细胞的直接杀伤。
根据本发明的至少一些实施例，这样一种抗体可以可任选地抑制iTreg的积累和免疫抑制性功能，和/或增强效应T细胞的活性。
如在此所使用的术语“癌”应当被理解为涵盖任一肿瘤性疾病(不论是浸润性的或转移性的)，该肿瘤性疾病的特征在于导致恶性生长或肿瘤的异常的和不受控制的细胞***，该肿瘤性疾病的非限制性实例在此进行了说明。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或包括特定的结构特征，例如至少一种包括特定氨基酸序列的CDR区。根据至少一些实施例，本发明提供了根据本发明的至少一些实施例的分离的抗体，制作此类抗体的方法，包括此类抗体的免疫轭合物和双特异性分子以及包含这些抗体、免疫轭合物、替代支架或双特异性分子的药物组合物和诊断组合物。
根据至少一些实施例，本发明涉及使用这些抗体以及它们的片段来对LSR蛋白中的任一种进行检测的体外和体内方法。
根据至少一些实施例，本发明进一步涉及使用这些前述抗体和片段和/或它们的轭合物和/或包括上述事物的药物组合物和/或诊断组合物来治疗和/或诊断癌症的方法，如在此所述。
LSR是一种在肝中的多聚蛋白复合物，它在与游离脂肪酸结合时会发生构象变化，从而暴露出对apoB和apoE两者进行识别的一个或多个结合位点。在小鼠中，LSR基因的完全失活是胚胎致死性的。单个LSR等位基因的去除(LSR-/+)导致了血浆甘油三酯和胆固醇两者的水平在统计学上的显著提高。已经在人、大鼠和小鼠中对LSR的生物学进行了彻底的研究。LSR主要在肝细胞膜中表达，并且已最阐明的功能是在游离脂肪酸的激活之后介导乳糜微粒的清除。然而，既然LSR也在其他组织中表达，可能存在其他功能。在像卵巢癌和膀胱癌之类的肿瘤组织中已经显示出了LSR的表达，在这些肿瘤组织中LSR是被鉴定为一种潜在肿瘤标志物的三十种基因中的一种。在上皮细胞中敲低LSR时，紧密接合处的形成会受到影响，并且上皮屏障功能会减弱。(《BMC医学遗传学》(BMC Med Genomics.)2008；1:31.糖尿病.2009年5月；58(5):1040-1049，《细胞科学杂志》(J CellSci)，2011年2月15日，124,548-555)。
LSR蛋白被披露于PCT申请号：PCT/IB2012/051868中，它与本申请被共同拥有，通过引用结合于此，好像在此进行了完全阐述。本申请展示了与小鼠IgG2a融合的小鼠LSR分子的ECD序列抑制了小鼠T细胞的激活(由抗CD3和抗CD28所诱导)、细胞因子的分泌。该融合蛋白改善了多发性硬化症小鼠模型(EAE模型)中的疾病症状，表明LSR在免疫调节中具有一种重要作用。PCT/IB2012/051868说明了被潜在用作治疗剂和/或诊断剂(在体外和体内诊断方法中)的LSR抗体。尤其包括了免疫激活或免疫抑制的抗体和片段，例如经由ADCC(抗体依赖性细胞毒作用)或CDC(补体依赖性细胞毒作用)活性靶向细胞的抗体或片段，特别是用于治疗其中对该LSR抗原进行表达的病症，包括癌症，和/或在感染性失调，和/或免疫相关失调中。
如在此所使用的，术语LSR指SEQ ID NO:10-18、21、22、31、32、47-50、62-69、143、211-212、237中的任一种中所阐述的这些蛋白中的任一种，和/或对应于LSR IGV结构域(选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:95、102中的任一种)的氨基酸序列，和/或对应于SEQ ID NO:18、和/或它的变体、和/或它的直系同源物和/或片段的独特边缘的这些氨基酸序列，和/或对上述事物进行编码的核酸序列(它们差异表达于癌症中、于癌细胞上或于渗入肿瘤的免疫细胞中)。
在WO2005019258；WO2005016962；WO2010105298中LSR蛋白被列出于许多其他蛋白中间，用于免疫相关疾病的诊断和治疗。
在美国专利申请号：US20070054268中，LSR蛋白被列出于许多其他蛋白中间，这些蛋白被建议用于诊断卵巢癌和/或生存的可能性，或疾病的复发。
在美国专利申请号：US20070154889中，LSR蛋白被列出于许多用于鉴定一种黑色素瘤的其他蛋白中间，用于将一种恶性的黑色素细胞与良性的黑色素细胞区别开。
在PCT申请号：WO06133923中，LSR蛋白被列出于许多用于对乳腺癌进行诊断、预后和预测的其他蛋白中间。
在PCT申请号：WO06138275中，LSR蛋白被列出于许多在干细胞基因标签(gene signature)之内的、用于在癌症的诊断和管理中使用的其他蛋白中间。
美国专利号：US7919091、US6635431和US7291709以及其他相关专利家族成员披露了LSR蛋白和LSR特异性抗体，特别是用于治疗肥胖症和其他代谢失调。
美国专利申请号：20120064100披露了在若干用于治疗与免疫***的调节T(Treg)细胞介导的抑制相关联的一种病症或用于调节免疫应答的其他蛋白中间的LSR蛋白。
然而，以上所参考的专利和/或专利申请没有教导或提示或提供任何以下激励，该激励将指导一名熟练技术人员使用包括如在此所述的这些特异性CDR中的一种或多种的抗体，这些抗体特异性结合至具有选自下组的氨基酸序列的一种或多种多肽，该组由以下各项组成：SEQ ID NO215和216，并且不会特异性结合至SEQ ID NO10的任何其他部分，其中对SEQID NO215来说，所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-80或氨基酸99至234，或其中对SEQ ID NO216来说，所述SEQID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-117或氨基酸136至234，或SEQ ID NO10的氨基酸30-110，并且不会特异性结合至SEQ ID NO10的其他部分，其中所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-29或氨基酸111至234。
此外，以上所参考的专利和/或专利申请没有教导或提示或提供任何以下激励，该激励将指导一名熟练技术人员使用如在此所述的对用于癌症的治疗和/或诊断的LSR ECD是特异性的抗体。此类用于癌症的治疗和/或诊断的抗体的效用的实例在下面给出。
此外，以上所参考的专利和/或专利申请没有教导或提示或提供任何以下激励，该激励将指导一名熟练技术人员使用如在此所述的对用于免疫相关失调的治疗和/或诊断的LSR ECD是特异性的抗体。不希望以任何方式受到限制，所预期的是，这些抗体具有对免疫细胞的细胞毒性活性，包括抗体依赖性或补体依赖性细胞毒作用活性，导致它们的耗尽，引起该免疫疾病的改善。此外，仍然不希望以任何方式受到限制，所预期的是，这些抗体可以增强LSR对T细胞激活的抑制效应，导致免疫细胞应答的抑制和该免疫疾病的改善。
此外，以上所参考的专利和/或专利申请没有教导或提示或提供任何以下激励，该激励将指导一名熟练技术人员使用如在此所述的对用于感染性疾病的治疗和/或诊断的LSR ECD是特异性的抗体。不希望以任何方式受到限制，所预期的是，作为一种“感染”包括由外来抗原的持续存在所引起的一种失调、疾病和/或病症，导致减弱的针对该外来抗原的免疫应答，这些抗体在激活免疫***以对该感染因子进行攻击中将是有效的。此类减弱的免疫应答特征在于受损的功能性，该受损的功能性可以表现为T细胞耗竭、细胞增殖和细胞因子产生的降低，并且可以通过使用如在此所述的抗体对抑制途径进行阻断而逆转。
如在此所使用的，术语“抗体”可以可任选地指以下项中的任一种(并且还可任选地，以下项的组合)：单克隆和/或多克隆抗体和抗原结合片段和/或替代支架和/或轭合物和/或免疫轭合物。
根据至少一些实施例，本发明提供了如在此所述的抗体和片段，可任选地并且优选地，其中该抗体结合至具有1×10-8M的KD或以下的人LSR，并且其中该抗体展现出以下性质中的至少一种：对B7相关性共刺激进行调节、使T细胞的激活增加、使T细胞的抑制缓解、使细胞因子的分泌提高、使IL-2的分泌提高；使出自T细胞的干扰素-γ的产生增加、使Th1应答提高、使Th2应答降低、使M2巨噬细胞减少或消除、使M2巨噬细胞的促致瘤活性降低、对癌抗原表位的扩散进行促进、使对T细胞激活的抑制降低、使一种哺乳动物中的T细胞应答提高、对抗原特异性记忆应答进行刺激、引起癌细胞的凋亡或裂解、刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制效应、诱导对癌细胞的直接杀伤、对补体依赖性细胞毒作用和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用进行诱导。
可任选地，所述抗体或片段提高了针对该癌症的免疫应答。
可任选地，所述抗体或片段降低了调节T淋巴细胞(T-reg)的活性。
可任选地，所述抗体或片段抑制了iTreg分化。
根据至少一些实施例，本发明提供了前述抗体和它们的片段，其中该抗体是一种嵌合的、人源化的、完全人类抗体和/或是一种具有对靶细胞的CDC或ADCC活性的抗体或抗体片段。
尤其包括了免疫激活或免疫抑制的抗体和片段，例如经由ADCC(抗体依赖性细胞毒作用)或CDC(补体依赖性细胞毒作用)活性靶向细胞的抗体或片段。
根据至少一些实施例，本发明提供了阻断抗体，该阻断抗体特异性结合选自下组的LSR蛋白中的任一种，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10-18、21、22、31、32、47-50、62-69、143、211-212中的任一种，和/或对应于其胞外结构域的氨基酸序列，选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12、14、47-50中的任一种，和/或其片段和/或抗原表位，可以可任选地并且优选地单用或与一种或多种增效剂联用而被特异性应用于癌症免疫疗法，这使内源性抗肿瘤应答提高。
此外，出人意料地，已经发现，一种抗体，特异性结合选自下组的LSR蛋白中的任一种，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10-18、21、22、31、32、47-50、62-69、95、102、143、211-212中的任一种，和/或它们相应的胞外结构域(选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12、14、47-50中的任一种)，和/或其片段和/或抗原表位，可以可任选地并且优选地被特异性应用于特定癌症的治疗，针对这些特定癌症这样一种抗体展示出了特别的疗效。在此还提供了与一种药学上可接受的载体相结合的、包括这样一种抗体的药物组合物。
此外，出人意料地，已经发现，所述抗体在特定癌症中展示出了特别的疗效，这些特定癌症包括在其中LSR表达于恶性细胞、渗入肿瘤的免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、髓样来源抑制细胞、肥大细胞)和/或间质肿瘤细胞上的癌症。在以上所列出的这些细胞中的任一种上的LSR表达可能在按护理剂标准的治疗之前存在，或在治疗之后被诱导。
此外，出人意料地，已经发现，使用以上LSR抗体用于治疗以下项中的任一项或多项，能够获得改善的结果：
·乳腺癌，优选导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌中的任一种，优选硬腺癌；
·结肠直肠癌，优选盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌中的任一种，优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌；
·肺癌，优选高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌中的任一种，优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、小细胞肺癌；
·***癌，优选腺癌格利森分级5-9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、未分化癌中的任一种；
·胃癌，优选中分化型胃腺癌；
·卵巢癌，优选浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、浸润性浆液性***状癌中的任一种；
·脑癌，优选星形细胞瘤中的任一种，优选4级星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤；
·肾癌，优选透明细胞性肾细胞癌；
·肝癌，优选肝细胞癌中的任一种，优选低级别肝细胞癌、纤维板层型肝细胞癌；
·血液癌，优选大细胞淋巴瘤、高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤中的任一种。
应当指出的是，出人意料地并且与记录的技术相反，以下癌症亚型，何杰金氏淋巴瘤、卵巢颗粒细胞瘤以及星形细胞瘤2级，被发现频繁地(如果不是典型地的话)不能表达足够水平的LSR，并且因此患有这些亚型的患者不太可能从用抗LSR抗体的治疗中获益。
甚至更加出人意料地，发现的是，导管腺癌、浸润性导管癌、乳腺小叶癌、乳腺粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化至低分化型腺癌、升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌：中分化型、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、腺癌格利森分级7至9级、浸润性腺癌、中分化型腺癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、4级星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、以及低级别肝细胞癌，特别易受用抗LSR抗体的治疗的影响，因为在这些癌细胞上发现显著高水平的LSR表达。
根据至少一些实施例，对以上所述的癌症中的任一种来说，可任选地，以上所说明的癌症类型或亚型中的每一种可以可任选地形成一个单独的实施例，和/或可以可任选地组合为多个实施例或子实施例。
根据至少一些实施例，对以上所说明的癌症中的任一种来说，提供了如在此所述的治疗的方法，还有这些抗体和药物组合物的用途，其中该癌症在癌细胞上或在渗入肿瘤的免疫细胞中表达LSR多肽(这些LSR多肽被包括于SEQ ID NO:10-18、21、22、31、32、47-50、62-69、95、102、143、211-212中)，和/或他们对应的胞外结构域(选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12、14、47-50中的任一种)，和/或片段(例如像SEQ IDNO:237)，和/或其抗原表位。
如在此所使用的，当术语“其抗原表位”出现时，它可以可任选地并且非限制地指如实施于SEQ ID NO:215、216和/或SEQ ID NO237中的抗原表位。
可任选地，这些抗体可以被用于如在此所述的癌症的治疗。可任选地，所述癌症、所述免疫渗液或两者都表达足够水平的LSR，并且所述癌症是如在此所述的。免疫渗液指的是渗入肿瘤或渗入癌性细胞区域的免疫细胞。“表达足够水平的LSR”指的是根据一种测定，此类细胞表达足够高水平的LSR蛋白。例如，如果该测定是IHC(免疫组织化学)，并且在一种0至3的级别体系上对表达进行测量(0-无表达，1-淡淡的染色，2-中度表达，以及3-强表达)，那么一种足够水平的LSR表达将可任选地至少是1，优选至少是2，并且更加优选至少是3。可任选地，如在此所述的这些抗体或免疫分子可以被用于这样一种测定。
更加优选地，该抗体结合至对应的具有3X10-8M的KD或以下、或具有1X10-9M的KD或以下、或具有0.1.X10-9M的KD或以下、或具有0.05.X10-9M的KD或以下或具有1X10-9M的KD与1X10-11M的KD之间的人LSR抗原。
另外，优选地，这些抗体和/或轭合物在引起选择性杀伤此类癌细胞并且对调节自身免疫和癌症中涉及的免疫应答中是有效的。
用于评估这些抗体对LSR的结合能力的标准测定在本领域是已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹以及RIA。适宜的测定在实例中被详细说明。这些抗体的结合动力学(例如，结合亲和性)也可通过本领域中已知的标准测定来评估，例如通过Biacore分析来评估。
在产生抗-LSR抗体时，来自抗体的序列可以与LSR结合，VH和VL序列可以被“混合并且匹配”以产生其他根据本发明的至少一些实施例的抗-LSR结合分子。此类“混合并且匹配”的抗体的LSR结合可以使用以上所说明的这些结合测定(例如ELISA)来测试。优选地，当VH和VL链混合并且匹配时，来自一个具体VH/VL配对的VH序列被一个结构类似的VH序列所替代。同样，优选地，来自一个具体VH/VL配对的VL序列被一个结构类似的VL序列所替代。例如，同源抗体的VH和VL序列尤其顺从于混合和匹配。
可任选地，该抗体包括选自下组的CDR氨基酸序列，该组由以下各项组成：(a)如在此所列出的序列；(b)通过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多保守氨基酸取代(除了在重链CDR3中100A位(卡巴特编号***)的丝氨酸残基)而与(a)中所指定的那些CDR氨基酸序列不同的序列；(c)与(a)或(b)中所指定的这些序列有90％或更大、95％或更大、98％或更大、或99％或更大的序列一致性的氨基酸序列；(d)一种具有以下一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列由具有编码如在此所列出的这些氨基酸的一种核酸序列的多核苷酸所编码。
可任选地，对在此所述的任一抗体或片段来说，该抗体可以是双特异性的，这指的是该Ig分子的一条臂对与如在此所述的该靶蛋白或抗原表位的结合来说是特异性的，并且该Ig分子的另一条臂具有一种不同的特异性，该不同的特异性能够使该抗体或片段的生物学活性增强或重定向。在此方面，一种多特异性抗体也被认为至少是双特异性的。从是多价的意义上说，该抗体或片段还可以是多特异性的。
根据至少一些实施例，本发明涉及具有类似于特异性抗体的范围的特异性和亲和性的蛋白支架。根据至少一些实施例，本发明涉及一种抗原结合构建体，这种抗原结合构建体包括一种被连接至一个或多个抗原表位结合结构域的蛋白支架。此类工程化蛋白支架通常是通过设计一个聚焦于环区或另外的可允许表面区域的随机突变库并且通过经由噬菌体展示或相关技术针对给定的靶标对变体进行选择来获得的。根据至少一些实施例，本发明涉及替代支架，包括，但不局限于：抗体模拟物(anticalin)、DARPin、犰狳重复序列蛋白(Armadillo repeat proteins)、蛋白A、脂质运载蛋白、纤维连接蛋白结构域、锚蛋白共有序列重复结构域(ankyrin consensusrepeat domain)、硫氧还蛋白、化学约束肽(chemically constrained peptides)等。根据至少一些实施例，本发明涉及用作如在此所列举的癌症的治疗连同用于体内诊断学的治疗剂的替代支架。
根据至少一些实施例，提供了一种在一名受试者中进行以下项中的一种或多种的方法：
(a)使细胞因子上调，(b)使T细胞增殖和/或扩增提高，(c)使出自T细胞的干扰素-γ的产生增加(d)使IL-2分泌增加(e)刺激抗体应答；(f)对癌细胞生长进行抑制，(g)促进抗原特异性T细胞免疫，(g)促进CD4+和/或CD8+T细胞激活，(i)对T细胞抑制进行缓解，(i)对癌细胞的凋亡或裂解进行缓解，(k)对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制效应，
包括将如在此所述的一种抗体或免疫分子或如在此所述的一种药物组合物对该受试者进行给药。
为了在不同实施例中使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐述。
如在此所使用的，术语“分离的”是指一种处于不同于它天然发生的环境中的感兴趣的化合物(例如多核苷酸或多肽)，例如分离自其天然的环境，例如通过将一种肽浓缩成一种在自然界中未发现的浓缩物。“分离的”包括在以下样品之内的化合物，这些样品针对该感兴趣的化合物进行了相当地富集，和/或在这些样品中该感兴趣的化合物进行了部分地或相当地纯化。
一种“免疫细胞”是指任何来自造血源的细胞，包括但不局限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、以及巨噬细胞。
如在此所使用的，术语“多肽”是指一个任意长度的氨基酸链，无论是否被修饰(例如，磷酸化或糖基化)。
如在此所使用的，一种“共刺激多肽”或“共刺激分子”是一种在与T细胞上的细胞表面分子相互作用时便调节T细胞应答的多肽。
如在此所使用的，“共刺激信号”是在抗原特异性T细胞应答过程中，来源于抗原递呈细胞上的共刺激多肽与T细胞上的其受体之间的相互作用的信号活性。不希望受单一假设的限制，该抗原特异性T细胞应答被认为由两种信号所介导：1)T细胞受体(TCR)与在MHC的情况中所呈现的抗原肽的衔接(信号1)；以及2)通过不同共刺激受体/配体对之间的接触所传递的一种第二抗原独立性信号(信号2)。不希望受单一假设限制，此“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化vs抑制)以及该应答的强度和持续时间中是关键的，并且此“第二信号”由来自共刺激分子(例如B7蛋白家族)的正信号和负信号两者调节。
如在此所使用的，术语“B7”多肽是指共刺激T细胞的B7蛋白家族的一个成员，包括但不局限于：B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3以及其生物活性的片段和/或变体。代表性生物活性片段包括共刺激T细胞的胞外结构域或胞外结构域片段。
如在此所使用的，与相对应的野生型多肽的氨基酸序列相比，一种“变体”多肽包含至少一个氨基酸序列改变。
如在此所使用的，“保守的”氨基酸取代是其中取代的氨基酸具有类似结构特性或化学特性的取代。如在此所使用的，术语“宿主细胞”是指可以向其中引入一种重组载体的原核细胞和真核细胞。
如在此所使用的，术语“边缘部分”或“新接合处”是指根据本发明所述的一种剪接变体的两个部分之间的一种连接，这两个部分在野生型或已知蛋白中没有被接合。例如，一种边缘可以可任选地由于以上的一种变体的“已知蛋白”部分和尾之间的接合而产生，和/或如果野生型序列的内部部分不再存在时可以发生，如此以致在已知蛋白中为非连续的序列的两个部分现在在剪接变体中是连续的。一种“桥接”可以可任选地为以上所说明的一种边缘部分，但还可以包括一种变体的头和“已知蛋白”部分之间的一种接合，或一种变体的尾和“已知蛋白”部分之间的一种接合，或一种变体的***部分和“已知蛋白”部分之间的一种接合。
在一些实施例中，一种变体的头或尾或独特的***部分和“已知蛋白”部分之间的一种桥接，包括至少约10个氨基酸，或在一些实施例中至少约20个氨基酸，或在一些实施例中至少约30个氨基酸，或在一些实施例中至少约40个氨基酸，其中至少一个氨基酸来自一种变体的该尾/头/***部分且至少一个氨基酸来自该“已知蛋白”部分。在一些实施例中，该桥接可包括从大约10个到大约40个氨基酸的任何数目(例如，长度为10、11、12、13……37、38、39、40个氨基酸，或其间的任何数目)的氨基酸。
应该指出的是一种桥接在任何方向上不能延长超过序列的长度，且应假定每个桥接说明以桥接长度不延长超过序列本身的方式来解读。
此外，在以下某些情况下，依照一种滑动窗口(sliding window)来说明桥接。例如，这些桥接的某些说明按以下格式为特征：两个边缘之间的一种桥接(其中已知蛋白的一个部分在变体中不存在)可以可任选地说明如下：该蛋白的一个桥接部分，包括一个具有长度“n”的多肽，其中n至少长约10个氨基酸，可任选地是至少长约20个氨基酸、至少长约30个氨基酸、至少长约40个氨基酸、或至少长约50个氨基酸，其中至少两个氨基酸包括XX(位于该桥接中心的2个氨基酸，来自该边缘的每个末端的各有一个)，具有如下一种结构(根据该蛋白的序列进行编号)：起始于氨基酸编号49-x至49中的任一个(例如)并且终止于氨基酸编号50+((n-2)-x)中的任一个(例如)的一种序列，其中x从0至n-2变化。在本实例中，还应该被解读为包括以下桥接，在这些桥接中n为10-50个氨基酸长度之间的任何氨基酸数目。此外，该桥接多肽不能延长超过该序列，因此应该解读为使得49-x(例如)不小于1，而50+((n-2)-x)(例如)不大于总序列长度。
如在此所使用的，术语“疫苗”是指一种生物制品，该生物制品改善对一种特定疾病的免疫，其中该疫苗包括癌抗原，针对该癌抗原会引起免疫应答。一种疫苗典型地包括一种作为免疫增强剂来刺激免疫***的佐剂。如在此所使用的，术语“治疗性疫苗”和/或“治疗性疫苗接种”是指一种用于治疗癌症的疫苗。
如在此所使用的，术语“佐剂”是指一种用于刺激免疫***并且增加对一种疫苗的应答、而本身不具有任何特异性抗原作用的试剂。
如在此所使用的，术语“免疫学的”(immunologic、immunological)或“免疫”应答是直接针对受者患者中的肽的有益的体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答的发展。这种应答可为通过免疫原的给药来诱导的主动应答或通过抗体或致敏T-细胞的给药来诱导的被动应答。不希望受单一假设限制，通过结合II类或I类MHC分子来呈递多肽抗原表位以便分别激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞，来引起一种细胞免疫应答。该应答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的激活、嗜中性粒细胞或先天性免疫的其他组分的激活或募集。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对于免疫原的保护或治疗效果的相对贡献可通过单独地将抗体以及T-细胞从免疫接种的同系动物中分离并且测量在第二受试者中的保护或治疗效果来区分。
一种“免疫原性试剂”或“免疫原”能够在给药至哺乳动物时诱导针对其自身的一种免疫应答，可任选地与一种佐剂相结合。
如在此所指的术语“抗体”包括完整的多克隆和单克隆抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。一种“抗体”指包括由二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链由至少一个重链可变区(在此缩写为VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2以及CH3。每个轻链由至少一个轻链可变区(在此缩写为VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区可以被进一步细分为散布有更保守区(被命名为构架区(FR))的高变异度区(被命名为互补性决定区(CDR))。每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与一种抗原相互作用的一种结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，包括免疫***的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补***统的第一组分(Clq)。
如在此所使用的，术语一种抗体的“抗原结合部分”(或简单地，“抗体部分”)是指保留了特异性结合一种抗原(例如，LSR分子，和/或其片段)的能力的一种抗体的一个或多个片段。已经示出一种抗体的抗原结合功能可以由一种全长抗体的片段来执行。涵盖在术语一种抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，一个由V轻、V重、恒定轻(CL)以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab').2片段，一个在铰链区包括由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由一种抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，(1989)《自然》(Nature)341:544-546)，由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是它们可以使用重组方法经由一个合成接头来连接，其中这个合成接头使它们能够被制备为一个单一的蛋白链，其中VL和VH区组成一对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，伯德(Bird)等人(1988)《科学》(Science)242:423-426；以及休斯顿(Huston)等人(1988)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语一种抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域普通技术人员所知的常规技术来获得的，并且以和完整抗体相同的方式针对效用对这些片段进行筛选。
如在此所使用的，一种“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的一种抗体(例如，分别特异性结合LSR蛋白和/或其片段的、并且基本上不含特异性结合除了LSR之外的抗原的抗体的一种分离的抗体)。然而，特异性结合LSR蛋白的一种分离的抗体可以分别对其他抗原(例如来自其他物种的LSR分子)具有交叉反应性。并且，一种分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
如在此所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的一种制剂。一种单克隆抗体组合物对一种特定抗原表位显示单一的结合特异性和亲和性。
如在此所使用的，术语“人类抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区两者都来源于人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体包含一个恒定区，那么该恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。根据本发明的至少一些实施例，人类抗体可包括不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或定点诱变引入的突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如在此所使用的术语“人类抗体”并非旨在包括以下抗体，在这些抗体中来源于另一个哺乳动物物种(例如一只小鼠)的种系的CDR序列已经被移植于人类构架区序列上。
术语“人类单克隆抗体”是指具有以下可变区、展示出单一结合特异性的抗体，在这些可变区中构架区和CDR区两者都来源于人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施例中，这些人类单克隆抗体是由一种杂交瘤产生的，该杂交瘤包括从一种转基因非人类动物(例如一只转基因小鼠)获得的一种B细胞，该转基因非人类动物具有融合至一种无限增殖化细胞的包括人类重链转基因和轻链转基因的基因组。
如在此所使用的，术语“重组人类抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从人类免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体(以下进一步描述)，(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞中(例如，从转染瘤中)分离的抗体，(c)从重组的、组合的人类抗体库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有以下可变区，在这些可变区中构架区和CDR区来源于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，可将此类重组人类抗体经受体外诱变(或者，当使用人类Ig序列的转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，因此这些重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人类种系VH和VL序列并与之相关的、但可能并非天然存在于体内的人类抗体种系谱中的序列。
如在此所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因所编码的抗体种类(例如，IgM或IgGl)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
如在此所使用的，“与人类LSR蛋白特异性结合的”一种抗体旨在指与LSR蛋白、优选一种具有5X10-8M的KD或以下的、更加优选3X10-8M的KD或以下的、甚至更加优选1X10-9M的KD或以下的、甚至更加优选1X10-10M的KD、甚至更加优选1X10-11M的KD并且甚至更加优选1X10-12M的KD或以下的LSR蛋白结合的一种抗体。
如在此所使用的，术语“K-assoc”或“Ka”旨在指一个具体抗体-抗原相互作用的缔合速率；而如在此所使用的，术语“Kdiss”或“Kd”旨在指一个具体抗体-抗原相互作用的离解速率。如在此所使用的，术语“KD”旨在指解离常数，其是从Kd比Ka的比率(即Kd/Ka)获得的并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域已建立的方法来确定。用于确定一种抗体的KD的一个优选方法是通过使用表面等离振子共振，优选使用一种生物传感器***，例如***。
如在此所使用的，术语对一种IgG抗体来说的“高亲和性”指一种针对一种靶抗原具有10-8M的KD或以下的、更加优选10-9M的KD或以下的并且甚至更加优选10-10M的KD或以下的抗体。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和性”结合可以是不同的。例如，对一种IgM同种型来说的“高亲和性”结合指一种具有10-7M的KD或以下的、更加优选10-8M的KD或以下的抗体。
如在此所使用的，术语“受试者”或“患者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施例中，本发明的一种抗体包括一个来自一种具体种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或一个来自一种具体种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
如在此所使用的，如果人类抗体的可变区从使用人种系免疫球蛋白基因的***获得，则该抗体包括呈特定的种系序列的“产物”或“来源于”特定的种系序列的重链或轻链可变区。此类***包括利用感兴趣的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或利用感兴趣的抗原对噬菌体展示的人类免疫球蛋白基因库进行筛选。作为一种人类种系免疫球蛋白序列的“产物”的或自其“起源的”一种人类抗体可以像这样进行鉴定，通过将该人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并且选择与该人类抗体的序列在序列上最接近的(即，最大％一致性)的人类种系免疫球蛋白序列。
作为一种具体人类种系免疫球蛋白序列的“产物”的或自其“起源的”一种人类抗体可以包含与种系序列相比的氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的刻意引入。然而，选择的人类抗体与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上典型地是至少90％一致的，并且当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠科种系序列)相比时，包含鉴定该人类抗体是人类的氨基酸残基。在某些情况下，一种人类抗体与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可以是至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、、97％、、98％、、或99％一致的。典型地，来源于一种特定的人类种系序列的一种人类抗体将显示不超过10个不同于由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列的氨基酸差异。在某些情况下，该人类抗体可显示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个不同于由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列的氨基酸差异。
同源抗体
在又另一个实施例中，本发明的一种抗体包括重链和轻链可变区，这些重链和轻链可变区分别包括与优选的抗-LSR抗体的分离的抗-LSR氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中这些抗体保留这些亲本抗-LSR抗体的所希望的功能特性。
如在此所使用的，两个氨基酸序列之间的百分比同源性与这两个序列之间的百分比一致性是等同的。这两个序列之间的百分比一致性是这些序列所共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目×100)，并考虑到为这两个序列的最优比对而需引入的空位数目和每个空位的长度。如以下的非限制性实例中所说明的，两个序列之间的序列对比和百分比一致性的确定可利用一种数学算法来完成。
两个氨基酸序列之间的百分比一致性可以使用已经合并在ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller的算法(《计算机应用生物科学》(Comput.Appl.Biosci.)，4:11-17(1988))来确定，使用一种PAM120权重残基表，空位长度罚分为12以及空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比一致性可以使用已经合并在GCG软件包(可商业上获得)中的GAP程序中的Needleman和ffunsch(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48：444-453(1970))算法来确定，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和空位权重(gap weight)16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。
额外地或可替代地，本发明的这些蛋白序列可以被进一步用作一种“查询序列”以进行针对公共数据库的检索，例如鉴定相关序列。此类检索可以使用阿特休尔(Altschul)等人，(1990)《分子生物学杂志》(J Mol.Biol.)215:403_10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序来进行，得分＝50、字长＝3以获得与根据本发明的至少一些实施例所述的这些抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可利用如阿特休尔(Altschul)等人，(1997)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25(17):3389_3402中所说明的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施例中，本发明的一种抗体包括一个重链可变区(包括CDRl、CDR2以及CDR3序列)和一个轻链可变区(包括CDRl、CDR2以及CDR3序列)，其中这些CDR序列中的一个或多个包括基于优选的抗-抗-LSR抗体的特定的氨基酸序列，这些抗体是使用在此的方法分离和产生的，或其保守修饰，并且其中这些抗体分别保留根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LSR抗体的所希望的功能特性。
在不同实施例中，该抗-LSR抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此所使用的，术语“保守序列修饰“旨在指不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的该抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导诱变)将修饰引入到根据本发明的至少一些实施例的一种抗体中。保守氨基酸取代是其中的该氨基酸残基被一个具有相似侧链的氨基酸残基所替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，根据本发明的至少一些实施例的一种抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基所替代，并且可以使用在此所述的这些功能性测定来针对保留的功能(即，以上(c)到(j)中所阐述的这些功能)对这些经改变的抗体进行测试。
与根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LSR一样结合相同抗原表位的抗体。
在另一个实施例中，本发明提供了与人类LSR上的优选抗原表位结合的抗体，这些抗体拥有所希望的功能性质，例如对共刺激的调节和相关功能。可以选择具有所希望的抗原表位特异性的其他抗体，并且对于与LSR抗原的结合，它们将具有与这些所希望的抗体交叉竞争的能力。
工程化的和修饰的抗体
根据本发明的至少一些实施例所述的一种抗体可以进一步使用具有以下这些VH和/或VL序列中的一个或多个的一种抗体来制备，这些VH和/或VL序列来源于一种抗-LSR抗体起始材料以工程化一种经修饰的抗体，这种经修饰的抗体可以具有来自该起始抗体的改变的特性。可通过修饰一个可变区或两个可变区(即，VH和/或VL)内的一个或多个残基来工程化一种抗体，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个构架区内。额外地或可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化一种抗体，例如用来改变该抗体的效应子功能。
可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在单独抗体之间更加多样化。因为CDR序列负责绝大部分的抗体-抗原相互作用，可能的是通过构建包括以下CDR序列的表达载体来表达模拟了特定的天然存在的抗体的性质的重组抗体，这些CDR序列来自这些特定的天然存在的抗体，被移植到来自具有不同性质的一种不同的抗体的构架序列上(见例如里希曼(Riechmann)，L.等人(1998)《自然》(Nature)332:323-327；琼斯(Jones)，P.等人(1986)《自然》(Nature)321:522-525；奎因(Queen)，C.等人(1989)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.)86:10029-10033；给温特(Winter)的美国专利号5,225,539，以及给奎因(Queen)等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
适合的构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。例如，针对人类重链和轻链可变区基因的种系DNA系列可以在以下项中找到，“Vbase”人类种系序列数据库(可在互联网上获得)，连同卡巴特，E.A.，等人(1991)《免疫学上感兴趣的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国健康与人类服务部，NIH出版号91-3242；汤姆林森(Tomlinson)，I.M.，等人(1992)“人类种系VH序列的所有组成成分揭示了大约五十组具有不同高变环的VH区段(The Repertoire of人Germline VH Sequences Reveals about FiftyGroups of VH Segments with Different Hypervariable Loops)”《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)227:776-798；以及科克斯(Cox)，J.P.L.等人(1994)“一种人类种系VH区段的目录揭示了在它们的使用中的一种强烈的倾向性(A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage)”《欧洲免疫学杂志》(Eur.J Immunol.)24:827-836；它们中的每一项的内容都明确地通过引用结合于此。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，以由此改善该感兴趣的抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和性)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入这些突变，并且对抗体结合或其他感兴趣的功能性质的效应可在适当的体外或体内测定中来评估。优选地，引入保守修饰(如上所讨论的)。这些突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但优选地为取代。并且，典型地，一个CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
根据本发明的至少一些实施例的工程化的抗体包括其中对VH和/或VL内的构架残基作出修饰的抗体，例如，以改良该抗体的性质。典型地，作出此类构架修饰以降低该抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”到对应的种系序列。更具体地，已经经历体细胞突变的一种抗体可以包含不同于该抗体自其起源的种系序列的构架残基。此类残基可以通过将这些抗体构架序列与该抗体自其起源的这些种系序列进行比较来鉴定。
除在构架内或CDR区内作出的修饰外，或替代在构架内或CDR区内作出的修饰，根据本发明的至少一些实施例的抗体可以被工程化以包括Fc区内的修饰，典型地，以改变该抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒作用。此外，根据本发明的至少一些实施例的一种抗体可以被化学修饰(例如，可将一种或多种化学部分连接至该抗体)或被修饰以改变其糖基化，再一次以改变该抗体的一种或多种功能性质。此类实施例在下面进一步进行说明。Fc区中的残基的编号为卡巴特的EU索引中的编号。
在一个实施例中，将CH1的铰链区进行修饰这样使得在该绞链区中的半胱氨酸残基的数目改变，例如，增加或减少。这种方法进一步说明于出自博德默(Bodmer)等人的美国专利号5,677,425中。将CH1的绞链区中的半胱氨酸残基的数目改变，以例如协助轻链和重链的组装或以增加或减少该抗体的稳定性。
在另一个实施例中，将一种抗体的Fc铰链区突变以降低该抗体的生物学半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到该Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域交界区而使该抗体相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合具有削弱的SpA结合。这种方法进一步详细说明于出自沃德(Ward)等人的美国专利号6,165,745中。
在另一个实施例中，该抗体被修饰以提高其生物学半衰期。多种方法是可能的。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如在给沃德(Ward)的美国专利号6,277,375中所说明的。可替代地，为了提高生物学半衰期，可以在CH1或CL区内对该抗体进行改变以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的一种补救受体结合抗原表位，如在出自普雷斯塔(Presta)等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所说明的。
在另外其他实施例中，通过用一种不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变该抗体的效应子功能。例如，可以将一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320以及322的氨基酸用一种不同的氨基酸残基进行替代，这样使得该抗体具有针对一种效应子配体的一种经改变的亲和性，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和性被改变的效应子配体可以是例如一种Fc受体或补体的C1组分。这种方法进一步详细说明于全都出自温特(Winter)等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一个实例中，可以将一个或多个选自氨基酸残基329、331以及322的氨基酸用一种不同的氨基酸残基进行替代，这样使得该抗体具有经改变的Clq结合和/或被减少的或废除的补体依赖性细胞毒作用(CDC)。这种方法进一步详细说明于出自Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
在另一个实例中，可以将氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基进行改变，以由此改变该抗体固定补体的能力。这种方法进一步说明于出自博德默(Bodmer)等人的PCT公布WO94/29351中。
在又另一个实例中，通过修饰在以下位置的一个或多个氨基酸，对该Fc区进行修饰以提高该抗体对抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)进行介导的能力，和/或以提高该抗体针对一种Fcy受体的亲和性：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法进一步说明于出自普雷斯塔(Presta)的PCT公开案WO00/42072中。并且，人类IgGl上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已被确定位置并且具有经改善的结合的变体已被说明(参见希尔兹(Shields)，R.L.等人(2001)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)276＝6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339上的特定突变显示出会改善对FcyRIII的结合。额外地，以下组合突变体显示出会改善FcγRIII的结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，突变(例如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S)改善了对FcRn的结合并且增加了抗体的循环半衰期(参见钱(Chan)CA和卡特(Carter)PJ(2010)《免疫学自然评论》(Nature RevImmunol)10:301-316)。
在再另一个实施例中，对一种抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制备一种去糖基化的抗体(即，该抗体缺少糖基化)。糖基化可被改变以，例如，提高该抗体对于抗原的亲和性。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变该抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以作出一个或多个氨基酸取代，这导致一个或多个可变区构架糖基化位点的消除，以由此在那个位点消除糖基化。这样的去糖基化可以提高该抗体对于抗原的亲和性。这样一种方法进一步详细说明于出自Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
额外地或可替代地，可以制备一种具有一种经改变的糖基化类型的抗体，例如一种具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或一种具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。已经证实此类经改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在一种具有经改变的糖基化机制的宿主细胞中表达该抗体来完成。具有经改变的糖基化机制的细胞在本领域中已被说明且可用作在其中表达根据本发明的至少一些实施例的重组抗体从而产生具有经改变的糖基化的一种抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，而使在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中所表达的抗体在其碳水化合物上缺少岩藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709FUT8.-/-细胞系是通过使用两种置换型载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生的(参见出自山根(Yamane)等人的美国专利公开号20040110704和山根-大贯(Yamane-Ohnuki)等人(2004)《生物技术生物工程》(Biotechnol Bioeng)87:614-22)。作为另一个实例，出自花井(Hanai)等人的EP1,176,195说明了一种具有一种功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码一种岩藻糖基转移酶，从而通过减少或消除α1,6键相关酶使在这样一种细胞系中所表达的抗体表现出低岩藻糖基化。花井(Hanai)等人还说明了对将岩藻糖添加到结合抗体的Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上具有一种低酶活性或者不具有该酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。出自普雷斯塔(Presta)的PCT公布WO03/035835说明了一种变体CHO细胞系，Lecl3细胞，其对将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物具有降低的能力，也导致了在那种宿主细胞中所表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见希尔兹(Shields)，R.L.等人(2002)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)277：26733-26740)。出自乌马纳(Umana)等人的PCT公布WO99/54342说明了工程化的细胞系以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))而使在这些工程化的细胞系中所表达的抗体表现出增高的平分型GlcNac结构，这导致了这些抗体增高的ADCC活性(还参见乌马纳等人(1999)《自然生物技术》(Nat.Biotech.)17:176-180)。可替代地，该抗体的岩藻糖残基可以使用一种岩藻糖苷酶而被剪切掉。例如岩藻糖苷酶a-L-岩藻糖苷酶从抗体上去除岩藻糖基残基(塔伦蒂诺(Tarentino)，A.L.等人(1975)《生物化学》(Biochem.)14:5516-23)。
本发明所考虑的在此的这些抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将一种抗体聚乙二醇化以例如增加该抗体的生物学(例如，血清)半衰期。为了将一种抗体聚乙二醇化，典型的是，在其中一个或多个PEG基团可附接至该抗体或抗体片段的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的一种反应性酯或醛衍生物)进行反应。优选地，聚乙二醇化是经由与一种反应性PEG分子(或类似反应性水可溶聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行的。如在此所使用的，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用来衍生其他蛋白的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的该抗体是一种去糖基化的抗体。用于聚乙二醇化蛋白的方法是本领域中已知的且可用于根据本发明的至少一些实施例的这些抗体中。参见例如，出自西村(Nishimura)等人的EP 0 154 316和出自石川(Ishikawa)等人的EP 0 401384。
工程化抗体的方法
如以上所讨论的，在此所披露的具有VH和VK序列的抗LSR抗体可以分别通过修饰这些VH和/或VL序列或与其附接的恒定区而被用于产生新的抗LSR抗体。因此，在根据本发明的至少一些实施例的另一个方面中，根据本发明的至少一些实施例的一种抗-LSR抗体的结构特征被用来产生结构上相关的抗-LSR抗体，这些抗体保留根据本发明的至少一些实施例的这些抗体的至少一种功能性质，例如分别与人类LSR结合。例如，一种LSR抗体或其突变的一个或多个CDR区可以与已知框架区和/或其他CDR重组地合并以产生额外的、重组工程化的、如以上所讨论的、根据本发明的至少一些实施例的抗-LSR抗体。其他类型的修饰包括在先前部分中所说明的那些。用于该工程化方法的起始材料是在此所提供的这些VH和/或VK序列中的一个或多个，或其一个或多个CDR区。为产生该工程化的抗体，不需要实际制备(即，表达为一种蛋白)具有在此所提供的这些VH和/或VK序列中的一个或多个，或其一个或多个CDR区的一种抗体。而是，这些序列中所包含的信息被用作起始材料而产生来源于这些原始序列的一种“第二代”序列且然后制备这些“第二代”序列并表达为一种蛋白。
可以使用标准分子生物学技术来制备并且表达经改变的抗体序列。
优选地，由这些经改变的抗体序列所编码的该抗体是分别保留了这些抗LSR抗体的功能性质中的一种、一些或全部的、通过在此所提供的方法并且用在此所提供的序列所产生的一种抗体，这些功能性质包括具有一种特定KD水平或以下的与LSR抗原的结合，和/或对B7共刺激的调节，和/或与所希望的靶细胞(像，表达LSR抗原的细胞)的选择性结合。
这些经改变的抗体的功能性质可使用在本领域中可获得的和/或在此所述的标准测定来评估。
在根据本发明的至少一些实施例的对抗体进行工程化的这些方法的某些实施例中，突变可以沿着一种抗LSR抗体编码序列的全部或部分被随机地或选择性地引入，并且可以对这些所产生的经修饰的抗LSR抗体针对结合活性和/或其他所希望的功能性质进行筛选。
突变方法在本领域中已经被说明。例如，出自肖特(Short)的PCT公开案WO02/092780说明了使用饱和诱变、合成连接组装或它们的组合用于产生和筛选抗体突变的方法。可替代地，出自拉扎尔(Lazar)等人的PCT公开案WO03/074679说明了使用计算筛选方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
编码抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及对根据本发明的至少一些实施例所述的抗体进行编码的核酸分子。核酸可存在于全细胞、细胞裂解物或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术被从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白)纯化开时，一种核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳以及其他本领域熟知的技术。参见，F.奥苏伯尔(Ausubel)等人编辑(1987)《当代分子生物学方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，格林出版和威力跨学科(Greene Publishing and WileyInterscience)，纽约。根据本发明的至少一些实施例的一种核酸可以是，例如，DNA或RNA并可含或可不含内含子序列。在一个优选的实施例中，该核酸是一种cDNA分子。
根据本发明的至少一些实施例的核酸可以使用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤表达的抗体(例如，如以下进一步说明的，由携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠而制备的杂交瘤)，编码由该杂交瘤制备的该抗体的轻链和重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术而获得。对于从一种免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，利用噬菌体展示技术)，编码该抗体的核酸可从该文库中回收。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可通过标准重组DNA技术对这些DNA片段进行进一步操作，例如以将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，一种编码VL或VH的DNA片段***作性地连接于另一种编码另一种蛋白(例如一种抗体恒定区或一种柔性连接物)的DNA片段。
如在此背景下所使用的，术语“操作性地连接”旨在意指将这两种DNA片段接合，这样使得由这两种DNA片段编码的这些氨基酸序列仍然在框架内。
可以通过将编码VH的DNA操作性地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2以及CH3)的另一个DNA分子来将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见，例如卡巴特，E.A.，等人(1991)《免疫学上感兴趣的蛋白的序列》(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国健康与人类服务部，NIH出版号91-3242)并且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。该重链恒定区可以是一种IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选一种IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，编码VH的DNA可以***作性地连接至另一个只编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可以通过将编码VL的DNA操作性地连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子来将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(连同Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见，例如卡巴特，E.A.，等人(1991)《免疫学上感兴趣的蛋白的序列》(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国健康与人类服务部，NIH出版号91-3242)并且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。该轻链恒定区可以是一种κ或λ恒定区，但是最优选一种κ恒定区。
为了产生一种scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段操作性地连接至另一个编码柔性连接物(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的片段，这样使得这些VH和VL序列可以被表达为一种连续的单链蛋白，这些VH和VL区由该柔性连接物接合(参见，例如，伯德(Bird)等人(1988)《自然》(Science)242:423-426；休斯顿(Huston)等人(1988)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883；麦卡弗蒂(McCafferty)等人，(1990)《自然》(Nature)348:552-554)。
抗LSR单克隆抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术来产生，包括常规单克隆抗体方法学，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)(《自然》(Nature))256:495的标准体细胞杂交技术。虽然体细胞杂交方法是优选的，原则上，其他用于产生单克隆抗体的技术也可被应用，例如，B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一个优选动物***是鼠***。在小鼠中杂交瘤的产生是一种非常完善建立的程序。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以基于如上所说明而制备的一种鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤获得，并且可以使用标准分子生物学技术来工程化以包含非鼠(例如，人类)免疫球蛋白序列。例如，为产生一种嵌合抗体，可使用本领域中已知的方法(参见，例如，给卡比利(Cabilly)等人的美国专利号4,816,567)将鼠可变区连接到人类恒定区。为产生一种人源化抗体，可以使用本领域中已知的方法将鼠CDR区***至一种人类构架中(参见例如，给温特(Winter)的美国专利号5,225,539，以及给奎因(Queen)等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体是人类单克隆抗体。此类直接针对LSR的人类单克隆抗体可以使用携带人类免疫***而非小鼠***的部分的转基因小鼠或转染色体小鼠来产生。这些转基因小鼠和转染色体小鼠在此分别被称为HuMAb小鼠RTM和KM小鼠RTM，并且在此被统称为“人类Ig小鼠”。HuMAb小鼠TM(Medarex.公司)包含对非重排人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，连同使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，伦贝格(Lonberg)等人(1994)《自然》(Nature)368(6474)：856-859)。相应地，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫接种，这些所引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，以产生高亲和性人类IgGκ单克隆(伦贝格，N.等人(1994)，见上文；综述于伦贝格，N.(1994)《实验药理学手册》(Handbook of ExperimentalPharmacology)113:49-101中；伦贝格，N.和胡萨尔(Huszar)，D.(1995)《免疫学国际评论》(Intern.Rev.Immunol.)13:65-93，以及哈丁(Harding)，F.和伦贝格(Lonberg)，N.(1995)《纽约科学学术年报》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)764:536-546)。HuMab小鼠RTM的制备和用途，以及由此类小鼠所携带的这些基因组修饰进一步说明于以下项中，泰勒(Taylor)，L.等人(1992)《核酸研究》(Nucleic Acids Research)20:6287-6295；陈(Chen)，J.等人(1993)《国际免疫学》(International Immunology)5:647-656；蒂阿永(Tuaillon)等人(1993)《美国国家自然科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:3720-3724；崔(Choi)等人(1993)《自然遗传学》(NatureGenetics)4:117-123；陈(Chen)，J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；蒂阿永(Tuaillon)等人(1994)《免疫杂志》(J.Immunol.)152:2912-2920；泰勒(Taylor)，L.等人(1994)《国际免疫学》(International Immunology)6:579-591；以及费舍威尔德(Fishwild)，D.等人(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14:845-851，所有这些的内容通过应用以其全文特别结合于此。进一步参见，全部给伦贝格和凯(Kay)的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、以及5,770,429；给苏拉尼(Surani)等人的美国专利号5,545,807；全部给伦贝格和凯的PCT公布号WO92/03918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/13852、WO98/24884以及WO99/45962；以及给科曼(Korman)等人的PCT公布号WO01/14424。
在另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例的人类抗体可利用在转基因上或转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠来产生，比如携带人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠。在此被称为“KM小鼠TM.”的此类小鼠被详细说明于给石田(Ishida)等人的PCT公布WO02/43478中。
再者，表达人类免疫球蛋白基因的替代转基因动物***在本领域是可用的，并且可以被用来培养根据本发明的至少一些实施例的抗-LSR抗体。例如，可以使用被称为转基因小鼠(Xenomouse)(安根尼克斯(Abgenix)公司)的一种替代转基因***；此类小鼠被说明于例如给库彻拉帕提(Kucherlapati)等人的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584以及6,162,963中。
并且，表达人类免疫球蛋白基因的替代转染色体动物***在本领域是可用的，并且可以被用来培养根据本发明的至少一些实施例的抗-LSR抗体。例如，可以使用被称为“TC小鼠”、携带人类轻链转染色体和人类重链转染色体两者的小鼠；此类小鼠被说明于富冢(Tomizuka)等人(2000)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad Sci.USA)97：722-727中。此外，携带人类重链和轻链转染色体的牛已经在本领域中说明(黑岩(Kuroiwa)等人(2002)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)20:889-894)，并且可以被用来培养根据本发明的至少一些实施例的抗-LSR抗体。
根据本发明的至少一些实施例的人类单克隆抗体还可以使用用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。此类用于分离人类抗体的噬菌体展示方法在本领域是已建立的。参见例如：给拉德纳(Ladner)等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；给道尔(Dower)等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；给麦卡弗蒂(McCafferty)等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及给格里菲思(Griffiths)等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
根据本发明的至少一些实施例的人类单克隆抗体还可以使用SCID小鼠来制备，在其中已经重构了人类免疫细胞，这样使得当免疫接种时可以产生人类抗体应答。此类小鼠说明于例如给威尔逊(Wilson)等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
人类Ig小鼠的免疫接种
当人类Ig小鼠被用于培养根据本发明的至少一些实施例的人类抗体时，可以用一种经纯化的或经富集的LSR抗原和/或重组LSR或LSR融合蛋白的制剂对此类小鼠进行免疫接种，如由伦贝格，N.等人(1994)《自然》(Nature)368(6474):856-859；费舍威尔德(Fishwild)，D.等人(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14:845-851；以及PCT公布WO98/24884和WO01/14424所说明的。优选地，在第一次输注时，这些小鼠将是6-16周龄。例如，可以使用LSR抗原的一种纯化或重组制剂(5-50.mu.g)来腹腔内地免疫接种这些人类Ig小鼠。
其他人用不同抗原的先前经验已经显示出当首先用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫接种，随后用不完全弗氏佐剂中的抗原每隔一周IP免疫接种(共有6次)时，这些转基因小鼠会响应。然而，除弗氏佐剂外的佐剂也被发现是有效的。此外，无佐剂的全细胞被发现具有高度免疫原性。可以在该免疫接种方案的过程中用通过眶后放血获得的血浆样品对该免疫应答进行监测。可以通过ELISA筛选血浆(如下所说明的)，并且具有足够滴度的抗-LSR人类免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。在处死并且去除脾之前3天，可以使用抗原来静脉内地使小鼠增强免疫。期望的是对于每次免疫接种都可能需要进行2-3次融合。对于每种抗原典型地免疫接种6与24只之间的小鼠。通常使用HCo7和HCo12两种品系。此外，HCo7和HCo12两种转基因可以被一起繁殖进一只具有两种不同人类重链转基因(HCo7/HCo12)的单个小鼠中。可替代地或额外地，可以使用KM小鼠RTM品系。
产生人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生根据本发明的至少一些实施例的人类单克隆抗体的杂交瘤，可以从经免疫接种的小鼠分离脾细胞和/或***细胞，并且可以被融合至一种适当的无限增殖化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。可以针对抗原特异性抗体的产生对这些生成的杂交瘤进行筛选。例如，可以将来自经免疫接种的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液用50％的PEG融合至六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)。将细胞以约2X10-5在平底微量滴定板上涂板，随后是在包含以下的选择培养基中孵育两周：20％胎儿克隆血清(fetal Clone Serum)，18％“653”条件培养基，5％奥利金(origen)(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮钠，5mM HEPES，0.055mM2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素以及1X HAT(西格玛；在融合后24小时添加HAT)。在约两周之后，可以将细胞在将HAT用HT替代的培养基中进行培养。然后可以通过ELISA针对人类单克隆IgM和IgG抗体对单独的孔进行筛选。一旦大量的杂交瘤生长出现，通常在10-14天之后可以对培养基进行观察。分泌杂交瘤的抗体可以被重新涂板、再次筛选，并且如果对人类IgG仍然是阳性的，那么这些单克隆抗体可以通过有限稀释法被至少亚克隆两次。然后可以将稳定的亚克隆在体外培养，以在用于表征的组织培养基中生成少量抗体。
为纯化人单克隆抗体，可在2升旋转瓶中培养所选择的杂交瘤用于单克隆抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(法玛西亚(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)亲和层析之前，可以将上清液过滤并且浓缩。为了保证纯度，可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法对洗脱的IgG进行检查。可以将缓冲溶液换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD280来对浓度进行确定。可将单克隆抗体分成小份并在-80℃下贮存。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
根据本发明的至少一些实施例的抗体还可以使用例如本领域中所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合来在一种宿主细胞转染瘤中产生(例如，莫里森(Morrison)，S.(1985)《科学》(Science)229：1202)。
例如，为了表达这些抗体、或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤的cDNA克隆)来获得编码部分的或全长的轻链和重链的DNA，并且这些DNA可以***进表达载体中，这样使得这些基因***作性地连接至转录和翻译控制序列。在此背景下，术语“操作性地连接”旨在意指抗体基因被连接至一个载体，这样使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择的表达载体和表达控制序列与所使用的表达宿主细胞是能兼容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因***进单独的载体，或更典型地，这两种基因被***进同一表达载体。通过标准方法将抗体基因***进表达载体(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，平末端连接)。可以使用在此所述的这些抗体的轻链和重链可变区，来通过将它们***表达载体来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，这些表达载体已经编码了所希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区，这样使得VH区段***作性地连接至该载体内的CH区段并且VK区段***作性地连接至该载体内的CL区段。额外地或可替代地，这种重组表达载体可以对协助该抗体从宿主细胞中分泌的信号肽进行编码。可以将该抗体链基因克隆进该载体，这样使得信号肽被框架内地连接至该抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，根据本发明的至少一些实施例的重组表达载体携带了控制这些抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制这些抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列被说明于例如格德尔(Goeddel)(基因表达技术(Gene Expression Technology)，酶学中的方法(Methods in Enzymology)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚州(1990))中。本领域的普通技术人员将理解的是，对该表达载体的设计，包括对调节序列的选择，可取决于这类因子，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白的表达水平等。针对哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平的蛋白表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，例如泛素蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调节元件由来自不同来源，例如包含来自SV40早期启动子的序列和人类T细胞白血病病毒类型1的长末端重复的SRα、启动子***的序列组成(武部(Takebe)，Y.等人(1988)《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)8：466-472)。
除了这些抗体链基因和调节序列之外，根据本发明的至少一些实施例的重组表达载体可以携带额外的序列，例如在宿主细胞中调节该载体的复制的序列(例如，复制起点)以及选择性标志物基因。选择性标志物基因协助已经向其中引入该载体的宿主细胞的选择(参见例如，全部出自阿克塞尔(Axel)等人的美国专利号4,399,216、4,634,665以及5,179,017)。例如，典型地，在一种已经将该载体引入其中的宿主细胞上，该选择性标志物基因赋予了对药物(例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。优选的选择性标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染进宿主细胞中。不同形式的术语“转染”旨在涵盖多种多样的通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明的至少一些实施例的抗体是可能的，但是在真核细胞、并且最优选哺乳动物宿主细胞中的抗体的表达是最优选的，因为此类真核细胞、并且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更容易组装并且分泌适当折叠的并且有免疫学活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达针对活性抗体的高产量的生产是无效的(博斯(Boss)，M.A.和伍德(Wood)，C.R.(1985)《今日免疫学》(Immunology Today)6:12-13)。
用于对根据本发明的至少一些实施例的这些重组抗体进行表达的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，它在乌尔劳布(Urlaub)和蔡辛(Chasin)，(1980)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77:4216-4220中说明，与一种DHFR选择性标志物(例如如在R.J.考夫曼(Kaufman)和P.A.夏普(Sharp)(1982)《分子生物学》(Mol.Biol.)159:601-621中所说明的)一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，用于与NSO骨髓瘤细胞一起使用的另一个优选的表达***是披露于WO87/04462、WO89/01036以及EP338,841中的GS基因表达***。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，这些抗体是通过将这些宿主细胞培养一段足够允许在这些细胞中的抗体的表达或更优选地，允许该抗体分泌至这些宿主细胞生长的培养基中的时间来产生的。可以使用标准蛋白纯化方法将抗体从该培养基中回收。
与抗原结合的抗体的表征
可以通过例如标准ELISA针对与LSR的结合对根据本发明的至少一些实施例的抗体进行测试。简言之，将微量滴定板用PBS中的0.25.μg/ml的经纯化的L LSR进行包被，并且然后用PBS中的5％的牛血清白蛋白封闭。将抗体的稀释物(例如，来自经免疫的小鼠的血浆的稀释物)添加至每个孔并且在37℃孵育1-2小时。将这些板用PBS/吐温进行洗涤，并且然后用与碱性磷酸酶轭合的第二试剂(例如，对人类抗体来说，一种羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃孵育1小时。洗涤之后，将这些板用pNPP底物(1mg/ml)进行显色，并且在OD405-650下进行分析。优选地，显色出最高滴度的小鼠将用于融合。
还可以使用如上所说明的ELISA测定来筛选显示出与LSR免疫原的阳性反应性的杂交瘤。将以高亲合力与LSR结合的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以选择来自每个杂交瘤的一个保留亲本细胞的反应性(通过ELISA)的克隆，用于制备5-10个小瓶细胞库，在-140℃下储存，并且用于抗体纯化。
为了纯化抗LSR抗体，可以使所选择的杂交瘤生长在用于单克隆抗体纯化的两升的转瓶中。在用蛋白A-琼脂糖(法玛西亚(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)亲和层析之前，可以将上清液过滤并且浓缩。为了保证纯度，可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法对洗脱的IgG进行检查。可以将缓冲溶液换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD280来对浓度进行确定。可将单克隆抗体分成小份并在-80℃下贮存。
为了确定所选择的抗-LSR单克隆抗体是否与独特的抗原表位结合，可以使用可商购的试剂(皮尔斯(Pierce)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(IL))使每个抗体生物素化。可以使用如上所说明的经LSR包被的ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争性研究。生物素化的mAb结合可利用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针来检测。
为了确定经纯化的抗体的同种型，可以使用特异性针对一种具体同种型的抗体的试剂来进行同种型ELISA。例如，为了确定一种人类单克隆抗体的同种型，微量滴定板的孔可以用1.mu.g/ml的抗人免疫球蛋白在4℃进行过夜包被。在用1％BSA封闭之后，将这些板与1m ug/ml或以下的试验单克隆抗体或经纯化的同种型对照在环境温度下反应一至两小时。然后可以将这些孔与人类IgG或人类IgM特异性碱性磷酸酶轭合探针进行反应。如上所说明的，对板进行显色并分析。
可以通过蛋白质印迹，针对与LSR抗原的反应性，对抗LSR人类IgG分别进行进一步测试。简言之，可以制备LSR抗原并且让其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将这些分离的抗原转移至硝酸纤维素滤膜，用10％胎牛血清进行封闭，并且用有待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(西格玛化学公司，圣路易斯，密苏里州)进行显色。
替代支架
根据至少一些实施例，本发明涉及具有类似于特异性抗体的范围的特异性和亲和性的蛋白支架。根据至少一些实施例，本发明涉及一种抗原结合构建体，这种抗原结合构建体包括一种被连接至一个或多个抗原表位结合结构域的蛋白支架。此类工程化蛋白支架通常是通过设计一个具有诱变(该诱变集中于环区或另外的可允许的表面区域处)的随机突变库并且通过经由噬菌体展示或相关技术针对给定的靶标对变体进行选择来获得的。根据至少一些实施例，本发明涉及替代支架，包括但不局限于：抗体模拟物(anticalin)、DARPin、犰狳重复序列蛋白(Armadillo repeat proteins)、蛋白A、脂质运载蛋白、纤维连接蛋白结构域、锚蛋白共有序列重复结构域(ankyrin consensus repeat domain)、硫氧还蛋白、化学约束肽(chemicallyconstrained peptides)等。根据至少一些实施例，本发明涉及可以用作治疗癌症、自身免疫性和感染性疾病连同用于体内诊断学的治疗剂的替代支架。
根据至少一些实施例，本发明进一步提供了一种药物组合物，包括一种如在此所述的抗原结合构建体、一种药学上可接受的载体。
如在此使用，术语“蛋白支架”包括但不局限于免疫球蛋白(Ig)支架，例如IgG支架，可以是四链或双链抗体，或可以只包括抗体的Fc区，或可以包括来自抗体的一个或多个恒定区(其恒定区可以是人类的或灵长类源的)，或可以是人类和灵长类恒定区的人造嵌合体。此类蛋白支架除了一个或多个恒定区之外还可以包括抗原结合位点，例如其中该蛋白支架包括一个完整IgG。此类蛋白支架能够被连接至其他蛋白结构域，例如具有抗原结合位点的蛋白结构域，例如表位结合结构域或ScFv结构域。
“结构域”是一种具有独立于蛋白的其他部分的三级结构的折叠的蛋白结构。通常，结构域负责蛋白的离散功能特性，并且在许多情况下，可以被添加至、除去或转移至其他蛋白而不失去该蛋白的剩余物和/或该结构域的功能。“单个抗体可变结构域”是一种包括抗体可变结构域的序列特征的折叠的多肽结构域。因此，它包括完全抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中的一个或多个环已经被不是抗体可变结构域的特征的序列所替代，或已经被平截或包括N末端或C末端延伸的抗体可变结构域，连同至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
短语“免疫球蛋白单个可变结构域”是指与独立于不同V区或结构域的抗原或抗原表位特异性结合的抗体可变结构域(VH、V-HH、V-L)。免疫球蛋白单个可变结构域能以与其他不同可变区或可变结构域一起(例如，同多聚体或异多聚体)的方式存在，其中该单个免疫球蛋白可变结构域不需要这些其他区或结构域结合抗原(即，其中该免疫球蛋白单个可变结构域独立于额外的可变结构域地结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与如在此所使用能够结合抗原的“免疫球蛋白单个可变结构域”是相同的。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人类抗体可变结构域，但是还包括来自其他物种的单个抗体可变结构域，例如啮齿类动物(例如，如在WO00/29004中所披露的)、铰口鲨以及骆驼科动物V-HH dAb。骆驼科动物V-HH是来源于包括以下物种、产生天然缺乏轻链的重链抗体的免疫球蛋白单个可变结构域多肽：骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼、以及原驼。此类V-HH结构域可以根据本领域可用的标准技术人源化，并且根据本发明此类结构域仍被认为是“结构域抗体”。如在此所使用的，“VH”包括骆驼科动物V-HH结构域。NARV是另一类在软骨鱼类(包括铰口鲨)中鉴定出的免疫球蛋白单个可变结构域。这些结构域也称为新颖抗原受体(NovelAntigen Receptor)可变结构域(通常缩写为V(NAR)或NARV)。关于进一步的细节，参见MoI.Immunol.44,656-665(2006)和US20050043519A。
术语“抗原表位结合结构域”是指与独立于不同V区或结构域的抗原或抗原表位特异性结合的结构域，这可以是一种结构域抗体(dAb)(例如人类、骆驼科动物或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域)或它可以是一种作为选自下组的支架的衍生物的结构域，该组由以下各项组成：CTLA-4(埃维体(Evibody))；脂质运载蛋白；蛋白A衍生的分子，例如蛋白A的Z-结构域(亲和体(Affibody)，SpA)，A-结构域(阿维体(Avimer)/大抗体(Maxibody))；热激蛋白，例如GroEI和GroES；转移酶(反式体(trans-body))；锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)；肽适体；C-类凝集素结构域(四连接素)；人类&#947-晶体蛋白以及人类泛素蛋白(affilin)；PDZ结构域；人类蛋白酶抑制剂的蝎毒素库尼茨(kunitz)型结构域；犰狳重复序列蛋白、硫氧还蛋白、以及纤维连接蛋白(艾得奈可汀(adnectin))；该结构域已经经受蛋白工程化以获得与除了天然配体之外的配体的结合。
对应于抗体的CDR的环可以被异源序列取代以赋予不同结合性质，即埃维体(Evibody)。关于进一步的细节，参见《免疫方法杂志》(Journal ofImmunological Methods)248(1-2)，31-45(2001)。脂质运载蛋白是一种细胞外蛋白家族，这些蛋白对小疏水分子(例如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质)进行转运。它们具有刚性的二级结构，在圆锥形结构的开口末端有多个环，它们可以被工程化以与不同靶抗原结合。抗体模拟物(anticalin)大小是160-180个之间的氨基酸，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见《生物化学与生物物理学报》(Biochim BiophysActa)1482:337-350(2000)，US7250297B1和US20070224633。亲和体(affibody)是一种来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的支架，它可以被工程化以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化生成了文库。关于进一步的细节，参见《蛋白质工程设计与选择》(Protein Eng.Des.SeI.)17,455-462(2004)和EP1641818A1。阿维体(Avimer)是来源于A-结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采取限定的二硫化物键合结构。通过由A-结构域家族展示的天然变异的改组产生多样性。关于进一步的细节，参见《自然生物技术》(Nature Biotechnology)23(12),1556-1561(2005)以及《关于研究药物的专家观点》(Expert Opinion on Investigational Dr ugs)16(6),909-917(2007年6月)。一种转铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。转铁蛋白可以通过将肽序列***自由表面环中而被工程化以结合不用靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括反式体(Trans-body)。关于进一步的细节，参见《生物化学杂志》(J.Biol.Chem)274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是一种介导整合膜蛋白附接至细胞骨架的蛋白家族。单个的锚蛋白重复序列是一种由两个α螺旋；β转角组成的33个残基的基序。它们可以通过随机化在每个重复序列的第一α-螺旋和β-转角中的残基而被工程化，以结合不同的靶抗原。可以通过增加模块的数目来增加其结合界面(亲和性成熟的方法)。关于进一步的细节，参见《分子生物学杂志》(J.MoI.Biol.)332,489-503(2003),PNAS100(4),1700-1705(2003)和《分子生物学杂志》(J.MoI.Biol.)369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。
纤维连接蛋白是一种可以被工程化以结合抗原的支架。艾得奈可汀(Adnectin)由15个重复单位的人类III型纤维连接蛋白(FN3)的第10结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。位于β夹层的一个末端的三个环可以被工程化以使艾得奈可汀能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步的细节，参见《蛋白质工程设计与选择》(Protein Eng.Des.SeI.)18,435-444(2005)，US20080139791，WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定的支架蛋白、典型地是硫氧还蛋白(TrxA)组成的组合识别分子，这种恒定的支架蛋白包含在活性位点处***的约束可变肽环。关于进一步的细节，参见《关于生物疗法的专家观点》(Expert Opin.Biol.Ther.)5.783-797(2005)。
微体来源于长为25-50个氨基酸的天然存在的微量蛋白，这些微量蛋白包含3-4个半胱氨酸桥-微量蛋白的实例包括KalataBI和芋螺毒素(conotoxin)以及打结素(knottin)。这些微量蛋白具有一个环，该环可以被工程化以包括高达25个氨基酸而不影响该微量蛋白的整体折叠。关于工程化打结素结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
结合结构域的其他抗原表位包括已经作为支架被用于工程化不同靶抗原结合特性的蛋白，包括人类β-晶体蛋白和人类泛素蛋白(affilin)，人类蛋白酶抑制剂的库尼茨(kunitz)型结构域，Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域，蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin)，C-型凝集素结构域(四连接素)，综述于第7章-来自治疗性抗体手册的非抗体支架(Non-AntibodyScaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies)(2007，由斯蒂芬迪贝尔(Stefan Dubel)编辑)和《蛋白科学》(Protein Science)15:14-27(2006)。本发明的抗原表位结合结构域可以来源于这些替代蛋白结构域中的任一种。
轭合物或免疫轭合物
本发明涵盖用于在免疫疗法中使用的轭合物，这些轭合物包括LSR抗原及其可溶性部分，该抗原及其可溶性部分包括其胞外结构域或部分或变体。例如，本发明涵盖其中LSR抗原的ECD附接至免疫球蛋白或其片段的轭合物。本发明考虑它们用于促进或抑制LSR抗原活性(例如免疫共刺激)的用途以及它们在治疗在此所述的移植、自身免疫、以及癌症适应症中的用途。
在另一个方面中，本发明突出了被连接至一种有效负载药物(通常是细胞毒性的)、用于例如癌症的治疗、由一种抗体(或抗体片段，例如单链可变片段(scFv))组成的抗体-药物轭合物(ADC)。抗体导致ADC结合至靶癌细胞。通常然后ADC被该细胞内化并且该药物被释放进该细胞。由于靶向，副作用被降低了并且给出一个更宽的治疗窗。亲水性连接物(例如，PEG4Mal)帮助阻止该药物通过MDR(多重抗药性)转运蛋白而被具有抗性的癌细胞泵出。
在另一个方面中，本发明突出了免疫轭合物，这些免疫轭合物包括被轭合于一种治疗剂(例如一种细胞毒素、一种药物(例如，一种免疫抑制剂)或一种放射性毒素)的一种抗-LSR抗体、或其片段。此类轭合物在此被称为“免疫轭合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫轭合物被称为“免疫毒素”。一种细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害(例如，杀死)的试剂。实例包括紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普罗卡因、丁卡因、利多卡因、***、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括，例如，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、硫喷妥苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环瑟伏酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C、以及顺式二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(原名道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素以及安曲霉素(AMC))、以及抗有丝***剂(例如长春新碱和长春碱)。
可以轭合于根据本发明的至少一些实施例的抗体的治疗性细胞毒素的其他优选实例包括多卡米新、刺孢霉素、美登素和奥里斯他汀(auristatin)、及其衍生物。刺孢霉素抗体轭合物的一个实例是可商购的(麦罗塔(Mylotarg.)TM.；惠氏公司(Wyeth))。
可以使用本领域中可用的连接物技术使细胞毒素轭合于根据本发明的至少一些实施例的抗体。已经用于将细胞毒素轭合于抗体的连接物类型的实例包括，但不局限于：腙、硫醚、酯、二硫化物以及包含肽的连接物。可以选择例如易于被溶酶体分隔区内低pH剪切或易于被蛋白酶(例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D))剪切的连接物。
关于对细胞毒素类型、连接物以及用于将治疗剂轭合于抗体的方法的进一步讨论，还参见斋藤(Saito)，G.等人(2003)《先进药物递送评论》(Adv.Dr ug Deliv.Rev.)55:199-215；特雷尔(Trail)，P.A.等人(2003)《癌症免疫学免疫疗法》(Cancer Immunol.Immunother.)52:328-337；佩恩(Payne)，G.(2003)《癌细胞》(Cancer Cell)3:207-212；艾伦(Allen)，T.M.(2002)《癌症自然评论》(Nat.Rev.Cancer)2:750-763；帕斯坦(Pastan)，I.和克赖特曼(Kreitman)，R.J.(2002)《研究药物的当前观点》(Curr.Opin.Investig.Dr ugs)3:1089-1091；森特(Senter)，P.D.和施普林格(Springer)，C.J.(2001)《先进药物递送评论》(Adv.Dr ug Deliv.Rev.)53:247-264。
本发明的抗体还可以被轭合于放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也被称为放射免疫轭合物。可以被轭合于诊断或治疗用途的抗体的放射性同位素的实例包括，但不限于：碘131、铟111、钇90以及镥177。用于制备放射免疫轭合物的方法在本领域中是建立的。放射免疫轭合物的实例是可商购的，包括泽娃灵(Zevalin)(IDEC制药公司)和托西莫(Bexxar)(Corixa制药公司)，并且可以使用类似方法来制备使用根据本发明的至少一些实施例的抗体的放射免疫轭合物。
根据本发明的至少一些实施例的抗体轭合物可以被用来修饰一种给定的生物应答，并且药物部分不被理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所希望的生物活性的蛋白或多肽。此类蛋白可以包括例如，酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；一种蛋白，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或，生物学反应修饰剂，例如像淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其他生长因子。
用于将这样的治疗部分轭合于抗体的技术是熟知的，参见例如，阿尔农(Arnon)等人，“用于对在癌症疗法中的药物进行免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Dr ugs In CancerTherapy)”，在《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibodies And CancerTherapy)中，雷斯菲尔德(Reisfeld)等人(编著)，243-56页(Alan R.Liss公司1985)；赫尔斯特龙(Hellstrom)等人，“用于药物递送的抗体(Antibodies For Dr ug Delivery)”，在《受控的药物递送》(Controlled Dr ugDelivery)(第2版)中，罗宾逊(Robinson)等人(编著)，623-53页(马歇尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.)1987)；索普(Thorpe)，“癌症疗法中的细胞毒剂的抗体载体：综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review)”，在《单克隆抗体‘84：生物和临床引用》(Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications)中，平凯拉(Pinchera)等人(编著)，475-506页(1985)；“放射性标记的抗体在癌症疗法中的治疗用途的分析、结果和未来展望(Analysis,Results,AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy)”，在《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体》(MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy)中，鲍尔温(Baldwin)等人(编著)，303-16页(学术出版社(Academic Press)1985)，以及索普(Thorpe)等人，“抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性性质(The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conj ugates)”，《免疫学评论》(Immunol.Rev.)，62:119-58(1982)。
双特异性分子
根据至少一些实施例，本发明还涵盖一种多特异性抗体。多特异性抗体是具有针对至少两种不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在另一个方面中，本发明突出了双特异性分子，这些双特异性分子包括根据本发明的至少一些实施例的一种抗-LSR抗体、或其片段。根据本发明的至少一些实施例的一种抗体、或其抗原结合部分可以被衍生化或被连接至另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白(例如，针对一种受体的另一种抗体或配体)，以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的一种双特异性分子。根据本发明的至少一些实施例所述的抗体还可以被实际衍生化或被连接至多于一种的其他功能分子以产生与多于两个的不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在由如在此所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生根据本发明的至少一些实施例的一种双特异性分子，可以将一种抗体功能上地连接至(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价联合或以另外的方式)一个或多个其他结合分子，例如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，这样使得生成一种双特异性分子。在某些实施例中，这些双特异性抗体的结合特异性中的一种是针对LSR的，并且另一种是针对任何其他抗原的。在某些实施例中，双特异性抗体可以与LSR的两种不同抗原表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位至表达LSR的细胞。双特异性抗体能够被制备为全长抗体或抗体片段。
根据本发明的至少一些实施例的一种双特异性抗体，是一种与两种不同结构的靶标同时结合的抗体。根据本发明的至少一些实施例的双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)，具有至少一条与一种B细胞抗原或抗原表位特异性结合的臂，以及至少一条其他的与一种可靶向的轭合物特异性结合的臂。
根据至少一些实施例，本发明还涵盖一种融合抗体蛋白，该融合抗体蛋白是一种重组产生的抗原结合分子，在该抗原结合分子中具有相同或不同特异性的两种或更多种不同单链抗体或抗体片段区段是相连接的。使用分子工程可以产生多种双特异性融合抗体蛋白。在一种形式中，该双特异性融合抗体蛋白是单价的，由例如一种具有针对一种抗原的单一结合位点的sent和一种具有针对一种第二抗原的单一结合位点的Fab片段组成。在另一种形式中，该双特异性融合抗体蛋白是二价的，由例如一种具有针对一种抗原的两个结合位点的IgG和两种具有针对一种第二抗原的两个结合位点的scFv组成。
根据至少一些实施例，本发明还涵盖具有三种或更多种功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见例如US2006/0025576A1)。
根据至少一些实施例，本发明还涵盖一种“双作用FAb(Dual ActingFAb)”或“DAF”，该“双作用Fab”或“DAF”包括一种与LSR连同另一种不同抗原结合的抗原结合位点(参见例如US2008/0069820)。
因此，本发明包括以下双特异性分子，这些双特异性分子包括至少一种针对LSR的第一结合特异性以及一种针对一种第二靶标抗原表位的第二结合特异性。根据本发明的至少一些实施例，该第二靶标抗原表位是一种Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够分别与表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))以及与表达LSR的靶细胞两者相结合的双特异性分子。这些双特异性分子将LSR表达细胞靶向于效应细胞并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如LSR表达细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、细胞因子释放、或超氧化物阴离子的产生。
根据本发明的至少一些实施例，其中该双特异性分子是多特异性的，该分子除了一种抗-Fc结合特异性之外，可以进一步包括一种第三结合特异性。在一个实施例中，该第三结合特异性是一种抗增强因子(EF)部分，例如与细胞毒性活性中涉及的一种表面蛋白结合并且由此增加针对靶细胞的免疫应答的一种分子。
该“抗增强因子部分”可以是一种抗体、功能性抗体片段或一种与一种给定的分子例如一种抗原或一种受体结合的配体，并因此导致针对Fc受体或靶标细胞抗原的结合决定簇的效应的增强。该“抗增强因子部分”可以结合一种Fc受体或一种靶标细胞抗原。可替代地，该抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性结合的实体。例如，该抗增强因子部分可以结合一种细胞毒性T-细胞(例如，经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的增加的免疫应答的其他免疫细胞)。
根据本发明的至少一些实施例，这些双特异性分子包括作为结合特异性的至少一种抗体、或其抗体片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab').sub.2、Fv、或单链Fv。该抗体还可以是一种轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或在拉德纳(Ladner)等人的美国专利号4,946,778中所说明的一种单链构建体，其内容通过引用而明确地结合。
在一个实施例中，针对一种Fcγ受体的结合特异性是由一种单克隆抗体提供的，这种结合不被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。如在此所使用的，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的八种γ-链基因中的任一种。这些基因共编码十二种跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型被分组为三种Fcγ受体种类：FcγR1(CD64)、FcγRII(CD32)以及FcγRIII(CD16)。在一个优选实施例中，该Fcγ受体是一种人类高亲和性FcγRI。该人类FcγRI是一种对单体IgG(108-10-9M.-1)示出高亲和性的72kDa的分子。
某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的产生和表征由范杰(Fanger)等人在PCT公开案WO88/00052中和在美国专利号4,954,617中说明，其传授内容通过引用而完全结合在此。这些抗体在一个不同于该受体的Fcγ结合位点的位点处与FcγRl、FcyRII或FcyRIII的抗原表位结合，因此，其结合不被生理水平的IgG实质阻断。在本发明中有用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62以及mAb197。产生mAb32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC登录号HB9469。在其他实施例中，该抗-Fcy受体抗体是一种单克隆抗体22的人源化形式(H22)。该H22抗体的产生和表征在格拉齐亚诺(Graziano)，R.F.等人(1995)《免疫学杂志》(J.Immunol.)155(10):4996-5002和PCT公开案WO94/10332中说明。产生H22抗体的细胞系以名称HAO22CLI保藏于美国典型培养物保藏中心，且登录号为CRL11177。
在再其他的优选实施例中，针对Fc受体的结合特异性是由与人类IgA受体(例如，Fc-α受体(FcαRI(CD89)))结合的抗体提供的，其结合优选地不被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的α-基因(FcαRI)的基因产物。已知这个基因编码若干55kDa至10kDa的可变剪接的跨膜同种型。
FcαRI(CD89)组成性地表达于单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜中性粒细胞上，但是不在非效应细胞群体上表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者具有中等亲和性(约5X10-7M-1)，这种亲和性当暴露于细胞因子(例如G-CSF或GM-CSF)时增加(莫顿(Morton)，H.C.等人(1996)《免疫学锐评》(Critical Reviews in Immunology)16:423-440)。已经说明了四种FcaRI特异性单克隆抗体，这些FcaRI特异性单克隆抗体被鉴定为A3、A59、A62和A77，在IgA配体结合结构域之外与FcαRI结合(蒙蒂罗(Monteiro)，R.C.等人(1992)《免疫学杂志》(J.Immunol.)148:1764)。
FcαRI和FcγRI是用于在根据本发明的至少一些实施例的这些双特异性分子中使用的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞上表达，例如，单核细胞、PMN、巨噬细胞以及树突细胞；(2)以高水平表达(例如，5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性的介质(例如，ADCC、吞噬作用)；(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原递呈。
尽管人类单克隆抗体是优选的，但是可以在根据本发明的至少一些实施例的这些双特异性分子中采用的其他抗体是鼠的、嵌合体的以及人源化的单克隆抗体。
本发明的这些双特异性分子可以使用本领域中已知的方法通过使组分结合特异性(例如抗-FcR和抗-LSR结合特异性)轭合来制备。例如，双特异性分子的每种结合特异性可以分别产生并且然后彼此轭合。当结合特异性是蛋白或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂来用于共价轭合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)以及硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)(参见例如卡尔波夫斯基(Karpovsky)等人(1984)《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)160:1686；刘(Liu)，M A等人(1985)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:8648)。其他方法包括在保卢斯(Paulus)(1985)Behring Ins.Mitt.78期，118-132；布伦南(Brennan)等人(1985)《科学》(Science)229:81-83)，以及格伦尼(Glennie)等人(1987)《免疫学杂志》(J.Immunol.)139:2367-2375)中所说明的方法。优选的轭合剂是SATA和sulfo-SMCC，两者都可从皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)(罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(IL))获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两个重链的C-末端绞链区的巯基键合来轭合。在一个特别优选的实施例中，在轭合之前，将绞链区进行修饰以包含奇数的巯基残基，优选是一个。
可替代地，两种结合特异性可以在同一载体中编码并且在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab')2或配体XFab融合蛋白时，这种方法是特别有用的。根据本发明的至少一些实施例的一种双特异性分子可以是一种包括一种单链抗体和一种结合决定簇的单链分子，或一种包括两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包括至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法在例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858中说明。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见米尔斯坦(Milstein)和奎洛(Cuello)，《自然》(Nature)305:537(1983)、WO93/08829以及特兰内克(Traunecker)等人，EMBO J.10:3655(1991))，以及“孔中旋钮(knob-in-hole)”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体还可以通过以下来制备：用于制备抗体Fc杂二聚体分子的工程化静电转向效应(engineering electrostatic steering effect)(WO2009/089004A1)；受控的Fab-臂交换(参见Labrijn等人，PNAS110(13):5145-50(2013))；将两种或更多种抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，以及布伦南(Brennan)等人，《科学》(Science)，229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性分子(参见例如科斯特尔尼(Kostelny)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如霍林格(Hollinger)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如格鲁伯(Gruber)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，152:5368(1994))；以及制备如例如在塔特(Tutt)等人《免疫学杂志》(J.Immunol.)147:60(1991)中所说明的三特异性抗体。
双特异性分子与它们的特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用特异性针对感兴趣的复合物的一种经标记的试剂(例如，一种抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并且特异性结合至抗体-FcR复合物的一种经酶连接的抗体或抗体片段对FcR-抗体复合物进行检测。可替代地，可以使用多种其他免疫测定中的任一种对这些复合物进行检测。例如，可以将该抗体进行放射性标记并且在放射性免疫测定(RIA)中使用(参见例如，温特劳布(Weintraub)，B.，放射性免疫测定的原则(Principles of Radioimmunoassays)，关于放射性配体测定技术的第七次培训课程(Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques)，内分泌学会(The Endocrine Society)，1986年3月，将其通过引用结合在此)。可以通过这样的手段，如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来对放射性同位素进行检测。
抗体及其药物组合物的用途-癌症
“治疗”指治疗性治疗(therapeutic treatment)和预防性或防范性措施两者，在这个实例中这涉及癌症的治疗，然而，还如以下所说明的，抗体和药物组合物的用途还被提供用于治疗感染性疾病和/或自身免疫性病症。需要治疗的那些包括已经患有癌症的那些连同在其中要预防该癌症的那些。因此，待治疗的哺乳动物在此可以已经被诊断为患有该癌症或可以易患或对该癌症敏感。如在此所使用的，术语“治疗”是指以上所说明的癌性疾病、失调或病症的预防、发病的延迟、治愈、逆转(reversing)、弱化、缓解、最小化、抑制、有害作用的停止(halting)、或可辨别症状的稳定。它还包括应对(manage)如以上所说明的癌症。“应对(manage)”指的是降低该疾病的严重性、降低该疾病的发作的频率、降低此类发作的持续时间、降低此类发作的严重性、减缓/降低癌细胞的生长或繁殖、减缓至少一种症状的进展、改善至少一种可测身体参数等。
用于治疗目标的“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、等。优选地，该哺乳动物是人类。优选地，该哺乳动物是一个这样的人，该人被诊断患有在上文中所说明的疾病、失调或病症中的一种，或可替代地，易患至少一种类型的癌症。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的药剂有效地治疗一种哺乳动物的一种疾病或失调的量。
本发明的治疗剂可以单独，或作为它们与药学上可接受的载体混合于其中的药物组合物的一部分来提供给受试者。
根据本发明的至少一些实施例的抗LSR抗体，其一种片段，一种轭合物和/或一种包括上述事物的药物组合物还可以在联合疗法(即与其他增效剂联合)和/或其他疗法中进行给药。根据至少一些实施例，该抗LSR抗体可以与本领域中已知的癌症治疗护理标准(可以例如在http://www.cancer.gov/cancertopics中找到)中的任一种联合使用。
例如，该联合疗法可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂、其他化合物或免疫疗法、或免疫刺激策略联合的一种抗LSR抗体，其一种片段，一种轭合物和/或一种包括上述事物的药物组合物，包括但不局限于：肿瘤疫苗，过继性T细胞疗法，Treg耗尽，抗体(例如，贝伐单抗、爱必妥、易普利姆玛)，肽，肽体，小分子，化学治疗剂，例如细胞毒剂和细胞抑制剂(例如，紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂)，免疫学修饰剂，例如干扰素和白细胞介素，免疫刺激性抗体，生长激素或其他细胞因子，叶酸，维生素，矿物质，芳香酶抑制药，RNAi，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂等。在另一个实例中，该联合疗法可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂联合的、根据本发明的至少一些实施例的一种抗-LSR抗体或LSR调节剂，例如包含LSR抗原的胞外结构域或一种小分子(例如肽、核酶、适体、siRNA)的一种可溶性多肽轭合物，或其他与LSR结合的药物。
根据本发明的至少一些实施例，可以与抗LSR抗体联合使用的治疗剂是使抗肿瘤应答增强的增效剂。
有多种策略可供用于将一种抗LSR阻断抗体与用于癌症免疫疗法的增效剂相联合。根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与主要面向提高内源性抗肿瘤应答的增效剂联合使用，例如放射疗法、冷冻疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的常规/经典化学疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的靶向疗法、抗血管生成疗法、靶向免疫抑制细胞例如Treg和MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、治疗性癌症疫苗、过继细胞转移。
在与某些化学疗法或抗癌常规药物联合使用的背后的科学原理是，癌细胞死亡是大多数化学疗法化合物的细胞毒性作用的结果，可能导致肿瘤抗原的水平提高，肿瘤抗原的水平提高会引起抗原呈递和对抗肿瘤免疫应答的刺激(即免疫原性细胞死亡)增强，导致将抗LSR抗体的效果增效(蔡特福格尔(Zitvogel)等人2008，加卢齐(Galluzzi)等人2012)。其他可能通过肿瘤细胞死亡将抗肿瘤应答增效的联合疗法是放射疗法、冷冻疗法、手术和激素剥夺。这些癌症疗法中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的一种来源。
根据本发明的至少一些实施例，作为用于与抗LSR抗体联合的将抗肿瘤免疫应答增效的药剂的经典化学疗法和常规抗癌疗法选自下组，该组由以下各项组成(但不限于)：铂基化合物，例如奥沙利铂、顺铂、卡铂； 具有抗癌活性的抗生素，例如更生霉素、博来霉素、丝裂霉素-C、光辉霉素，以及蒽环类，例如阿霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星；蒽二酮，例如米托蒽醌；烷化剂，例如达卡巴嗪、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、替莫唑胺、苯丁酸氮芥、白消安、氮芥、亚硝基脲；抗代谢物，例如氟尿嘧啶、雷替曲塞、吉西他滨、阿糖胞苷、羟基脲，以及叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶、培美曲塞；抗有丝***剂，例如polokinase抑制剂，以及微管抑制剂，例如紫杉烷，以及紫杉烷类二萜，例如紫杉醇、多西他赛；长春花碱，例如长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞宾；拓扑异构酶抑制剂，例如依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、依立替康、喜树碱；细胞抑制剂，包括抗***，例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、艾多昔芬(iodoxyfene)，抗雄激素，例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特以及醋酸丙氯孕酮，孕激素类，例如醋酸甲地孕酮，芳香酶抑制药，例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)、依西美坦；GnRH类似物，例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、地加瑞克(degarelix)；以及5α-还原酶抑制剂，例如非那雄胺。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与已经显示出具有抗癌活性的双膦酸盐类，尤其是氨基-双膦酸盐类(ABP)联合使用。与ABP相关联的这些活性中的一些是针对人类γδT细胞的，这些人γδT细胞跨越先天性和获得性免疫的交界面并且具有有力的抗肿瘤活性。
通过诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡或通过参与免疫效应机制，靶向疗法也能够刺激肿瘤特异性免疫应答(加卢齐(Galluzzi)等人2012，瓦内曼(Vanneman)和德拉诺夫(Dranoff)2012)。此外，根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与以下项中的任一项联合使用：特定治疗性单克隆抗体，曲妥珠单抗，它们促成肿瘤特异性细胞毒性CD8T细胞的产生，以及NK细胞渗入肿瘤和NK细胞介导的细胞毒作用；特定酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，它们通过提高MHC II类的表达、肿瘤浸润性免疫抑制细胞Treg和MDSC的降低的水平、降低出自肿瘤细胞的免疫抑制酶IDO的表达、和/或DC功能的抑制来促进癌症定向免疫应答；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，它们被发现会提高在癌细胞表面上的NK激活受体配体的表达，从而协助NK细胞对肿瘤细胞的识别，而蛋白酶体抑制剂被发现会使肿瘤细胞对CTL介导的或NK介导的细胞裂解变得敏感。
根据本发明的至少一些实施例，被用作用于与用于治疗癌症的抗LSR抗体联合的药剂的靶向疗法选自下组，该组由以下各项组成(但不限于)：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，例如伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、倍力诺斯塔特(belinostat)、摩西提诺斯塔特(mocetinostat)、阿贝西诺斯塔特(abexinostat)、恩替诺特、雷斯姆诺斯塔特(resminostat)、吉维诺司他(givinostat)、奎西诺斯塔特(quisinostat)、丁酸钠；蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米、卡非佐米、双硫仑；mTOR途径抑制剂，例如坦罗莫司、雷伯霉素、依维莫司；PI3K抑制剂，例如哌立福辛、CAL101、PX-866、IPI-145、BAY80-6946；B-raf抑制剂，例如维罗非尼、索拉非尼；JAK2抑制剂，例如来他替尼、帕克里替尼布(pacritinib)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，例如埃罗替尼、伊马替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、吉非替尼、索拉非尼、尼罗替尼、托西尼布(toceranib)、博舒替尼、来那替尼、瓦他拉尼、瑞格菲尼、卡博替尼；其他蛋白激酶抑制剂，例如克唑替尼；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂，例如Ras/Raf信号转导抑制剂，例如法尼基转移酶抑制剂；丝氨酸蛋白酶(例如蛋白裂解酶(matriptase)、赫普森(hepsin)、尿激酶)的抑制剂；细胞内信号转导抑制剂，例如替吡法尼、哌立福辛；通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号转导的抑制剂；极光激酶抑制剂，例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528、AX39459；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如CDK2和/或CDK4抑制剂；存活信号转导蛋白(包括Bcl-2、Bcl-XL)的抑制剂，例如ABT-737；HSP90抑制剂；治疗性单克隆抗体，例如抗EGFR mAb西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗，抗ERBB2mAb曲妥珠单抗、帕妥珠单抗，抗CD20mAb例如利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗，以及靶向其他肿瘤抗原的mAb，例如阿仑单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳妥珠单抗；TRAIL途径激动剂，例如杜拉乐明(dulanermin)(可溶性rhTRAIL)、阿波单抗、玛帕图木单抗、来沙木单抗、西他土珠单抗、替加珠单抗；抗体片段，双特异性抗体和双特异性T细胞衔接器(BiTE)，例如卡妥索单抗、布李纳图木单抗；抗体药物轭合物(ADC)以及其他免疫轭合物，例如替伊莫单抗屈昔坦、托西莫单抗、布伦土昔单抗威多廷、吉妥珠单抗奥佐米星、克利维妥珠单抗四昔坦、佩姆图木单抗、曲妥珠单抗埃姆坦西尼；抗血管生成疗法，例如贝伐单抗、伊瑞西珠、伏洛昔单抗、雷姆齐鲁单抗、阿柏西普、索拉非尼、舒尼替尼、瑞格菲尼、阿西替尼、南特达尼(nintedanib)、莫替沙尼、帕唑帕尼、西地尼布；金属蛋白酶抑制剂，例如马立马司他；尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂；组织蛋白酶活性的抑制剂。
其他也能够提高内源性抗肿瘤应答的癌症免疫疗法还可以通过增强免疫效应机制(例如过继T细胞疗法、治疗性癌症疫苗、免疫抑制细胞和它们的功能的降低、细胞因子疗法或免疫刺激性抗体)使抗LSR抗体的效果增效。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与靶向调节性免疫抑制细胞(例如调节T细胞(Treg)和髓样来源抑制细胞(MDSC))的治疗剂联合使用。多种常用的化疗药物施加对Treg的非特异性靶向，并且降低Treg或MDSC的数量或免疫抑制能力(法恰贝内(Facciabene)等人2012；伯恩(Byrne)等人2011；加布里洛维奇(Gabrilovich)和纳加拉杰(Nagaraj)2009)。在此方面，用某些化学疗法药物的节拍疗法经由对调节性细胞的调节导致了免疫刺激性而非免疫抑制性效应。因此，根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与选自(但不限于)以下项的药物联合使用：环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、氟达拉滨、多西他赛、紫杉醇、沙利度胺和沙利度胺衍生物。
此外，根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与新型Treg特异性靶向药剂联合使用，这些新型Treg特异性靶向药剂包括：1)通过识别Treg细胞表面受体而直接靶向Treg的耗减(depleting)或杀伤抗体，例如抗CD25mAb达利珠单抗、巴利昔单抗，或2)配体定向毒素，例如地尼白介素(Ontak)-一种人类IL-2和白喉毒素的融合蛋白，或LMB-2-一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的一种融合物。3)靶向Treg细胞表面受体(例如CTLA4、PD-1、OX40和GITR)的抗体。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与在下面说明的用于扰乱Treg诱导和/或功能的这些选项中的任一项联合使用，包括TLR(toll样受体)激动剂；干扰腺苷能途径(adenosinergic pathway)的药剂，例如胞外核苷酸酶抑制剂，或A2A腺苷受体的抑制剂；TGF-β抑制剂，例如夫苏木单抗(fresolimumab)、乐地单抗、美替木单抗(metelimumab)、trabedersen、LY2157299、LY210976；对Treg向肿瘤组织募集的阻断，包括趋化因子受体抑制剂，例如CCR4/CCL2/CCL22途径。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与在下面说明的用于对免疫抑制性肿瘤微环境进行抑制的这些选项中任一项联合使用，包括发挥免疫抑制活性的细胞因子和酶的抑制剂，例如IDO(吲哚胺-2,3-双加氧酶)抑制剂；促进一种免疫抑制性微环境的抗炎性细胞因子的抑制剂，例如IL-10、IL-35、IL-4和IL-13；降低Treg并且促成DC分化的贝伐单抗。
。根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与在下面说明的用于靶向MDSC的这些选项中的任一项联合使用，包括通过维生素D3或维生素A代谢产物(例如视黄酸、全反式维甲酸(ATRA))促进它们分化为不具有抑制功能的成熟髓样细胞；通过COX2抑制剂、磷酸二酯酶5抑制剂(像西地那非)、ROS抑制剂(例如硝基阿司匹林(nitroaspirin))对MDSC抑制活性进行抑制。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与作为使抗肿瘤免疫应答增效的药剂的免疫刺激性抗体联合使用(帕多尔(Pardoll)2012)：
免疫刺激性抗体通过直接调节免疫功能，即阻断其他抑制性靶标或增强共刺激蛋白，而促进抗肿瘤免疫。根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与靶向免疫检验点的拮抗性抗体联合使用，这些拮抗性抗体包括抗CTLA4mAb，例如易普利姆玛、曲美目单抗；抗PD-1，例如尼沃鲁单抗(nivolumab)BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、AMP224、CT-011、MK-3475；抗PDL-1拮抗剂，例如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A；抗LAG-3，例如IMP-321，抗TIM-3，抗BTLA，抗B7-H4，抗B7-H3，抗VISTA；与靶向免疫刺激性蛋白的激动性抗体联合使用，这些激动性抗体包括抗CD40mAb，例如CP-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)；抗CD137mAb，例如BMS-663513urelumab、PF-05082566；抗OX40mAb，例如抗OX40；抗GITR mAb，例如TRX518；抗CD27mAb，例如CDX-1127；抗ICOS mAb。
细胞因子是分子信使，这些分子信使允许免疫***的细胞相互之间进行通讯，以产生对一种靶标抗原的一种协调的、稳健的、但是自限性的应答。基于细胞因子的疗法体现了一种对患者自己的免疫***进行刺激以抗拒癌症的直接尝试。在过去的二十年中，对利用免疫***以根除癌症的日益增长的兴趣已经伴随着更高的努力，以对细胞因子进行表征，并且对它们的巨大的信号转导网络进行利用以发展对癌症的治疗。细胞因子对在肿瘤位点的免疫效应细胞和基质细胞进行直接刺激，并且增强细胞毒性效应细胞对肿瘤细胞的识别。许多动物肿瘤模型研究已经证实，细胞因子具有广泛的抗肿瘤活性，并且这已经被转化为多种用于癌症疗法的基于细胞因子的方法(李(Lee)和马戈林(Margolin)2011)。多种细胞因子处于临床前或临床开发中，作为用于癌症免疫疗法的使抗肿瘤免疫应答增效的药剂，其中包括：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNβ、IFNγ。
若干细胞因子已经被批准用于癌症的治疗，并且还有更多正在开发中。然而，治疗疗效常常受重度副作用和不良药代动力学特性所妨碍。因此，除了细胞因子的全身性给药之外，可以运用多种策略用于递送治疗性细胞因子和将它们定位至肿瘤位点，以便改善它们的药代动力学，连同它们的疗效和/或毒性，包括抗体-细胞因子融合分子(免疫细胞因子)、与聚乙二醇化学轭合(PEG化)、细胞因子在自体全肿瘤细胞中的转基因表达、细胞因子基因结合于DNA疫苗中、对细胞因子基因进行递送的重组病毒载体等。在免疫细胞因子的情况下，细胞因子与肿瘤特异性抗体或抗体片段的融合考虑到了靶向递送，并且因此考虑到了改善的疗效和药代动力学，以及降低的副作用。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与细胞因子疗法联合使用，该细胞因子疗法涉及使用细胞因子作为使抗肿瘤免疫应答增效的药剂，包括细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNα-2b、IFNβ、IFNγ，以及它们的不同递送策略，如以上所说明的。
癌症疫苗用于治疗现有的癌症(治疗性的)或防止癌症在特定的高危个体中的发展(预防性的)。治疗性癌症疫苗考虑到了改善的T细胞启动，以及改善的抗原呈递，并且能够用作用于使抗肿瘤免疫应答增效的治疗剂(梅尔曼(Mellman)等人2011；施洛姆(Schlom)2012)。
若干种类型的治疗性癌症疫苗处于临床前和临床开发中。这些包括例如：
1)全肿瘤细胞疫苗，其中，将在手术期间移除的癌细胞进行处理以增强它们的免疫原性，并且注射入该患者体内以诱导针对这些肿瘤细胞中的抗原的免疫应答。该肿瘤细胞疫苗可以是自体的，即一名患者自己的肿瘤，或同种异体的，典型地，包含一种给定的肿瘤类型的两种或三种已建立的并且已表征的人类肿瘤细胞系，例如GVAX疫苗平台。
2)肿瘤抗原疫苗，其中，将一种肿瘤抗原(或几种肿瘤抗原的组合)，通常是蛋白或肽，进行给药以加强免疫***(可能是与一种佐剂和/或与免疫调节剂或树突细胞的吸引剂，例如GM-CSF一起)。这些肿瘤抗原可以特异性地针对一种特定类型的癌症，但是它们不是针对一名具体的患者制成的。
3)基于载体的肿瘤抗原疫苗和DNA疫苗能够被用作一种提供抗原的一种稳定供应的方式，以刺激一种抗肿瘤免疫应答。将针对肿瘤抗原进行编码的载体注射入该患者(可能是与促炎性的或其他的吸引剂，例如GM-CSF一起)，这些载体在体内被细胞摄取，以制成特异性抗原，这些特异性抗原然后将激起所希望的免疫应答。载体可以用于一次递送一种以上肿瘤抗原，以提高免疫应答。此外，重组病毒、细菌或酵母载体应当引发它们自己的免疫应答，这些免疫应答也可以增强总体免疫应答。
4)溶瘤病毒疫苗，例如OncoVex/T-VEC，该OncoVex/T-VEC涉及优先感染癌细胞的条件复制型单纯疱疹病毒(replication-conditional herpessimplex virus)的肿瘤内注射。该病毒(还进行工程化以表达GM-CSF)能够在一种癌细胞内复制，导致它的裂解，释放新的病毒和大量肿瘤抗原，并且在该过程中分泌GM-CSF。因此，此类溶瘤病毒疫苗增强了肿瘤微环境中的DC功能，以刺激抗肿瘤免疫应答。
5)树突细胞疫苗(帕鲁卡(Palucka)和邦舍罗(Banchereau)2012)：树突细胞(DC)吞噬肿瘤细胞，并且将肿瘤抗原呈递至肿瘤特异性T细胞。在这种方法中，将DC从该癌症患者中分离，并且针对呈递肿瘤特异性T细胞进行启动。为此，可以使用若干方法：用肿瘤细胞或裂解物对DC进行加载；用肿瘤抗原的融合蛋白或肽对DC进行加载；将肿瘤抗原偶联至DC靶向mAb。将这些DC在一种刺激因子(例如GM-CSF)的存在下进行处理，进行激活并且进行离体成熟化，并且然后再注入回该患者体内，以便激起一种对这些癌细胞的免疫应答。还可以通过用被工程化以分泌刺激细胞因子(例如GM-CSF)的经辐照的全肿瘤细胞对患者进行注射，在体内对树突细胞进行启动。可以用单核细胞实施相似的方法。Sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))是一种已经被批准用于晚期***癌的治疗的治疗性癌症疫苗，是一种树突细胞疫苗的一个实例。
因此，根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与治疗性癌症疫苗联合使用。此类治疗性癌症疫苗的非限制性实例包括全肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、基于载体的疫苗、溶瘤病毒疫苗、树突细胞疫苗，如以上所说明的。
癌症免疫疗法的一种方法是基于过继T细胞疗法或过继细胞转移(ACT)，它涉及天然存在的自体肿瘤特异性T细胞的离体鉴定和扩增，这些天然存在的自体肿瘤特异性T细胞然后被过继转移回至该癌症患者体内(雷斯蒂福(Restifo)等人2012)。在离体扩增之后被注入回至一名患者体内的细胞能够流通至肿瘤，并且介导对它的消灭。在这种过继转移之前，可以通过辐照和/或化学疗法对宿主进行免疫耗竭。淋巴耗竭、过继细胞转移和T细胞生长因子(例如IL-2)的组合能够引起肿瘤患者中的持久的肿瘤根除。一种更新的方法涉及正常外周血T细胞的离体遗传修饰，以赋予针对肿瘤相关抗原的特异性。例如，具有特别良好的抗肿瘤应答的T细胞的TCR的克隆能够被***至病毒表达载体中，并且被用于对来自待治疗的患者的自体T细胞进行感染。另一个选项是使用嵌合抗原受体(CAR)，这些嵌合抗原受体实质上是一种嵌合免疫球蛋白-TCR分子，也被称为一种T体。被移植到能够激活T细胞的TCR细胞内结构域上的CAR具有抗体样特异性，并且识别在靶细胞表面上的MHC非限制性结构(细胞外靶标结合模块)(雷斯蒂福(Restifo)等人2012，史(Shi)等人2013)。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗LSR抗体与使抗肿瘤免疫应答增效的过继细胞转移联合使用，该过继细胞转移包括经遗传修饰的T细胞，如以上所说明的。
根据本发明的至少一些实施例的这些LSR特异性抗体、和/或替代支架和/或多特异性及双特异性分子和免疫轭合物、包括上述事物的组合物，可以与一种或多种其他治疗剂一起进行共给药，该一种或多种其他治疗剂与根据本发明的至少一些实施例的该组合物结合或协同起作用，以治疗或预防癌症。这些LSR相关治疗剂以及该一种或多种其他治疗剂可以顺序地或同时地进行给药。这些其他治疗剂是例如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂。该组合物可以被连接至该药剂(作为一种免疫复合物)或可以与该药剂分别进行给药。在后一种情况(分别给药)下，该组合物可以在该药剂之前、之后或同时进行给药，或可以与其他已知疗法，例如一种抗癌疗法(例如辐射)，进行共给药。此类治疗剂除了其他之外还包括抗肿瘤剂，例如阿霉素(亚德里亚霉素)、顺铂硫酸博莱霉素、卡莫司汀、瘤可宁、以及环磷酰胺羟基脲，它们本身只有处于对患者有毒性或亚毒性水平才有效。将顺铂依照100mg/剂每四周静脉给予一次，并且将亚德里亚霉素依照60-75mg/ml剂量每21天静脉给予一次。根据本发明的至少一些实施例的人类抗LSR抗体、或其抗原结合片段和/或替代支架与化学治疗剂的共给药提供两种抗癌剂，这两种抗癌剂经由不同机制起作用，这些不同机制对人类肿瘤细胞产生细胞毒性效应。这样的共给药可以解决因药物抗性形成或使得肿瘤细胞与抗体不反应的肿瘤细胞抗原性改变而引起的问题。在其他实施例中，可以额外用调节(例如，增强或抑制)Fcy或Fcy受体的表达或活性的一种药剂治疗该受试者，例如，用一种细胞因子治疗该受试者。用于在利用多特异性分子的治疗期间进行给药的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)，和肿瘤坏死因子(TNF)。
靶标特异性效应细胞，例如被连接至根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)的效应细胞也可以被用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人类白细胞，例如巨噬细胞、噬中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞以及其他带IgG-受体或IgA-受体的细胞。如果希望的话，效应细胞可以从待治疗的受试者获得。可以将这些靶标特异性效应细胞作为一种生理学上可接受的溶液中的一种细胞悬浮液来进行给予。所给药的细胞的数目可以是约10-8至10-9，但是将取决于治疗目的而变化。通常，这个量足以获得在靶细胞(例如一种表达LSR蛋白的肿瘤细胞)处的定位，并且通过例如吞噬作用足够实现杀死细胞。给药途径也可以变化。
使用靶标特异性效应细胞的疗法可以与用于去除靶细胞的其他技术结合进行。例如，使用根据本发明的至少一些实施例的这些组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)和/或配备有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法结合使用。额外地，可以使用联合免疫疗法来使两种不同的细胞毒性效应群体指向肿瘤细胞排斥。例如，被连接至抗-Fc-γRI或抗-CD3的抗-LSR抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂结合使用。
根据本发明的至少一些实施例的双特异性分子和多特异性分子也可以被用来调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过帽化并且消除细胞表面上的受体。抗-Fc受体的混合物也可以用于这个目的。
在补体存在的情况下，还可以使用根据本发明的至少一些实施例的具有补体结合位点(例如，来自结合补体的IgGl、IgG2、或IgG3或IgM的部分)的这些治疗组合物(例如，人类抗体、替代支架、多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物)。在一个实施例中，包括具有根据本发明的至少一些实施例的一种结合剂的靶细胞以及适当的效应细胞的一种细胞群体的离体治疗可以通过添加补体或包含补体的血清进行补充。被根据本发明的至少一些实施例的一种结合剂包被的靶细胞的吞噬作用可以通过补体蛋白的结合来改善。在另一个实施例中，被根据本发明的至少一些实施例的这些组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)包被的靶细胞也可以被补体裂解。在又另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例的这些组合物不激活补体。
还可以将根据本发明的至少一些实施例的这些治疗组合物(例如，人类抗体、替代支架、多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物)与补体一起进行给予。因此，根据本发明的至少一些实施例，存在包括人类抗体、多特异性分子或双特异性分子以及血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为这种补***于紧密接近这些人类抗体、多特异性分子或双特异性分子处。可替代地，可以将根据本发明的至少一些实施例的这些人类抗体、多特异性分子或双特异性分子与补体或血清分开给予。
优选地，“治疗有效剂量”的根据本发明的至少一些实施例的一种抗LSR抗体会导致疾病症状的严重度的下降、疾病无症状时期的频率和持续时间的提高、寿命的提高、疾病缓解或由于疾病痛苦造成的损伤或残疾的预防。例如，为了治疗LSR阳性肿瘤，优选地，“治疗有效剂量”将细胞生长或肿瘤生长抑制至少大约20％，更优选地，抑制至少大约40％，甚至更加优选地，抑制至少大约60％，并且仍然更加优选地，抑制至少大约80％(相对于未经治疗的受试者)。一种化合物抑制肿瘤生长的能力可以在一种预测在人类肿瘤中的疗效的动物模型***中进行评估。可替代地，一种组合物的这种特性可以通过检查该化合物抑制的能力来进行评估，这样的体外抑制是通过熟练的从业者已知的测定进行的。治疗化合物的治疗有效量可以降低肿瘤尺寸，或以另外的方式改善受试者的症状。
本领域普通技术人员将能够基于例如受试者体型、受试者症状的严重度以及所选择的具体组合物或给药途径的因素来确定治疗有效量。
根据本发明的至少一些实施例的这些抗-LSR抗体可以用作中和抗体。一种中和抗体(Nab)是一种能够结合并且中和或抑制一种特异性抗原从而抑制其生物效应的抗体，例如通过阻断细胞或病毒上的受体，抑制该病毒与宿主细胞的结合。Nab将部分地或彻底地废除一种药剂的生物作用，通过阻断其活性所需要的一种重要的表面分子或通过干扰该药剂与一种靶细胞上的其受体的结合。
如在此所使用的，“治疗剂”是如在此所列举的、被采用用于癌症治疗的这些单克隆和/或多克隆抗体、和/或抗原结合片段、和/或包含上述事物的轭合物、和/或包括与这些LSR多肽中任一种或其一种抗原表位特异性结合的一种抗原结合位点的其替代支架中的任一种。
根据本发明的一个额外的方面，这些治疗剂可以用来防止对T细胞活性的病理性抑制，例如针对癌细胞的那种。
根据本发明的一个额外的方面，这些治疗剂可以用来抑制T细胞激活，如可以例如由T细胞增殖和细胞因子分泌所证明的。
因此，根据本发明的一个额外的方面，提供了一种通过以下来在一名受试者中治疗如在此所列举的癌症，和/或促进由LSR多肽所介导的免疫刺激的方法：向一位有需要的受试者给予一个有效量的这些治疗剂中的任一种和/或包括这些治疗剂中的任一种并且进一步包括一种药学上可接受的稀释剂或运载体的一种药物组合物。
还可以将根据本发明的至少一些实施例的一种治疗剂或药物组合物与其他化合物或免疫疗法结合进行给予。例如，该联合疗法可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂、或免疫刺激策略联合的本发明的一种化合物，包括但不局限于：肿瘤疫苗，过继性T细胞疗法，Treg耗尽，抗体(例如，贝伐单抗、爱必妥)，肽，肽体(pepti-bodies)，小分子，化学治疗剂，例如细胞毒剂和细胞抑制剂(例如，紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂)，免疫学修饰剂，例如干扰素和白细胞介素，免疫刺激性抗体，生长激素或其他细胞因子，叶酸，维生素，矿物质，芳香酶抑制药，RNAi，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂等。
根据至少一些实施例，免疫细胞(优选是T细胞)可以在体内或离体与这些治疗剂进行接触以调节免疫应答。与这些治疗剂进行接触的T细胞可以是表达T细胞受体(包括α/β和γ/δT细胞受体)的任何细胞。T-细胞包括表达CD3的所有细胞，包括还表达CD4和CDS的T-细胞子集。T-细胞包括初始和记忆细胞以及效应细胞，例如CTL。T-细胞还包括例如Th1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、Th17、Th22、Treg以及Tr1细胞的细胞。T-细胞还包括NKT-细胞以及T-细胞谱系的相似独特类别。
LSR阻断还可以与标准癌症治疗联合。LSR阻断可以与化学治疗方案有效地联合。在这些实例中，降低所给予的化学治疗试剂的剂量是可能的。这样一种联合的一个实例是与用于治疗晚期肾细胞癌的坦罗莫司联合的一种抗LSR抗体。这样一种联合的另一个实例是与用于治疗晚期肾细胞癌的白介素2(IL-2)联合连同与易普利姆玛或BMS-936558联合的一种抗LSR抗体。将LSR阻断与化学疗法联合使用背后的科学原理是，细胞死亡是大多数化学疗法化合物的细胞毒性作用的结果，应当导致在抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平的提高。其他可能通过细胞死亡而导致与LSR阻断的协同的联合疗法是放射疗法、冷冻疗法、手术和激素剥夺。其他用额外的免疫调节分子的额外的联合疗法将协同地促成对免疫***的刺激以根除癌症。这些方案中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的一种来源。血管生成抑制剂也可以与LSR阻断联合。对血管发生的抑制引起肿瘤细胞死亡，肿瘤细胞死亡可以将肿瘤抗原投入宿主的抗原呈递途径中。
LSR阻断抗体也可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞的双特异性抗体联合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可以被用来靶向两种不同的抗原。例如，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体已经被用来将巨噬细胞靶向至肿瘤位点。这种靶向可以更加有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过使用LSR阻断而被扩充。可替代地，可以通过使用双特异性抗体而将抗原直接递送至DC，这些双特异性抗体与肿瘤抗原和一种树突细胞特异性细胞表面标志物相结合。
肿瘤通过各种各样的机制逃避宿主免疫监视。可以通过对由这些肿瘤所表达的、并且是免疫抑制性的蛋白进行失活，克服这些机制中的许多种。这些其中包括TGF-β(克尔(Kehrl)，J.等人(1986)《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)163:1037-1050)、IL-10(霍华德(Howard)，M.和O'Garra,A.(1992)《今日免疫学》(Immunology Today)13:198-200)、以及Fas配体(哈恩(Hahne)，M.等人(1996)《科学》(Science)274:1363-1365)。关于这些实体中的每一种的抗体可以与抗LSR联合使用，以抵消免疫抑制剂的效应并且促成宿主的肿瘤免疫应答。
其他可以被用来激活宿主免疫应答性的抗体可以与抗LSR联合使用。这些包括对DC功能和抗原呈递进行激活的、在树突细胞表面上的分子。抗CD40抗体能够有效代替辅助性T细胞活性(里奇(Ridge)，J.等人(1998)《自然》(Nature)393:474-478)，并且可以与LSR抗体结合使用(伊托(Ito)，N.等人(2000)《免疫生物学》(Immunobiology)201(5)527-40)。将关于T细胞共刺激分子(例如OX-40(温伯格(Weinberg)，A.等人(2000)《免疫学》(Immunol)164:2160-2169)、4-1BB(梅莱罗(Melero)，I.等人(1997)《自然医学》(Nature Medicine)3:682-685(1997))、以及ICOS(胡特洛夫(Hutloff)，A.等人(1999)《自然》(Nature)397:262-266))的抗体连同阻断负向共刺激分子(例如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097，易普利姆单抗(implimumab))或BTLA(渡边(Watanabe)，N.等人(2003)《自然免疫学》(Nat Immunol)4:670-9)、B7-H4(西卡(Sica)，G L等人(2003)《免疫学》(Immunity)18:849-61)、PD-1)的活性的抗体进行激活也可以为T细胞激活的水平提高做准备。骨髓移植当前正在被用来治疗造血来源的各种肿瘤。尽管移植物抗宿主疾病是这种治疗的一种结果，从移植物抗肿瘤应答中可以得到治疗益处。LSR阻断可以用来提高这些供体移入的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还有若干实验性治疗方案，这些实验性治疗方案涉及对抗原特异性T细胞进行离体激活和扩增以及将这些细胞过继转移至受者中，以便针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg,R.和Riddell,S.(1999)Science285:546-51)。这些方法还可以用来激活对感染因子(例如CMV)的T细胞应答。可以预期在抗LSR抗体的存在下进行的离体激活会提高这些经过继转移的T细胞的频率和活性。
可任选地，关于LSR的抗体可以与一种免疫原性剂(例如癌性细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽以及糖类分子)、细胞以及用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞)联合(He等人(2004)《免疫学杂志》(J.Immunol.)173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括用于治疗结肠癌的MUC1的肽、用于治疗卵巢癌的MUC-1/CEA/TRICOM的肽、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(在下面进一步讨论)。
在人类中，一些肿瘤已经显示出是免疫原性的，例如RCC。预计通过LSR阻断将T细胞激活的阈值提升，我们可以预期会激活宿主中的肿瘤应答。
当与一种疫苗接种方案联合时，LSR阻断很可能是最有效的。已经策划出了许多种用于针对肿瘤进行疫苗接种的实验性策略(参见罗森堡(Rosenberg)，S.,2000，癌症疫苗的开发(Development of Cancer Vaccines)，ASCO教育册春(ASCO Educational Book Spring):60-62；洛戈塞蒂斯(Logothetis)，C.,2000，ASCO教育册春(ASCO Educational Book Spring):300-302；哈亚特(Khayat)，D.2000，ASCO教育册春(ASCO EducationalBook Spring):414-428；富恩(Foon)，K.2000，ASCO教育册春(ASCOEducational Book Spring):730-738；还参见雷斯蒂福(Restifo)，N.和索诺尔(Sznol)，M.，癌症疫苗(Cancer Vaccines)，Ch.61,3023-3043页德维塔(DeVita)，V.等人(编辑)，1997，《癌症：肿瘤学的原理和实践》(Cancer:Principles and Practice of Oncology).第五版)。在这些策略中的一种中，一种疫苗是使用自体的或同种异体的肿瘤细胞制备的。这些细胞疫苗已经显示出当这些肿瘤细胞被转换以表达GM-CSF时是最有效的。GM-CSF已经显示出是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的一种强有力的激活剂(德拉诺夫(Dranoff)等人(1993)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.)90:3539-43)。
在不同肿瘤中对基因表达以及大规模基因表达模式的研究已经引起对所谓肿瘤特异性抗原的定义(罗森堡(Rosenberg)，S A(1999)《免疫学》(Immunity)10:281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在这些肿瘤中以及在肿瘤从其中出现的细胞中所表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100，MAGE抗原以及Trp-2。更重要地，这些抗原中的许多种可以显示出是在宿主中所发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。LSR阻断可以与在一种肿瘤中所表达的重组蛋白和/或肽的一种集合结合使用，以便产生对这些蛋白的一种免疫应答。这些蛋白被免疫***正常地视为自身抗原，并且因此对它们是耐受的。该肿瘤抗原还可以包括蛋白端粒酶，该蛋白端粒酶是合成染色体的端粒所需要的，并且在85％以上的人类癌症中并且只在数量有限的体细胞组织中表达(金姆(Kim)，N等人(1994)《科学》(Science)266:2011-2013)。(可以通过不同手段保护这些体细胞组织免于免疫攻击)。肿瘤抗原还可以是由于改变了蛋白序列或产生了两种不相关序列之间的融合蛋白(即费城染色体中的bcr-ab1)的体细胞突变而在癌细胞中所表达的“新抗原”，或来自B细胞肿瘤的个体遗传型。
其他肿瘤疫苗可以包括来自牵涉进人类癌症中的病毒(例如人***瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)以及卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KHSV))的这些蛋白。可以与LSR阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一种形式是从该肿瘤组织本身所分离的经纯化的热激蛋白(HSP)。这些热激蛋白包含来自这些肿瘤细胞的蛋白的片段，并且这些HSP在向用于引发肿瘤免疫的抗原呈递细胞的递送上是高效的(索特(Suot)，R和斯里瓦斯塔瓦(Srivastava)，P(1995)《科学》(Science)269:1585-1588；田村(Tamura)，Y.等人(1997)《科学》(Science)278:117-120)。
树突细胞(DC)是可以用来启动抗原特异性应答的强有力的抗原呈递细胞。DC可以离体产生，并且用不同蛋白和肽抗原连同肿瘤细胞提取物进行加载(内斯特尔(Nestle)，F.等人(1998)《自然医学》(Nature Medicine)4:328-332)。还可以通过遗传手段对DC进行转换以同样表达这些肿瘤抗原。还已经将DC直接融合至用于免疫接种目的的肿瘤细胞(库格勒(Kugler)，A.等人(2000)《自然医学》(Nature Medicine)6:332-336)。作为疫苗接种的一种方法，DC免疫接种可以与LSR阻断有效联合，以激活更加强有力的抗肿瘤应答。
根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂作为用于癌症疫苗接种的佐剂的用途：
针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫接种是用于癌症治疗和预防的一种有前途的途径，但是它面对若干挑战和局限，例如与由肿瘤细胞表达的自身抗原相关的耐受性机制。共刺激分子(例如B7.1(CD80)和B7.2(CD86))在动物模型中已经改善了基于基因的疫苗和基于细胞的疫苗的疗效，并且作为佐剂在临床试验中处于研究之下。这种佐剂活性可以通过增强共刺激信号或阻断抑制信号来实现，该抑制信号是由肿瘤细胞表达的负向共刺激因子传递的(内伯斯(Neighbors)等人，2008《免疫疗法杂志》(JImmunother.)；31(7):644-55)。
根据本发明的至少一些实施例，特异性针对LSR蛋白中的任一种的多克隆或单克隆抗体和/或抗原结合片段和/或包含上述事物的轭合物、和/或替代支架中的任一种可以被用作用于癌症疫苗接种的佐剂。根据至少一些实施例，本发明提供了用于改善针对TAA的免疫接种的方法，包括向一名患者给予一个有效量的特异性针对LSR蛋白中的任一种的多克隆或单克隆抗体和/或抗原结合片段和/或包含上述事物的轭合物、和/或替代支架中的任一种。
根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂用于免疫增强的用途
1.癌症治疗
在此所提供的这些治疗剂在体内和离体中作为免疫应答刺激治疗剂通常是有用的。通常，这些所披露的治疗剂组合物对于治疗患有或易患其中受试者的免疫***对其发动免疫应答的任何疾病或失调的受试者是有用的。治疗剂调节LSR免疫信号的能力使得一种更强劲的免疫应答成为可能。根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂对于刺激或增强涉及免疫细胞(例如T细胞)的免疫应答是有用的。
根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂对于在宿主中刺激或增强一种免疫应答来治疗癌症是有用的，这是通过将一个在一名受试者中有效刺激T细胞的量的一种治疗剂向该受试者进行给予来实现的。
2.这些治疗剂在疫苗中的用途
根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂进行单独给药或与任何其他适合的治疗进行联合给药。在一个实施例中，可以将这些治疗剂与如以上所说明的一种疫苗组合物结合给予、或作为其组分来给予。可以在一种疫苗给予之前、同时、或之后给予根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂。在一个实施例中，在给予一种疫苗的同时给予这些治疗剂。
抗体和药物组合物用于治疗自身免疫性疾病的用途
根据至少一些实施例，如在此所述的抗体和药物组合物可以可任选地用于治疗一种免疫***相关疾病。
可任选地，该免疫***相关病症包括一种免疫相关病症、如在此所列举的自身免疫性疾病、移植物排斥和移植物抗宿主疾病和/或用于阻断或促进由LSR介导的免疫共刺激、如在此所列举的免疫相关疾病和/或用于免疫疗法(促进或抑制免疫共刺激)。
可任选地，该免疫病症选自自身免疫性疾病、移植排斥、或移植物抗宿主疾病。
可任选地，将该治疗与另一种用于治疗免疫相关病症的部分相联合。
可任选地，该部分选自下组，该组由以下各项组成：免疫抑制剂，例如皮质类固醇、环胞素、环磷酰胺、***、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、雷伯霉素、他克莫司、来氟米特或其一种类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；吗替麦考酚酯；15-去氧精胍菌素或其一种类似物；生物剂，例如TNF-α阻断剂或拮抗剂，或任何其他靶向任何炎性细胞因子的生物剂，非甾体抗炎药物/Cox-2抑制剂、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopryine)、金盐、益赛普、英利昔单抗、吗替麦考酚酯、巴利昔单抗、阿塞西普(atacicept)、利妥昔单抗、环磷酰胺、干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉默、盐酸米托蒽醌、阿那白滞素和/或其他生物制剂和/或静脉内免疫球蛋白(IVIG)、干扰素例如IFN-β-1a(利比阿沃纳斯和希诺韦斯)以及IFN-β-1b(倍泰龙)；叶斯塔维贝他费隆齐弗伦 )；醋酸格拉默(克帕松)，一种多肽；那他珠单抗(泰萨瑞)，米托蒽醌(诺安托)，一种细胞毒剂，一种钙调神经磷酸酶抑制剂，例如环胞素A或FK506；一种免疫抑制性大环内酯，例如雷伯霉素或其一种衍生物；例如40-O-(2-羟基)乙基雷伯霉素，一种淋巴细胞归巢剂，例如FTY720或其一种类似物，皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；甲氨蝶呤；来氟米特或其一种类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；吗替麦考酚酯；15-去氧精胍菌素或其一种类似物；免疫抑制性单克隆抗体，例如关于白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或它们的配体的单克隆抗体；或其他免疫调节化合物，例如CTLA4-Ig(阿巴西普，奥瑞希纳贝拉西普(belatacept))、CD28-Ig、B7-H4-Ig、或其他共刺激药剂，或粘附分子抑制剂，例如mAb或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选凝素拮抗剂和VLA-4拮抗剂，或另一种免疫调节剂。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗多发性硬化症可以与例如用于治疗多发性硬化症的任何已知治疗剂或方法联合。这样的用于治疗多发性硬化症的已知治疗剂或方法的非限制性实例包括干扰素类，IFN-β-1a(利比阿沃纳斯和希诺韦斯)以及IFN-β-1b(倍泰龙叶斯塔维贝他费隆齐弗伦 )；醋酸格拉默(克帕松)，一种多肽；那他珠单抗( )；以及米托蒽醌(诺安托)，一种细胞毒剂，氨吡啶(安帕拉)。其他药物包括皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤，以及静脉内免疫球蛋白(IVIG)、肌苷、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab；R1594)、米留斯(克拉屈滨(Caldribine))、阿来组单抗(坎帕斯(Campath))、达利珠单抗(赛尼哌(Zenapax))、帕那克莱尔(Panaclar)/延胡索酸二甲酯(BG-12)、特立氟胺(Teriflunomide；HMR1726)、芬戈莫德(fingolimod；FTY720)、拉喹莫德(laquinimod；ABR216062)，以及造血干细胞移植、涅罗瓦克斯(Neurovax)、利妥昔单抗(美罗华(Rituxan))、BCG疫苗、低剂量纳曲酮(naltrexone)、驱虫疗法、血管成形术、静脉支架，以及替代疗法，例如维生素D、多不饱和脂肪、医用***。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗类风湿性关节炎可以与例如用于治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗类风湿性关节炎的已知治疗剂或方法的非限制性实例包括糖皮质激素，非甾体抗炎药(NSAID)例如水杨酸盐，或环氧合酶-2抑制剂，布洛芬和萘普生，双氯芬酸，吲哚美辛，依托度酸。缓解病情抗风湿药物(DMARD)-口服DMARD：金诺芬(瑞德)、硫唑嘌呤(依木兰)、环孢霉素(山地明、金格福、新山地明、通用的)、D-青霉胺(固必明)、羟氯喹(氯奎宁)、IM金金硫丁二钠(硫代苹果酸金(Myochrysine))、金硫葡糖(葡糖硫金(Solganal))、来氟米特(爱若华(Arava))、甲氨蝶呤(Rheumatrex)、二甲胺四环素(米诺环素)、葡萄球菌A蛋白免疫吸附(Prosorba柱)、柳氮磺胺吡啶(柳氮磺吡啶)。生物DMARD：TNF-α阻断剂，包括阿达木单抗(修美乐(Humira))、益赛普(恩博(Enbrel))、英利昔单抗(类克(Remicade))、戈利木单抗(辛普尼(Simponi))、赛妥珠单抗佩格尔(certolizumab pegol，西马齐亚(Cimzia))，以及其他生物DMARD，例如阿那白滞素(基纳雷特(Kineret))、利妥昔单抗(美罗华(Rituxan))、托珠单抗(埃克塔姆拉(Actemra))，CD28抑制剂，包括阿巴西普(奥瑞希纳(Orencia))以及贝拉西普。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗IBD可以与例如用于治疗IBD的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗IBD的已知治疗剂或方法的非限制性实例包括控制症状的免疫抑制，例如***(prednisone)、美沙拉嗪(Mesalazine)(包括安萨科(Asacol)、颇得斯安(Pentasa)、里亚尔德(Lialda)、阿斯皮罗(Aspiro))、硫唑嘌呤(依木兰(Imuran))、甲氨喋呤或6-巯基嘌呤、类固醇、昂丹司琼(Ondansetron)、TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗佩格尔(certolizumab pegol))、奥瑞希纳(阿巴西普(abatacept))、优特克单抗(ustekinumab)(喜达诺)、布里金乌单抗(Briakinumab)(ABT-874)、赛妥珠单抗(西马齐亚)、ITF2357(吉维诺司他(givinostat))、那他珠单抗(泰萨瑞(Tysabri))、非拉司特(SB-683699)、类克(英利昔单抗)、维多珠单抗(vedolizumab)(MLN0002)，其他药物包括GSK1605786CCX282-B(特拉费塞特(Traficet)-EN)、AJM300、喜达诺(优特克单抗)、塞马莫德(CNI-1493)、塔索奇蒂尼巴(tasocitinib)(CP-690550)、LMW肝素MMX(LMW Heparin MMX)、布***MMX、辛普尼(戈利木单抗)、马尔蒂斯特姆加德西HPV疫苗(加德西HPV疫苗)、爱巴苏(病毒体的A型肝炎疫苗)，手术，例如肠切除术、肠狭窄成形术(strictureplasty)或暂时性或永久性结肠造口术或回肠造口术抗真菌药，例如制霉菌素(广谱肠抗真菌素)以及伊曲康唑(斯皮仁诺(Sporanox))或氟康唑(大扶康(Diflucan))；替代药物，益生元和益生菌，***，鞭虫属猪丹毒杆菌寄生虫(Trichuris suis helminth)的驱虫治疗或其***的治疗。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗银屑病可以与例如用于治疗银屑病的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗银屑病的已知治疗剂的非限制性实例包括典型地用于轻微疾病的外用剂、用于中度疾病的光照疗法，以及用于严重疾病的全身剂。外用剂的非限制性实例：沐浴溶液和保湿剂、矿物油以及凡士林油；包含以下物质的药膏和乳膏：煤焦油、蒽三酚(蒽啉)、皮质类固醇如去羟米松(去氧米松(Topicort))、倍他米松、氟轻松乙酸酯、维生素D3类似物(例如卡泊三醇)，以及类视黄醇。光照疗法的非限制性实例：阳光；波长为311-313nm，补骨脂素和长波紫外线光照疗法(PUVA)。全身剂的非限制性实例：生物制剂，例如白介素拮抗剂、TNF-α阻断剂，包括抗体，例如英利昔单抗(类克(Remicade))、阿达木单抗(修美乐(Humira))、戈利木单抗、赛妥珠单抗、以及重组TNF-α诱饵受体，益赛普(恩博(Enbrel))；靶向T细胞的药物，例如依法珠单抗(依法利珠单抗，基恩里姆(Xannelim)/瑞体肤(Raptiva))、阿法赛特(阿米维(Ameviv))、树突细胞样依法珠单抗(dendritic cells such Efalizumab)；靶向细胞因子的单克隆抗体(MAb)，包括抗-IL-12/IL-23(优特克单抗(品牌名称喜达诺))以及抗白介素-17；Briakinumab(ABT-874)；小分子，包括但不限于ISA247；免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤、环孢霉素；维生素A和类视黄醇(维生素A的合成形式)；以及替代疗法，例如饮食和生活方式的变化、禁食期(fasting period)、低能量饮食和素食饮食、补充有富含维生素A和维生素D的鱼肝油的饮食(例如鳕鱼肝油)、富含两种ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)并且包含维生素E的鱼肝油的饮食；鱼疗法(Ichthyotherapy)，催眠疗法，***。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗1型糖尿病可以与例如用于治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗1型糖尿病的已知治疗剂的非限制性实例包括胰岛素，胰岛素类似物，胰岛移植，干细胞疗法(包括)，非胰岛素疗法，例如il-lβ抑制剂，包括阿那白滞素(基纳雷特)、阿巴西普(奥瑞希纳)、迪亚迈得(Diamyd)、阿法赛特(alefacept)(阿米维)、欧特利克斯株单抗(Otelixizumab)、DiaPep277(Hsp60衍生肽)，α1-抗胰蛋白酶、***、硫唑嘌呤、环孢霉素，El-INT(一种可注射的胰岛新生疗法，包括表皮生长因子类似物和胃泌激素类似物)，他汀，包括素果塞姆鲁普塞姆卡 塞姆瓦卡西他列汀(二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂)，抗-CD3mAb(例如，特普利株单抗(Teplizumab))；CTLA4-Ig(阿巴西普)，抗IL-Iβ(康纳单抗)，抗-CD20mAb(例如，利妥昔单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗葡萄膜炎可以与例如用于治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗葡萄膜炎的已知治疗剂的非限制性实例包括皮质类固醇，外用睫肌麻痹剂，例如阿托品或后马托品，或注射PSTTA(后部眼球筋膜囊下醋酸去炎松)，抗代谢物药物，例如甲氨蝶呤，TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、益赛普、戈利木单抗、赛妥珠单抗佩格尔(certolizumabpegol))。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗修格兰氏综合征可以与例如用于治疗修格兰氏综合征的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗修格兰氏综合征的已知治疗剂的非限制性实例包括环孢霉素、匹鲁卡品(萨拉基恩(Salagen))以及西维美林(埃沃萨克(Evoxac))、羟基氯喹(氯奎宁)、可的松(***以及其他)和/或硫唑嘌呤(依木兰)或环磷酰胺(癌得星(Cytoxan))、***、沙立度胺、去氢表雄酮、NGX267、瑞巴派特、FID114657、益赛普、瑞体肤(Raptiva)、贝利木单抗、莫须瘤(利妥昔单抗)；阿那白滞素、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、异体骨髓间充质干细胞(AlloMSC)、“Saliwell Crown”的自动神经电刺激。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例的这些药剂来治疗***性红斑狼疮可以与例如用于治疗***性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法联合。此类用于治疗***性红斑狼疮的已知治疗剂的非限制性实例包括皮质类固醇以及缓解病情抗风湿药物(DMARD)、通常抗患疟疾药物例如氯奎宁(plaquenil)以及免疫抑制剂(例如甲氨喋呤和硫唑嘌呤)、羟基氯喹、细胞毒性药物(例如环磷酰胺和吗替麦考酚酯)、羟基氯喹(HCQ)、贝利单抗(Benlysta)(贝利木单抗)、非甾体抗炎症药物、***、骁悉(Cellcept)、普乐可复(Prograf)、阿塞西普(Atacicept)、鲁普佐尔(Lupuzor)、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、骁悉(CellCept)(吗替麦考酚酯)、奥瑞希纳(Orencia)、CTLA4-IgG4m(RG2077)、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、CNTO136、西法木单抗(Sifalimumab；MEDI-545)、A-623(以前AMG623)、AMG557、罗利珠单抗、帕喹莫德(paquinimod；ABR-215757)、LY2127399、CEP-33457、去氢表雄酮、左旋甲状腺素、阿贝莫司钠(abetimussodium；LJP394)、美金刚、阿片类药物、西罗莫司、肾移植、干细胞移植。
如在此所列举的根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂和/或包括上述事物的一种药物组合物可以作为单独活性成分或连同免疫调节方案中的其他药物或其他抗炎剂一起进行给药，例如用于治疗或预防同种异体或异种移植急性或慢性排斥反应或炎性或自身免疫性失调，或用于诱导耐受性。
如在此所使用的，术语“自身免疫性疾病”应该被理解为涵盖任何自身免疫性疾病以及慢性炎性病症。根据本发明的至少一些实施例，这些自身免疫性疾病应该被理解为涵盖选自下组的任何疾病失调或病症，该组包括但不限于：多发性硬化症，包括复发型多发性硬化症，原发性进展型多发性硬化症，以及继发进展型多发性硬化症；银屑病；类风湿性关节炎；银屑病关节炎，***性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞脉管炎，血小板减少性紫癜，特发性血小板减少，特发性自身免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生失调，修格兰氏综合征，风湿性疾病，***疾病，炎性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿性关节炎，痛风性关节炎，肌肉性风湿病，慢性多关节炎，冷球蛋白血症性脉管炎(cryoglobulinemic vasculitis)，ANCA-关联性脉管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征，慢性免疫多神经病，自身免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森病，膜性肾小球性肾病，古德帕斯丘病(Goodpasture's disease)，自身免疫性胃炎，自身免疫性萎缩性胃炎，恶性贫血，天疱疮，寻常型天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多肌炎，纤维肌炎，肌硬化，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，过敏性紫癜，埃文斯综合征(Evans syndrome)，异位性皮炎，银屑病，关节病性银屑病(psoriasis arthropathica)，格雷夫斯氏病，格雷夫斯氏眼病，硬皮病，***性硬皮病，进行性***性硬皮病，哮喘，过敏症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自身免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病，显微镜下多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克病(Devic's disease)，儿童自身免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自身免疫性血细胞减少，在获得性A型血友病中阻止自身免疫性抗VIII因子抗体的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵人综合征，牙龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及炎性皮肤失调，选自下组，该组由以下各项组成：银屑病，异位性皮炎，湿疹，酒渣鼻，荨麻疹，和痤疮，正常补体血症性荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，贝凯特综合征，PAPA综合征，布劳综合征，痛风，成年和少年斯蒂尔氏病(adult and juvenile Still's disease)，冷吡呤病，穆克勒-威尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多***炎性疾病，家族性地中海热，慢性小儿神经***、皮肤和关节综合征，***性幼年特发性关节炎，超IgD综合征(Hyper IgDsyndrome)，施尼茨勒综合征(Schnitzler's syndrome)，自身免疫性视网膜病，年龄相关性黄斑变性，动脉硬化，慢性***炎以及TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPS)。
可任选地并且优选地，该自身免疫性疾病包括但不限于任何以下各项的任何类型和亚型：多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、***性红斑狼疮、炎性肠病、葡萄膜炎、或修格兰氏综合征。
如在此所使用的，“多发性硬化症”包括以下各项中的一种或多种：多发性硬化症、良性多发性硬化症、复发缓和多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、进展型复发多发性硬化症、慢性进展型多发性硬化症、过渡性/进展型多发性硬化症、迅速恶化多发性硬化症、临床上确切的多发性硬化症、恶性多发性硬化症(也被称为马尔堡的变体(Marburg's Variant))、以及急性多发性硬化症。可任选地，“与多发性硬化症有关的病症”包括，例如，德维克病(也被称为视神经脊髓炎)；急性播散性脑脊髓炎、急性脱髓鞘性视神经炎、脱髓鞘横贯性脊髓炎、米勒费歇尔综合征(Miller-Fisher syndrome)、脑脊髓神经根神经病(encephalomyelradiculoneuropathy)、急性脱髓鞘多神经病、肿瘤样多发性硬化症以及巴洛同心圆硬化症。
如在此所使用的，“类风湿性关节炎”包括以下各项中的一种或多种：类风湿性关节炎、痛风和假性痛风、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、斯蒂尔病、强直性脊柱炎、类风湿性脉管炎。可任选地，与类风湿性关节炎有关的病症包括例如骨关节炎、肉状瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、脓毒性关节炎、血色病、肝炎、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、莱姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海热、具有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关周期性综合征，以及与炎性肠病相关的肠病性关节炎。
如在此所使用的，“葡萄膜炎”包括以下各项中的一种或多种：葡萄膜炎、前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间型葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)以及全葡萄膜炎(panuveitic)形式。
如在此所使用的，“炎性肠病”包括以下各项中的一种或多种：炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、***、不确定性结肠炎。
如在此所使用的，“银屑病”包括以下各项中的一种或多种：银屑病，非脓包型银屑病(包括寻常型银屑病和银屑病性红皮病(红皮病型银屑病))，脓包型银屑病(包括泛化脓包型银屑病(冯宗布什(von Zumbusch)的脓包型银屑病))，掌跖脓疱病(持续性掌跖脓疱病、巴伯类型的脓包型银屑病、肢末端的脓包型银屑病)，环形脓疱型银屑病，连续性肢末端皮炎，疱疹样脓疱病。可任选地，与银屑病有关的病症包括例如药物诱导的银屑病、皮褶银屑病、尿布区银屑病、脂溢性皮炎样银屑病、滴状银屑病、指甲银屑病、银屑病性关节炎。
如在此所使用的，“1型糖尿病”包括以下各项中的一种或多种：1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、特发性糖尿病、幼年1型糖尿病、青年的成熟型发病型糖尿病、成人的隐匿性自身免疫糖尿病、妊娠期糖尿病。与1型糖尿病有关的病症包括：神经病变，包括多神经病变、单神经病变、周围神经病变以及自主神经病变；眼睛并发症：青光眼、白内障、视网膜病。
如在此所使用的，“修格兰氏综合征”包括以下各项中的一种或多种：修格兰氏综合征、原发性修格兰氏综合征和继发性修格兰氏综合征、以及涉及修格兰氏综合征的病症，包括***病，例如类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、或硬皮病。其他并发症包括肺炎，肺纤维化，间质性肾炎，肾脏过滤器周围组织的炎症，肾小球性肾炎，肾小管性酸中毒，腕管综合征，周围神经病变，颅神经病变，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝脏的炎症(包括肝炎)，多肌炎，雷诺氏现象(Raynaud'sphenomenon)，脉管炎，自身免疫甲状腺问题，淋巴瘤。
如在此所使用的，“***性红斑狼疮”包括以下各项中的一种或多种：***性红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮性关节炎、狼疮性肺炎、狼疮性肾炎。与***性红斑狼疮有关的病状包括骨关节结核、抗磷脂抗体综合征、心脏各个部分的炎症(例如心包炎、心肌炎以及心内膜炎)、肺以及胸膜炎症、胸膜炎、胸膜腔积液、慢性弥散性间质性肺病、肺动脉高压、肺栓塞、肺出血，以及肺萎缩综合征、狼疮性头痛、格林-巴利综合征(Guillain-Barresyndrome)、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病变、多发性单神经炎、重症肌无力、脊髓病变、颅神经病变、多神经病变、脉管炎。
如在此所使用的，术语“免疫相关疾病(或失调或病症)”应该被理解为涵盖任何选自下组的疾病失调或病症，包括但不限于：自身免疫性疾病，与移植物移植排斥反应相关联的炎性失调和免疫失调，例如器官移植、同种异体干细胞移植、自体干细胞移植、骨髓移植的急性和慢性排斥反应，以及移植物抗宿主疾病。
如在此所使用的，可交换使用的术语“炎性失调”和/或“炎症”包括特征在于对有害刺激(例如病原体、受损细胞、或刺激物)的失调的免疫应答的炎性异常。炎性失调构成非常多的人类疾病的基础。在炎性过程中具有病因学源的非免疫性疾病包括癌症、动脉硬化、以及缺血性心脏病。与炎症相关联的失调的实例包括：慢性***炎，肾小球肾炎，超敏反应，***，再灌注损伤，结节病，脉管炎，间质性膀胱炎，正常补体血症性荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，白塞氏综合征，PAPA综合征，布劳氏综合征，痛风，成人和幼年斯蒂尔病，冷吡呤病，穆克勒-威尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多***炎性疾病，家族性地中海热，慢性婴儿型神经***，皮肤和关节综合征，***性幼年特发性关节炎，超IgD综合征(Hyper IgD syndrome)，施尼茨勒综合征(Schnitzler'ssyndrome)，TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPSP)，牙龈炎，牙周炎，肝炎，肝硬化，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及选自下组的炎性皮肤失调，该组由以下各项组成：银屑病、异位性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹、以及痤疮。
抗体和药物组合物用于治疗感染性疾病的用途
根据至少一些实施例，如在此所述的抗体和药物组合物可以可任选地用于治疗一种感染性疾病。
慢性感染病通常特征在于病毒特异性T-细胞应答的不同程度功能性损伤，并且这种缺陷是宿主没有能力消除持久性病原体的主要原因。尽管在感染的早期阶段过程中最初产生了功能性效应T细胞，但是由于持续性暴露于外源抗原，它们在慢性感染的过程中逐渐失去功能，这导致T细胞耗尽。经耗尽的T细胞表达高水平的多种共抑制性受体，例如CTLA-4、PD-1和LAG3(克劳福德(Crawford)等人，《当前免疫学观点》(Curr OpinImmunol.)2009；21:179-186；考夫曼(Kaufmann)等人，《免疫学杂志》(J Immunol)2009；182:5891-5897，夏普(Sharp)等人，《自然免疫学》(Nat Immunol)2007；8:239-245)。从遭受慢性病毒感染(包括HIV、HCV以及HBV)的患者中临床上观察到出自经耗尽的T细胞的PD-1过表达(克劳福德(Crawford)等人，《当前免疫学观点》(Curr Opin Immunol.)2009；21:179-186；考夫曼(Kaufmann)等人，《免疫学杂志》(J Immunol)2009；182:5891-5897，夏普(Sharp)等人，《自然免疫学》(Nat Immunol)2007；8:239-245)。已经有一些对这种途径在额外的病原体(包括其他病毒、细菌和寄生物)中的研究(霍夫迈尔(Hofmeyer)等人，《生物医学与生物技术杂志》(J Biomed Biotechnol.)2011卷，Art.ID451694，巴德拉(Bhadra)等人，《国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci.)2011；108(22):9196-201)。例如，使用一种通过标准盲肠结扎术和穿孔方法诱导的败血症模型，已经显示出控制细菌感染中涉及到了PD-1途径。在这个模型中，在敲除的小鼠中PD-1的不存在保护其免受败血症诱导的死亡(黄(Huang)等人，PNAS2009:106；6303-6308)。
T细胞耗尽可以通过阻断共抑制途径(例如PD-1或CTLA-4)而被逆转(里瓦斯(Rivas)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2009；183:4284-91；戈尔登-梅森(Golden-Mason)等人，《病毒学杂志》(J Virol.)2009；83:9122-30；霍夫迈尔(Hofmeyer)等人，《生物医学与生物技术杂志》(J Biomed Biotechnol.)2011卷，Art.ID451694)，因此允许抗病毒免疫功能的恢复。用于治疗病毒性感染的共抑制阻断的治疗潜力已经通过阻断PD-l/PD-Ll途径而进行了广泛地研究，这在若干感染的动物模型中显示出是有效的，包括恒河猴中的急性和慢性猴免疫缺陷病毒(SIV)感染(沃卢(Valu)等人，《自然》(Nature)2009；458:206-210)，和小鼠模型中的慢性病毒性感染，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)(巴尔伯(Barber)等人，《自然》(Nature).2006；439:682-7)，以及在SJL/J小鼠中的泰勒鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)模型(邓肯(Duncan)和米勒普洛斯温(Miller PLoS One.)2011；6:el8548)。在这些模型中，PD-l/PD-L1阻断改善了抗病毒性应答并且促进了持久性病毒的清除。此外，PD-l/PD-L1阻断增加了体液免疫，如在血浆中的特异性抗病毒抗体的提高的产量所证明的，这与改善的细胞应答相联合导致血浆病毒载量的减少和增加的存活。
如在此所使用的，可交换使用的术语“感染性失调和/或疾病”和/或“感染”包括由在一个单独的宿主有机体中的病原性生物剂的存在和/或生长导致的任何失调、疾病和/或病症。如在此所使用的，术语“感染”包括如上的展示出临床上明显的疾病(即，疾病的典型医学征象和/或症状)和/或在其许多或全部过程中是无症状的失调、疾病和/或病症。如在此所使用的，术语“感染”还包括由外源抗原的存留导致的失调、疾病和/或病症，该外源抗原导致耗尽T细胞表型，耗尽T细胞表型特征在于减少的增殖以及细胞因子产生所证明的受损的功能性。如在此所使用的，术语“感染性失调和/或疾病”和/或“感染”进一步包括由细菌感染、病毒感染、真菌感染和/或寄生虫感染导致的任何以下所列的感染性失调、疾病和/或病症。
如在此所使用的，术语“病毒感染”包括由病毒导致的任何感染，可任选地包括但不限于：逆转录病毒(例如人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1或HIV-2，获得性免疫缺陷(AIDS)(也被称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III)；以及其他分离株，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如导致肠胃炎的品系)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒、布尼亚病毒(bungavirus)、白蛉病毒以及Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒以及轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；噬肝病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(***状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原学媒介，丁型肝炎的媒介(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)，非甲型、非乙型肝炎的媒介(类别1-内部传输的；类别2-肠道外传输的(即，丙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒，以及星状病毒)连同严重急性呼吸综合征病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)。
如在此所使用的，术语“真菌感染”包括由真菌导致的任何感染，可任选地包括但不限于：新型隐球菌，荚膜组织胞浆菌，粗球孢子菌，皮炎芽生菌，沙眼衣原体，白色念珠菌。
如在此所使用的，术语“寄生虫感染”包括由寄生虫导致的任何感染，可任选地包括但不限于：原生动物，例如阿米巴原虫(Amebae)、鞭毛虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、纤毛虫、球虫、微孢子虫、孢子虫；蠕虫，线虫(蛔虫)，绦虫(带虫(Tapeworm))，吸虫(吸虫(Fluke))，节肢动物，以及被称为朊病毒的异常蛋白。
一种由细菌导致的感染性失调和/或疾病可以可任选地包括以下项中的一种或多种：脓毒、败血性休克、鼻窦炎、皮肤感染、肺炎、支气管炎、脑膜炎、细菌性***病、尿道感染(UCI)、细菌性肠胃炎、脓疱病和丹毒、丹毒、蜂窝组织炎、炭疽、百日咳、莱姆病、布鲁菌病、肠炎、急性肠炎、破伤风、白喉、伪膜状结肠炎、气性坏疽、急性食物中毒、厌氧菌性蜂窝织炎、医院感染、腹泻、婴儿脑膜炎、旅行者腹泻、出血性结肠炎、溶血尿毒综合征、兔热病、胃溃疡、胃和十二指肠溃疡、军团病、军团菌热、钩端螺旋体病、李斯特菌病、麻风病(汉森氏病)、结核病、淋病、新生儿眼炎、脓毒性关节炎、脑膜炎球菌病包括脑膜炎、沃-弗综合征、假单胞菌感染、落基山斑疹热、伤寒型沙门氏菌病、伴有肠胃炎和小肠结肠炎的沙门氏菌病、杆菌性痢疾/志贺氏杆菌痢疾，凝固酶阳性葡萄球菌感染：局部皮肤感染包括弥漫性皮肤感染(脓疱病)、深局部感染、急性感染性心内膜炎、败血症、坏死性肺炎、毒素性病例如中毒性休克综合征和葡萄球菌性食物中毒、膀胱炎、子***、中耳炎、链球菌性咽炎、猩红热、风湿热、产褥热、坏死性筋膜炎、霍乱、鼠疫(包括腺鼠疫和肺鼠疫)，连同由选自(但不限于)以下项中的一种细菌所导致的任何感染：幽门螺杆菌、伯氏疏螺旋体(Boreliai burgdorferi)、嗜肺军团菌、分枝杆菌属菌(例如结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈氏分枝杆菌)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性链球菌(A组链球菌属)、无乳链球菌(B组链球菌属)、链球菌属(绿色组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌属(厌氧菌)、肺炎链球菌、病原性弯曲杆菌属菌、肠球菌属菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属菌、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneuomiae)、多杀性巴氏杆菌(Pasturella multicoda)、拟杆菌属菌、具核梭杆菌、念珠状链杆菌(Sreptobacillus moniliformis)、***(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体、钩端螺旋体属以及伊氏放线菌(Actinomeyces israelli)。
由病毒所导致的感染性失调和/或疾病的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成(但不限于)：获得性免疫缺陷(AIDS)、西尼罗河脑炎、冠状病毒感染、鼻病毒感染、流行性感冒、登革热、出血热；一种耳科感染；重度急性呼吸器官综合症(SARS)、急性发热性咽炎、咽结膜热、流行性角膜结膜炎、婴幼儿肠胃炎、感染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发性HSV-1感染(儿童龈口炎，成人扁桃体炎和咽炎，角膜结膜炎)、潜伏性HSV-1感染(唇疱疹、感冒疮)、无菌性脑膜炎、巨细胞病毒感染、巨细胞包涵体病、卡波西氏肉瘤、卡斯特尔曼病、原发性渗出性淋巴瘤、流行性感冒、麻疹、脑炎、感染后脑脊髓炎、腮腺炎、增生性上皮病变(普通疣，扁平疣，跖疣，***生殖器疣，喉***状瘤，疣状表皮发育不良)、哮吼、肺炎、细支气管炎、脊髓灰质炎、狂犬病、细支气管炎、肺炎、德国麻疹、先天性风疹、出血热、水痘、登革热、埃博拉感染、埃可病毒感染、EBV感染、感染性红斑、线状病毒、黄病毒、手足口病、带状疱疹病毒(带状疱疹)、人***瘤病毒相关的表皮病变，拉沙热、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、副流感病毒感染、副粘病毒、细小病毒B19感染、微小核糖核酸病毒、痘病毒感染、轮状病毒腹泻、风疹、麻疹、水痘、天花感染。
由真菌所导致的一种感染性失调和/或疾病可任选地包括但不限于：变应性支气管肺曲菌病、曲霉肿、曲霉病、蛙粪霉病、芽生菌病、假丝酵母病、慢性肺曲霉病、壶菌病、球孢子菌病、耳霉病(Conidiobolomycosis)、坚黑穗病(大麦)、隐球酵母病、表皮寄生菌、癣菌疹(Dermatophytid)、皮肤真菌病、毛内癣菌、昆虫病原性真菌、流行性***炎、流行性溃疡综合征、食管念珠菌病、毛外癣菌(Exothrix)、真菌血症、网状内皮细胞真菌病、链状芽生菌病、Massospora cicadina、霉菌病、草莓球腔菌(Mycosphaerella fragariae)、鼓膜霉菌病、副球孢子菌病、病原性真菌、青霉病、千溃疡病(Thousand cankers disease)、癣、Zeaspora、接合菌病。由寄生物所导致的感染性失调和/或疾病的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成(但不限于)：棘阿米巴属、阿米巴病、蛔虫病、钩虫病、异尖线虫病、巴贝虫病、小袋虫病、贝蛔虫病(Baylisascariasis)、人芽囊原虫病(Blastocystosis)、牙签鱼、恰加斯病、华支睾吸虫病、锥蝇属、球虫目、中华肝吸虫病(Chinese Liver Fluke Cryptosporidiosis)、双核阿米巴病(Dientamoebiasis)、裂头绦虫病、肾膨结线虫(Dioctophyme renalis)感染、龙线虫病、棘球蚴病、象皮肿、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾弟虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、片吸虫病综合征、等孢球虫病、钉螺热、利什曼病、淋巴丝虫病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、蟠尾丝虫病、虱病、原发性阿米巴脑膜脑炎、寄生虫感染性肺炎、并殖吸虫病、疥螨病、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病、裂头蚴病、鼻孢子菌病、河盲症、绦虫病(猪囊尾蚴病的原因)、弓蛔虫病、弓形体病、毛线虫病、滴虫病、鞭虫病、锥虫病、绦虫感染。
感染性疾病的一个优选实例是由以下项中的任一项所导致的一种疾病：乙型肝炎、丙型肝炎、感染性单核细胞增多症、EBV、巨细胞病毒、AIDS、HIV-1、HIV-2、结核病、疟疾以及血吸虫病。
根据本发明的至少一些实施例，提供了如在此所列举的治疗剂和/或包括它们的一种药物组合物与有效治疗感染的一种已知治疗剂的组合的用途。
如在此所列举的这些治疗剂和/或包括它们的一种药物组合物可以与一种或多种用于治疗细菌感染的额外的治疗剂联合进行给药，这些额外的治疗剂包括但不限于：抗生素，包括氨基糖甙类、碳青霉烯类、头孢菌素类、大环内酯类、林可酰胺类、硝基呋喃类、青霉素类、聚缩氨酸、喹诺酮类、磺胺类、四环素；针对分枝杆菌的药物，包括但不限于氯法齐明、环丝氨酸、环丝氨酸、利福布汀、利福喷汀、链霉素；以及其他抗细菌药物，例如氯霉素、磷霉素、甲硝唑、莫匹罗星、以及替硝唑。
如在此所列举的这些治疗剂和/或包括它们的一种药物组合物可以与一种或多种用于治疗病毒感染的额外的治疗剂联合进行给药，这些额外的治疗剂包括但不限于：抗病毒药物，例如奥塞米韦(品牌名称为达菲)和扎那米韦(品牌名称为瑞乐砂)阿比朵尔-金刚烷衍生物(金刚烷胺、金刚乙胺)-神经氨酸苷酶抑制剂(奥塞米韦、拉尼米韦、帕拉米韦、扎那米韦)核苷类逆转录酶抑制剂，包括嘌呤类似物鸟嘌呤(阿昔洛韦#/伐昔洛韦，更昔洛韦/缬更昔洛韦，喷昔洛韦/泛昔洛韦)和腺嘌呤(阿糖腺苷)，嘧啶类似物，尿嘧啶核甙(碘苷、曲氟尿苷、依度尿苷)，胸腺嘧啶(溴夫定)，胞嘧啶(阿糖胞苷)；膦甲酸；核苷类似物/NARTI:恩替卡韦、拉米夫定、替比夫定、克拉夫定；核苷酸类似物/NtRTI：阿德福韦、替诺福韦；核酸抑制剂，例如西多福韦；干扰素，干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素α-2a；利巴韦林#/塔利韦林；抗逆转录病毒药物，包括齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦/恩曲他滨、依法韦仑，它们中的每一种单用或不同的组合，gp41(恩夫韦地)，雷特格韦，蛋白酶抑制剂，例如呋山那韦，洛匹那韦和阿扎那韦，美替沙腙，二十二醇，福米韦生，曲金刚胺。
如在此所列举的这些治疗剂和/或包括它们的一种药物组合物可以与一种或多种用于治疗真菌感染的额外的治疗剂联合进行给药，这些额外的治疗剂包括但不限于：聚烯类抗真菌剂的抗真菌药物，咪唑、***、以及噻唑抗真菌剂，烯丙基胺，棘球白素或其他抗真菌药物。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了一种包含根据本发明的至少一些实施例的这些治疗剂中的一种或其组合的组合物，例如一种药物组合物。
因此，本发明突出了一种包括一个治疗有效量的根据本发明的至少一些实施例的一种治疗剂的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施例的该药物组合物进一步优选地用于如在此所列举的癌症的治疗。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些包括已经患有该失调的那些连同在其中要预防该失调的那些。因此，在此待治疗的哺乳动物可以已经被诊断为患有该失调或可以易患或对该失调敏感。用于治疗目标的“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、等。优选地，该哺乳动物是人类。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的药剂有效地治疗一种哺乳动物的一种疾病或失调的量。
本发明的治疗剂可以单独，或作为它们与药学上可接受的载体混合于其中的药物组合物的一部分来提供给受试者。
一种组合物被称为一种“药学上可接受的载体”，如果它的给药可以被一位受者患者所忍受的话。如在此所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。
此类组合物包括无菌水，pH和离子强度的缓冲盐水(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，以及可任选的添加剂，例如洗涤剂和加溶剂(例如，聚山梨酯20，聚山梨酯80)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)，防腐剂(例如，硫柳汞(Thimersol)，苯甲醇)以及膨胀物质(例如，乳醇、甘露醇)。非水性溶剂或媒介物也可以如下详细说明地来使用。
可以用于根据本发明的至少一些实施例的这些药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物，植物油(例如橄榄油)，以及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过使用包被材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所要求粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。取决于给药途径，该活性化合物(即特异性结合任一种LSR蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体以及抗原结合片段以及包含上述事物的轭合物、和/或替代支架，或双特异性分子)可以被包被于一种用来使该化合物免于酸的作用以及可以使该化合物失活的其他自然条件的破坏的材料中。根据本发明的至少一些实施例的这些药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。一种“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何所不希望的毒物学效应的盐(参见例如，伯奇(Berge)，S.M.等人(1977)《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.))66:1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些盐，这些无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及来源于无毒有机酸的盐，这些有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸类、脂族以及芳族磺酸等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些盐，这些碱土金属例如钠、钾、镁、钙等，以及来源于无毒有机胺的盐，这些有机胺例如N,N'--二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等。
根据本发明的至少一些实施例的一种药物组合物还可以包括一种药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可以包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防存在微生物可以通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸等来确保。可能还希望将等渗剂，例如糖、氯化钠等包括于这些组合物中。此外，可以通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝以及明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用作药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除了在任何常规介质或药剂与该活性化合物不相容的范围内之外，考虑了它们在根据本发明的至少一些实施例的这些药物组合物中的用途。补充的活性化合物也可以并入这些组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。该组合物可以配制为一种溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载体可以为一种包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可以例如通过使用一种包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所希望粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选将等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠包括在该组合物中。可以通过在该组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的一种延迟吸收的药剂来实现这些可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的该活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入一种适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将该活性化合物并入一种无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将所需量的该活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入一种适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将该活性化合物并入一种无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。
本发明的一种组合物可以使用本领域中已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种给药途径来进行给药。如被技术人员所理解的，给药途径和/或给药模式将取决于所希望的结果而变化。根据本发明的至少一些实施例的治疗剂的优选给药途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱、口服、肠内、直肠、肺部(例如吸入)、鼻腔、外用(包括经皮肤、口腔以及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、***、大脑递送(例如脑室内、大脑内以及对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、髓周以及脊柱内)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内以及真皮内)、经粘膜(例如舌下给药)给药或经由植入物给药，或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注，或在本领域中已知的其他递送途径和/或给药形式。如在此所使用的，短语“肠胃外给药”意味着除了肠给药和局部给药之外的、通常通过注射的给药模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。在一个具体实施例中，根据本发明的至少一些实施例的一种蛋白、一种治疗剂或一种药物组合物可以腹膜内或静脉内给药。
可替代地，一种LSR特异性抗体或可以经由一种非肠胃外途径进行给药，例如一种局部、表皮或粘膜给药途径，例如，鼻内给药、口服给药、***给药、直肠给药、舌下给药或局部给药。
这些活性化合物可以用将保护该化合物以便避免快速释放的载体来制备，例如一种受控释放配制品，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送***。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。许多用于制备此类配制品的方法是获专利的或通常是本领域的普通技术人员已知的。参见例如《持续以及受控释放药物递送***》(Sustained and Controlled Release Dr ug DeliverySystems)，J.R.罗宾逊(Robinson)编著，马歇尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约(New York)，1978。
治疗组合物可以使用本领域已知的医疗装置来给药。例如，在一个优选实施例中，根据本发明的至少一些实施例的一种治疗组合物可以使用一种针状皮下注射装置来进行给药，例如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所披露的装置。用于本发明中的熟知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露了一种用于以一种受控的速率对药物进行分配的可植入微量输注泵；美国专利号4,486,194，它披露了一种用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露了一种用于以一种精确输注速率对药物进行递送的药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露了一种用于持续药物递送的可变速流可植入输注装置；美国专利号4,439,196，它披露了一种具有多个多室腔的渗透药物递送***；以及美国专利号4,475,196，它披露了一种渗透药物递送***。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送***以及模块是本领域技术人员已知的。
在特定实施例中，可以对这些抗LSR抗体进行配制以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施例的这些治疗化合物穿过BBB(如果希望)，它们可以例如配制在脂质体中。关于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。这些脂质体可以包括被选择性运输至特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如V.V.拉纳德(Ranade)(1989)《临床药理学杂志》(J.Clin.Pharmacol.)29:685)。示例性靶向部分包括：叶酸酯或生物素(参见例如给洛(Low)等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(梅泽(Umezawa)等人，(1988)《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)153:1038)；抗体(P.G.布卢门(Bloeman)等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.乌韦斯(Owais)等人(1995)《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.AgentsChemother.)39:180)；表面活性蛋白A受体(布里斯科(Briscoe)等人(1995)《美国生理学杂志》(Am.J Physiol.)1233:134)；p120(施赖埃尔(Schreier)等人(1994)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)269:9090)；还参见K.凯纳宁(Keinanen)；M.L.劳卡宁(Laukkanen)(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.基利昂(Killion)；I.J.菲德勒(Fidler)(1994)《免疫方法》(Immunomethods)4:273。
根据本发明的至少一些实施例的这些抗-LSR抗体可以用作中和抗体。一种中和抗体(Nab)是一种能够结合并且中和或抑制一种特异性抗原从而抑制其生物效应的抗体，例如通过阻断细胞或病毒上的受体，抑制该病毒与宿主细胞的结合。Nab将部分地或彻底地废除一种药剂的生物作用，通过阻断其活性所需要的一种重要的表面分子或通过干扰该药剂与一种靶细胞上的其受体的结合。
在又另一个实施例中，可以使用本发明的免疫轭合物通过将化合物连接至该抗体而将此类化合物(例如，治疗剂、标签、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向至具有LSR细胞表面受体的细胞。因此，本发明还提供了用于离体或体内定位表达LSR的细胞的方法(例如，用一种可检测的标签，例如一种放射性同位素、一种荧光化合物、一种酶或一种酶辅因子)。可替代地，这些免疫轭合物可以通过将细胞毒素或放射性毒素靶向至LSR抗原而用来杀死具有LSR细胞表面受体的细胞。
如在此所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。取决于给药途径，该活性化合物(即包含LSR抗原的胞外结构域、抗体、免疫轭合物、替代支架，和/或双特异性分子的可溶性多肽轭合物)可以被包被于一种用来使该化合物免于酸的作用以及可以使该化合物失活的其他自然条件的破坏的材料中。根据本发明的至少一些实施例的这些药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。一种“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何所不希望的毒物学效应的盐(参见例如，伯奇(Berge)，S.M.等人(1977)《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.))66:1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些盐，这些无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及来源于无毒有机酸的盐，这些有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸类、脂族以及芳族磺酸等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些盐，这些碱土金属例如钠、钾、镁、钙等，以及来源于无毒有机胺的盐，这些有机胺例如N,N'--二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等。
根据本发明的至少一些实施例的一种药物组合物还可以包括一种药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。可以用于根据本发明的至少一些实施例的这些药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物，植物油(例如橄榄油)，以及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过使用包被材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所要求粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可以包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防存在微生物可以通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸等来确保。可能还希望将等渗剂，例如糖、氯化钠等包括于这些组合物中。此外，可以通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝以及明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用作药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除了在任何常规介质或药剂与该活性化合物不相容的范围内之外，考虑了它们在根据本发明的至少一些实施例的这些药物组合物中的用途。补充的活性化合物也可以并入这些组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。该组合物可以配制为一种溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载体可以为一种包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可以例如通过使用一种包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所希望粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选将等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠包括在该组合物中。可以通过在该组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的一种延迟吸收的药剂来实现这些可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的该活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入一种适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液是通过将该活性化合物并入一种无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将所需量的该活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入一种适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将该活性化合物并入一种无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。
可以与一种载体材料联合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的受试者以及具体给药模式而变化。可以与一种载体材料联合以产生单一剂型的活性成分的量总体上将是产生一种治疗效果的该组合物的那个量。通常，在一百个百分点中，与一种药学上可接受的载体联合地，这个量将在从约百分之0.01至约百分之九十九的活性成分，优选地从约百分之0.1至约百分之70，最优选地从约百分之1至约百分之30的活性成分的范围内变化。
对剂量方案进行调整以提供最佳的所希望的应答(例如一种治疗应答)。例如，可以给予一种快速灌注剂，可以随时间推移给予若干分次剂量，或可以按治疗状况的急切需要所指出的，将剂量成比例地降低或提高。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以便于给药以及剂量的均匀性。如在此所使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位包含预定数量的经过计算结合所需药用载体以产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施例的这些剂量单位形式的规格由以下因素支配以及直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征以及待达到的特定治疗效果，以及(b)调配这样一种活性化合物用于个体中的敏感性的治疗的领域中固有的限制。
为了对该抗体进行给药，该剂量的范围是从约0.0001至100mg/kg，并且更通常是0.01至5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案要求进行以下给药：每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每三个月至每6个月一次。用于根据本发明的至少一些实施例的一种抗体的优选剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重，经由静脉给药，所给出的该抗体使用以下给药方案中的一种：(i)每四周，持续六次剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重进行一次，随后每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体被同时给药，在这种情况下给药的每种抗体的剂量落入所指出的范围。抗体通常在多种场合被给药。单一剂量之间的间隔可以是例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是无规律的，如由在患者中测量关于靶标抗原的抗体的血液水平所表明的。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000mug/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中约25-300.mu.g/ml。
可替代地，可以将治疗剂作为一种持续释放配制品进行给药，在这种情况下需要较低频率的给药。剂量和频率取决于该治疗剂在患者体内的半衰期而变化。通常，人类抗体显示了最长的半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。融合蛋白的半衰期可广泛地变化。给药剂量和频率可以取决于治疗是预防性或是治疗性而变化。在预防性应用中，一种相对低的剂量以相对不频繁的间隔在长时期内进行给药。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求相对短的间隔下的一种相对高的剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到该患者显示出疾病症状的部分或完全改进为止。此后，可向该患者给予一种预防方案。
本发明的这些药物组合物中的这些活性成分的实际剂量水平可以改变以便获得对于具体患者、组合物以及给药模式有效实现所希望治疗应答，而对该患者无毒的该活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的这些具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所使用的该具体化合物的***速率、治疗持续时间、与所使用的这些具体组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况以及以前病史，以及医学领域熟知的类似因素。
用于肠胃外给药的配制品
在一个进一步的实施例中，在此所披露的组合物，包括包含肽和多肽的那些，以一种水溶液通过肠胃外注射来给药。这种配制品也可呈悬浮液或乳液形式。通常，所提供的药用组合物包含有效量的肽或多肽，并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这类组合物可任选地包括以下物质中的一种或多种：稀释剂、无菌水、不同缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH以及离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如，吐温20(聚山梨醇酯-20)，吐温80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，以及防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)以及增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物的实例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶，以及可注射有机酯，例如油酸乙酯。这些配制品可冷冻干燥(冻干)或真空干燥并且在即将使用之前再溶解/再悬浮。这种配制品可通过例如经由细菌保留过滤器来过滤，将灭菌剂并入组合物中，照射组合物，或加热组合物来灭菌。
用于局部给药的配制品
在此所披露的LSR多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体可以局部应用。局部给药对于大多数肽配制品并不能良好地起作用，但是如果应用至肺、鼻腔、口腔(舌下、颊腔)、***或直肠粘膜，它可以是尤其有效的。
组合物在以具有小于约5微米的气体动力学直径的气溶胶或喷雾干燥颗粒形式递送时可在吸入时被递送至肺并且横穿肺上皮衬里到达血流。可使用被设计成经肺部递送治疗产品的广泛范围的机械装置，包括但不局限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。可购得装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗制药公司(Mallinckrodt Inc.)，圣路易斯，密苏里州(St.Louis,Mo.))；Acorn II雾化器(马凯斯特医疗产品(Marquest Medical Products)，恩格尔伍德，科罗拉多州(Englewood,Colo.))；万托林(Ventolin)计量剂量吸入器(葛兰素公司(Glaxo Inc.)，研究三角园，北卡罗来纳州(Research Triangle Park,N.C.))；以及斯宾哈勒(Spinhaler)粉末吸入器(费森斯公司(Fisons Corp.)，贝德福德，马萨诸塞州(Bedford,Mass.))。奈克塔(Nektar)、阿尔科姆斯(Alkermes)以及曼肯达(Mannkind)都具有经过批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中这种技术可应用于在此所述的这些配制品。
用于向粘膜给药的配制品将典型地是喷雾干燥的药物颗粒，这些药物颗粒可以被并入一种片剂、凝胶剂、胶囊、悬浮液或乳液中。标准药用赋形剂可从任何配方设计师处获得。口服配制品可呈口香糖、凝胶条、片剂或锭剂形式。还可制备经皮配制品。这些将典型地是软膏、洗剂、喷雾剂或贴片，全部可使用标准技术来制备。经皮配制品将需要包括渗透促进剂。
受控递送聚合物基质
也可以将在此所披露的LSR多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体以受控释放配制品进行给予。可制造受控释放聚合物装置以便在植入聚合物装置(杆、圆柱体、膜、盘)或注射(微粒)之后全身性长期释放。基质可呈例如微球的微粒形式，其中肽分散于固体聚合物基质或微胶囊中，其中核心具有与聚合物外壳不同的材料，并且肽是分散或悬浮于在性质上可为液体或固体的核心中。除非在此明确定义，否则微粒、微球以及微胶囊可互换使用。可替代地，聚合物可铸造成从数纳米至四厘米范围内的薄板或膜、通过研磨或其他标准技术产生的粉末，或甚至例如水凝胶的凝胶。可使用不可生物降解或可生物降解的基质递送多肽或编码多肽的核酸，但是可生物降解基质是优选的。这些基质可以为天然或合成聚合物，但是合成聚合物由于降解以及释放特性的更好表征而为优选的。该聚合物是基于所希望的释放时段来选择的。在一些情况中，线性释放可能是最有用的，但是在其他情况中一种脉冲释放或“大批释放(bulk release)”可能提供更有效的结果。聚合物可以呈水凝胶(通常吸收多达按重量计约90％的水)形式，并且可任选地可与多价离子或聚合物交联。
基质可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取以及本领域技术人员已知的其他方法来形成。可生物蚀解的微球可使用开发用于制造微球以便进行药物递送的任何方法来制备，这些方法例如由马西威兹(Mathiowitz)和兰格(Langer)，《受控释放杂志》(J.Controlled Release)，5:13-22(1987)；马西威兹(Mathiowitz)等人，《反应性聚合物》(Reactive Polymers)，6:275-283(1987)；以及马西威兹(Mathiowitz)等人，《应用高分子科学杂志》(J.Appl Polymer ScL)，35:755-774(1988)所说明的。
这些装置可经过配制用于局部释放来治疗植入或注射区域-典型地将递送比用于治疗整个身体或全身递送的剂量少得多的剂量。这些装置可被植入或注射至皮下、肌内、脂肪或被吞咽。
抗LSR抗体的诊断用途
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体(例如人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子以及组合物)可以用来检测LSR的水平或在它们的膜表面包含LSR的细胞的水平，然后这些水平可以与特定疾病症状相联系。可替代地，这些抗体可以用来抑制或阻断LSR功能，该LSR功能转而可以与癌症的预防或改善相联系。这可以通过将一个样品和一个对照样品与该抗LSR抗体在考虑到该相应抗体与LSR之间的一种复合物的形成的条件下进行接触来实现。对该抗体和LSR之间形成的任何复合物进行检测并在该样品和该对照中进行比较。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子以及组合物)可以针对与体外治疗或诊断用途相关联的结合活性进行初始测试。例如，根据本发明的至少一些实施例的组合物可以使用低细胞计数测定来进行测试。
也在本发明的范围之内的是以下试剂盒，这些试剂盒包括根据本发明的至少一些实施例的该LSR特异性抗体(例如，人类抗体、替代支架、双特异性或多特异性分子、或免疫轭合物)以及使用说明书。该试剂盒可以进一步包含一种或多种额外的试剂，例如一种免疫抑制试剂、一种细胞毒剂或一种放射性毒剂，或一种或多种根据本发明的至少一些实施例的额外的人类抗体(例如，一种具有互补活性、与不同于第一人类抗体的抗原上的抗原表位结合的人类抗体)。
根据本发明的至少一些实施例的这些抗体还可以用来靶向表达FcγR或LSR的细胞，例如用于标记此类细胞。为了这样的用途，可将结合剂与可被检测的分子连接。因此，本发明提供了用于离体或体外定位表达了Fc受体例如FcγR或LSR抗原的细胞的方法。可检测标记可以是，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在一个具体实施例中，本发明提供了分别用于对一个样品中的LSR抗原的存在和/或水平进行检测，或对LSR抗原的量进行测量的方法，包括使该样品和一个对照样品与特异性结合至LSR的一种抗体或其一种抗原结合部分在允许该抗体或其部分与LSR之间的一种复合物的形成的条件下进行接触。然后对一种复合物的形成进行检测，其中在该样品相比于该对照样品之间的一种差异复合物形成指示着在该样品中LSR抗原的存在。如所指出的，本发明尤其包括用于在体外和体内对LSR抗原进行检测的测定，例如免疫测定、放射免疫测定、放射测定、放射成像测定、ELISA、蛋白质印迹、FACS、狭线印迹、免疫组织化学测定、以及本领域技术人员所熟知的其他测定。
在又另一个实施例中，可以使用本发明的免疫轭合物通过将化合物连接至该抗体而将此类化合物(例如，治疗剂、标签、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向至具有LSR细胞表面受体的细胞。因此，本发明还提供了用于离体或体内定位表达LSR的细胞的方法(例如，用一种可检测的标签，例如一种放射性同位素、一种荧光化合物、一种酶或一种酶辅因子)。可替代地，这些免疫轭合物可以通过将细胞毒素或放射性毒素靶向至LSR抗原而用来杀死具有LSR细胞表面受体的细胞。
根据至少一些实施例，本发明提供了一种用于对一种器官或组织进行成像的方法，该方法包括：(a)将一种经标记的多肽给予一名需要这种成像的受试者；并且(b)对该经标记的多肽进行检测，以确定在该受试者中该经标记的多肽所集中的位置。当用于成像应用中时，根据本发明的至少一些实施例的这些经标记的多肽典型地具有一种与其共价或非共价附接的成像剂。适合的成像剂包括但不限于放射性核素、可检测标签、荧光团、荧光蛋白、酶蛋白等。本领域技术人员将熟悉将成像剂附接至多肽的其他方法。例如，该成像剂可经由部位特异性轭合来附接，例如，将该成像剂共价附接至一种肽连接物，例如一种存在于Fc融合分子的羧基末端的具有五个至七个精氨酸的聚精氨酸部分。该成像剂还可直接经由非位点特异性轭合来附接，例如，将该成像剂共价附接至存在于该多肽中的伯胺基团。本领域技术人员将认识到一种成像剂还可经由非共价相互作用(例如离子键、疏水性相互作用、氢键、范德华力、双极子-双极子键等)来结合至一种蛋白。
在某些情况下，通过将一种放射性核素直接附接至该多肽来将该多肽用该放射性核素进行放射性标记。在某些其他实例中，该放射性核素结合至一种螯合剂或附接至该多肽的螯合剂-连接物。用于直接轭合的合适放射性核素包括但不限于18F、124I、125I、131I及其混合物。与一种螯合剂一起使用的合适放射性核素包括但不限于、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117m Sn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi及其混合物。优选地，结合至一种螯合剂的该放射性核素是64Cu、90Y、111In或其混合物。适合的螯合剂包括但不限于DOTA、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、其膦酸酯类似物及其混合物。本领域技术人员将熟悉将放射性核素、螯合剂以及螯合剂-连接物附接至本发明的多肽的方法。具体地说，附接可便利地使用例如可购得的双官能连接基团(通常为异双官能连接基团)来完成，这些连接基团可附接至存在于多肽的无干扰位置中的官能团，并且然后进一步连接至放射性核素、螯合剂或螯合剂-连接物。
适合于用作成像剂的荧光团或荧光染料的非限制性实例包括亚历克萨荧光染料(英杰公司(Invitrogen Corp.)；卡尔斯巴德(Carlsbad),加利福尼亚州)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿(Oregon Green)TM；若丹明、得克萨斯红、异硫氰酸四若丹明(TRITC)、赛迪(CyDye)TM荧光剂(例如Cy2、Cy3、Cy5)等等。
适合于用作成像剂的荧光蛋白的实例包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(例如DsRed)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及其变体(参见例如美国专利号6,403,374、6,800,733以及7,157,566)。GFP变体的具体实例包括但不限于，增强型GFP(EGFP)，不稳定EGFP，在多恩(Doan)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，55:1767-1781(2005)中所说明的这些GFP变体，在克莱默里(Crameri)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)，14:315-319(1996)中所说明的该GFP变体，在里佐(Rizzo)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol)，22:445(2004)和钱(Tsien)，《生物化学年度评论》(Annu.Rev.Biochem.)，67:509(1998)中所说明的这些天蓝色荧光蛋白，以及在纳加尔(Nagal)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)，20:87-90(2002)中所说明的该黄色荧光蛋白。DsRed变体说明于例如沙纳(Shaner)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)，22:1567-1572(2004)中并且包括m草莓(mStrawberry)、m樱桃(mCherry)、m橙子(morange)、m香蕉(mBanana)、m白兰瓜(mHoneydew)以及m柑橘(mTangerine)。额外的DsRed变体说明于例如王(Wang)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，101:16745-16749(2004)中，并且包括m覆盆子(mRaspberry)和m李子(mPlum)。DsRed变体的另外实例包括在费希尔(Fischer)等人，FEBSLett.，577:227-232(2004)中所说明的的mRFPmars以及在费希尔(Fischer)等人，FEBS Lett.，580:2495-2502(2006)中所说明的mRFPruby。
在其他实施例中，结合至根据本发明的至少一些实施例的一种多肽的该成像剂包括一种可检测标签，例如像生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素。在其他实施例中，该成像剂包括一种酶蛋白，包括但不限于荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、辣根过氧物酶、木聚糖酶、碱性磷酸酶等。
在本领域中已知用于检测受试者体内的放射性核素的放射性发射的任何装置或方法是适用于本发明的。例如，例如单光子发射计算机化断层显像(SPECT)(它使用一种旋转γ照相机对来自一种单光子γ发射放射性核素的辐射进行检测)，以及放射性核素闪烁照相术(它使用一种闪烁γ照相机获得一种放射性核素在组织、器官、身体***中的分布的一种影像或一系列连续影像)的方法可以用于检测从本发明的一种经放射性标记的多肽中发射的辐射。正电子发射断层术(PET)是用于检测受试者体内的辐射的另一种合适技术。旨在用于医学用途的微型并且灵活的辐射检测器由内部医疗有限公司(Intra-Medical LLC)(圣塔莫尼卡，加利福尼亚州(SantaMonica,Calif.))生产。磁共振成像(MRI)或本领域技术人员已知的任何其他成像技术也适合于检测放射性核素的放射性发射。不管所使用的方法或装置为何，这种检测旨在确定经过标记的多肽集中于受试者体内的位置，并且这种浓度是疾病活性的指标。
动物和人类的非侵入性荧光成像还可提供体内诊断信息并且用于多种临床专科中。例如，多年以来已开发出用于在UV激发之后进行简单眼部观察直至使用先进设备进行复杂光谱成像的技术(参见例如安德森-***(Andersson-Engels)等人，《医学和生物学中的物理学》(Phys.Med.Biol.)，42:815-824(1997))。本领域中已知的用于荧光(例如来自荧光团或荧光蛋白)的体内检测的具体装置或方法包括但不限于，体内近红外荧光(参见例如弗兰焦尼(Frangioni)，《当前化学生物学观点》(Curr.Opin.Chem.Biol.)，7:626-634(2003))，马埃斯特罗(Maestro)TM体内荧光成像***(剑桥科研&仪器公司(Cambridge Research&Instrumentation,Inc.)；沃本(Woburn)，马萨诸塞州(Mass.))，使用一种飞点扫描仪的体内荧光成像(参见例如拉马努金(Ramanujam)等人，关于生物医药工程的IEEE会报(IEEE Transactions on Biomedical Engineering)，48:1034-1041(2001))等。
用于检测光学应答的其他方法或装置包括但不限于目视检查、CCD摄像机、视频摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或使用光电倍增器管的信号放大。
根据一些实施例，用于进行根据本发明的至少一些实施例的该诊断测定、取自一名受试者(患者)的样品选自下组，该组由以下各项组成：体液或分泌物，包括但不限于血液、血清、尿液、血浆、***液、***(seminalfluid)、***(semen)、皮肤、呼吸道、肠道、以及泌尿生殖道的外分泌物、眼泪、脑脊髓液、滑液、痰液、唾液、乳、腹膜液、胸膜液、囊液、乳腺导管***(the breast ductal system)分泌物(和/或其灌洗液)、支气管肺泡灌洗液、生殖***的灌洗液、以及身体的任何其他部分或身体中的***的灌洗液；任何器官(包括分离的细胞或组织)的样品，其中该细胞或组织可以从一种选自以下但不限于以下的器官获得：肺、结肠、卵巢和/或乳腺组织；粪便或组织样品，或其任何组合。在一些实施例中，这个术语涵盖体内细胞培养组分的样品。在经受该诊断测定之前，该样品能可任选地使用一种适合的洗脱液进行稀释。
在一些实施例中，在本发明背景下的短语“标志物”是指与一种取自不患有上述疾病或病症之一的受试者的可比较的样品相比，差异地存在于取自患有在此所述的疾病或病症之一的患者(受试者)的样品中的核酸片段、肽、或多肽。
在一些实施例中，短语“差异地存在”是指与一种取自不患有在此所述的疾病或病症之一的患者的可比较的样品相比，存在于一种取自患有在此所述的疾病或病症之一的患者的样品中的一种标志物的量或质量上的差异。例如，如果一种样品中的一种核酸片段的量显著不同于另一种样品中的该核酸片段的量，那么该核酸片段能可任选地差异地存在于这两种样品之间，例如如通过杂交和/或基于NAT的测定所测量的。如果一种样品中的一种多肽的量显著不同于另一种样品中的该多肽的量，那么该多肽差异地存在于这两种样品之间。应注意地是如果该标志物在一种样品中是可检测的，而在另一种样品中是不可检测的，则这样的标志物可被认为是差异存在的。可任选地，如在此所述的，一种相对低的上调的量可作为该标志物。本领域中的普通技术人员可以容易地确定这些标志物的此类相对水平；在以下每种单独的标志物的说明中提供了进一步的指导。
在一些实施例中，短语“诊断(diagnostic)”意味着鉴定一种病理学病症的存在或性质。诊断方法在其敏感性和特异性方面存在不同。一种诊断测定的“敏感性”是测试呈阳性的患病个体的百分数(“真阳性”的百分数)。未由该测定检测出的患病个体是“假阴性”。未患病并且在该测定中呈阴性的受试者被叫做“真阴性”。一种诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为测试呈阳性但不患有该疾病的那些的比例。尽管一种具体诊断方法可能不会提供一种病症的一种明确的诊断，但是如果该方法提供了一种在诊断中有帮助的阳性指示的话，它是能够的。
如在此所使用的，术语“诊断(diagnosis)”是指通过其征象、症状来鉴定一种医学病症或疾病的过程，并且特别是从不同诊断程序的结果来鉴定，包括例如，在获得自一个个体的一种生物样品(例如，如下所定义的，在细胞、组织或血清中)中检测根据本发明的至少一些实施例的这些核酸或多肽的表达。此外，如在此所使用的，术语“诊断(diagnosis)”涵盖：筛选一种疾病，检测一种疾病的存在或严重性，提供一种疾病的预后，监测疾病的进展或复发，连同对一种疾病、失调或病症的疗效和/或复发的评估，连同为一种疾病选择一种疗法和/或治疗，一种给定的疾病疗法的优化，监测一种疾病的治疗，和/或预测针对特定患者或亚群的一种疗法的适合性或确定一种治疗产品在患者或亚群中的适当配量。诊断程序可以在体内或体外进行。
在一些实施例中，当就如在此所述的一种多核苷酸或多肽的表达水平上的差异而论时，短语“定性”是指表达的存在对不存在；或在一些实施例中，是指表达的时序调节；或在一些实施例中，是指表达的时机；或在一些实施例中，是指对所表达的分子的翻译后修饰；以及其他被本领域普通技术人员所理解的。在一些实施例中，当就如在此所述的一种多核苷酸或多肽的表达水平上的差异而论时，短语“定量”是指表达量上的绝对差异，如通过任何本领域中已知的手段所确定的；或在其他实施例中，是指统计学上可以是有意义的相对差异；或在一些实施例中，当被视为一个整体或在延长的一段时间内等，指示就表达的差异而言的趋势。
在一些实施例中，术语“诊断(diagnosing)”是指把一种疾病或一种症状分级，确定该疾病的严重性，监测疾病的进展，预测一种疾病的后果和/或恢复的前景。术语“检测”也可以可任选地涵盖以上任一项。
在一些实施例中，对根据本发明的一种疾病的诊断可以受到对获得自受试者的一种生物样品中的本发明的一种多核苷酸或一种多肽的一种水平的确定的影响，其中该确定的水平可以与该疾病的易患病体质、或存在或不存在有关。应该指出的是，一种“获得自受试者的生物样品”还可以可任选地包括一种未从该受试者身体上移除的样品，如下进行更加详细的说明。
在一些实施例中，术语“水平”是指RNA和/或蛋白的表达水平，或是指本发明的一种标志物的DNA拷贝数。
典型地，获得自受试者的一个生物样品中的该标志物的水平与获得自一个健康个体的一个类似样品(生物样品的实例是在此所述的)中的同一标志物的水平是不同的(即，增加或减少)。
为了确定受试者中的该感兴趣的标志物的DNA、RNA和/或多肽的水平，可以利用许多熟知的组织或流体采集方法来从该受试者中采集生物样品。
实例包括，但不限于，细针穿刺活检、穿刺活检、芯针穿刺活检和手术活检(例如，脑活检)和灌洗。无论使用何种方法，一旦获得了一种活检物/样品，则可确定该标志物的水平且从而可作出一种诊断。
确定同一来源的正常组织中的同一标志物的水平优选地并行实现，以对照这些正常组织检测该标志物的升高的表达和/或扩增和/或减少的表达。
在一些实施例中，术语一种标志物的“测试量”指与一种具体疾病或病症的诊断一致的一种受试者的样品中的一种标志物的量。测试量可以是绝对量(例如，微克/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施例中，术语一种标志物的“对照量”可以是待与一种标志物的测试量相比的任何量或量的范围。例如，一种标志物的对照量可以是患有一种具体疾病或病症的一名患者或不患有这样的一种疾病或病症的一个人中的一种标志物的量。对照量可以是绝对量(例如，微克/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施例中，术语“检测”是指鉴定待检测的对象的存在、不存在或量。
在一些实施例中，术语“标记”包括被光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何部分或事项。例如，有用的标记包括32P，35S，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，如在ELISA中常用的)，生物素-链霉亲和素，地高辛(dioxigenin)，针对其的抗血清或单克隆抗体可获得的半抗原和蛋白，或具有与一种靶标互补的序列的核酸分子。该标记通常产生一种可以用来定量一个样品中所结合的标记的量的可测量的信号，例如一种放射性信号、发色信号、或荧光信号。该标记可以共价地、或通过离子键、范德华力或氢键被合并进或附接至一种引物或探针，例如与被链霉亲和素识别的放射性核苷酸、或生物素化的核苷酸合并。该标记可以是直接或间接可检测的。间接检测可以涉及一种第二标记与该第一标记直接或间接地结合。例如，该标记可以是一种结合配偶体(例如作为链霉亲和素的一种结合配偶体的生物素，或作为可以与其特异性杂交的互补序列的结合配偶体的一种核苷酸序列)的配体。该结合配偶体本身可以是直接可检测的，例如，一种抗体本身可以被一种荧光分子所标记。该结合配偶体还可以是间接可检测的，例如，具有互补核苷酸序列的一种核酸可以是一种分支DNA分子的一部分，该分支DNA分子转而通过与其他经标记的核酸分子的杂交是可检测的(参见例如，P.D.法尔兰德(Fahrlander)和A.克劳斯纳(Klausner)，《生物/技术》(Bio/Technology)6:1165(1988))。信号的定量通过例如闪烁计数、光密度测定法、或流式细胞术来实现。
可任选地并且优选地用于免疫测定的示例性可检测标记包括但不限于磁珠，荧光染料，放射性标记，酶(例如，辣根过氧化物、碱性磷酸酯酶以及ELISA中常用的其他物质)，以及量热标记(例如胶体金或有色玻璃或塑料珠)。可替代地，该样品中的该标志物可以使用一种间接测定来检测，其中例如使用一种第二、经标记的抗体来检测所结合的标志物特异性抗体；和/或以一种竞争或抑制测定，其中例如将与该标志物的一种不同抗原表位结合的一种单克隆抗体与该混合物同时孵育。
“免疫测定”是一种使用与一种抗原特异性结合的一种抗体的测定。免疫测定的特征在于使用一种具体抗体的特异性结合特性来分离、靶向、和/或定量该抗原。
当提及一种蛋白或肽(或其他抗原表位)时，在一些实施例中，短语与一种抗体“特异性(或选择性)结合”或“与之特异性(或选择性)免疫反应”或“特异性相互反应或结合”，是指用于确定蛋白以及其他生物制剂的异质群体中该蛋白的存在的一种结合反应。因此，在特指的免疫测定的条件下，这些指定的抗体与一种具体蛋白的结合比背景(非特异性信号)大至少两倍，并且不以显著的量实质上地与该样品中存在的其他蛋白结合。在这样的条件下，与一种抗体的特异性结合可能需要针对其对一种具体蛋白的特异性而被选择的一种抗体。例如，可以选择来自特定物种(例如大鼠、小鼠、或人类)的***碱性蛋白而培养的多克隆抗体来仅获得与***碱性蛋白特异性免疫反应而不与其他蛋白(除了***碱性蛋白的多态变体和等位基因之外)特异性免疫反应的那些多克隆抗体。这种选择可以通过减去与来自其他物种的***碱性蛋白交叉反应的抗体来实现。可以使用多种免疫测定方式来选择与一种具体蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与一种蛋白特异性免疫反应的抗体(参见例如，哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，(1988)，提供了可以用来确定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件的说明)。典型地，特异性或选择性反应将至少为背景信号或噪音的两倍，且更典型地为背景的10-100倍以上。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于在一种生物样品中检测本发明的这些多肽的方法，包括：使一种生物样品与特异性识别根据本发明的一种多肽的一种抗体进行接触并且检测所述相互作用；其中一种相互作用的存在与该生物样品中一种多肽的存在相关。
在本发明的一些实施例中，在此所述的这些多肽是用于诊断一种疾病和/或一种指示病症的标志物的非限制性实例。本发明的每种标志物可以单独地或联合地用于不同用途，包括但不限于一种疾病和/或一种指示病症的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测。
本发明的每种多肽/多核苷酸可以单独地或联合地用于不同用途，包括但不限于疾病和/或一种指示病症的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测，如上所详细说明的。
这样的一种组合可以可任选地包括标志物的任何亚组合，和/或特征是至少一种其他标志物(例如一种已知的标志物)的一种组合。此外，关于确定在此所述的任何标志物与在此所述的任何其他标志物、和/或任何其他已知标志物、和/或任何其他标志物之间的定量的或半定量的测量值的比例，这样的一种组合能可任选地并且优选地如上所说明的来使用。
在本发明的一些实施例中，提供了用于一种疾病或病症的诊断的方法、用途、装置以及测定。可任选地，可以与本发明一起使用多个标志物。该多个标志物可以可任选地包括在此所述的标志物，和/或一个或多个已知标志物。优选地，然后使该多个标志物与该疾病或病症相关联。例如，这样的关联可以可任选地包括对该多个标志物中的每个的浓度进行确定，并且单独地将每个标志物浓度与一种阈值水平进行比较。可任选地，如果该标志物浓度高于或低于该阈值水平(取决于该标志物和/或正在进行的诊断测试)，那么该标志物浓度与该疾病或病症相关联。可任选地并且优选地，多个标志物浓度与该疾病或病症相关联。
可替代地，这样的关联可以可任选地包括对该多个标志物中的每个的浓度进行确定，基于该多个标志物中的每个的浓度计算单一指数值，以及将这个指数值与一种阈值水平进行比较。
还可替代地，这样的关联可以可任选地包括对这些标志物中的至少一种的暂时变化进行确定，并且其中将该暂时变化用于关联步骤中。
还可替代地，这样的关联可以可任选地包括对该多个标志物中的至少“X”数目是否具有预定范围外和/或高于或低于一个阈值(如上所说明的)的浓度进行确定。“X”的值可以可任选地是一个标志物、多个标志物或全部标志物；可替代地或额外地，不是在“X”的计数中包括任何标志物，该多个标志物中的一个或多个特异性标志物可以可任选地被要求与该疾病或病症相关联(根据一个范围和/或阈值)。
还可替代地，这样的关联可以可任选地包括对针对两个标志物的标志物浓度的比例是否在范围之外和/或高于或低于一个阈值进行确定。可任选地，如果该比例高于或低于该临界水平和/或在范围之外，那么该比例与该疾病或病症相关联。
可任选地，这些相关性中的两个或更多个的组合可以被与一张单个的图一起来使用，和/或用于多个图之间的关联。
可任选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少70％的敏感性、至少85％的特异性辨别一种疾病或病症。如在此使用，敏感性涉及检测的阳性(患病)样品的数目/存在的阳性样品的总数；特异性涉及检测的真阴性(非患病)样品的数目/存在的阴性样品的总数。优选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少80％的敏感性、至少90％的特异性辨别一种疾病或病症。更优选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少90％的敏感性、至少90％的特异性辨别一种疾病或病症。还更优选地，当与展示出模拟疾病或病症症状的症状的受试者相比时，这种方法以至少70％的敏感性、至少85％的特异性辨别一种疾病或病症。
可以使用多种本领域的普通技术人员熟知的方式来对一种标志物面板进行分析。例如，可以将一种面板的每个成员与一个“正常”值、或一个指示具体结果的值进行比较。一种具体的诊断/预后可以取决于每个标志物与这个值的比较；可替代地，如果只有一个子集的标志物在正常范围之外，那么这个子集可以指示一种具体的诊断/预后。技术人员还将理解，可以将诊断标志物、差别诊断标志物、预后标志物、标志物发作时间、疾病或病症差异标志物等结合于一个单一测定或装置中。标志物通常还可以用于多种目的，针对不同目的，例如通过将不同阈值或不同加权因子应用于该标志物。
在一个实施例中，这些面板包括用于以下目的的标志物：一种疾病的诊断；如果该疾病处于急性期和/或该疾病的急性发作已经发生，疾病和适应症的诊断；如果该疾病处于非急性期和/或该疾病的非急性发作已经发生，疾病和适应症的诊断；指示急性期和非急性期或发作的组合是否已经发生；一种疾病的诊断以及随后的不良后果的预后；一种疾病的诊断以及随后的急性期或非急性期或发作的预后；疾病的进展(例如对于癌症，这样的进展可以包括例如转移的发生或复发)。
上面的诊断还可以可任选地包括用来将其与其他疾病区分开的该疾病的差别诊断，包括特征可以在于一种或多种类似的或相同的症状的那些疾病。
在某些实施例中，一种或多种诊断的或预后的指示物仅通过这些指示物的存在或不存在而与一种病症或疾病相关联。在其他实施例中，可以制定诊断的或预后的指示物的阈值水平，并且一种患者样品中的这些指示物的水平可以简单地与这些阈值水平进行比较。一种诊断的和/或预后的测试的敏感性以及特异性不只是取决于该测试的分析“质量”--它们还取决于什么构成异常结果的定义。在实践中，接受者工作特征曲线、或“ROC”曲线典型地是通过在“正常”和“患病”群体中绘制对其相对频率的变量的值，和/或通过将治疗前、治疗中和/或治疗后从受试者得到的结果进行比较来计算的。
本发明还涉及基于此类诊断方法或测定的试剂盒。也在本发明的范围之内的是以下试剂盒，这些试剂盒包括本发明的LSR轭合物或抗体组合物(例如，人类抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫轭合物)以及使用说明书。该试剂盒可以进一步包含一种或多种额外的试剂，例如一种免疫抑制试剂、一种细胞毒剂或一种放射性毒剂，或一种或多种根据本发明的至少一些实施例的额外的人类抗体(例如，一种具有互补活性、与不同于第一人类抗体的抗原上的抗原表位结合的人类抗体)。
免疫测定
在本发明的另一个实施例中，可以使用一种免疫测定来定性地或定量地检测和分析一个样品中的标志物。这种方法包括：提供一种与一种标志物特异性结合的抗体；使一个样品与该抗体进行接触；并且在该样品中检测与该标志物结合的该抗体的一种复合物的存在。
为了制备与一种标志物特异性结合的一种抗体，可以使用经纯化的蛋白标志物。可以使用任何本领域已知的适合的方法来制备与一种蛋白标志物特异性结合的抗体。
在提供了该抗体之后，可以使用多种公认的免疫学结合测定中的任一种来对一种标志物进行检测和/或定量。有用的测定包括例如，一种酶免疫测定(EIA)(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、一种放射性免疫测定(RIA)、一种蛋白质印迹测定、或一种狭线印迹测定(slot blot assay)(参见，例如，美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；以及4,837,168)。通常，从一名受试者中获得的一个样品可以与特异性结合该标志物的该抗体进行接触。
可任选地，在将该抗体与一个样品进行接触之前，可以将该抗体固定至一种固相支持体以协助该复合物的洗涤以及随后的分离。固相支持体的实例包括但不限于，例如处于以下形式的玻璃或塑料：微量滴定板、棒、珠、或微珠。抗体也可以被附接至一种固相支持体。
在将该样品与抗体孵育之后，将该混合物进行洗涤，并且可以检测出形成的该抗体-标志物复合物。这可以通过将该经洗涤的混合物与一种检测试剂一起孵育来实现。可替代地，可以使用一种间接测定来检测该样品中的该标志物，其中例如使用一种第二、经标记的抗体来检测所结合的标志物特异性抗体；和/或以一种竞争或抑制测定，其中例如将与该标志物的一种不同抗原表位结合的一种单克隆抗体与该混合物同时孵育。
贯穿这些测定，在试剂的每种组合之后需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可以从约5秒钟至数小时变化，优选是从约5分钟至约24小时。然而，孵育时间将取决于测定方式、标志物、溶液的体积、浓度等。通常，尽管这些测定可以在一个温度范围内(例如10℃至40℃)进行，但是它们将在周围温度下进行。
可以使用该免疫测定来确定来自一名受试者的一个样品中的一种标志物的测试量。首先，可以使用以上所说明的免疫测定方法来检测一个样品中的一种标志物的测试量。如果该样品中存在一种标志物，那么在以上所说明的适合的孵育条件下，它将与特异性结合该标志物的一种抗体形成一种抗体-标志物复合物。一种抗体-标志物复合物的量能可任选地通过与一种标准品进行比较来确定。如上所指出，只要测量值的单位可以与对照量和/或信号进行比较，那么不需要以绝对单位测量标志物的测试量。
放射-免疫测定(RIA)：在一个版本中，这种方法涉及所希望的底物的沉淀并且涉及在此以下详细说明的方法，其中在一个可沉淀的载体(例如琼脂糖珠粒)固定有特异性抗体以及放射性标记的抗体结合蛋白(例如，被I125标记的蛋白A)。沉淀的小粒的计数的数目正比于底物的量。
在RIA的一个替代版本中，采用标记的底物和未标记的抗体结合蛋白。以变化的量的形式添加包含未知量的底物的样品。来自标记的底物的沉淀计数的减少正比于添加的样品中的底物的量。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：这种方法涉及将包含一种蛋白底物的一个样品(例如，固定的细胞或蛋白溶液)向一个表面(例如一个微量滴定板的一个孔)的固定。应用与一种酶偶联的底物特异性抗体并且允许它与该底物结合。然后采用与该抗体偶联的酶通过比色反应来检测并且定量该抗体的存在。在这种方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。如果很好校准并且在反应的线性范围内，那么该样品中存在的底物的量正比于产生的颜色的量。为了改善定量准确度，通常采用一种底物标准品。
蛋白质印迹：这种方法涉及借助丙烯酰胺凝胶将底物与其他蛋白的分离，随后是将该底物向膜(例如，尼龙或PVDF)的转移。然后通过与该底物特异性结合的抗体对该底物的存在进行检测，这些抗体转而通过抗体结合试剂来进行检测。抗体结合试剂可以是例如蛋白A、或其他抗体。抗体结合试剂可以如在上文所说明的进行放射性标记或酶联。检测可以通过放射自显影、比色反应或化学发光进行。这种方法允许通过该膜上的相对位置来定量底物的量和确定其一致性两者，膜上的相对位置是电泳过程中丙烯酰胺凝胶中的迁移距离的指示。
免疫组织化学分析：这种方法涉及通过底物特异性抗体对固定的细胞中的底物的原位检测。底物特异性抗体可以被酶联或被连接至荧光团。通过显微镜和主观评价进行检测。如果采用酶联抗体，那么需要比色反应。
荧光激活细胞分选(FACS)：这种方法涉及通过底物特异性抗体对细胞中的底物的原位检测。这些底物特异性抗体被连接至荧光团。借助细胞分选设备进行检测，当每个细胞穿过一个光束时，该细胞分选设备读出由每个细胞射出的光的波长。这种方法可以同时采用两种或更多种抗体。
放射成像方法
这些方法包括但不限于，正电子发射断层术(PET)、单光子发射计算机化断层显像(SPECT)。这两种技术都是非侵入性的，并且可以用来检测和/或测量多种多样组织事件和/或功能，例如像检测癌性细胞。与PET不同，SPECT可以可任选地与两种标记同时使用。SPECT还具有一些其他的优点，例如关于成本和可用的标记的类型。例如，美国专利号6,696,686说明了SPECT用于检测乳腺癌的用途，并且通过引用将其结合在此，如同完全在此阐述一样。
治疗诊断学(THERAN0STICS)：
术语治疗诊断学说明了诊断测试的以下用途：用于根据诊断测试的结果诊断疾病、选择正确的治疗方案和/或根据诊断测试的结果监测患者对治疗的反应。可以使用治疗诊断学测试来为患者选择特别可能使其受益并且不太可能产生副作用的治疗。它们还可以提供个体患者的疗效的早期的并且客观的指示，这样使得(如果必需的话)这种治疗能以最小的延迟来改变。例如：达科(DAKO)和基因泰克(Genentech)一起创造了用于治疗乳腺癌的海尔采谱测试(HercepTest)和赫赛汀(曲妥珠单抗)，这是第一种被批准的同时带有一种新治疗药物的治疗诊断学测试。除了海尔采谱测试(HercepTest)(一种免疫组织化学测试)之外，其他的治疗诊断学测试正处于研发中，它们使用传统的临床化学、免疫测定、基于细胞的技术以及核酸测试。PPGx's最近推出了TPMT(巯基嘌呤S-甲基转移酶)测试，它使得医生能够鉴定对6-巯基嘌呤(一种用于白血病的治疗的药剂)有潜在致命不良反应的风险的患者。而且，诺维分子(Nova Molecular)开辟了载脂蛋白E基因的SNP基因分型以预测阿耳茨海默病患者对拟胆碱能药治疗的反应，并且现在它广泛地用于针对这种适应症的新药的临床试验中。因此，治疗诊断学领域代表诊断测试信息的交叉点，断测试信息能预测患者对治疗的反应连同为那位具体患者选择适当的治疗。
如在此所述的，术语“治疗诊断学(theranostic)”可以可任选地指首先针对如在此所述的LSR的某种最小水平(例如可任选地在癌性组织中和/或在免疫渗液中)作为LSR表达的一种足够水平，对该受试者(例如该患者)进行测试。测试可以可任选地离体(其中将该样品从该受试者移除)或在体内进行。
如果该癌性组织和/或该免疫渗液已经显示出具有LSR的该最小水平，那么可以可任选地将一种抗LSR抗体单独或可任选地与如在此所述的其他治疗模式一起给予该受试者。
替代标志物(SURROGATE MARKER)：
一种替代标志物是在一个实验室中可检测的和/或根据患者中的一种体征或症状可检测的一种标志物，且其在治疗试验中用作一种临床上有意义的终点的替代物。该替代标志物是关于患者感觉、功能或存活如何的直接量度，预期其可预测治疗的效果。对替代标志物的需求主要出现在此类替代标志物与被称作临床终点的在治疗对患者的效果方面感兴趣的终点相比可被更早地、更方便地或更频繁地测量时。理想地，一种替代标志物应该是生物学上貌似合理的、预测疾病的进展的并且通过标准化测定(包括但不限于传统的临床化学、免疫测定、基于细胞的技术、核酸测定以及成像模式)可测量的。
在补体存在的情况下，还可以使用根据本发明的至少一些实施例的具有补体结合位点(例如，来自结合补体的IgGl、IgG2、或IgG3或IgM的部分)的这些治疗组合物(例如，人类抗体、多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物)。在一个实施例中，包括具有根据本发明的至少一些实施例的一种结合剂的靶细胞以及适当的效应细胞的细胞群体的离体治疗可以通过添加补体或包含补体的血清进行补充。被根据本发明的至少一些实施例的一种结合剂包被的靶细胞的吞噬作用可以通过补体蛋白的结合来改善。在另一个实施例中，被根据本发明的至少一些实施例的这些组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)包被的靶细胞也可以被补体裂解。在又另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例的这些组合物不激活补体。
也可以将根据本发明的至少一些实施例的这些治疗组合物(例如，人类抗体、多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物)与补体一起给予。因此，根据本发明的至少一些实施例，存在包括人类抗体、多特异性分子或双特异性分子以及血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为这种补***于紧紧靠近这些人类抗体、多特异性分子或双特异性分子处。可替代地，可以将根据本发明的至少一些实施例的这些人类抗体、多特异性分子或双特异性分子与补体或血清分开给予。
通过以下实例来进一步说明本发明。此信息以及实例是说明性的并且不应被视为进一步限制。贯穿本申请引用的所有图以及所有参考文献、专利以及公开专利申请的内容明确地通过引用结合在此。
实例
实例1：LSR蛋白的克隆
A.LSR_Tl_P5a ORF的克隆
如下所说明的，通过PCR进行LSR_Tl_P5a开放阅读框(ORF)(SEQID NO:154)的克隆以产生LSR_P5a蛋白(SEQ ID NO:11)。
使用PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(安捷伦，目录号600670)在以下条件下进行一种PCR反应：以上所说明的pIRES_puro3_LSR_T1_P5a_标签构建体50ng充当PCR反应的一种模板，引物200_369_LSR_Kozak_NheI(SEQ ID NO:147)和200-372_LSR_BamHI_Rev(SEQ ID NO:152)中的每一种0.5微升，总反应体积25μl。这些反应条件是98℃5分钟；35个循环的：98℃20秒，55℃30秒以及72℃1.5分钟；然后72℃10分钟。使用的所有引物包括基因特异性序列、限制性内切酶位点以及Kozak序列。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。在验证预期带的大小之后，使用如上所说明的QiaquickTM凝胶提取试剂盒(QiaquickTM Gel Extraction Kit)对该PCR产物进行纯化。
将该经纯化的PCR产物用NheI和BamHI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。消化之后，将DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。将预期大小的带从如上所说明的该凝胶中切除并且提取。然后将经消化的DNA连接进被如上所说明的NheI和BamHI消化的pIRESpuro3载体中，在37℃下使用南极磷酸酯酶(Antarctic Phosphatase)(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，贝弗利，马萨诸塞州(MA)，美国，目录号M0289L)孵育30分钟，并且使用如上所说明的QiaquickTM凝胶提取试剂盒(QiaquickTM GelExtraction Kit)将其从1％的琼脂糖凝胶中纯化。使用T4DNA连接酶(普洛麦格(Promega)，目录号M180A)进行连接反应。
对以上所说明的经标记的构建体和未经标记的构建体两者进行序列验证(海拉伯(Hylabs)，雷霍沃特(Rehovot)，以色列)。鉴定了两种核苷酸错配，如下：在SEQ ID NO:154的核酸位置119处的G至A，以及来自SEQ ID NO:154的核酸位置626处的A至G，导致了在SEQ ID NO:145(对该未经标记的构建体来说)中以及在SEQ ID NO:146(对该经标记的构建体来说)中所阐述的一种核酸序列，产生了在氨基酸位置11中具有一种氨基酸错配I至M的一种多肽，导致了具有在SEQ ID NO:143(对该未经标记的构建体来说)中以及在SEQ ID NO:144(对该经标记的构建体来说)中所阐述的氨基酸序列的一种蛋白。
对上面的重组质粒进行处理用于如下所说明的稳定库的产生。
2.LSR_WT ORF的克隆
如以下所说明的，LSR_WT开放阅读框(ORF)的克隆通过将627位的丙氨酸通过一步定点诱变PCR而置换为甘氨酸进行，以产生LSR_WT蛋白(SEQ ID NO:154)。
使用PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(安捷伦，目录号600670)在以下条件下进行一种PCR反应：以上所说明的pIRES_puro3_LSR_T1_P5a_标签_m构建体(SEQ ID NO:145)20ng充当PCR反应的一种模板，引物200_398(SEQ ID NO:199)和200-399(SEQ ID NO:200)中的每一种2.5微升，总反应体积50μl。这些反应条件是95℃3分钟；12个循环的：95℃1分钟，55℃1分钟以及72℃3分钟；然后72℃10分钟。将2ul DpnI添加至该PCR反应，并且在37℃孵育2h。
对以上所说明的经标记的构建体进行序列验证(海拉伯(Hylabs)，雷霍沃特(Rehovot)，以色列)。
对上面的重组质粒进行处理用于如下所说明的稳定库的产生。
3.LSR_SKIP4ORF的克隆
对人-LSR的全长cDNA(SEQ ID NO:201)的在C-末端带有一种标签标签的变体(跳过外显子4)进行合成，并且通过GenWiz(USA)克隆在pUC57载体中。如以下所说明的，这种cDNA随后被克隆在pRp3哺乳动物表达载体pcDNA3.1中，以产生一种表达构建体。
cDNA用NheI和BamHI限制性内切酶进行消化，并且连接至先前用这些相同的酶所消化的pIRESpuro3(pRp3)哺乳动物表达载体(克隆泰克(Clontech)，目录号：631619)。将所产生的这些表达构建体通过序列(SEQID No:201)进行验证，并且随后用于如以下所说明的转染和稳定库的产生。
4.小鼠LSR-WT标签构建体的克隆
如以下所说明的，对在C-末端带有一种标签标签的小鼠WT LSR(SEQID NO:202)的全长cDNA进行合成，通过金斯瑞(GenScript)克隆至pUC57载体中，并且亚克隆至一种哺乳动物表达载体pcDNA3.1中，以产生一种表达构建体。
cDNA用NheI和BamHI限制性内切酶进行消化，并且连接至先前用这些相同的酶所消化的pcDNA3.1+哺乳动物表达载体。将所产生的这些表达构建体通过序列(SEQ ID No:202)进行验证，并且随后用于如以下所说明的转染和稳定库的产生。
5.CYNO LSR_WT ORF的克隆
如以下所说明的，通过PCR进行cyno LSR_WT开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:203)的克隆以产生cyno LSR_WT蛋白(SEQ ID NO:203)。
使用Go Taq DNA聚合酶(普洛麦格(Promega)，目录号M3001)在以下条件下进行一种PCR反应：猴cDNA库(博诚(Biochain)，目录号C8534502-Cy，C8534501-Cy)充当用于2种不同PCR反应的一种模板。第一种用引物200_403_cLSR_Kozak_NheI(SEQ ID NO:204)和200-407_cLSR_Rev(SEQ ID NO:205)中的每一种1微升，并且第二种用引物200_404_cLSR_标签_EcoRI(SEQ ID NO:206)和200-406_cLSR_For(SEQ ID NO:207)中的每一种1微升，两者总反应体积都是50μl。
这些反应条件是95℃5分钟；40个循环的：95℃30秒，55℃30秒以及72℃1分钟；然后72℃5分钟。使用的所有引物包括基因特异性序列、限制性内切酶位点以及Kozak序列。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。在验证预期带的大小之后，使用如上所说明的QiaquickTM凝胶提取试剂盒(QiaquickTM Gel Extraction Kit)对这些PCR产物进行纯化。这些经纯化的PCR产物用作用于在以下条件下的一种PCR反应的一种模板：95℃5分钟；40个循环的：95℃30秒，55℃30秒以及72℃1.5分钟；然后72℃5分钟，使用Go Taq DNA聚合酶(普洛麦格(Promega)，目录号M3001)。将该PCR产物加样在1％琼脂糖凝胶上，并且按以上所说明的相同的方式对该产物进行纯化。
将该经纯化的PCR产物用NheI和EcoRI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。消化之后，将DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。将预期大小的带从如上所说明的该凝胶中切除并且提取。然后将经消化的DNA连接进被如上所说明的NheI和EcoRI消化的pIRESpuro3载体中，在37℃下使用南极磷酸酯酶(Antarctic Phosphatase)(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，贝弗利，马萨诸塞州(MA)，美国，目录号M0289L)孵育30分钟，并且使用如上所说明的QiaquickTM凝胶提取试剂盒(QiaquickTMGelExtraction Kit)将其从1％的琼脂糖凝胶中纯化。使用T4DNA连接酶(普洛麦格(Promega)，目录号M180A)进行连接反应。
对以上所说明的经标记的构建体进行序列验证(海拉伯(Hylabs)，雷霍沃特(Rehovot)，以色列)。
对上面的重组质粒进行处理用于如下所说明的稳定库的产生。
6.CYNO LSR_SKIP4ORF的克隆
如以下所说明的，通过PCR进行cyno LSR_skip4开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:208)的克隆以产生cyno LSR_skip4蛋白(SEQ ID NO:208)。
使用Go Taq DNA聚合酶(普洛麦格(Promega)，目录号M3001)在以下条件下进行一种PCR反应：猴cDNA库(博诚(Biochain)，目录号C8534502-Cy，C8534501-Cy)充当用于PCR反应的一种模板。
引物200_403_cLSR_Kozak_NheI(SEQ ID NO:204)和200-404_cLSR_标签_EcoRI(SEQ ID NO:206)中的每一种1微升，总反应体积50μl。
这些反应条件是95℃5分钟；40个循环的：95℃30秒，55℃30秒以及72℃1.45分钟；然后72℃5分钟。使用的所有引物包括基因特异性序列、限制性内切酶位点以及Kozak序列。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。在验证预期带的大小之后，使用如上所说明的QiaquickTM凝胶提取试剂盒(QiaquickTM Gel Extraction Kit)对这些PCR产物进行纯化。将该经纯化的PCR产物用NheI和EcoRI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。消化之后，将DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。将预期大小的带从如上所说明的该凝胶中切除并且提取。然后将经消化的DNA连接进被如上所说明的NheI和EcoRI消化的pIRESpuro3载体中，在37℃下使用南极磷酸酯酶(Antarctic Phosphatase)(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，贝弗利，马萨诸塞州(MA)，美国，目录号M0289L)孵育30分钟，并且使用如上所说明的QiaquickTM凝胶提取试剂盒(QiaquickTMGelExtraction Kit)将其从1％的琼脂糖凝胶中纯化。使用T4DNA连接酶(普洛麦格(Promega)，目录号M180A)进行连接反应。
对以上所说明的经标记的构建体进行序列验证(海拉伯(Hylabs)，雷霍沃特(Rehovot)，以色列)。
对上面的重组质粒进行处理用于如下所说明的稳定库的产生。
实例2：表达LSR蛋白的重组细胞的稳定库的建立
1.表达LSR_P5a_标签_M蛋白的重组HEK293T细胞的稳定库的建立
用LSR_T1_P5a_标签_m(SEQ ID NO:146)和pIRESpuro3空载体质粒对HEK-293T细胞进行稳定转染如下：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞铺板于一个适合组织培养的无菌6孔板中，该无菌6孔板包含2ml预暖的完全培养基，DMEM[杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Media)，生物产业(Biological Industries)(贝特哈'伊美伊康(Beit Ha’Emek)，以色列，目录号：01-055-1A)+10％FBS[胎牛血清，生物产业(贝特哈'伊美伊康，以色列，目录号：04-001-1A)+4mM L-谷氨酰胺(生物产业(贝特哈'伊美伊康，以色列)，目录号：03-020-1A)。使用稀释于94ul DMEM中的6μl富基因(FuGENE)6试剂(罗氏(Roche)，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体对500,000个细胞每孔进行转染。将该混合物在室温下孵育15分钟。将该复杂混合物滴加至这些细胞中。将这些细胞放置于维持在37℃、具有5％的CO2含量的培养箱中。转染后48小时，将这些细胞转移至包含15ml的选择培养基(补充有5μg\ml嘌呤霉素(西格玛，目录号P8833)的完全培养基)的75cm2的组织培养烧瓶中。将细胞放置于培养箱中，并且每3-4天置换培养基，直到观察到克隆形成。
2.表达人以及CYNO WT和SKIP4LSR蛋白的稳定转染子库的产生
使用富基因(Fugene)6转染试剂(罗氏(Roche)，目录号：111-988-387)用以上所说明的这些人以及cyno LSR(SEQ ID NO:154、201、203、208)LSR pRp3构建体或用空载体(pRp3)(作为阴性对照)对HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞进行转染。选择嘌呤霉素抗性的菌落用于稳定库的产生。对于小鼠LSR WT(SEQ ID NO:202)来说，使用一种不同的表达载体以及其他细胞系用于产生稳定转染子库(见下面)。
3.表达小鼠WT蛋白的稳定转染子库的产生
在GeneScript(美国公司)产生了表达该WT-小鼠LSR-标签蛋白(SEQID NO:202)的稳定转染子细胞库。对在C'-末端带有该标签标签的小鼠WT LSR序列(SEQ ID NO:202)进行合成，克隆至pUC57载体中，并且亚克隆至一种哺乳动物表达载体pcDNA3.1中。将该重组质粒转染至CHO-K1(ATCC，cat#CCL-61)和至HEK-293(ATCC cat#CRL-1573TM)细胞中。对稳定转染子的细胞库使用G418进行筛选，并且使用抗-标签Ab通过蛋白质印迹进行分析。
实例3：表达验证
A.LSR_P5a_标签_M在经稳定转染的HEK293T细胞中的异位表达的分析
使用如在表1中指出的抗LSR抗体和抗标签抗体，通过细胞裂解物的蛋白质印迹分析来确定LSR_P5a_标签_m(SEQ ID NO:144)在经稳定转染的HEK293T细胞中的表达。
使用基于PBS的无酶细胞解离缓冲液(Cell Dissociation BufferEnzyme-Free PBS-Based)(古布可(Gibco)；13151-014)将细胞从该板上解离，在杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)(PBS)(生物产业(Biological Industries)，02*023-lA)中洗涤并且在1200g下离心5分钟。通过将这些细胞重悬浮于补充有25x的无蛋白酶抑制剂混合物(罗氏(Roche)，11873580001)的完全EDTA的50mM Tris-HClpH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100中并且涡旋20秒钟来进行全细胞提取。在4℃下、在20000g下离心20分钟之后收集细胞提取物并且使用布拉德福德伯乐(Bradford Biorad)蛋白测定(伯乐(Biorad)cat#500-0006)来确定蛋白浓度。通过SDS-PAGE(英杰公司，NuPAGE4％-12％NuPAGE Bis Tris，Cat#NP0335，NP0322)对相等蛋白量进行分析并且将其转移至硝酸纤维素膜(BA83，0.2μm，施莱克尔(Schleicher)和许尔(Schuell)，Cat#401385)。将膜用TTBS(生物实验室(Biolab)，Cat#:20892323)/10％脱脂乳(迪夫科(Difco)，Cat#232100)封闭并且在4℃下、使用处于所指出的浓度(表2)的被稀释进TTBS/5％BSA(西格玛-奥德里奇，A4503)的所指出的第一抗体(图1)孵育16小时。在使用TTBS洗涤3次之后，该膜在室温下使用如所指出的、稀释于TTBS中的二级轭合抗体进一步孵育1小时。使用ECL蛋白质印迹检测试剂(ECLWestern Blotting Detection Reagent)(GE医疗(GE Healthcare集团)，Cat#RPN2209)进行化学发光反应并且将该膜暴露于超级RX富士X斜线胶片(Super RX Fuji X-Ray film)(目录号4741008389)。
图1展示了在重组HEK293T细胞中LSR_P5a_标签_m蛋白(SEQ ID:144)在所预期的条带大小～70kDa处的表达，用抗标签(西格玛cat#A8592)(图1A)和如下抗LSR抗体进行检测：亚诺法，cat#H00051599-B01P(图1B)，艾碧康，cat ab59646(图1C)以及西格玛cat#HPA007270(图1D)。
B.人、CYNO以及小鼠LSR_WT和LSR SKIP4在经稳定转染的HEK293T细胞或在CHO-K1细胞中的表达验证
使用如在表1中指出的抗LSR抗体和抗标签抗体，通过细胞裂解物的蛋白质印迹分析来确定人、cyno以及小鼠LSR_WT和LSR skip4在经稳定转染的HEK293T细胞中或在CHO-K1细胞中的表达。
使用基于PBS的无酶细胞解离缓冲液(Cell Dissociation BufferEnzyme-Free PBS-Based)(古布可(Gibco)；13151-014)将细胞从该板上解离，在杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)(PBS)(生物产业(Biological Industries)，02*023-lA)中洗涤并且在1200g下离心5分钟。通过将这些细胞重悬浮于补充有25x的无蛋白酶抑制剂混合物(罗氏(Roche)，11873580001)的完全EDTA的50mM Tris-HClpH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100中并且涡旋20秒钟来进行全细胞提取。在4℃下、在20000g下离心20分钟之后收集细胞提取物并且使用布拉德福德伯乐(Bradford Biorad)蛋白测定(伯乐(Biorad)cat#500-0006)来确定蛋白浓度。通过SDS-PAGE(英杰公司，NuPAGE4％-12％NuPAGE Bis Tris，Cat#NP0335，NP0322)对相等蛋白量进行分析并且将其转移至硝酸纤维素膜(BA83，0.2μm，施莱克尔(Schleicher)和许尔(Schuell)，Cat#401385)。将膜用TTBS(生物实实验室(Biolab)，Cat#:20892323)/5％脱脂乳(迪夫科(Difco)，Cat#232100)封闭并且在室温下、使用处于所指出的浓度(表1)的被稀释进TTBS/5％BSA(西格玛-奥德里奇，A4503)的所指出的第一抗体(图1)孵育1小时。在使用TTBS洗涤3次之后，该膜在室温下使用以1:20,000稀释于TTBS中的二级轭合抗体羊抗兔IgG-过氧化物酶(杰克逊(Jackson)，目录号111-035-003)进一步孵育1小时。使用ECL蛋白质印迹检测试剂(ECL Western BlottingDetection Reagent)(GE医疗(GE Healthcare集团)，Cat#RPN2209)进行化学发光反应并且将该膜暴露于超级RX富士X斜线胶片(Super RX FujiX-Ray film)(目录号4741008389)。
图2、3、4、5描述了对人(图2、3)、cyno(图4)以及小鼠(图5)LSR_WT和LSR skip4蛋白(SEQ ID NO:11、13、211、212、31)在用人和cyno LSR的LSR_WT和LSR skip4构建体两者转染的重组HEK293T细胞中以及在用小鼠LSR的WT构建体转染的HEK293和CHO-K1细胞中在所预期的条带大小～70kDa处的表达进行展示的蛋白质印迹分析结果，用抗标签(西格玛cat#A8592)(图5)和抗LSR抗体(艾碧康，cat ab59646)(图2、3、4)进行检测。
图2描述了用3种不同的针对LSR的商业Ab对人LSR_WT进行的检测：2A指的是西格玛Ab，而2B指的是艾碧康Ab，并且2C指的是亚诺法Ab(如在表1中所详细说明的)。泳道#1表示被用作一种阴性对照的经HEK293T_pIRESpuro3空载体转染的细胞，而泳道#2表示经HEK293T_pIRESpuro3_人WT LSR_标签转染的细胞。
图3描述了使用艾碧康Ab对人LSR_skip4蛋白进行的检测。泳道#1表示被用作一种阴性对照的经HEK293T_pIRESpuro3空载体转染的细胞，而泳道#2表示经HEK293T_pIRESpuro3_人LSR skip4_标签转染的细胞。
图4描述了对cyno LSR_WT(泳道2)和LSR_skip4(泳道3)蛋白进行的检测，两者都与空载体细胞裂解物(泳道1)相比较。
图5描述了在CHO-K1细胞中(泳道2)以及在HEK293细胞中(泳道4)通过抗标签Ab对小鼠LSR_WT蛋白进行的检测，与相关的空载体细胞裂解物(分别为泳道1和3)相比较。
表1：第一抗体和第二抗体
C.内源LSR蛋白在不同细胞系中的表达的分析
如以下所说明的通过蛋白质印迹对内源LSR蛋白在不同细胞系中的表达进行分析。
如以上所说明的制备SK-OV3(ATCC号HTB-77)、Caov3(ATCC号HTB-75)、OVCAR3(ATCC号HTB-161)、ES-2(ATCC号CRL-1978)、OV-90(ATCC号CRL-11732)、TOV112D(ATCC号CRL-11731)以及HepG2(ATCC号HB-8065)的细胞提取物。
从圣克鲁斯生物技术(SantaCruz Biotechnology)购买海拉细胞(目录号sc-2200)、MCF-7(目录号sc-2206)、CaCo2(目录号sc-2262)以及SkBR3(目录号sc-2218)的细胞提取物。
如以上所说明的，通过SDS-PAGE分析相等蛋白量并且将其转移至硝酸纤维素膜。将膜用TTBS(生物实验室(Biolab)，Cat#：20892323)/10％脱脂乳(迪夫科(Difco)，Cat#232100)封闭并且在4℃下、使用处于所指出的浓度(表2)的被稀释进TTBS/5％BSA(西格玛-Aldrich，A4503)的抗LSR抗体(艾碧康，cat#ab59646)孵育16小时。在使用TTBS洗涤3次之后，该膜在室温下使用如所指出的(表2)、稀释于TBS中的二级轭合抗体进一步孵育1小时。使用ECL蛋白质印迹检测试剂(ECL WesternBlotting Detection Reagent)(GE医疗(GE Healthcare集团)，Cat#RPN2209)进行化学发光反应并且将该膜暴露于超级RX富士X斜线胶片(Super RXFuji X-Ray film)(目录号4741008389)。
图6展示了在不同细胞系中的LSR的内源表达。用SK-OV3、Caov3、OVCAR3、OV-90、Hep G2、海拉细胞、CaCo2、以及SkBR3的提取物中的抗LSR抗体检测到了对应于LSR的处于72kDa的带(图6A)。抗GAPDH(艾碧康cat#ab9484)充当一种上样对照(图6B)。
表2：第一抗体和第二抗体
实例4A：通过SiRNA将LSR蛋白表达敲低
为了验证对人LSR_WT(SEQ ID NO:11)蛋白特异性的siRNA(赛默科学Cat#M-009672-00-0005)的性能，并且为了验证它的特异性，对稳定表达人LSR_WT(SEQ ID NO:11)的这些HEK293T细胞进行LSR蛋白的敲低。
在siRNA转染之前24hr，将以上所说明的表达人LSR_WT(SEQ IDNO:11)的经稳定转染的重组HEK293T细胞铺板于6孔板中、于包含10％FBS的2mlI减少血清培养基(古布可(Gibco)，cat#31985-047)中。对每个转染样品来说，如下制备并且添加寡聚体和脂转染胺2000转染试剂(英杰公司cat#11668019)复合物：将100pmol siRNA寡聚体和5ul的该转染试剂混合于最终体积为250ul的不含血清的最佳条件中。将以上复合物在RT下孵育20分钟，并且添加至包含细胞和培养基的每个孔中。将该板轻轻混合，并且在一个CO2培养箱中在37℃下孵育48hr，然后使用基于PBS的无酶细胞解离缓冲液(Cell Dissociation BufferEnzyme-Free PBS-Based)(古布可(Gibco)；13151-014)从该板上收集这些细胞，在杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's Phosphate BufferedSaline)(PBS)(生物产业(Biological Industries)，02*023-1A)中洗涤并且在1200g下离心5分钟。如上述的，进行全细胞提取和蛋白质分析。
在图7中所显示的这些结果展示了与该乱序siRNA(赛默科学Cat#D-001810-01-05)(泳道1)相比较，由该LSR特异性siRNA(赛默科学Cat#M-009672-00-0005)(泳道2)转染之后，该～70kDa条带的信号强度的急剧降低，表明人WT LSR-标签蛋白的异位表达的特异性敲低。
实例4B：在内源细胞系中LSR的敲低
在HT29细胞中或在HepG2/C3A细胞中的LSR蛋白(SEQ ID NO:11)的内源表达的敲低通过对LSR(SEQ ID NO:11)特异性的siRNA的瞬时转染来实施。使用RNAiMAX转染试剂(英杰公司，Cat#13778-150)，用30pmol(10nM)(对HT29细胞来说)以及用50pmol(对HepG2/C3A来说)LSR特异性siRNA(赛默科学Cat#M-009672-00-0005)以及乱序siRNA(赛默科学Cat#D-001810-01-05)(作为一种阴性对照)对细胞进行转染。在72hr(对HT29细胞来说)或48hr(对HepG2/C3A细胞来说)的孵育之后，使用抗LSR(SEQ ID NO:11)mAb8C8的杂交瘤上清液(sup)通过FACS或使用如在以上表1中所说明的商业抗LSR多克隆抗体通过蛋白质印迹对细胞进行分析。
图16展示了通过蛋白质印迹所分析的内源LSR(SEQ ID NO:11)蛋白表达的一种特异性敲低。
图17展示了在用LSR特异性siRNA(赛默科学Cat#M-009672-00-0005)进行瞬时转染之后，HT29(图17A)和HepG2/C3A(图17B)细胞的FACS分析结果。
显示出了与用乱序siRNA(赛默科学Cat#D-001810-01-05)转染的细胞(箭头#2)(作为阴性对照)相比较，内源LSR(SEQ ID NO:11)蛋白表面表达(箭头#1)的特异性敲低。
实例5：这些异位LSR蛋白在这些经转染的细胞中的亚细胞定位的确定
A.异位LSR_P5a_标签_M在HEK293T细胞中的亚细胞定位的确定
通过共聚焦显微镜在经稳定转染的细胞中对LSR_P5a_标签_m蛋白(SEQ ID NO:144)的亚细胞定位进行确定。
将以上所说明的表达LSR_P5a_标签_m(SEQ ID NO:144)的经稳定转染的重组HEK293T细胞铺板于用聚L-赖氨酸(西格玛；目录号P4832)预包被的盖玻片上。24小时之后，对这些细胞进行处理用于免疫染色并且通过共聚焦显微镜进行分析。将盖玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行洗涤，然后在PBS/3.7％多聚甲醛(PFA)(EMS，目录号：15710)/3％葡萄糖(西格玛，目录号：G5767)的溶液中固定15分钟。将PFA用PBS/3mM甘氨酸(西格玛，目录号：G7126)淬灭5分钟。在两个PBS中的5分钟的洗涤之后，将这些细胞使用PBS/0.1％Triton-X100在室温下透性化5分钟并且在PBS中洗涤两次。然后，使用PBS/牛血清白蛋白(BSA)(西格玛，目录号：A4503)进行非特异区的阻断，持续20分钟。然后将盖玻片与多种第一抗体在湿箱(humid chamber)中孵育1小时，所用每种第一抗体如所指出的在PBS/5％BSA中进行稀释，随后是在PBS中的三次5分钟的洗涤。然后，将盖玻片用相对应的第二抗体孵育30分钟，将该第二抗体在指出的稀释度下稀释于PBS/2.5％BSA中。使用的抗体和稀释度规定于表2中。在汉克平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solutions)w/o酚红(HBSS)(生物产业(Biological Industries)，目录号02-016-1)中的一次预洗涤之后，将盖玻片用以1:200稀释于HBSS中的WGA-亚历克萨488(英杰公司，目录号W11261)孵育10min，在HBSS中进行洗涤并且在以1:1000稀释于HBSS中的双苯酰亚胺H33258(西格玛，目录号：14530)进行孵育。然后将盖玻片安装在具有Gel Mount水性介质(西格玛，目录号：G0918)的载玻片上并且使用共聚焦显微镜针对荧光产物的存在对细胞进行观察。
在图8中展示了LSR_P5a_标签_m的亚细胞定位，LSR_P5a_标签_m(SEQ ID NO:144)主要定位于细胞的细胞质，但是也能够在细胞表面被检测到，如用抗标签(西格玛cat#A9594)(图8A)和如下抗LSR抗体进行的检测：艾碧康，cat ab59646(图8B)，亚诺法，cat#H00051599-B01P(图8C)以及西格玛cat#HPA007270(图8D)。
B.异位人、CYNO以及小鼠LSR_WT和LSR_SKIP4在HEK293T和CHO-K1细胞中的亚细胞定位的确定
通过共聚焦显微镜在经稳定转染的细胞中对LSR_WT(SEQ ID NO:11、211、31)和skip4蛋白(SEQ ID NO:13、212)的亚细胞定位进行确定。
将以上所说明的表达人和cyno LSR_WT(SEQ ID NO:11、211)和LSR_skip4(SEQ ID NO:13、212)的经稳定转染的重组HEK293T细胞以及表达小鼠LSR_WT(SEQ ID NO:31)的CHO-K1细胞铺板于用聚L-赖氨酸(西格玛；目录号P4832)预包被的盖玻片上。24小时之后，对这些细胞进行处理用于免疫染色并且通过共聚焦显微镜进行分析。将盖玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行洗涤，然后在PBS/3.7％多聚甲醛(PFA)(EMS，目录号：15710)/3％葡萄糖(西格玛，目录号：G5767)的溶液中固定15分钟。将PFA用PBS/3mM甘氨酸(西格玛，目录号：G7126)淬灭5分钟。在两次在PBS中的5分钟的洗涤之后，使用PBS/5％牛血清白蛋白(BSA)(西格玛，目录号：A4503)进行非特异区的封闭，持续20分钟。然后将盖玻片与多种第一抗体在湿箱(humid chamber)中孵育1小时，所用每种第一抗体如所指出的在PBS/5％BSA中进行稀释，随后是在PBS中的三次5分钟的洗涤。然后，将盖玻片用相对应的第二抗体孵育30分钟，将该第二抗体在指出的稀释度下稀释于PBS/2.5％BSA中。使用的抗体和稀释度规定于表1中。在汉克平衡盐溶液(Hank's Balanced SaltSolutions)w/o酚红(HBSS)(生物产业(Biological Industries)，目录号02-016-1)中的一次预洗涤之后，将盖玻片用以1:200稀释于HBSS中的WGA-亚历克萨488(英杰公司，目录号W11261)孵育10min，在HBSS中进行洗涤并且在以1:1000稀释于HBSS中的双苯酰亚胺H33258(西格玛，目录号：14530)进行孵育。然后将盖玻片安装在具有Gel Mount水性介质(西格玛，目录号：G0918)的载玻片上并且使用共聚焦显微镜针对荧光产物的存在对细胞进行观察。
在图9、10、11、12中展示了人、cyno以及小鼠LSR_WT(分别为SEQID NO:11、211、31)和cyno LSR_skip4((SEQ ID NO:212)的亚细胞定位。LSR蛋白主要定位于细胞的细胞质，但是也能够在细胞表面被检测到，如用抗标签(西格玛cat#A9594)(图9A、10A、11A、12A以及13A)和如下抗LSR抗体进行的检测：艾碧康，cat ab59646(图9C)以及西格玛cat#HPA007270(图9B、10B、11B、12B以及13B)。所有表达LSR蛋白的重组细胞都与被用作一种阴性对照的空载体细胞(在所有的图中编号为A-1、B-1以及C-1)相比较。箭头指示了膜染色。
用这些抗标签(西格玛cat#A9594)(图9A-2)和抗LSR抗体(西格玛cat#HPA007270，艾碧康，cat ab59646，分别为图9B-2和9C-2)两者主要在胞内区观察到了人WT LSR(SEQ ID NO:11)，低百分比的细胞展示了膜定位。
使用一种抗标签抗体(图10A-2)，也主要在胞内区(包括在ER和高尔基体中)观察到了cyno WT LSR(SEQ ID NO:211)蛋白。然而，当使用一种抗LSR抗体(西格玛cat#HPA007270)(图10B-2)时，表达cyno WTLSR(SEQ ID NO:211)蛋白的这些相同细胞显示出了一种更加显著的膜染色。有趣的是，使用两种抗体，与表达cyno WT LSR-标签蛋白(SEQ IDNO:211)的重组细胞相比较，在表达cyno Skip4LSR-标签变体(SEQ ID NO:212)的这些重组细胞中在细胞表面上的表达更加显著(图12A-2和12B-2)。
表达小鼠WT LSR(SEQ ID NO:31)蛋白的重组HEK293细胞，用该抗标签抗体显示出了一种信号(尽管非常弱)(图11A)，并且使用该特异性抗LSR抗体(西格玛cat#HPA007270)(图11B)在细胞膜上显示出了一种弱信号。表达小鼠LSR-标签蛋白(SEQ ID NO:31)的重组CHO-K1细胞(图13A和13B)展示了用两种抗体的ER定位。
实例6
A.通过对稳定表达的细胞的FACS分析对人和CYNO LSR蛋白的细胞表面表达的验证
使用该8C8杂交瘤克隆，通过流式细胞术(FACS)，对过表达这些不同LSR蛋白(WT和skip4)(SEQ ID NO:11、13、211、212以及31)的HEK293T和CHO_K1经稳定转染的细胞进行分析。如在图14中所示，不同mAb浓度的该8C8mAb与稳定表达这些LSR蛋白(分别是人WT(SEQID NO:11)、cyno WT(SEQ ID NO:211)、小鼠WT(SEQ ID NO:31)、人和cyno Skip4变体(SEQ ID NO:13、212))的细胞的结合大幅高于对于用空载体所转染的细胞、或用对照培养基所染色的细胞所观察到的结合，表明了这五种LSR蛋白的细胞膜表达。
B.内源LSR蛋白在不同细胞系中的表达的分析
如以下所说明的，通过蛋白质印迹对内源LSR蛋白在不同细胞系(来源于卵巢、肝、乳腺、宫颈以及结肠，在表3中说明)中的表达进行分析。
通过SDS-PAGE对全细胞提取物(对这些癌细胞系来说是50-75ug，并且对这些异位表达的细胞系来说是30ug)进行分析，并且如以上所说明的，转移至硝酸纤维素膜。将膜用TTBS(生物实验室(Biolab)，Cat#:20892323)/5％脱脂乳(迪夫科(Difco)，Cat#232100)封闭并且在室温下、使用处于所指出的浓度(表1)的被稀释进TTBS/5％BSA(西格玛-奥德里奇，A4503)的抗LSR抗体(艾碧康，cat#ab59646或西格玛，cat#HPA007270)孵育1小时。在使用TTBS洗涤3次之后，该膜在室温下使用如所指出的(表1)、稀释于TTBS中的二级轭合抗体进一步孵育1小时。使用ECL蛋白质印迹检测试剂(ECL Western Blotting Detection Reagent)(GE医疗(GE Healthcare)，Cat#RPN2209)进行化学发光反应并且将该膜暴露于超级RX富士X斜线胶片(Super RX Fuji X-Ray film)(目录号4741008389)。
表3
图15展示了在不同细胞系中的LSR的内源表达。在这些阳性对照细胞(泳道1和14)中观察到了并且还在若干细胞系中检测到了与所预期的～70kDa LSR相对应的一个蛋白条带，表明了在肝癌细胞系HepB3、HepG2以及它的衍生物HepG2/C3A(泳道4、15、16、17)，乳腺癌细胞系SK-BR-3(泳道#2)以及卵巢癌细胞系SKOV-3、OVCAR-3、ES-2、Caov-3(泳道8、9、10、12)中的LSR的内源表达。
实例7：针对LSR的小鼠单克隆抗体的产生
针对人LSR蛋白(SEQ ID NO:10)细胞外结构域的鼠单克隆抗体的产生在BIOTEM(比耶夫尔第九创业园(Parc d'activité Bièvre Dauphine)，885rue Alphonse Gourju，38140阿普里厄(APPRIEU)，法国)使用一种肽免疫接种策略来进行。用于该免疫接种的这些肽取自人LSR蛋白(SEQID NO:10)的细胞外结构域，并且在下面进行披露。
培养抗LSR mAb的项目的第一阶段包括使用如下的来源于LSR蛋白(SEQ ID NO:10)的ECD区的两种肽对3只BALB/c小鼠进行免疫接种：肽1：KSFCRDRIADAFSPASVD，对应于SEQ ID NO:10的氨基酸残基81-98，如在SEQ ID NO:215中所阐述，以及肽2：CQDSVRTVRVVATKQGNA，对应于SEQ ID NO:10的氨基酸残基118-135，如在SEQ ID NO:216中所阐述。这些氨基酸位置是从该开放阅读框中的第二个Met开始数的。
该方案的第二阶段包括将来自这些经免疫接种的小鼠的淋巴细胞与Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞进行融合，并且在10个微量滴定96孔板上进行铺板。
使用该人LSR融合蛋白((SEQ ID NO:236)、用于免疫接种的这些肽(SEQ ID NO:215、216)以及表达人WT LSR-标签蛋白的这些重组HEK293T细胞，通过ELISA对成熟克隆进行筛选。随后使用一种羊抗小鼠亚历克萨荧光488(英杰公司cat#A10667)作为用于检测的第二Ab，用经纯化的单克隆Ab8C8实施FACS分析。
第三阶段包括通过有限稀释和稳定作用进行杂交瘤克隆，以及进一步的，进行处理用于产生和纯化。
通过ELISA对这些杂交瘤克隆的培养物上清液进行分析。如在表4中所示，鉴定出了一种以下的阳性克隆(8C8)，该阳性克隆显示出了与该人LSR融合蛋白(SEQ ID NO:236)并且与过表达该人WT LSR蛋白的HEK293T细胞的特异性结合，而不与非相关人IgG1融合蛋白或用空pRp3载体转染的HEK293T细胞特异性结合。这种克隆显示出了与肽1(SEQ IDNO:215)而不与肽2(SEQ ID NO:216)结合。
使用过表达这些不同LSR蛋白(SEQ ID NO:11、13、211、212、31)的HEK293T经转染的细胞，通过流式细胞术(FACS)对该阳性克隆的经纯化的mAb8C8进行进一步分析。
表4：
在图14中所描述的这些结果表明了，与这些阴性对照(小鼠IgG2a(同种型对照)以及用空载体转染的细胞)相比较，使用该mAb8C8通过对LSR蛋白的异位细胞表面表达的检测所显示的该8C8mAb的特异性以及它用于FACS分析的适应性。如以上所说明和显示的，内源性地使用对在HT29结肠癌细胞上的内源性LSR细胞表面表达进行的siRNA介导的特异性敲低进一步确认了该8C8杂交瘤克隆对LSR的特异性。
实例8：单克隆抗体测序
按Plus RNA纯化***(英杰公司，目录号：15596-026)的技术手册，从冷冻的杂交瘤细胞中提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳对该总RNA进行分析。按SuperScriptTM III第一链合成***(英杰公司，目录号18080-051)的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录为cDNA。然后进行RT-PCR以扩增该抗体的重链和轻链。根据金斯瑞(GenScript)的RACE的标准操作程序，对VH和VL的抗体片段进行扩增。
使用标准分子克隆程序，将经扩增的抗体片段分别克隆至一种标准克隆载体中。
进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的***片段的克隆。
送出十个具有正确VH和VL***片段大小的单菌落用于测序。十种不同克隆的VH和VL基因被发现几乎相同。
以下所显示的共有序列是由该杂交瘤8C8所产生的该抗体(抗体8C8)的序列。该8C8抗体的重链的DNA和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:217和218中。该8C8抗体的轻链的DNA和氨基酸序列分别显示在SEQ IDNO:219和220中。该前导序列以斜体字体显示；CDR1、CDR2、CDR3的序列以粗体显示。恒定区FR1、FR2、FR3和FR4以一种常规字体显示。图18A描述了这些8C8抗体重链CDR的核酸和氨基酸序列。8C8抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别阐述于SEQ ID NO:224、225、226中。8C8抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的对应的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:227、228、229中。图18B描述了这些8C8抗体轻链CDR的核酸和氨基酸序列。8C8抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别阐述于SEQ ID NO:230、231、232中。8C8抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的对应的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:233、234、235中。
SEQ ID NO:217，8C8重链：DNA序列(420bp)
前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAACTTCGGGCTCAGATTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCTGTGTGACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAGCCATTAATAGTAATGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTGCAAGACATGATTACTACGGTAGTAGCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:218，8C8重链：氨基酸序列(140AA)
前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MNFGLRLIFLVLVLKGVLCDVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARHDYYGSSFAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:219，8C8轻链：DNA序列(381bp)
前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACTATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGATAGTAAGCATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
SEQ ID NO:220，8C8轻链：氨基酸序列(127AA)
前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQDSKHPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:224，8C8重链-CDR1DNA序列
GGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCT
SEQ ID NO:225，8C8重链-CDR2DNA序列
GCCATTAATAGTAATGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGC
SEQ ID NO:226，8C8重链-CDR3DNA序列
CATGATTACTACGGTAGTAGCTTTGCTATGGACTAC
SEQ ID NO:227，8C8重链CDR1氨基酸序列
GFTFSSYYMS
SEQ ID NO:228，8C8重链CDR2氨基酸序列
AINSNGGSTYYPDTVKG
SEQ ID NO:229，8C8重链CDR3氨基酸序列
HDYYGSSFAMDY
SEQ ID NO:230，8C8轻链CDR1DNA序列
AGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAAC
SEQ ID NO:231，8C8轻链CDR2DNA序列
TACACATCAAGATTACACTCA
SEQ ID NO:232，8C8轻链CDR3DNA序列
CAACAGGATAGTAAGCATCCGTGGACG
SEQ ID NO:233，8C8轻链CDR1氨基酸序列
RASQDISNYLN
SEQ ID NO:234，8C8轻链CDR2氨基酸序列
YTSRLHS
SEQ ID NO:235，8C8轻链CDR3氨基酸序列
QQDSKHPWT
实例9：LSR蛋白的IHC分析
校准研究
为了建立用于评估LSR表达的正确抗体浓度和抗原修复，实施了一种校准研究。
使用了在此的表5中所说明的经***固定和石蜡包埋的(FFPE)细胞系(表达LSR的HEK293T以及pRp‘空载体’细胞)的切片(4μm)以及正常肝、肿瘤肝、乳腺肿瘤和卵巢肿瘤的全断面(full-face)组织切片。
在该测定中包括了对人结肠的切片中的Von Willebrand因子进行检测的一种阳性对照以及一种阳性对照细胞系，以验证第二抗体、LSR抗体以及检测试剂。包括了一种‘无一抗’对照。
使用pH9.0Flex+3-in-1抗原修复缓冲液，在PT连接装置中在95℃持续20min对这些切片进行去石蜡化、抗原修复以及再水化。抗原修复之后，将切片在Flex洗涤缓冲液中放置10min，并且然后加载至一种DAKO自动染色机加(DAKO Autostainer Plus)中。然后将这些切片用Flex+过氧化物酶封闭试剂孵育10min，在50mM Tris HCl，150mM NaCl，0.1％吐温-20，pH7.6(TBST)中冲洗两次，随后用蛋白封闭试剂(DAKO X0909)进行一次10min的孵育。
将这些切片用稀释于DAKO Envision Flex抗体稀释剂(DAKOCytomation，Cat#K8006)中的第一抗体孵育30min。在各自的切片中，以6、4和2μg/ml对LSR pAb进行测试。用非免疫兔IgG抗体(Dako,CAT#0936)以6、4和2μg/ml或在DAKO Envision Flex抗体稀释剂(‘无一抗’对照)中对这些阴性对照切片进行孵育。
使用第一抗体孵育之后，然后将切片在FLEX缓冲液中漂洗两次，用抗-小鼠/兔Flex+HRP孵育20min，在FLEX缓冲液中漂洗两次并且然后用二氨基联苯胺(DAB)底物孵育10min。通过用蒸馏水冲洗这些载玻片来终止该显色反应。色素形成之后，将切片使用苏木精复染色，在递增系列的乙醇(90％-99％-100％)中脱水，在三次变化的二甲苯中清洗并且在DePeX下封片。使用一种具有一种莱卡(Leica)DFC290照相机的奥林巴斯BX51显微镜对经染色的切片进行分析，并且对适合的数字图像进行捕获。
IHC组织微阵列(TMA)
该研究的目标是使用根据本发明的至少一些实施例的LSR特异性抗体来确定在不同癌性组织中的LSR表达。使用免疫组织化学(IHC)对LSR在经***固定/石蜡包埋的(FFPE)切片中的分布进行检查。
在肿瘤和正常组织微阵列(‘多肿瘤TMA’)的FFPE切片以及如在此的表6中所说明的来自三个供体的正常***、扁桃体和脾的全断面(fullface)切片中，使用如以上所说明的多克隆兔抗体。该TMA包括11种组织类型(表3)：乳腺、结肠、淋巴和***(每个各8个肿瘤样品和2个正常样品)、胃、卵巢、大脑、肾、肝和皮肤(每个各4个肿瘤样品和2个正常样品)以及肺(8个非小细胞肿瘤样品和4个小细胞肿瘤样品，以及4个正常样品)。在这个研究中，切片和使用了额外的正常组织，***(n＝3)、扁桃体(n＝3)以及脾(n＝3)的切片(表7)。使用了表达LSR的细胞系HEK293T的FFPE切片(4μm)、该‘多肿瘤’TMA以及正常***、扁桃体和脾的全断面(full-face)切片。使用pH9.0Flex+3-in-1抗原修复缓冲液，在PT连接装置中在95℃伴随自动加热和冷却持续20min对这些切片进行去石蜡化、抗原修复以及再水化。抗原修复之后，将切片在蒸馏水中洗涤2×5min，然后加载至一种DAKO自动染色机加(DAKO Autostainer Plus)中。然后将这些切片用Flex+过氧化物酶封闭试剂孵育10min，在50mM Tris HCl，150mM NaCl，0.1％吐温-20，pH7.6(TBST)中冲洗两次，随后用蛋白封闭试剂(DAKO X0909)进行一次10min的孵育。将这些切片用稀释于DAKO Envision Flex抗体稀释剂(DAKO Cytomation，Cat#K8006)中的第一抗体孵育30min。以6μg/ml应用LSR多克隆抗体。用非免疫兔IgG抗体(Dako,CAT#0936)以6μg/ml或在DAKO Envision Flex抗体稀释剂(‘无一抗’对照)中对这些阴性对照切片进行孵育。使用第一抗体孵育之后，然后将切片在FLEX缓冲液中漂洗两次，用抗-小鼠/兔Flex+HRP孵育20min，在FLEX缓冲液中漂洗两次并且然后用二氨基联苯胺(DAB)底物孵育10min。通过用蒸馏水冲洗这些载玻片来终止该显色反应。色素形成之后，将切片使用苏木精复染色，在递增系列的乙醇(90％-99％-100％)中脱水，在三次变化的二甲苯中清洗并且在DePeX下封片。使用一种具有一种莱卡DFC290照相机的奥林巴斯BX51显微镜对经染色的切片进行分析，并且对适合的数字图像进行捕获。针对特异性染色的强度对这些切片进行分析，并且使用了一种半定量评分***。具有最强LSR免疫反应性的组织阵列中的核心被分配一个3+的得分，并且相对于该3+核心的强度，对在其他核心中的免疫反应性的强度进行评分。使用以下范围估算并且记录LSR免疫反应性肿瘤的百分比：0％-25％、25％-50％、50％-75％以及75％-100％。
结果：
以下数据集表示在指定的阳性对照组织中以及在一种空载体细胞系中对LSR兔多克隆抗体进行的优化和检测。在图19中显示了对内部测定工作条件和抗体验证进行展示的测定阳性对照。图19(X60)显示了在pH9.0AR之后的LSR阳性细胞的切片。画面A显示了使用以2ìg/ml应用的LSR抗体进行孵育的这些载玻片。画面B显示了这些相邻的‘无一抗的’经孵育的切片。阳性LSR免疫反应性见于画面A中，表明有效的抗体工作条件。该相邻的无一抗的切片(画面B)没有显示出明显的免疫反应性。在正常和肿瘤肝样品两者中在阳性对照组织中以及在乳腺肿瘤样品中检测到了特异性的免疫反应性。在这两个正常肝供体中以及在一个肿瘤供体中，该LSR抗体展示了膜和细胞质染色。
在这两个正常肝样品的肝细胞和胆管上皮中在6和4μg/ml检测到了特异性LSR免疫反应性。在肿瘤肝中，见到了膜和细胞质LSR免疫反应性，并且与这些正常肝样品相比较，在肿瘤细胞中该免疫反应性是明显强的。在卵巢肿瘤(DI16974)中，在最高的浓度(6ìg/ml)下见到了特异性膜和细胞质LSR免疫反应性。在4ìg/ml下，在这些肿瘤细胞中只注意到了细胞质免疫反应性。在样品DI16976中，只在6和4ìg/ml两者下在肿瘤细胞中观察到了特异性细胞质免疫反应性。检测到了非特异性免疫反应性，但是在两个供体样品中只在最高浓度下存在。
在pRp3空载体细胞中没有检测到明显的LSR免疫反应性。检测到了非特异性免疫反应性。
LSR免疫反应性组织已经显示出了在肿瘤类型之中在染色模式和强度水平上的不同。然而，所注意到的是，结肠和肝的肿瘤染色得最强，而遍及这些样品，其他肿瘤显示出了中度染色。在大多数核心中，免疫反应性平均为75％-100％。表8描述了对该TMA的全面分析。
在乳腺肿瘤中的LSR表达
在该乳腺肿瘤集内，染色的强度在范围(1-2+)内变化，两种肿瘤得分为2+。在该阵列内只有一个乳腺肿瘤核心是0-25％免疫反应性的，大多数在75％-100％免疫反应性的区域中。这些2+得分的肿瘤是浸润性导管癌(IDC)。
在大肠癌中的LSR表达
在该大肠队列内，八个样品具有中分化型腺癌肿瘤。六个样品得分为(2+或3+)，一个得分为(3+)的免疫反应性的最强水平，并且一个样品得分为(0-1+)。所有的样品都是75％-100％免疫反应性的。在该一个正常样品中，在粘膜上皮的上升部分见到了特异性的细胞质免疫反应性，而下降腺管展示出具有染色评分(2-3)的一种膜结合表型。
在***癌中的LSR表达
在这些***肿瘤中，免疫反应性水平在(1-2+)之间变化。来自一个8种腺癌的队列的一种肿瘤记录了2+得分(格利森评分9)并且两种记录了1-2得分(格利森评分9和7)并且三种得分为1+。所有的***肿瘤都看起来是LSR免疫反应性的。在这些核心中，免疫反应性是细胞质的，例外是在肿瘤上皮内观察到了一种显著的膜表型。在这些正常***样品内，在腺上皮和偶尔的平滑肌区中见到了染色，染色强度为+1-+2。
在淋巴瘤中的LSR表达
在淋巴瘤样品内，观察到了一种较低水平的染色-NHL的三个样品得分为(1+)并且NHL和HL的五个为(0-1+)，在核心内的范围为75％-100％免疫反应性(HL样品具有IHC得分0-1)。然而，所注意到的是，在一个供体(15052)中，一种离散的肿瘤细胞群体展示了较高水平的染色。在正常***的两个样品中，在这些生发中心内在一个样品中见到了细胞质染色。少量离散免疫细胞被观察到展示了在另一个样品内的免疫反应性。
在肺癌中的LSR表达：
在该肺肿瘤集中，十二个肿瘤样品中的八个展示出了特异性LSR免疫反应性。所见到的强度和免疫反应性在肿瘤类型内变化。在NSCL腺癌的一个样品中，这些肿瘤是强免疫反应性的，得分为2+-3+，而在鳞状细胞癌的两个样品中，见到了强度得分(2+)和(1+-2+)。NSCLC的两个样品具有1+-2+的强度水平，并且两者都是低分化至中分化型的。在三个腺癌样品中，两个展示了2+的染色强度得分，而另一个样品显示了只有1+的染色得分，并且是低分化型的。大多数肿瘤被见到是75％-100％免疫反应性的。在小细胞癌样品的该队列中，在肿瘤细胞中没有见到明显的免疫反应性；在推定的巨噬细胞中只见到了偶尔的免疫反应性。在正常肺的样品中，在呼吸上皮中见到了阳性细胞质免疫反应性。还见到了偶尔的肺泡细胞是免疫反应性的，强度是+1至+2。
在胃肿瘤中的LSR表达
在胃肿瘤中，四个腺癌样品(中分化型)在这些肿瘤内明显地展示了LSR表达，其中在每个核心中75％-100％是免疫反应性的。见到了所有样品在得分水平上变化，一个样品得分为2+-3+，而余下的样品得分为1+或2+。所注意到的是，在特定组织中见到了偶尔的显著的与膜相关联的染色，浸润性的推定的巨噬细胞也展示了免疫反应性。在该正常胃组织内，在粘膜上皮中见到了明显呈特异性的细胞质免疫反应性。在一个具体供体(2874)中，见到了细胞质和核染色，强度为+1至+2。
在卵巢癌中的LSR表达
该卵巢癌队列也展示了在核心为75％-100％免疫反应性的肿瘤中的特异性弥漫性细胞质免疫反应性。在肿瘤类型内，染色强度是可变的。浆液性***状癌的两个样品分别得分为0-1+和2+，少量肿瘤细胞显示出了一种更深强度的染色模式(供体13003)。在该粒层肿瘤中，这的得分是相对弱的(0-1+)，然而，该浆液性囊腺癌样品中见到具有一种2+的强染色与相关联的膜免疫反应性(供体9407)。在正常卵巢组织中，只在一个样品中在间质区中注意到了某种特异性免疫反应性，染色强度为+2。
在黑色素瘤中的LSR表达
在皮肤黑色素瘤中，染色被见到是弱的(0-1+)，这些肿瘤细胞中的25％-50％是免疫反应性的。在这种组织内没有观察到明显的与膜相关联的染色。在正常皮肤中，在表皮内没有见到免疫反应性。只有偶尔的皮肤淋巴细胞是阳性染色的。
在脑肿瘤中的LSR表达
在脑肿瘤中，(4级-星形细胞瘤)两个样品在这些肿瘤细胞中的75％-100％中展示了免疫反应性。与具有一种较低强度染色(0-1+)的供体13845相比较，一个供体(供体9516)尤其显示了核-膜染色(2+)。一名患有2级星形细胞瘤的患者具有IHC得分0。在肿瘤类型和免疫反应性水平之间不能作出相关性。在正常大脑中，一个样品在神经毡细胞以及其他所观察的神经纤维内明显地展示了特异性细胞质免疫反应性。
在肾肿瘤中的LSR表达
在这些肾癌中，三种透明细胞型肿瘤以及一种非透明细胞癌展示了LSR免疫反应性。强度水平在1+-2+之间变化，在每个核心中75％-100％的肿瘤细胞是免疫反应性的。还有所注意到的是，与较低分化型细胞类型相比较，透明细胞癌显示出了一种细胞质膜特异性结合染色模式。在正常肾样品中，在集合小管中见到了特异性细胞质染色。
在肝肿瘤中的LSR表达
在肝肿瘤中，所有三个样品都在肿瘤细胞中展示了显著的免疫反应性，而在每个核心中75％-100％的肿瘤细胞被染色。供体19115被分配一个3+的得分(并且被用来对其他核心相对于它的强度水平进行评分)，因为这是在该阵列中被最强染色的核心。还有所注意到的是，在一个细胞子集中，与周围的肿瘤相比较，观察到了细胞质染色的一种强水平，具有偶尔的与膜相关联的免疫反应性。在正常肝中，见到了特异性膜免疫反应性。
在正常淋巴组织中的LSR表达
在正常***、扁桃体以及脾的全断面(full-face)切片中，所观察到的是，大多数在来自这三个组织集的生发中心中展示了阳性细胞质染色，少量推定的巨噬细胞也显示出了免疫反应性。在***中，一些细胞被观察到显示出了在淋巴滤泡内的细胞质-膜的染色，并且偶尔的平滑肌也被染色。
表5：TMA样品特征(校准)
表6：癌症TMA样品特征
表7：淋巴器官TMA样品特征
表8：癌症TMA样品IHC分析
使用LSR特异性pAb的TOP4TM组织微阵列研究；
该‘前4(Top4)’TMA由来自以下4种组织类型的核心构成：乳腺(4个正常的和26个肿瘤)、大肠(4个正常的和26个肿瘤)、肺(4个正常的和26个肿瘤)以及***(4个正常的和26个肿瘤)。TMA的安排显示在表9中。使用了细胞系HEK293T LSR的FFPE切片(4μm)，‘前4’多肿瘤TMA。除非另外指出，所有的孵育在室温下实施。使用pH9.0Flex+3-in-1抗原修复缓冲液，在PT连接装置中在95℃伴随自动加热和冷却持续20min对这些切片进行去石蜡化、抗原修复以及再水化。抗原修复之后，将切片在Flex(TBST)缓冲液中洗涤2×5min，然后加载至一种DAKO自动染色机加(DAKO Autostainer Plus)中。然后将这些切片用Flex+过氧化物酶封闭试剂孵育10min，在50mM Tris HCl，150mM NaCl，0.1％吐温-20，pH7.6(TBST)中冲洗两次，随后用蛋白封闭试剂(DAKO X0909)进行一次10min的孵育。将这些切片用稀释于DAKO Envision Flex抗体稀释剂(DAKO Cytomation，Cat#K8006)中的第一抗体孵育30min。以6μg/ml应用抗LSR pAb(艾碧康ab169583)。以1μg/ml应用抗VonWillebrand因子(VWf)抗体。用非免疫兔IgG抗体(Dako,CAT#0936)以6和1μg/ml或在DAKO Envision Flex抗体稀释剂(“无一抗”对照)中对这些阴性对照切片进行孵育。使用第一抗体孵育之后，然后将切片在FLEX缓冲液中漂洗两次，用抗-小鼠/兔Flex+HRP孵育20min，在FLEX缓冲液中漂洗两次并且然后用二氨基联苯胺(DAB)底物孵育10min。通过用蒸馏水冲洗这些载玻片来终止该显色反应。色素形成之后，将切片使用苏木精复染色，在递增系列的乙醇(90％-99％-100％)中脱水，在三次变化的二甲苯中清洗并且在DePeX下封片。使用一种具有一种莱卡DFC290照相机的奥林巴斯BX51显微镜对经染色的切片进行分析，并且对适合的数字图像进行捕获。
在该乳腺肿瘤集内，在大多数病例中染色强度是非均匀的；所见到的免疫反应性是弱至中度的。在这个队列中，在50％-100％的反应性肿瘤内两个样品得分为一种3-3+的最大强度。在这些样品中的十四个内，在25％-100％的肿瘤(2/3级)内，染色强度得分为一个2+的最大值。十个其他样品得分为一种1+的低强度，其中大多数肿瘤样品是25％-50％反应性的。还见到了其他很少的反应性肿瘤样品是0-25％至75％-100％弱染色的。在这些间质区内，浸润性免疫细胞也是被阳性染色的。大多数肿瘤主要是浸润性导管和小叶癌-混合级别。没有被观察到的可以特异性归因于肿瘤类型或级别的免疫反应性的模式。在正常乳腺中，在这些腺泡内见到了特异性细胞质免疫反应性。
在该大肠队列内，这些腺癌样品都是免疫反应性的，除了这项研究中的一个样品之外。在该队列内，大多数肿瘤是低分化至高分化类型。在八个样品中，在25％-100％的2/3级的肿瘤内见到了一个所分配的3+染色得分。这些肿瘤中的大多数具有一个展示出显著的细胞质-膜表型的明显的特点。在十个样品中，在25％-100％的2/3级反应性肿瘤中见到了一个2+得分。在六个样品中，给肿瘤分配了一个1+的较低得分，大多数展示了0-25％-50％-75％反应性。在这些肿瘤集中见到了相对于这些所分配的强度得分的一种明显一致的染色模式。较高的得分展示了一种显著的膜表型。在正常组织样品中，在粘膜上皮和微血管元件中检测到了特异性免疫反应性。
在该肺肿瘤集中，在大多数所研究的肿瘤中见到了特异性免疫反应性，其中注意到了一种弱至中度的染色强度。大多数肿瘤是腺癌来源的、高分化至低分化细胞类型的非小细胞癌(NSCLC)。在这些肿瘤中，六个样品被分配了一个2+染色的最大强度得分，其中在大多数各自的核心中50％-100％的肿瘤是免疫反应性的。在25％-100％的肿瘤内，十八个样品被分配了一个1/1+染色的较弱得分。在小细胞癌的一个样品中，在关于这三个所分析的核心的25％-100％的肿瘤内，特异性细胞质免疫反应性被见到是被弱染色的(1+)。在血管元件以及被强染色的浸润性免疫细胞中见到了其他值得注意的染色特点。在该正常肺组织中，在一个细支气管上皮样品以及肺泡腔的游离巨噬细胞中检测到了特异性免疫反应性。在肺泡隔中见到了阴性染色。
在该***肿瘤集中，在大多数样品中见到了特异性染色，其中在肿瘤上皮中染色强度是弱至中度的。在一个样品中，在75％-100％的肿瘤(格利森评分4+5)中见到了一个所分配的最大(3)染色的得分，伴有免疫反应性的一种膜模式。在25％-100％的肿瘤内，七个其他样品具有一个2+的得分。这些中的大多数驻留在肿瘤岛中，格利森评分分别从(3+4)至(4+3)不等。最后，在25％-100％的肿瘤中，十七个肿瘤样品得分为较弱的1/1+染色。在这些正常***组织中，少数样品在腺上皮中展示了弱细胞质染色以及偶尔的细胞质-膜染色。总的来说，在上皮中免疫反应性是红色染色(blush staining)或阴性的。在推定的浸润性免疫细胞中见到了其他值得注意的染色。
表9：前4(Top4)TMA组织注释
实例10：针对结合测定对小鼠CD4+T细胞进行刺激
既然这些B7/CD28家族受体(例如，CTLA4、PD-1以及针对B7-H4的未知受体)中的一些的表达是激活依赖性的，在这项实验中对LSR的反受体是否在已激活的T细胞上表达进行了测试。为此，使用平板结合的抗CD3抗体在可溶性抗CD28抗体的存在下，或使用伴刀豆球蛋白A(Con A)通过全面激活，将鼠类原代CD4T细胞进行激活。
1.伴刀豆球蛋白A(Con A)刺激-将经纯化的CD4+T细胞以2x105个细胞每孔接种在平底96孔板中。添加Con A(3μg/ml，西格玛，Cat.C5275)，并且在37℃下将细胞孵育48hr。
2.抗CD3+抗CD28刺激-对抗CD3免疫接种来说，平底96孔板的每孔添加75μl的5μg/ml抗CD3(0.5mg/ml，cat.553058BD)，并且在室温下孵育至少2hr。用200μl的PBS将孔洗涤3次。用2ug/ml的可溶性抗CD28(eBioscience,cat.16-0281-85)将经纯化的CD4+T细胞以2x105每孔进行接种，并且在37℃下孵育48hr。
结合测定
使用用Con A或抗CD3/CD28刺激的1x105个CD4+T细胞用于结合。在这项结合测定中，使用了与小鼠IgG2a Fc M:M(批次#35)(SEQ ID NO:221)融合的小鼠LSR的ECD。作为阳性对照，对与小鼠IgG2a Fc H:M(在Fc中具有N297A突变，批次#23)(SEQ ID NO:223)融合的人ILDR2的ECD的一种非糖基化衍生物进行了平行测试。如以上所说明的，针对与T细胞系的结合，实施了对蛋白结合的检测。
图20展示了关于经刺激的CD4+T细胞的结合测定结果。根据这些结果，没有显示出与小鼠IgG2a Fc M:M(批次#35)(SEQ ID NO:221)融合的小鼠LSR ECD(以2μg/50μl/孔)与经抗CD3/CD28或Con A激活的鼠类T细胞的结合。
实例11：提高浓度的与小鼠IgG2A Fc融合的经生物素标记的小鼠LSRECD与K卡尔帕斯(KARPAS)-299细胞的结合。
卡尔帕斯(KARPAS)-299细胞(ACC31，DSMZ)被用来测试与小鼠IgG2a Fc(SEQ ID NO:221)融合的小鼠LSR-ECD的结合是否能够在更高的蛋白浓度下检测到。以提高浓度的与小鼠IgG2a Fc(SEQ ID NO:221)融合的经生物素标记的小鼠LSR-ECD，进行了卡尔帕斯(KARPAS)-299细胞的染色。
用不同浓度(2ug、3ug、4ug以及5ug)的与小鼠IgG2a Fc蛋白(SEQID NO:221)融合的经生物素标记的小鼠LSR-ECD，或5μg经生物素标记的对照mIgG2a，对细胞进行孵育。在细胞洗涤之后，添加链霉抗生物素蛋白-PE，并且通过FACS分析对结合进行评估。图23A呈现了对中位数荧光强度(MFI)进行显示的直方图。图23B呈现了对与小鼠IgG2a Fc(SEQID NO:221)融合的小鼠LSR-ECD vs对照mIgG2a相对于不同蛋白浓度的与小鼠IgG2a Fc融合的小鼠LSR-ECD的结合(MFI)比率进行显示的剂量依赖性曲线。
如在图21中所示，在高于3μg/50μl/孔的浓度下以一种剂量依赖性方式检测到了与小鼠IgG2a Fc(SEQ ID NO:221)融合的经生物素酰化的小鼠LSR-ECD的结合。
实例12：在M1和M2极化条件下对在巨噬细胞中mRNA表达水平的评估
这项研究的目标是使用一种小鼠LSR TaqMan探针(应用生物***(Applied Biosystems)；CAT#:Mm00660290_m1)在巨噬细胞分化上在mRNA水平上评估极化信号(对M1来说：IFNg，LPS，IFNg+LPS；对M2来说：IL-4，TGFb，糖皮质类固醇，肿瘤上清液)对LSR mRNA表达的效应。
巨噬细胞是高塑性细胞，能够响应于来源于微环境的信号而经历不同的极化激活，并且尤其地，来自适应性免疫***的信号是巨噬细胞极化的主要决定子。尤其，微生物产物和炎性细胞因子诱导巨噬细胞经历经典的激活谱(也被称为M1)，其特征在于它们杀伤细胞内微生物的能力的增强以及炎性细胞因子(TNF、IL-12、IL-23)和促炎性介质(一氧化氮和反应性氧中间体)的大量产生。另一方面，经可替代激活的M2巨噬细胞通过不同信号(包括IL-4/IL-13、TGF、糖皮质类固醇、IL-10)而被促进，并且在炎症解决期间维持血管发生和组织重塑。巨噬细胞极化激活在炎性和自身免疫性失调中以及在肿瘤生物学中具有显著的影响。尤其，尽管在经历慢性炎症的组织中M1巨噬细胞维持病原杀伤并且诱发肿瘤起始作用，经可替代激活的巨噬细胞具有免疫调节功能，参与伤口愈合，并且在已建立的肿瘤中，促进组织重塑和支持血管发生的肿瘤生长和转移。重要地，巨噬细胞的差异极化对淋巴细胞激活具有强烈的影响。M1巨噬细胞具有一种强倾向以将抗原呈递至T细胞并且激活一种保护性免疫应答，而M2巨噬细胞更加倾向于一种免疫调节性/免疫抑制性表型。
在这个实例中，在巨噬细胞分化上在mRNA水平上评估了极化信号(对M1来说：IFNg(派普泰克(Peprotech)315-05)、LPS(ALEXIS，ALX-581-009-L002)、IFNg+LPS；对M2来说：IL-4(派普泰克214-14)、TGFb(派普泰克100-21)、***素E2(开曼化学(Cayman Chemical)14010)肿瘤上清液)对LSR的表达的效应。作为对照，还评估了四种原型M1(iNOS和CD80)和M2(人类ALOX15或小鼠12/15，IL-10)高度极化型标志物加上1种管家基因的表达水平。因为M1和M2基因的表达的动力学常常是不同的，用极化信号持续不同时间段(包括2、8和18小时)对细胞进行处理。研究了三个生物学重复。
用鼠类巨噬细胞进行该实验。从在分离之前4天已经接受了500微升3％(wt/vol)巯基乙酸培养基(迪夫科(Difco)，底特律(Detroit)，密歇根州(MI))注射的小鼠中获得了鼠类腹膜巨噬细胞。在纯化(贴壁)之后，将细胞在标准培养条件下静置1小时，并且随后用于实验
在刺激之后，使用TRIzol(英杰生命技术(Invitrogen Life Technologies))提取总RNA，进行逆转录，并且进行制备用于关于M1和M2极化激活的专门设计的384孔TaqMan低密度阵列(LDA)LSR(应用生物***；CAT#：Mm00660290_m1)标志物。使用一种7900HT***用一种TaqMan LDA升级版(应用生物***)和SDS2.1软件对样品进行分析。对三个独立巨噬细胞制品进行实验，两个重复。
结果：
为了验证该实验***，如以上所说明的，在这些不同刺激下评估了原型M1和M2标志物的表达水平。如在图22中所示，在进行LPS+INFγ(M1驱动型)刺激时，INOS(一种原型M1标志物)的表达是升高的。如在图23中所示，在进行IL4和肿瘤上清液(M2驱动型)刺激时，ALOX15(一种原型M2标志物)的表达是升高的。
接下来，如以上所说明的，在这些不同刺激和不同时间点下评估了LSR的mRNA表达水平。如在图24中所示，在进行***素E和肿瘤上清液(M2驱动型)刺激时，LSR的表达是升高的。在8小时的激活之后，***素E2的效应是明显的，并且在18小时的激活之后，该肿瘤上清液的效应是明显的。在这些特指的刺激下的LSR的绝对表达水平比得上在M2驱动型条件下的ALOX15(一种M2原型标志物)的表达水平。
结论
这项研究的这些结果展示了在这些经可替代激活的M2巨噬细胞上的LSR mRNA表达的上调。
经可替代激活的M2巨噬细胞具有免疫调节功能，参与伤口愈合，并且在已建立的肿瘤中，促进组织重塑和促进支持了肿瘤生长和转移的血管发生。因此，不希望受单一假设约束，LSR在M2极化巨噬细胞上的表达具有针对以下的含义：抗LSR治疗性抗体通过耗尽这些与有害肿瘤相关联的M2巨噬细胞或通过抑制它们的免疫抑制功能并且因此增强免疫监视而用于治疗癌症的用途。
实例13：LSR蛋白作为癌症免疫监视的调节剂的作用：
1)概念的体内证明
a)小鼠癌症同系模型：
(i)将过表达LSR蛋白或一种非相关对照蛋白的肿瘤细胞移植至遗传匹配的小鼠中。然后检查肿瘤体积(以及处死这些动物之后的肿瘤重量)以展示在肿瘤生长上的延迟(即，过表达LSR的肿瘤比过表达该非相关对照蛋白的肿瘤长得更快)。实施对来自肿瘤引流***的免疫细胞的离体分析，以评估调节T细胞与效应T细胞的比率。
(ii)用针对LSR蛋白的中和抗体对同系肿瘤进行治疗作为单一疗法。将肿瘤细胞移植至遗传一致的小鼠中。用不同剂量的针对LSR蛋白的中和抗体对荷瘤小鼠进行注射。作为用特异性针对LSR蛋白的中和抗体的治疗的结果，该肿瘤的排斥被增加(即，在用针对LSR蛋白的中和抗体进行治疗的小鼠中，肿瘤生长得比用非相关抗体治疗的小鼠中的肿瘤更慢)。实施对来自肿瘤引流***的免疫细胞的离体分析，以确定调节T细胞与效应T细胞的比率。
所测试的这些肿瘤细胞系来自不同来源，包括结肠、乳腺和卵巢癌，黑色素瘤，肉瘤以及血液癌。同系模型在若干小鼠品系(包括BALB/c、C57bl/6以及C3H/Hej)中进行。在第一组实验中，所使用的这些同系可移植模型主要是针对癌症免疫疗法被证明为具预测性的那些模型。这些包括：BALB/c背景的B16-F10黑色素瘤(根据在Tihui Fu等人Cancer Res2011；71:5445-5454中所说明的该方法)，MC38结肠癌(根据在尼格欧(Ngiow)SF等人《癌症研究》(Cancer Res.)2011年5月15；71(10):3540-51中所说明的该方法)，ID8卵巢癌(根据在克雷姆斯基(Krempski)等人《免疫学杂志》(J Immunol)2011；186:6905-6913中所说明的该方法)，MCA105肉瘤(根据在王(Wang)等人《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)208卷3期577-592中所说明的该方法)，CT26结肠癌(根据在尼格欧(Ngiow)SF等人《癌症研究》(Cancer Res.)2011年5月15；71(10):3540-51中所说明的该方法)以及4T1乳腺癌(根据在竹田(Takeda)K等人《免疫学杂志》(J Immunol.)2010年5月15；184(10):5493-501中所说明的该方法)。
(iii)建立一种同系肿瘤，以及用针对LSR蛋白的中和抗体与额外的治疗系联合进行治疗。将肿瘤细胞移植至遗传一致的小鼠中。在建立肿瘤之后，用与常规化学疗法(例如，环磷酰胺，根据在姆克尔季昌(Mkrtichyan)等人《欧洲免疫学杂志》(Eur.J immunol.)2011；41，2977-2986中所说明的该方法)联合的、与其他免疫检验点阻断剂(例如，PD1和CTLA4，根据在柯伦(Curran)等人；《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci U S  A.)2010年3月2；107(9):4275-80中所说明的该方法)联合的、与其他免疫调节剂(例如，抗IL18，根据在泰尔梅(Terme)等人；《癌症研究》(cancer res.)2011；71:5393-5399中所说明的该方法)联合的、与癌症疫苗(根据在赫维茨(Hurwitz)等人《癌症研究》(Cancer Research)60，2444–2448，五月1，2000中所说明的该方法)联合的、或与放射疗法(根据在韦布吕热(Verbrugge)等人《癌症研究》(Cancer Res)2012；72:3163-3174中所说明的该方法)联合的不同剂量的针对LSR蛋白的中和抗体对小鼠进行IP注射。
(iv)人类癌症异种移植模型：将内源表达LSR的人类癌症细胞系移植至免疫缺陷小鼠中。将会评价在用抗LSR抗体治疗的小鼠vs用非相关同种型匹配抗体治疗的小鼠中的肿瘤体积。在该研究的一方面，抗LSR抗体 被轭合至一种毒素(根据在卢瑟(Luther)N等人《分子癌症疗法》(Mol Cancer Ther.)2010年4月；9(4):1039-46中所说明的该方法)以评价抗体药物轭合物(ADC)活性。在该实验的另一方面，用针对LSR的人类IgG1或小鼠IgG2a同种型抗体对小鼠进行治疗(根据在霍尔布鲁克(Holbrook)E.科尔特(Kohrt)等人《临床研究杂志》(J Clin Invest.)2012年3月1；122(3):1066–1075中所说明的该方法)。这些抗体同种型被用来评价抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)介导的肿瘤消除。
2)自然杀伤(NK)细胞活性的体外验证
a)结合测定：
(i)如在《免疫学杂志》2005；174；6692-6701中所说明的，进行关于经激活的原代培养NK细胞上的人类LSR ECD-FC蛋白的结合测定。如果在NK细胞上表达了LSR的反受体，那么观察到了LSR ECD-Fc的结合。
(ii)如在PNAS，2009，109卷；17858-17863中所说明的，进行关于在经激活的原代培养NK细胞上的针对LSR蛋白中的该任一种的一种特异性抗体的结合测定。如果在NK细胞上表达了任一种LSR，那么对应地观察到了LSR特异性抗体的结合。
(iii)如在《免疫学杂志》2006；176；6762-6769中所说明的，进行关于在可以充当针对NK杀伤的靶细胞的不同人类癌症细胞系上的人类LSRECD-FC蛋白的结合测定。如果在这些癌症靶细胞上表达了LSR中的任一种的反受体，那么对应地观察到了LSR ECD-Fc的结合。
b)功能性杀伤测定：
(i)使用一种过表达***(过表达LSR蛋白中任一种的NK细胞或癌症靶细胞)进行杀伤测定。如在PNAS，2009，109卷；17858-17863中所说明的，将这些NK细胞(效应物；e)与经放射性(S35)标记的癌症靶细胞(靶；t)以不同e:t比率进行共孵育。然后通过测量放射性发射，对NK杀伤活性对靶细胞的裂解进行评估。在这些癌症靶细胞和/或NK细胞系上的LSR蛋白中任一种的过表达导致NK介导的杀伤活性的下调。
(ii)如在PLoS ONE；2010；5卷；1-10页中所说明的，在这些人类LSR ECD-FC蛋白的存在下，进行杀伤测定。用LSR中的任一种的ECD-Fc的治疗干扰了LSR与其反受体的相互作用并且因此降低了其抑制活性，这引起增强的杀伤活性。
(iii)如在PNAS，2009，109卷；17858-17863中所说明的，在针对LSR蛋白中的任一种的一种中和抗体的存在下，进行杀伤测定。用针对LSR中的任一种的中和抗体的治疗引起了增强的NK杀伤活性。
(iv)进行“重定向杀伤测定”如下：用针对LSR蛋白中的任一种的激活抗体包被表达高密度Fc受体的癌症靶细胞，并且将这些癌症靶细胞暴露于NK细胞(表达该特指的LSR蛋白)，如在PNAS，2009，109卷；17858-17863中所说明的。LSR中的任一种与激活抗体的交联引起了降低的NK介导的杀伤活性。
3)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的体外验证
a)LSR蛋白在黑色素瘤细胞系中的表达。
在不同黑色素瘤细胞系上实施对LSR表达的流式细胞计数评价。
b)功能性测定。
为了进行功能性测定，使用了表达F4TCR(MART-1特异性的(黑色素瘤特异性抗原))的原代人类淋巴细胞。如在摩根(Morgan)等人，《自然》(Science)，2006中所说明的，TCR识别HLA-A2+/MART1+黑色素瘤细胞。用一种编码F4-TCR的逆转录病毒载体对经OKT3刺激的原代人类淋巴细胞(从当地的血库获得)进行转换。然后，在淋巴细胞培养基(包含IL-2)中培养经OKT3(抗CD3)刺激的原代人类淋巴细胞。用过表达全长LSR的黑色素瘤细胞系对这些经预刺激的淋巴细胞进行孵育。读数包括在3个不同时间点的细胞因子分泌，激活标志物和细胞毒性。
4)表达分析
a)在从人类肿瘤活检组织中分离的肿瘤和免疫细胞上的LSR蛋白的表达
(i)在来自该肿瘤的被分离的细胞群体上，使用针对LSR蛋白的特异性抗体，实施这些LSR蛋白的表达验证。如在克雷切克(Kryczek)I.等人，《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)；2006；203卷；871-881页以及《癌症研究》(Cancer res.)2007；67；8900-8905中所说明的，从肿瘤活检组织(例如，肿瘤细胞，内皮细胞，与肿瘤相关联的巨噬细胞(TAM)和DC，B细胞以及不同T细胞子集(CD4、CD8和Treg))中新鲜分离不同细胞群体，以展示LSR在肿瘤细胞中以及在肿瘤间质和免疫渗液上的表达。
ii)在来自该肿瘤的被分离的细胞群体上进行这些人类LSR ECD-FC蛋白的结合测定。如在《实验医学杂志》；2006；203卷；871-881页和《癌症研究》2007；67；8900-8905中所说明的，从肿瘤中新鲜分离来自肿瘤活检组织(例如，肿瘤细胞，内皮细胞，与肿瘤相关联的巨噬细胞(TAM)和DC，B细胞以及不同T细胞(CD4、CD8和Treg))的不同细胞群体，以显示针对LSR的反受体在肿瘤细胞中以及在肿瘤间质和免疫细胞上的表达。
b)在从荷瘤小鼠的引流***和脾中分离的细胞上的LSR蛋白的表达
(i)如在《临床癌症研究》19962卷，811-820中所说明的，使用针对LSR蛋白的特异性抗体，在来自C57荷瘤小鼠的肿瘤引流***vs脾中的上皮癌细胞上连同在免疫细胞上完成LSR蛋白的表达验证。测试了三种不同癌症类型：B16(黑色素瘤)、ID8(卵巢)以及MC38(结肠)，以便评估在肿瘤引流***内在肿瘤细胞中以及在免疫细胞中LSR的表达。
(ii)如以上所说明的，实施关于在从上皮癌中分离的细胞上的连同在来自C57荷瘤小鼠的肿瘤引流***vs脾的免疫细胞上的小鼠LSRECD-FC蛋白的结合测定，以显示出针对LSR的反受体在肿瘤引流***中的肿瘤细胞和免疫细胞中的表达。
c)在M2极化巨噬细胞上的LSR蛋白的表达
(i)如在比斯瓦斯(Biswas)SK，《自然免疫学》(Nat.Immunol.)2010；11卷；889-896页中所说明的，使用针对LSR蛋白的特异性抗体，在从外周血中分离的、分化为巨噬细胞的并且暴露于“M2驱动型刺激”(例如，IL4、IL10、糖皮质类固醇、TGFβ)的原代单核细胞上完成LSR蛋白的表达验证，以显示出LSR在M2分化巨噬细胞中的表达。
ii)如以上所说明的，实施关于在从外周血中分离的、分化为巨噬细胞的并且暴露于“M2驱动型刺激”(例如，IL4、IL10、糖皮质类固醇、TGFβ)的原代单核细胞上的LSR人类ECD-FC蛋白的结合测定，以评估针对LSR的反受体在M2分化巨噬细胞中的表达。
d.在髓样来源抑制细胞(MDSC)上的LSR蛋白的表达
(i)如在《国际免疫药理学》(Int Immunopharmacol.)2009年7月；9(7-8):937-48.电子出版(Epub)2009年4月9中所说明的，分别使用针对LSR蛋白的特异性抗体，在从荷瘤小鼠中分离的原代MDSC上完成LSR蛋白的表达验证。
ii)在从荷瘤小鼠中分离的原代MDSC上，用在PCT/IB2012/051868(它与本申请被共同拥有)中所说明的LSR人类ECD-Fc蛋白实施结合测定。
实例14：与已知免疫检验点的阻断相联合的针对该LSR蛋白的阻断抗体的抗肿瘤效应
免疫细胞上的抑制性受体是癌症中的免疫逃逸的关键的调节剂。其中有已知的免疫检验点，例如CTLA4、PD-1以及LAG-3。对单一免疫检验点的阻断常常导致肿瘤的效应T细胞浸润的增强，但是也可以导致在这些T细胞中其他未经阻断的阴性受体的补偿性上调。然而，对超过一种抑制途径的阻断使得T细胞实施一种更加有效的肿瘤应答，并且提高效应T细胞(Teff)与调节T细胞(Treg)的比率。具体地，对此类抑制性受体的双重阻断已经显示出在动物肿瘤模型中发挥协同治疗效应(柯伦(Curran)等人2010PNAS107:4275-4280；吴(Woo)等人2011《癌症研究》(CancerRes.)72:917-927)。基于这些发现，在患有转移性黑色素瘤的患者中的临床试验中，正在对抗CTLA-4和抗PD-1阻断抗体的联合进行测试。
在C57Bl/6背景中的该同系癌症MC38模型中测试了针对LSR和针对PD-1的阻断抗体的联合(如在吴(Woo)等人2011《癌症研究》72:917-927中所说明的)。简言之，将MC38细胞(2x106)s.c.植入C57Bl/6小鼠中。以10mg/kg抗LSR mAb和/或抗PD-1mAb(4H2)的剂量对患有可触知的肿瘤的小鼠进行i.p.注射。将同种型对照Ab以20mg/kg进行给药，或以10mg/kg添加至单独抗PD-1或抗LSR抗体治疗。用一种电子卡尺测量肿瘤体积，并且计算对肿瘤生长的效应。在将针对这两种靶标(PD-1或LSR)的阻断抗体联合时，增强了治疗效应，表现为对肿瘤生长的抑制。在肿瘤引流***以及非引流***中，确定了效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率以及Teff与Treg的比率。
实例15：与用环磷酰胺的节拍疗法相联合的针对该LSR蛋白的阻断抗体的抗肿瘤效应
环磷酰胺，由于它的直接细胞毒性效应以及它针对活性***细胞的抑制性活性，而已经被用作针对特定实体瘤和淋巴瘤的一种标准烷化化学治疗剂。尽管高剂量的环磷酰胺可以导致免疫细胞的耗尽，低剂量已经显示出会增强免疫应答并且诱导抗肿瘤免疫介导的效应，主要通过降低免疫抑制性Treg细胞的数量和功能(布罗德(Brode)和库克(Cooke)2008《免疫学锐评》(Crit.Rev.Immunol.)28:109-126)。使用经典化学疗法而非环磷酰胺的节拍疗法也已经显示出具有免疫刺激效应，包括吉西他滨；铂基化合物例如奥沙利铂、顺铂和卡铂；蒽环类例如阿霉素；紫杉烷类例如紫杉醇和多西他赛；微管抑制剂例如长春新碱。
环磷酰胺与其他免疫疗法(例如抗4-1BB激活Ab或抗PD1阻断Ab)的联合疗法导致了协同抗癌效应(金姆(Kim)等人2009《分子癌症疗法》(Mol Cancer Ther)8:469-478；姆克尔季昌(Mkrtichyan)等人2011《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)41:2977–2986)。
在C57BL/6背景中的该同系B16黑色素瘤模型中测试了与环磷酰胺联合的抗LSR阻断mAb(如在金姆(Kim)等人2009《分子癌症疗法》(MolCancer Ther)8:469-478中所说明的)。简言之，用4x105B16-F10黑色素瘤细胞对C57BL/6小鼠进行s.c.注射。在肿瘤植入的当天，以环磷酰胺的单次i.p.注射(150mg/kg)进行给药，并且在肿瘤植入的当天开始相隔5d，进行100μg的针对LSR的中和抗体的五次注射。为了检查联合疗法对已建立的肿瘤的抗肿瘤效应，在肿瘤注射之后第5天或第10天开始给予该联合疗法。用一种电子卡尺测量肿瘤体积，并且计算对肿瘤生长的效应。在将环磷酰胺与针对LSR的这些阻断抗体联合时，增强了治疗效应，表现为对肿瘤生长的抑制。在肿瘤引流***以及非引流***中，确定了效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率以及Teff与Treg的比率。
实例16：与细胞肿瘤疫苗相联合的针对该LSR蛋白的阻断抗体的抗肿瘤效应
治疗性癌症疫苗作为使抗肿瘤应答增效的药剂使得改善的T细胞启动和改善的抗原呈递成为可能。其中有细胞肿瘤疫苗，这些细胞肿瘤疫苗使用全细胞或细胞裂解物作为抗原的来源或作为在其中递送这些抗原的平台。基于树突细胞(DC)的疫苗致力于将离体抗原递送至DC。其他治疗性癌症疫苗由以下肿瘤细胞组成，这些肿瘤细胞经遗传修饰以分泌免疫刺激性细胞因子或生长因子，例如GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)或Flt3-配体，旨在将一种免疫刺激性背景中的体内肿瘤抗原递送至内源DC。
若干体内研究已经显示出，在免疫原性差的肿瘤中，仅当与经GM-CSF或Flt3-配体转换的肿瘤疫苗(分别被称为Gvax和Fvax)(范埃尔萨斯(vanElsas)等人1999《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)190:355-366；柯伦(Curran)和艾利森(Allison)2009《癌症研究》(Cancer Res.)69:7747-7755)联合时，免疫检验点阻断(例如抗CTLA-4抗体)的一种强有力的治疗效应，并且仅在小鼠中的那些最具免疫原性的肿瘤模型中单用该抗体是有效的。此外，两种免疫治疗剂(例如抗CTLA4和抗PD-1阻断抗体)的联合与治疗性癌症疫苗(例如Gvax或Fvax(柯伦(Curran)等人2010PNAS107:4275-4280))结合是更加有效的
在抗PD-1阻断抗体存在或不存在的情况下，使用被工程化以分泌GMCSF或Flt3-配体的经辐照的黑色素瘤细胞(分别是GVAX或FVAX)，测试了与肿瘤细胞疫苗联合的LSR中和抗体的效应(如在柯伦(Curran)等人2010PNAS107:4275-4280中所说明的)。简言之，在第0天，用5x104B16-BL6细胞在侧腹对小鼠进行i.d.注射，并且在第3、6、9天，用106个经辐照(150Gy)的经基因修饰的B16细胞(表达GMCSF或Flt3-配体)在对侧侧腹，与100ug的抗LSR阻断抗体的腹膜内给药联合，用或不用100ug的抗PD-1阻断抗体(克隆RMP1-14)或抗PDL-1阻断抗体(9G2)进行治疗。同种型Ig被用作阴性对照。用一种电子卡尺测量肿瘤体积，并且计算对肿瘤生长的效应。在将针对LSR的这些阻断抗体与该经基因修饰的肿瘤细胞疫苗联合时，增强了治疗效应，表现为对肿瘤生长的抑制。抗PD-1或抗PDL-1阻断抗体进一步增强了这种效应。在肿瘤引流***以及非引流***中，确定了效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率以及Teff与Treg的比率。
实例17：与放射疗法相联合的针对该LSR蛋白的阻断抗体的抗肿瘤效应
放射疗法，由于它强力的抗增殖能力以及死亡诱导能力，长期以来已经被用作抗癌疗法。然而，最近的临床前和临床数据表明，免疫原性细胞死亡也可以是电离辐射的一种重要结果，并且局部放射疗法能够唤起和/或调节抗肿瘤免疫应答(瑞茨(Reits)等人2006《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)203:1259-1271)。临床前研究已经显示出，在一种额外的免疫疗法(例如激活抗4-1BB Ab)不存在或存在的情况下，放射疗法和免疫疗法(包括关于免疫检验点例如CTLA4和PD-1的阻断抗体)的联合治疗中的增强的治疗效应(德马里亚(Demaria)等人2005《临床癌症研究》(Clin.Can.Res.)11:728-734；韦布吕热(Verbruge)等人2012《癌症研究》(Can.Res.)72:3163-3174)。
使用一种在BALB/c背景中的同系4T1哺乳动物癌细胞系，将对阻断抗LSR抗体与放射疗法的联合进行评价(如在德马里亚(Demaria)等人2005《临床癌症研究》(Clin.Can.Res.)11:728-734中所说明的)。简言之，将5x104个4T1细胞s.c.注射于BALB/c小鼠的侧腹中。当肿瘤达到5mm的平均直径(体积为65mm3)时，开始治疗。动物组包括用每种模式单用(抗LSR或放射疗法)和用该同种型Ig对照的治疗，以及抗LSR与放射疗法的联合，或Ig对照与放射疗法的联合。通过一份或两份(48hr间隔)的12Gy，将放射疗法递送至该原发性肿瘤。在放射疗法之后的第1、4和7天，以200ug i.p.给予抗LSR Ab或Ig对照。在一个额外的实验组中，抗PD-1阻断mAb(RMP1-14)以及抗4-1BB激活mAb(3E1)。用一种电子卡尺测量肿瘤体积，并且计算对肿瘤生长的效应。在将针对LSR的这些阻断抗体与放射疗法联合时，增强了治疗效应，表现为对肿瘤生长的抑制。抗PD-1阻断抗体或抗4-1BB激活Ab进一步增强了这种效应。在肿瘤引流***以及非引流***中，确定了效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率以及Teff与Treg的比率。
实例18：LSR-ECD-IgG融合蛋白在体外使可诱导的调节T细胞(iTreg)的分化上调
Treg在促成肿瘤-免疫逃避的免疫抑制网络中起一种关键作用。为了测试一种抗LSR抗体阻断Treg分化的能力，测试了LSR融合蛋白与初始T细胞的相互作用是否影响它们向iTreg的分化。为了这个目标，使用了mLSR-ECD-小鼠IgG2a(SEQ ID NO:221)和hLSR-ECD-人类IgG1融合蛋白(SEQ ID NO:222；236)，并且通过当在iTreg驱动型条件的存在下进行孵育时，测试CD4+CD25+纯化的T细胞对调节T细胞标志物FoxP3的表达，评估了它们对调节T细胞的分化的效应。
T细胞的激活是抗原特异性的或多克隆的(经由抗CD3)。从小鼠脾或人类PBMC中经由automax分选(CD4阴性分选以及CD25阳性分离，随后CD62L阳性分选)将初始CD4+T细胞分离。
在iTreg驱动型条件(即，IL-2、TGF-β以及对照Ig或LSR-ECD-IgG融合蛋白)的存在下将这些细胞激活。在培养的第4天，收获细胞并且针对活力、CD4、CD25和FoxP3表达进行染色。
在额外的研究中，对iTreg进行分选，并且针对它们的功能性(即，在共培养测定中，它们抑制T细胞激活的能力)进行测试。
不希望受单一假设的限制，这些LSR-Ig融合蛋白增强了CD4T细胞向iTreg的分化，因为LSR途径参与了iTreg的诱导和分化，这意味着用阻断单克隆抗体靶向LSR抑制了iTreg的累积和免疫抑制功能。此外，通过抑制LSR免疫检验点活性，此类阻断抗体增强了效应T细胞活性。因此，LSR阻断抗体对效应T细胞活性的增强以及对iTreg免疫抑制活性的抑制导致了单独或与一种增效剂联合使用此类抗体的癌症疗法中的增强的有益效应。
实例19：LSR-IG融合蛋白对Th分化的效应
使用在特异性Th驱动型条件下激活时的小鼠和人类CD4+T细胞，测试了LSR-Ig融合蛋白对Th分化的效应。鼠类T细胞的激活是抗原特异性的或多克隆的。不希望受单一假设的限制，使用小鼠或人类细胞的这些实验设置的这些结果，表明了LSR对T细胞的一种免疫调节性效应，据此Th1和Th17驱动性应答(在Th1和Th17驱动型条件下促炎细胞因子的分泌以及细胞增殖)受到抑制，而抗炎性细胞因子(Th2来源的，以及IL-10)的分泌受到促进。
已知的是，肿瘤逃避免疫监视所通过的这些机制中的一种是对一种 Th2/M2导向的免疫应答的促进(比斯瓦斯(Biswas)SK等人，2010年10月；11(10):889-96)。因此，不希望受单一假设的限制，对LSR的以上所展示的免疫调节效应(即，对Th2应答的促进和对Th1应答的抑制)进行抑制的一种中和抗体是对癌症的治疗有益的。
实例20：
完全人类抗LSR抗体的开发
针对LSR抗原的人类单克隆抗体的产生
通过标准重组方法产生由连接至一种小鼠IgG2Fc多肽的LSR的细胞外结构域组成的融合蛋白，并且将其用作免疫接种的抗原。
转基因HuMab小鼠。
使用来自表达人类抗体基因的转基因HuMab小鼠RTM的HCo7品系的小鼠，制备关于LSR的完全人类单克隆抗体。在这种小鼠品系中，该内源小鼠κ轻链基因已经被纯合地打断(如在陈(Chen)等人(1993)EMBOJ.12:811-820中所说明的)，并且该内源小鼠重链基因已经被纯合地打断(如在PCT公布WO01/09187的实例1中所说明的)。此外，这种小鼠品系携带一种人类κ轻链转基因KCo5(如在费舍威尔德(Fishwild)等人(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14:845-851中所说明的)，以及一种人类重链转基因HCo7(如在美国专利号5,545,806；5,625,825；和5,545,807中所说明的)。
HuMab免疫接种：
为了产生关于LSR的完全人类单克隆抗体，可以用来源于哺乳动物细胞的经纯化的重组LSR融合蛋白对该HCo7HuMab小鼠品系的小鼠进行免疫接种，用包含编码该融合蛋白的基因的一种表达载体对这些哺乳动物细胞进行转染。在伦贝格，N.等人(1994)《自然》(Nature)368(6474):856-859；费舍威尔德，D.等人(1996)《自然生物技术》14:845-851以及PCT公布WO98/24884中说明了用于HuMab小鼠的全身免疫接种方案。当第一次输注抗原时，这些小鼠是6-16周龄。使用一种经纯化的重组LSR抗原制剂(5-50.mu.g，从表达LSR融合蛋白的经转染的哺乳动物细胞中纯化)来对这些HuMab小鼠进行腹膜内免疫接种。
用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原对转基因小鼠IP免疫接种，随后是用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的该抗原的3-21天IP免疫接种(高达总共11次免疫接种)。通过眶后放血对免疫应答进行监测。通过ELISA筛选血浆(如以下所说明)，并且使用具有足够滴定度的抗-LSR人类免疫球蛋白的小鼠用于融合。在处死并且去除脾之前3天，使用抗原来静脉内地使小鼠增强免疫。
产生抗LSR抗体的HuMab小鼠的选择：
为了选择产生结合LSR的抗体的HuMab小鼠，如最初由费舍威尔德，D.等人(1996)所说明的，通过一种改进的ELISA对来自经免疫接种的小鼠的血清进行测试。简言之，利用以1-2mu.g/ml于PBS中的经纯化的重组LSR融合蛋白以50mu.1/孔包被微量滴定板，在4℃下进行过夜孵育，并且然后利用含5％BSA的PBS以200mu.1/孔进行封闭。向每个孔中添加来自经LSR-免疫接种的小鼠的血浆的稀释物，并且在周围温度下孵育1-2小时。使用PBS/吐温对这些板进行洗涤，并且然后使用一种与碱性磷酸酯酶轭合的羊抗人κ轻链多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤之后，将这些板用pNPP底物进行显色，并且在OD415-650下通过分光光度计进行分析。将显示最高滴定度的抗-LSR抗体的小鼠用于融合。如以下所说明的进行融合，并且通过ELISA针对抗-LSR活性对杂交瘤上清液进行测试。
产生关于LSR的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
基于标准方案，用PEG将分离自这些HuMab小鼠的小鼠脾细胞融合至一种小鼠骨髓瘤细胞系。然后针对抗原特异性抗体的产生对这些生成的杂交瘤进行筛选。将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液用50％的PEG(西格玛)融合至四分之一数目的P3X63Ag8.6.53非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)中。将细胞以约1X10-5/孔铺板于平底微量滴定板中，随后在补充有以下的包含10％的胎牛血清的选择培养基中孵育约两周：RPMI中的奥利金(origen)(IGEN0，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，HEPES，青霉素，链霉素，庆大霉素，lxHAT，以及β-巯基乙醇。在1-2周之后，将细胞在将HAT用HT替代的培养基中进行培养。然后针对人类抗-LSR单克隆IgG抗体，对单独的孔通过ELISA(以上所说明的)进行筛选。一旦大量的杂交瘤生长出现，通常在10-14天之后对培养基进行监测。将这些抗体分泌杂交瘤再铺板，再次筛选，并且如果对于人类IgG仍呈阳性，就将抗-LSR单克隆抗体通过有限稀释亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆在体外培养，以在用于进一步表征的组织培养基中生成少量抗体。
对杂交瘤克隆进行选择用于进一步分析。
所希望的抗LSR人类单克隆抗体的结构表征
使用标准PCR技术，从这些生成的杂交瘤中分别获得对这些所获得的抗-LSR单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的cDNA序列，并且使用标准DNA测序技术进行测序。
对重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列进行鉴定。可以将这些序列与已知的人类种系免疫球蛋白的轻链序列和重链序列以及所鉴定的这些所获得的抗-LSR序列的每个重链和轻链的CDR进行比较。
抗-LSR人类单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征
通过Biacore分析对抗-LSR抗体的结合亲和性、结合动力学、结合特异性以及交叉竞争进行检查。还通过流式细胞术对结合特异性进行检查。
结合亲和性和动力学
通过Biacore分析(Biacore AB，乌普萨拉，瑞典)针对亲和性和结合动力学对根据本发明所产生的抗-LSR抗体进行表征。使用标准胺偶联化学以及由Biacore提供的试剂盒，将经纯化的重组人类LSR融合蛋白经由伯胺共价地连接至一种CM5芯片(经羧甲基葡聚糖包被的芯片)。在50mu.l/min的流速下，通过使抗体在处于267nM的浓度的HBS EP缓冲液(由BIAcore AB提供)中流动对结合进行测量。对抗原结合抗体的结合动力学追踪3分钟，而对解离动力学追踪7分钟。使用BlAevaluation软件(BiacoreAB)，将结合曲线和解离曲线拟合为一种1:1的朗缪尔结合模型。为了最小化结合常数的估计中的亲和力的效应，仅使用对应于结合相和解离相的起始区段的数据用于拟合。
所获得的抗LSR抗体的抗原表位作图
Biacore被用来确定抗LSR HuMAb的抗原表位分组。所获得的抗LSR抗体被用来在该LSR抗原上对它们的抗原表位进行作图。将这些不同的抗体包被到相同芯片的三个不同的表面上，每个达8000RU。制备这些mAb中的每一种的稀释物(起始于10mu.g/mL)，并且用经Fc融合的LSR(50nM)孵育一小时。将该经孵育的复合物以20mu.L/min的流速同时注射至所有这三个表面(以及一个空白表面)，持续1.5分钟。已经在1.5分钟结束时，将减去适当的空白之后的来自每个表面的信号针对该复合物中mAb的浓度进行标绘。在分析这些数据时，取决于这些抗原表位作图结果，将这些抗LSR抗体归类为不同抗原表位组。还对其功能特性进行比较。
研发了在细胞表面表达LSR蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系并且通过流式细胞术将其用来确定这些LSR HuMAb的特异性。用包含对跨膜型的LSR抗原或其变体进行编码的全长cDNA的表达质粒对CHO细胞进行转染。在N-末端包含一种抗原表位标签的转染蛋白被用于通过特异性针对该抗原表位的一种抗体来进行检测。通过将这些LSR Ab中的每一种以10mu.g/ml的浓度与这些经转染的细胞一起孵育来对一种抗-LSR MAb的结合进行评价。洗涤这些细胞，并且用一种经FITC-标记的抗人IgG Ab来对结合进行检测。使用一种鼠类抗抗原表位标签Ab、随后是经标记的抗鼠类IgG作为阳性对照。使用非特异性的人类和鼠类Ab作为阴性对照。使用所获得的数据来评价这些HuMAb针对该LSR抗原靶标的特异性。
这些抗体和其他特异性关于LSR的抗体可以被用在这些前面所说明的抗LSR相关疗法(例如其中LSR抗原是差异性表达的癌症的治疗)中，和/或用于调节(增强或抑制)涉及该LSR抗原的B7免疫共刺激(例如在以下癌症和自身免疫性疾病的治疗中，其中此类抗体将例如防止针对所希望的靶标癌细胞的T细胞活性的阴性刺激或防止T细胞活性的阳性刺激从而引起一种所希望的抗自身免疫性效应)。
使用抗体文库生成关于LSR的单克隆抗体。
本领域的普通技术人员还将认识到，对抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)进行编码的DNA还可以来源于抗体文库，例如噬菌体展示文库。尤其，可以利用这样的噬菌体来展示从一种全范围或组合抗体文库(例如人类的或鼠类的)中表达的抗原结合结构域。表达与感兴趣的抗原结合的一种抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原(例如使用经标记的抗原或被结合或捕获至一种固体表面或珠的抗原)来进行选择或鉴定。在这些方法中所使用的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包括从噬菌体中表达的fd和M13结合结构域，该噬菌体具有Fab、Fv OE DAB(来自轻链或重链的单独的Fv区)或与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的经二硫稳定化的Fv抗体结构域。示例性的方法阐述于例如以下项中，EP 368 684 B1；美国专 利5,969,108，哈根博姆(Hoogenboom)，H.R.和查恩斯(Chames)，《今日免疫学》(Immunol.Today)27:371(2000)；纳吉(Nagy)等人《自然医学》(Nat.Med.)5:801(2002)；休伊(Huie)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.ScL USA)95:2682(2001)；卢伊(Lui)等人，《分子生物学杂志》(J.MoI.Biol.)5/5:1063(2002)，它们中的每一个都通过引用结合在此。若干出版物(例如，马克斯(Marks)等人，《生物/技术》(Bio/Technology)70:779-783(1992))已经说明了通过链改组连同组合感染和体内重组作为一种用于构建大噬菌体文库的策略来产生高亲和性人类抗体。在另一个实施例中，核糖体展示可以被用来替代噬菌体作为展示平台(参见例如黑尼斯(Hanes)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)75:1287(2000)；威尔逊(Wilson)等人,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.ScL USA)98:3750(2001)；或欧文(Irving)等人，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)248:3\(2001))。在又另一个实施例中，可以针对抗体对细胞表面文库进行筛选(博德(Boder)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.ScL USA)97:10701(2000)；多尔蒂(Daugherty)等人，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)243:211(2000))。
此类程序提供了用于单克隆抗体的分离和随后的克隆的传统杂交瘤技术的替代方案。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示于噬菌体颗粒的表面上，这些噬菌体颗粒携带编码它们的多核苷酸序列。例如，将编码VH和VL区的DNA序列进行扩增，或否则的话，从动物cDNA文库(例如，人类或鼠类的淋巴组织cDNA文库)或合成cDNA文库中进行分离。
在某些实施例中，通过PCR通过一种scFv连接物将编码这些VH和VL区的这些DNA接合在一起，并且克隆至一种噬粒载体(例如，pCANTAB6或pComb3HSS)中。
将该载体以电穿孔转至大肠杆菌中，并且用辅助噬菌体对该大肠杆菌进行感染。在这些方法中所使用的噬菌体典型地是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且这些VH或VL区通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达与一种感兴趣的抗原(即，LSR多肽或其一种片段)结合的一种抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原(例如使用经标记的抗原或被结合或捕获至一种固体表面或珠的抗原)来进行选择或鉴定。
可以被用来制备这些抗体的噬菌体展示方法的额外的实例包括在以下项中所披露的那些：布林克曼(Brinkman)等人《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)752:41-50(1995)；艾姆斯(Ames)等人，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)/￡4:177-186(1995)；凯特尔伯勒(Kettleborough)等人，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)24:952-95％(1994)；佩西克(Persic)等人，《基因》(Gene)757:9-18(1997)；伯顿(Burton)等人，《免疫学进展》(Advances in Immunology)57:191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公布WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743以及5,969,108；它们中的每一个都通过引用以其全文结合于此。
如在以上参考文献中所说明的，在噬菌体选择之后，可以对来自该噬菌体的这些抗体编码区进行分离，并且用来产生全抗体(包括人类抗体或任何其他所希望的抗原结合片段)，并且在任何所希望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母以及细菌)中进行表达。
实例21：抗LSR人类IgG1抗体通过补体依赖性细胞毒作用(CDC)对LSR异位表达细胞系的效应子功能活性
经由XOMA031人类Fab文库的噬菌体展示筛选，产生了针对LSR、S11-01.E02、S11-01.F08、S11-04.C11、S11-04.D11、S11-04.H07、S11-04.H09、S32-03.G11的人类IgG1抗体。
噬菌体淘选细节：
经生物素酰化的LSR的制备：将该人类LSR抗原(与一种小鼠IgG2aFc区融合的LSR细胞外结构域)和阴性对照蛋白(‘对照抗原’，也包括一种mIgG2a Fc融合物)进行生物素酰化，以协助基于溶液的噬菌体淘选。按照生产厂商的说明书(皮尔斯(Pierce)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(IL)，)，所有的蛋白都在500μL PBS中被稀释至1mg/mL，然后用一种硫-NHS-LC-生物素试剂盒(Sulfo-NHS-LC-Biotin kit)以3:1生物素：蛋白的比率进行标记。通过使用0.5mL3500MWCO Slide-A-Lyzer盒(Slide-A-Lyzer cassette)(皮尔斯)针对PBS pH7.4对样品进行过夜透析，将游离生物素去除。经透析的蛋白在-80℃下贮存。
人类抗体文库的噬菌体淘选：使用捕获这些经生物素酰化的抗原的经链霉抗生物素蛋白包被的磁珠，在溶液中实施淘选反应。使用一种捕获这些珠子(普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))的磁性支架进行所有的洗涤和洗脱步骤。在室温下，在一种管旋转器(BioExpress，凯斯维尔(Kaysville)，犹他州(UT))上，伴随轻轻的混合，进行所有的孵育步骤。如在表1中所概括的，进行该淘选实验：
表1：被用于针对LSR的噬菌体淘选的抗原密度和洗涤严格性。
用于淘选的噬菌体文库的制备：所有的噬菌体淘选实验使用了XOMA031人类fab抗体噬菌体展示文库(XOMA公司，伯克利(Berkeley)，加利福尼亚州(CA))。通过与PBS中的10％脱脂奶粉1:1混合(最终脱脂乳浓度5％)并且孵育1hr，对足够用于该文库的50倍过表现度的噬菌体进行封闭。
抗原偶联至链霉抗生物素蛋白珠：对每个淘选反应来说，通过悬浮于1mL的封闭缓冲液(PBS中的5％脱脂奶粉)中对三个100μL等分试样的经Dynal链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(生命技术(Life Technologies))进行封闭，并且与该封闭噬菌体文库一起进行孵育。将一个经封闭的珠子等分试样与一个量的经生物素酰化的LSR(取决于淘选轮次和反应条件(表1))混合。将其他两个等分试样与100pmol的该‘耗尽’对照抗原混合。将经生物素标记的抗原偶联至这些珠子，在RT下持续1hr。用PBS将珠子洗涤两次以去除游离抗原，并且重悬于100μL封闭缓冲液中。
来自该噬菌体文库的小鼠IgG2a Fc结合物的耗尽：在噬菌体淘选可以开始之前，去除不想要的对LSR的Fc区的结合物是必要的。为了实现这，将经封闭的噬菌体与偶联至该对照抗原的珠子混合，并且孵育1hr。然后弃掉这些珠子(据推测，以及不想要的mIgG2a Fc-结合物)。将‘经耗尽的’噬菌体文库上清液用于对该LSR抗原的三轮淘选。
Fab PPE产生和筛选：对从第3轮淘选中洗脱的噬菌体库进行稀释，并且感染至TG1大肠杆菌细胞(Lucigen，米德尔顿(Middleton)，威斯康星州(WI))中，使得当涂在一种2YTCG琼脂平板上时产生单菌落。
对分泌至大肠杆菌胞质中的Fab蛋白进行提取用于分析。通过在2500xG下离心收获细胞，弃掉上清液，并且将沉淀重悬于75μL用冰预冷的PPB缓冲液(Teknova)中。在4℃下伴随1000rpm摇荡将提取物孵育10min，然后并且接着添加225μL用冰预冷的ddH2O并且再孵育1hr。通过在2500xG下离心使所产生的胞质提取物(PPE)澄清，并且转移至分开的平板或管用于ELISA和FACS分析。注意到所有的提取缓冲液都包含Halt(皮尔斯)蛋白酶抑制剂
通过ELISA和FACS分析针对与LSR的结合对包含所表达的Fab的胞质提取物进行测试。通过ELISA鉴定了与LSR结合的十二种序列唯一的Fab。这些之中的七种针对结合是FACS阳性的。这些FACS结合物中的六种被重整为全长人类IgG1抗体，并且进行纯化用于功能性测试。
被进一步用于功能性测试的这些经纯化的抗体的序列在下面说明。
该功能性分析的目标是建立一种着手解决LSR单克隆抗体在一种表达LSR的细胞系上的补体固定能力的功能性测定，并且使用这种测定来针对潜在治疗性抗体针对CDC效应子功能进行筛选。
材料和方法
表达LSR的细胞系：如在此以上所说明的，产生了表达猕猴LSR或GFP表达载体或单独空载体的HEK293T细胞。将HEK293T经转染的细胞培养于完全培养基(CM)中：DMEM中5ug/ml嘌呤霉素，补充10％FBS，谷氨酰胺和青链霉素(Penstrep)。
抗体：如在此所述的，产生了针对LSR的人类IgG1抗体，S11-01.E02(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:244和238)、S11-01.F08(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:260和250)、S11-04.C11(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:273和263)、S11-04.D11(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:281和279)、S11-04.H07(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:308和283)、S11-04.H09(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:289和286)、S32-03.G11(对VL和VH来说分别是SEQ ID NO:308和293)。人类IgG1同种型对照(cat#ET-901)购自美国优瑞科医疗(Eureka Therapeutics)，针对人类LSR，8C8的小鼠IgG2a单克隆抗体在法国Biotem产生。小鼠IgG2a同种型对照，克隆MOPC-173(cat#400224)，购自美国生物传奇(Biolegend)。
一种针对抗体的标准化编号方案首先由卡巴特等人(1983)引入。这种编号方案是基于当没有针对抗体的结构信息可用时的序列比对而得到的。乔西亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)(1987)检查了抗体结构的可变结构域，并且显示了基于序列由卡巴特所暗示的CDR-L1和CDR-H1中的***和缺失的位点(得失位(indel))在结构上是不正确的。这导致了乔西亚编号方案的引入。在卡巴特和乔西亚两个方案中，编号是基于最常见的序列长度，并且为***提供***字母(例如30a)。
阿比南当(Abhinandan)和马丁(Martin)(2008)已经用卡巴特数据库中存在的标准编号检查了注释，并且已经发现了在该(手动应用的)编号中大致10％的序列具有一种错误。为了进行这种分析，他们已经创建了一种以一种自动的和可靠的方式应用卡巴特或乔西亚编号的软件工具(AbNum)。将由该AbNum程序所产生的编号与在卡巴特中出现的编号进行比较。在鉴定出差异的地方，对编号进行了手动检查以确定该错误是在AbNum中还是在卡巴特中。在该软件的若干轮改进之后，他们确定所有的错误都看起来是在卡巴特中。
当正在做编号时，可以对CDR进行定义。有三种定义CDR的流行的方式：(1)卡巴特定义，其基于序列可变性并且是最常用的；(2)乔西亚定义，其基于结构环区的定位；(3)AbM定义，其是前面这两种之间的一种折中，由牛津分子抗体建模软件(Oxford Molecular's AbM antibodymodelling software)所使用。这三种方式的详细说明在http://www.bioinf.org.uk/abs/进行说明。还有几种其他定义CDR的专利方法(例如(4)SeqAgentTM软件程序，由XOMA(US)LLC，伯克利(Berkeley)加利福尼亚州(CA).所开发，其原理在http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html中说明)。在下表中描述了这三种最流行的方式的概述。
基于这些不同的CDR定义，针对这些LSR抗体定义了以下CDR(在每个SEQ ID NO旁边的括号中的编号对应如以上所说明的用于相应的CDR定义的CDR检测的方法)：
S11-01.E02，描绘于SEQ ID NO:245(1-3)，246(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:247(1-3)，248(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:249(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:239(3)，240(4)，241(1)，252(2)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:256(4)，287(2-3)，288(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:242(1-3)，243(4)中的重链CDR3。
S11-01.F08，描绘于SEQ ID NO:303(1-3)，304(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:261(1-3)，306(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:262(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:251(3)，252(2)，253(4)，254(1)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:255(2-3)，256(4)，257(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:258(1-3)，259(4)中的重链CDR3。
S11-04.C11，描绘于SEQ ID NO:274(1-3)，275(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:276(1-3)，277(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:278(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:264(3)，265(2)，266(4)，267(1)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:268(2-3)，269(4)，270(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:271(1-3)，272(4)中的重链CDR3。
S11-04.D11，描绘于SEQ ID NO:274(1-3)，275(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:276(1-3)，277(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:282(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:264(3)，265(2)，266(4)，267(1)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:268(2-3)，269(4)，280(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:271(1-3)，272(4)中的重链CDR3。
S11-04.H07，描绘于SEQ ID NO:303(1-3)，304(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:305(1-3)，306(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:307(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:239(3)，240(4)，241(1)，252(2)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:256(4)，287(2-3)，288(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:284(1-3)，285(4)中的重链CDR3。
S11-04.H09，描绘于SEQ ID NO:290(1-3)，291(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:305(1-3)，306(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:292(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:251(3)，252(2)，253(4)，254(1)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:256(4)，287(2-3)，288(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:258(1-3)，259(4)中的重链CDR3。
S32-03.G11，描绘于SEQ ID NO:303(1-3)，304(4)中的轻链CDR1，描绘于SEQ ID NO:305(1-3)，306(4)中的轻链CDR2，描绘于SEQ ID NO:307(1-4)中的轻链CDR3，描绘于SEQ ID NO:294(3)，295(2)，296(4)，297(1)中的重链CDR1，描绘于SEQ ID NO:298(2-3)，299(4)，300(1)中的重链CDR2，描绘于SEQ ID NO:301(1-3)，302(4)中的重链CDR3。
试剂：经纯化的兔补体(cat#CL-3441)购自加拿大塞德林实验室(Cedarlane laboratories)。细胞滴定度Glo(Cell Titer Glo)试剂购自美国普洛麦格(Promega)。
细胞毒性测定：使用细胞滴定度glo(cell titer glo)试剂评估了LSR抗体针对异位表达cyno LSR或对照GFP的HEK293的CDC活性。以2.5X104个细胞每孔的密度将细胞铺板于一种96孔白色组织培养板中于50ul的CM中。在让细胞沉降2小时之后，以等体积将2x抗体、同种型或单独的培养基的系列稀释物添加至各自的孔。在室温下10分钟之后，将4ul的新鲜重构补体添加至除了对照孔以外的每个测试孔，并且将板在37度孵育一小时。然后将板平衡至室温，持续10分钟，并且每孔添加100ul的细胞滴定度glo(cell titer glo)试剂，并且在RT下孵育10分钟。在Victor2读板仪(珀金埃尔默(Perkin Elmer))上以RLU(相对发光单位)测量发光。在Excel中对数据进行分析，并且在GraphPad Prism中绘图。
百分比CDC如下进行计算：100-[(RLU实验孔/RLU对照孔)X100]。条件以三个重复运行，并且这里所显示的数据代表一次实验。
FACS分析：对用空载体转染的HEK293或表达cyno LSR的HEK293细胞进行洗涤，并且在4摄氏度下在50ul的不同浓度的FACS缓冲液(PBS(生命技术)，0.5％BSA(西格玛奥德里奇))中的LSR抗体或同种型对照中染色60分钟。在FACS缓冲液中将细胞洗涤一次，在4摄氏度下重悬于50ul的在10ug/ml下的经生物素酰化的抗小鼠IgG(GE cat#RPN1001V)或经生物素酰化的抗人Fc(杰克逊(Jackson)cat#109-065-097)中，持续30分钟。在FACS缓冲液中对细胞进行洗涤，重悬于50ul的在FACS缓冲液中制备的SA-PE(杰克逊(Jackson)cat#016-110-084)的1:100稀释物中，持续30分钟。将细胞洗涤两次，并且重悬于最终体积100ul的FACS缓冲液中。在Intellicyt HTFC上对样品进行读数。通过FCS Express(德诺沃(DeNovo))对数据进行分析，导出至Excel并且在GraphPad Prism中进行绘图。
结果
如在图25中所示，LSR人类IgG1抗体显示出展示了对异位表达LSR的HEK293的CDC活性。
在这项实验中，在单一浓度10ug/ml下，评估了7种针对在HEK293T细胞上异位表达的LSR蛋白的人类IgG1单克隆抗体的活性。如在图25中所示，7种抗体中的6种展示了对表达LSR的HEK293T细胞的CDC活性，同时没有显示出对该GFP对照细胞系的活性。8C8(一种针对人类LSR的小鼠IgG2a单克隆的)在这项测定中没有显示出活性，与阴性对照hIgG1(ET901)和mIgG2a(Mopc173)以及与这些抗LSR抗体中没有显示出活性的一种(S32-03.G11)相似。
如在图26C、D、E、F、G和H中所示，通过FACS染色，所有的显示出CDC活性的六种抗体与该表达LSR的细胞系结合，与空载体对照细胞系不结合或弱结合。如在图26B中所示，没有显示出特异性CDC活性的抗体S32-03.G11不与表达LSR的HEK293细胞结合。人类IgG1的同种型对照既不与表达LSR的细胞也不与用空载体转染的细胞结合。小鼠8C8mAb显示出了与这些表达LSR的HEK293细胞的结合(图26A)，但是没有CDC活性(图25)。
若干人类抗LSR抗体显示出了对表达LSR蛋白的HEK293T细胞的CDC活性。这项测定可以用来对LSR的功能性Ab进行表征。这些结果提高了以下可能性：以补体固定活性而闻名的人类IgG1子类的LSR治疗性抗体可以潜在地通过多种作用机制(包括对表达LSR的癌细胞的CDC介导的效应子功能)起作用。
实例22：在HEK293T细胞上表达的LSR对尤尔卡特细胞的激活的效应的体外测试以及通过CD69表达所测量的经重整的Ab对尤尔卡特T细胞的抗CD3介导的激活的降低的抑制。
为了评估天然细胞表面表达的LSR蛋白对T细胞激活的效应，使用了过表达LSR的HEK-293T细胞和由平板结合的抗CD3抗体所激活的尤尔卡特细胞(来源于一种人类T细胞白血病)的一种共培养测定。
材料和方法
通过CD69表达所测量的尤尔卡特T细胞的抗CD3介导的激活。
第1天：
1.将稀释于1X PBS中的抗CD3(克隆OKT3，e生物科学(eBioscience)；cat#16-0037-85或克隆UCHT1，BD生物科学；cat#555329)以75μL/孔以所指出的浓度固定于一种平底96孔板上。
2.用石蜡膜对板进行包裹，并且在4℃下孵育过夜。
3.将用编码LSR或CD20(作为阴性对照)的pRp3质粒的表达构建体、或用空载体pRp3稳定转染的HEK-293T细胞库以12X106个细胞每T75板的浓度进行接种，并且在一种加湿培养箱中在补充了10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养过夜。
第2天：
1.用200μl的X1PBS对用抗CD3包被的孔进行洗涤X3。在一种无菌环境中将流体倾倒。在最后一次洗涤之后，在一种无菌吸水纸上对该板进行印迹以去除任何残余流体。
2.用丝裂霉素C(西格玛，M4287)处理在前一天所接种的HEK-293T细胞：将900μl的一种在H2O中所新鲜制备的0.5mg/ml溶液直接添加至8.1ml的生长培养基，以获得50μg/ml的最终浓度。在37℃下用丝裂霉素C将细胞孵育1小时。
3.用10ml的1X PBS将经丝裂霉素C处理的HEK-293T细胞洗涤X3，并且通过添加2ml的细胞解离液(古布可(Gibco)；Cat.13151-014)而去除。
4.将脱离的HEK-293T细胞重悬于8ml的补充了10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的RPMI(尤尔卡特(Jurkat)细胞的生长培养基)中。
5.使用一种贝克曼库尔特计数器(Beckman coulter counter)对细胞进行计数，并且稀释至0.5X106个细胞每ml。
6.对细胞进行系列稀释，并且以所指出的浓度接种于100μl每孔的尤尔卡特细胞的生长培养基(以上所说明的)中。
7.将HEK293T细胞孵育2小时以允许附着。
8.以100μl每孔的体积在尤尔卡特细胞的生长培养基(以上所说明的)中，将50,000个尤尔卡特细胞(ATCC，克隆E6-1，TIB-152)添加至每个孔。
9.在一种加湿培养箱中在37℃下将细胞共培养过夜。
第3天：
1.将细胞转移至U形板，以1500rpm，4℃离心5分钟，并且对上清液进行倾倒。
2.将抗CD69Ab(生物传奇(Biolegend)，PE-抗人类CD69，克隆FN50，cat#310906，10μg/ml，2μl/孔)和Fc-阻断剂(美天旎(MiltenyiBiotec)，人类FcR阻断试剂，cat#120000-442，1μl/孔)在用冰预冷的FACS缓冲液(1X PBS+0.5％BSA+2mM EDTA+0.05％叠氮化物)中进行稀释，并且以最终体积50μl每孔进行添加。
3.通过吹打(不产生气泡)，将孔内容物轻轻混合。
4.将板在冰上孵育30分钟。
5.用200μl的FACS缓冲液将细胞洗涤一次，并且将这些板在1500rpm，4℃下离心5min。通过倾倒弃掉上清液。
6.将细胞重悬于200μl的FACS缓冲液中，并且转移至充满额外的100μl FACS缓冲液的FACS管。
7.通过流式细胞术针对CD69的细胞表面表达(平均荧光强度(MFI)或总T细胞中表达CD69的细胞的百分比)对尤尔卡特细胞进行分析。根据前向散射(FSC)vs侧向散射(SSC)，对尤尔卡特细胞进行选通。通过用抗CD2抗体(生物传奇(Biolegend)；克隆RPA-2.10，Cat.300206)对这些细胞进行染色，对选通程序进行了验证，以便鉴定这些尤尔卡特T细胞。
结果
通过CD69表达所测量的尤尔卡特T细胞的抗CD3介导的激活的抑制。
如在Mat和Meth中所说明的，用由平板结合的抗CD3抗体所激活的尤尔卡特T细胞对表达全长LSR蛋白的HEK-293T转染子进行共孵育。只用该载体(pRp3)转染的HEK-293T细胞被用作一种阴性对照。在图27中所示的代表性结果表明，与只用该载体(pRp3)转染的HEK-293T细胞的效应相比较，用抗人类CD3抗体的两种不同克隆(OKT3或UCHT1)所刺激的尤尔卡特T细胞在表达LSR的HEK-293T细胞的存在下展示了降低的激活，如通过CD69(T细胞激活的一种早期标志物)的降低的上调所表现的。当每孔使用50,000个HEK-293T经转染的细胞时，LSR的抑制性效应被最佳地检测出。在图28中，显示了来自一项相似实验的结果。在这项实验中，使用了UCHT1抗CD3Ab克隆，并且将结果显示为表达CD69的尤尔卡特细胞的％。这些发现与用表达CD20蛋白的HEK-293T细胞所获得的那些发现(没有显示出一种效应)进行了比较。
图27：在HEK-293T细胞上表达的LSR抑制了尤尔卡特细胞的激活。将表达LSR或pRp3空载体的HEK-293T细胞以25,000(A和C)或50,000(B和D)个细胞每孔接种于用0.25μg/ml的抗CD3(OKT3克隆)(A和B)或2μg/ml的抗CD3(UCHT1克隆)(C和D)预包被的孔中。在2小时之后，以50,000个细胞每孔添加尤尔卡特细胞，并且将这些共培养物孵育过夜。通过流式细胞术针对CD69的表达对细胞进行分析。作为参考，显示出了未经处理(即未用抗CD3进行处理)的尤尔卡特细胞(UT)的CD69值。Δ在(E)中描述了在50,000个HEK-293经转染的细胞的存在下，未经处理的与经抗CD3处理的尤尔卡特细胞之间CD69的MFI值，*表明值与该空载体的值具有显著差异(p<0.05，学生t检验)。
图28：与表达CD20的HEK-293T细胞相对比，表达LSR的HEK-293T细胞抑制了用抗CD3激活的尤尔卡特细胞。将表达LSR、CD20或pRp3空载体的HEK-293T细胞以25,000(A)或50,000(B)个细胞每孔接种于用2μg/ml的抗CD3(UCHT1克隆)预包被的孔中。在2小时之后，以50,000个细胞每孔添加尤尔卡特细胞，并且将这些共培养物孵育过夜。通过流式细胞术针对CD69的表达对细胞进行分析。在(A)和(B)中显示了表达CD69的尤尔卡特细胞的百分比。在(C)中显示了这些经激活的细胞与未经激活的细胞之间在％CD69上的差异(ΔCD69％)。在(D)中显示了对CD69上调的抑制的百分比，*表明值与该空载体的值具有显著差异(p<0.05，学生t检验)。
基于这些结果，在HEK-293T细胞的细胞表面上所表达的LSR的细胞表面表达形式抑制了尤尔卡特T细胞的激活。这些结果进一步支持了之前用该LSR融合蛋白所获得的发现，该LSR融合蛋白包括与mIgG2a Fc融合的LSR的胞外结构域，在不同实验设置中展示了对T细胞激活的一种抑制性效应。
通过CD69表达所测量的经重整的Ab对尤尔卡特T细胞的抗CD3介导的激活的降低的抑制。
为了评估LSR特异性Ab对T细胞激活的功能效应，在此所述的这些不同LSR hIgG1Ab的存在下进行了一种如以上所说明的共培养测定。
在LSR特异性Ab存在或不存在的情况下，用由平板结合的抗CD3抗体所激活的尤尔卡特T细胞对表达全长LSR野生型蛋白的HEK-293T细胞进行共培养。将LSR特异性Ab添加至每孔，在总体积50ul的尤尔卡特细胞生长培养基中至最终浓度20ug/ml。只用该载体(pRp3)转染的HEK-293T细胞被用作一种阴性对照。在一种阴性对照(hIgG1)的存在下，表达LSR的HEK-293T细胞与尤尔卡特T细胞的共培养导致了对CD69表达的抑制，如在此实例22中所展示的。初步结果指示，至少一种LSR hIgG1Ab，S11-04.H07的添加，提高了CD69表达的强度，但是这种趋势没有达到统计显著性，因此降低了由细胞表面表达的LSR蛋白所介导的抑制性效应。这种评论意见表明，这种Ab(之前显示出与细胞表面表达的LSR特异性结合)可能通过中和由LSR所介导的T细胞抑制而拥有一种功能效应。
尽管在该共培养测定中展示了中和活性，这些受试抗体在一种涉及平板结合的融合蛋白的测定形式中对T细胞激活的LSR抑制没有效应。不希望以任何方式受限制，这些测定之间的这种不一致可以是因为很多因素，包括在靶标密度上的差异，由蛋白与这些板的结合所引入的构象异常，或该融合蛋白的Fc区对T细胞激活的意外的效应。
已经对本发明进行了说明，并且已经提供了不同的实施例，这些实施例涉及制造和选择所希望的用于作为用于不同疾病的治疗剂和诊断方法的抗LSR抗体。超出在此所示的那些明确的组合和亚组合，不同的实施例可以可任选地在此以任何适合的方式联合。现在通过以下的权利要求来进一步说明本发明。

Claims (89)

1.一种免疫分子，包括具有一种选自下组的氨基酸序列的一种抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO229，235，242-243，245-249，258，274-278，264-272，251-256，280，287，284，285，290-292，287，288，259，295，297-302，306-307，其中这些抗原结合区适应于特异性结合至一种具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白。
2.如权利要求1所述的免疫分子，包括SEQ ID NO227、228或229中的至少一种，以及SEQ ID NO233、234或235中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO245、246、247、248或249中的至少一种，以及SEQ ID NO:239、240、241、252、256、287、288、242或243中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO303、304、261、306、或262中的至少一种，以及SEQID NO:251、252、253、254、255、256、257、258或259中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO274、275、276、277、或278中的至少一种，以及SEQ ID NO:264、265、266、267、268、269、270、271或272中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO274、275、276、277、或282中的至少一种，以及SEQ ID NO:264、265、266、267、268、269、280、271、或272中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO303、304、305、306、或307中的至少一种，以及SEQ ID NO:239、240、241、252、256、287、288、284、或285中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO290、291、305、306、或292中的至少一种，以及SEQ ID NO:251、252、253、254、256、287、288、258或259中的至少一种；或可替代地，SEQ ID NO303、304、305、306、或307中的至少一种，以及SEQ ID NO:294、295、296、297、298、299、300、301或302中的至少一种。
3.如权利要求1所述的免疫分子，包括SEQ ID NO:227-229、239-243、251-299、264-272、280、284-285、287-288、293-301或302中的至少一种以及SEQ ID NO233-235、245-249、261-262、274-278、282、290-292、303-306或307中的至少一种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫分子，是处于一种抗体片段的形式。
5.如权利要求1-3中任一项所述的免疫分子，包括至少两种具有选自下组的氨基酸序列的抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO239-243、245-249、251-259、261-262、264-272、274-278、280-281、282、284-285、287-288、290-292、294-307。
6.如权利要求5所述的免疫分子，包括至少一种具有一种选自下组的氨基酸序列的抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO227、228、229、245、246、247、248、249、261、262、274、275、276、277、278、282、303、304、305、306、307、290、291以及292。
7.如权利要求5或6所述的免疫分子，包括至少一种具有一种选自下组的氨基酸序列的抗原结合区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO233、234、235、239、240、241、287、288、242、243、251、252、253、254、255、256、257、258、259、264、265、266、267、268、269、270、271、272、280、294、295、296、297、298、299、300、301、302、284、285、287、288、258以及259。
8.如以上权利要求中任一项所述的免疫分子，包括具有SEQ ID NO:220、244、260、273、281、289、308中的任一种的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白。
9.如以上权利要求中任一项所述的免疫分子，包括具有SEQ ID NO:218、238、250、263、279、283、286、293中的任一个的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白。
10.如以上权利要求中任一项所述的免疫分子，包括具有SEQ ID NO:220的和SEQ ID NO:218的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:244的和SEQ ID NO:238的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:260的和SEQ ID NO:259的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:273的和SEQ ID NO:263的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:281的和SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:308的和SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:289的和SEQ ID NO:286的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有SEQ ID NO:308的和SEQ ID NO:293的氨基酸序列或与其95％同源的一种序列的一种蛋白；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO245或246中的一种；SEQ ID NO247或248中的一种；SEQ ID NO:249；SEQ ID NO239、240、241或252中的一种；SEQ ID NO256、287、288中的一种；以及SEQ ID NO242或243中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO303或304中的一种；SEQ ID NO261或306中的一种；SEQ ID NO:262；SEQ ID NO251、252、253或254中的一种；SEQ ID NO255、256或257中的一种；以及SEQ ID NO258或259中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO274或275中的一种；SEQ ID NO:276或277中的一种；SEQ ID NO:278；SEQ ID NO:264、265、266或267中的一种；SEQ ID NO:268、269或270中的一种；以及SEQ ID NO:271或272中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO274或275中的一种；SEQ ID NO:276或277中的一种；SEQ ID NO:282；SEQ ID NO:264、265、266、267中的一种；SEQ ID NO:268、269或280中的一种；以及SEQ ID NO:271或272中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO:303或304中的一种；SEQ ID NO:305或306中的一种；SEQ ID NO:307；SEQ ID NO:239、240、241或252中的一种；SEQ ID NO:256、287或288中的一种；以及SEQ ID NO:284或285中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO:290或291中的一种；SEQ ID NO:305或306中的一种；SEQ ID NO:292；SEQ ID NO:251、252、253或254中的一种；SEQ ID NO:256、287或288中的一种；以及SEQ ID NO:258或259中的一种；
或可替代地，包括具有以下氨基酸序列的一种蛋白：SEQ ID NO:303或304中的一种；SEQ ID NO:305或306中的一种；SEQ ID NO:307；SEQ ID NO:294、295、296或297中的一种；SEQ ID NO:298、299或300中的一种；以及SEQ ID NO:301或302中的一种。
11.一种对如以上权利要求中任一项所述的免疫分子进行编码的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，包括一种选自下组的核酸序列，该组由以下各项组成：SEQ NO224、225、226、230、231、232、217和219，以及它们的简并变体。
13.一种包括如权利要求11或12所述的多核苷酸的载体。
14.一种包括如权利要求13所述的载体的重组细胞，能够表达如以上权利要求中任一项所述的免疫分子。
15.一种用于产生如以上权利要求中任一项所述的免疫分子的方法，包括将如权利要求13所述的载体引入一种细胞中，以形成一种重组细胞；并且通过该重组细胞产生该免疫分子。
16.一种抗体或其一种抗原结合片段，所述抗体具有特异性结合至SEQ IDNO10的氨基酸30-110上、并且不会特异性结合至SEQ ID NO10的任何其他部分上的一种抗原结合区，其中所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-29或氨基酸111至234。
17.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有特异性结合至SEQ ID NO215或SEQ ID NO216上、并且不会特异性结合至SEQ ID NO10的任何其他部分上的一种抗原结合区，其中对SEQ ID NO215来说，所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-80或氨基酸99至234，或其中对SEQ ID NO216来说，所述SEQ ID NO:10的其他部分包括SEQ ID NO:10的氨基酸1-117或氨基酸136至234。
18.根据以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体或片段，其中该抗体是一种完全人类抗体、嵌合抗体、人源化或灵长化抗体。
19.根据以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体或抗原结合片段，其中该抗体选自下组，该组由以下各项组成：Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单位。
20.根据以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体或抗原结合片段，其中该抗体被偶联至一种选自以下的治疗剂：药物、放射性核素、荧光团、酶、毒素、治疗剂、或化学治疗剂；并且其中可检测的标志物是放射性同位素、金属螫合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
21.一种药物组合物，该药物组合物包括根据以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体或抗原结合片段。
22.如以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段或药物组合物用于在一名对其有的受试者中治疗一种选自下组的疾病的用途，该组由以下各项组成：癌症、免疫病症或感染性疾病。
23.如以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中所述抗体或片段对免疫细胞的活性进行调节、使T细胞的激活增加、使T细胞的抑制缓解、使免疫抑制性细胞因子的分泌减少、使促炎性细胞因子的分泌增加、使IL-2的分泌增加；使出自T细胞的干扰素-γ的产生增加、对癌抗原表位的扩散进行促进、使一种哺乳动物中的T细胞应答增加、使M2巨噬细胞减少或消除、使M2巨噬细胞的促致瘤活性降低、使抗原特异性记忆应答增强、使癌细胞的凋亡增强、使对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制效应增强、使对癌细胞的直接杀伤增强，对补体依赖性细胞毒作用和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用进行诱导。
24.如权利要求23所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中所述抗体或片段提高了针对癌症的免疫应答。
25.如权利要求24所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中将该治疗与另一种用于治疗癌症的治疗剂或疗法相联合。
26.如权利要求25所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该疗法包括放射疗法、冷冻疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术、激素剥夺或使用常规药物的联合疗法中的一种或多种。
27.如权利要求25所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、小分子、化学治疗剂、细胞毒性和细胞抑制剂、免疫调节剂、干扰素、白细胞介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、以及蛋白酶体抑制剂。
28.如以上权利要求中任一项所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，与一种或多种增效剂联合、同时或依次给予一名受试者以获得一种治疗效果，其中所述一种或多种增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的常规/经典抗癌疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、治疗性癌症疫苗、过继细胞转移。
29.如28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该常规/经典抗癌剂选自：铂基化合物、具有抗癌活性的抗生素、蒽环类、蒽二酮、烷化剂、抗代谢物、抗有丝***剂、紫杉烷、紫杉烷类二萜、微管抑制剂、长春花碱、叶酸拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、抗***、抗雄激素、芳香酶抑制剂、GnRh类似物、5α-还原酶抑制剂、二膦酸盐。
30.如权利要求28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该靶向疗法药剂选自下组，该组由以下各项组成：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、mTOR途径抑制剂、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、PI3K抑制剂、蛋白激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、细胞内信号转导的抑制剂、Ras/Raf信号转导的抑制剂、MEK抑制剂、AKT抑制剂、存活信号转导蛋白的抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、治疗性单克隆抗体、TRAIL途径激动剂、抗血管生成剂、金属蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂、免疫轭合物、抗体药物轭合物、抗体片段、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
31.如权利要求26所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该抗体疗法选自：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、阿仑单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳妥珠单抗；阿波单抗、玛帕图木单抗、来沙木单抗、西他土珠单抗、替加珠单抗、卡妥索单抗、布李纳图木单抗、替伊莫单抗屈昔坦、托西莫单抗、布伦土昔单抗威多廷、吉妥珠单抗奥佐米星、克利维妥珠单抗四昔坦、佩姆图木单抗、曲妥珠单抗埃姆坦西尼、贝伐单抗、伊瑞西珠、伏洛昔单抗、雷姆齐鲁单抗、阿柏西普。
32.如权利要求28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自：抗有丝***药、环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、沙利度胺、沙利度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体而直接靶向Treg的耗减或杀伤抗体，抗CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体定向毒素、地尼白介素(Ontak)-一种人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的一种融合物、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径的药剂、胞外核苷酸酶抑制剂、或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式维甲酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、西地那非、ROS抑制剂以及硝基阿司匹林。
33.如权利要求28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该免疫刺激性抗体选自：靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一种或多种的拮抗性抗体，和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一种或多种的激动性抗体。
34.如权利要求28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗，这些外源性癌症疫苗包括用于对一种肿瘤抗原发起一种免疫原性应答的蛋白或肽，编码肿瘤抗原的重组病毒和细菌载体，编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗，被靶向至树突细胞的蛋白，基于树突细胞的疫苗，全肿瘤细胞疫苗，表达GM-CSF、ICOS和/或Flt3-配体的经基因修饰的肿瘤细胞，溶瘤病毒疫苗。
35.如权利要求28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该细胞因子疗法选自以下细胞因子中的一种或多种，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNα-2b、IFNβ、IFNγ，以及它们针对递送的不同策略。
36.如权利要求28所述的免疫分子、抗体、抗体结合片段、组合物或用途，其中该过继细胞转移疗法在离体治疗之后实施，该离体治疗选自患者自体的天然存在的肿瘤特异性T细胞的扩增或T细胞的遗传修饰以赋予针对肿瘤抗原的特异性。
37.如以上权利要求中任一项所述的抗体或免疫分子或如以上权利要求中任一项所述的药物组合物的用途，以在一名受试者中进行以下项中的一种或多种以治疗一种疾病：(a)使细胞因子上调，(b)使T细胞增殖和/或扩增提高，(c)使出自T细胞的干扰素-γ的产生增加(d)使IL-2分泌增加(e)刺激抗体应答；(f)对癌细胞生长进行抑制，(g)促进抗原特异性T细胞免疫，(g)促进CD4+和/或CD8+T细胞激活，(i)对T细胞抑制进行缓解，(j)对癌细胞的凋亡或裂解进行缓解，(k)对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制效应。
38.一种用于在一名受试者中对一种疾病进行诊断的诊断方法，其中该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症或自身免疫性疾病，其中该诊断方法是离体进行的，包括使来自该受试者的一种组织样品与如以上权利要求中任一项所述的免疫分子或抗体进行离体接触，并且对与其特异性的结合进行检测。
39.一种用于在一名受试者中对一种疾病进行诊断的诊断方法，其中该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病，其中该诊断方法是在体内进行的，包括向该受试者给予如以上权利要求中任一项所述的免疫分子或抗体，并且对如以上权利要求中任一项所述的免疫分子或抗体与该受试者的一种组织的特异性结合进行检测。
40.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中如权利要求38或39所述的诊断方法是在向该受试者给予该免疫分子或抗体或药物组合物之前进行的。
41.如以上权利要求中任一项所述的用途，进一步包括在向该受试者给予该免疫分子或抗体或药物组合物之前，确定该受试者的一种组织中的LSR水平。
42.如权利要求41所述的用途，其中仅当所述LSR水平足够时，进行所述的向该受试者给予该免疫分子或抗体或药物组合物。
43.如权利要求42所述的用途，进一步包括根据所述LSR的表达水平确定所述LSR水平。
44.如权利要求43所述的用途，其中所述的确定所述表达水平包括对该受试者的一种组织应用一种IHC(免疫组织化学)测定或一种基因表达测定。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述的应用所述IHC测定包括确定在一种0至3的级别体系上一种表达水平是否至少是1。
46.如权利要求42-45中任一项所述的用途，其中所述组织包括癌细胞或免疫渗液。
47.如权利要求42-46中任一项所述的用途，其中所述在所述组织中确定所述LSR水平包括使该组织与如以上权利要求中任一项所述的抗体或免疫分子接触，并且对与其特异性的结合进行检测。
48.一种用于在一种取自一名受试者的组织样品中对一种疾病进行诊断的测定，包括如以上权利要求中任一项所述的免疫分子或抗体，以及用于对一种疾病进行诊断的至少一种试剂，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病。
49.以上权利要求中任一项用于以下项的用途或如权利要求48所述的测定用于以下项的用途：筛选一种疾病，检测一种疾病的存在或严重性，提供一种疾病的预后，监测疾病的进展或复发，连同对一种疾病、失调或病症的疗效和/或复发的评估，连同为一种疾病选择一种疗法和/或一种治疗，一种给定的疾病疗法的优化，监测一种疾病的治疗，和/或预测一种针对特定患者或亚群的疗法的适合性或确定一种治疗产品在患者或亚群中的适当配量。
50.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中所述癌症、所述渗入肿瘤的免疫细胞、或两者均表达一种足够水平的LSR，并且其中所述癌症选自下组，该组由以下各项组成：乳腺癌、***、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、***癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、骨髓性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、皮肤的良性瘤、角化棘皮瘤、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、滤泡树突细胞癌、肠癌、肌肉浸润性癌、精囊肿瘤、表皮癌、脾癌、膀胱癌、头颈癌、胃癌、肝癌、骨癌、脑癌、视网膜癌、胆道癌、小肠癌、唾液腺癌、子宫癌、睾丸癌、***癌、***肥大、脊髓发育不良、瓦尔登斯特巨球蛋白血症、鼻咽癌、神经内分泌癌、骨髓增生异常综合征、间皮瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、良性肿瘤、食管癌、输卵管癌、腹膜癌、***状浆液性勒氏癌、恶性腹水、胃肠道间质瘤(GIST)、李弗劳明综合征以及希佩尔-林道综合征(VHL)；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
51.如权利要求50所述的用途，其中所述癌症选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、乳腺小叶癌、乳腺粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化至低分化型腺癌、升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、结肠浸润性腺癌、直肠腺癌、直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、肺中分化至低分化型鳞状细胞癌、肺中高分化型角化型鳞状细胞癌、肺大细胞腺癌、***腺癌格利森分级7至9级、***浸润性腺癌、***中分化型腺癌、卵巢浆液性***状囊性癌、卵巢浆液性囊腺癌、4级星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、以及低级别肝细胞癌；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
52.如权利要求50所述的用途，其中所述乳腺癌选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述乳腺癌是硬腺癌。
54.如权利要求50所述的用途，其中所述结肠癌选自下组，该组由以下各项组成：盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌、优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、以及直肠中分化型粘液腺癌。
55.如权利要求50所述的用途，其中所述肺癌选自下组，该组由以下各项组成：高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌、优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌以及小细胞肺癌。
56.如权利要求50所述的用途，其中所述***癌选自下组，该组由以下各项组成：腺癌格利森分级5-9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、以及未分化癌。
57.如权利要求50所述的用途，其中所述胃癌是中分化型胃腺癌。
58.如权利要求50所述的用途，其中所述卵巢癌选自下组，该组由以下各项组成：浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、以及浸润性浆液性***状癌。
59.如权利要求50所述的用途，其中所述脑癌选自下组，该组由以下各项组成：多形性成胶质细胞瘤以及除星形细胞瘤2级以外的星形细胞瘤。
60.如权利要求59所述的用途，其中所述星形细胞瘤是4级星形细胞瘤。
61.如权利要求50所述的用途，其中所述肾癌是透明细胞性肾细胞癌。
62.如权利要求50所述的用途，其中肝癌是肝细胞癌。
63.如权利要求62所述的用途，其中所述肝细胞癌是低级别肝细胞癌或纤维板层型肝细胞癌。
64.如权利要求50所述的用途，其中所述血液癌选自下组，该组由以下各项组成：大细胞淋巴瘤以及高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤。
65.如权利要求22-49中任一项所述的用途、方法或测定，其中所述疾病是免疫病症，并且其中所述免疫病症选自下组，该组由以下各项组成：自身免疫性疾病、移植排斥、以及移植物抗宿主疾病。
66.如权利要求65所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自下组，该组由以下各项组成：其中该自身免疫性疾病选自下组，该组由以下各项组成：多发性硬化症，银屑病；类风湿性关节炎；银屑病关节炎，***性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞脉管炎，血小板减少性紫癜，自发性血小板减少，自发性自身免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生失调，修格兰氏综合征，风湿性疾病，***疾病，炎症性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿关节炎，痛风性关节炎，肌肉性风湿病，慢性多关节炎，冷球蛋白血症性脉管炎，ANCA-关联性脉管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征，慢性免疫多神经病，自身免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森病，膜性肾小球性肾病，古德帕斯丘病，自身免疫性胃炎，自身免疫性萎缩性胃炎，恶性贫血，天疱疮，寻常型天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多肌炎，纤维肌炎，肌硬化，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，过敏性紫癜，埃文斯综合征，异位性皮炎，银屑病，关节病性银屑病，格雷夫斯氏病，格雷夫斯氏眼病，硬皮病，***性硬皮病，进行性***性硬皮病，哮喘，过敏症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自身免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病，显微镜下多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克病，儿童自身免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自身免疫性血细胞减少，在获得性A型血友病中阻止自身免疫性抗VIII因子抗体的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵人综合征，牙龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及炎性皮肤失调，正常补体血症性荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，贝凯特综合征，PAPA综合征，布劳综合征，痛风，成年和少年斯蒂尔氏病，冷吡呤病，穆克勒-威尔斯综合征，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多***炎性疾病，家族性地中海热，慢性小儿神经***、皮肤和关节综合征，***性幼年自发性关节炎，超IgD综合征，施尼茨勒综合征，自身免疫性视网膜病，年龄相关性黄斑变性，动脉硬化，慢性***炎以及TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPS)。
67.如权利要求65所述的用途，其中将该治疗与另一种用于治疗免疫相关病症的部分相联合。
68.如权利要求22-49中任一项所述的用途、方法或测定，其中所述疾病是感染性疾病，并且其中所述感染性疾病选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染和/或其他寄生物感染所导致的疾病。
69.如权利要求68所述的用途、方法或测定，其中该感染性疾病选自乙型肝炎、丙型肝炎、感染性单核细胞增多症、EBV、巨细胞病毒、AIDS、HIV-1、HIV-2、结核病、疟疾以及血吸虫病。
70.如权利要求68所述的用途、方法或测定，其中将该治疗与另一种用于治疗感染性疾病的部分相联合。
71.特异性结合至SEQ ID NO:10的一种抗体或一种片段对患有一种疾病的一名受试者进行治疗或诊断的用途，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、硬腺癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌、优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌、优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、小细胞肺癌、腺癌格利森分级5至9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、未分化癌、中分化型胃癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、浸润性浆液性***状癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、星形细胞瘤4级、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、低级别肝细胞癌、纤维板层型肝细胞癌、大细胞淋巴瘤、以及高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
72.一种药物组合物，包括特异性结合至SEQ ID NO:10的一种抗体或一种片段，以对患有一种疾病的一名受试者进行治疗，该疾病选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、硬腺癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化、中分化和低分化型腺癌、管状腺癌、优选升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、优选直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌、优选中分化型鳞状细胞癌、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、小细胞肺癌、腺癌格利森分级5至9级、浸润性腺癌、高级别***上皮内瘤变、未分化癌、中分化型胃癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、浸润性浆液性***状癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、星形细胞瘤4级、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、低级别肝细胞癌、纤维板层型肝细胞癌、大细胞淋巴瘤、以及高级别和低级别非何杰金氏淋巴瘤；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
73.如权利要求71或72所述的用途或组合物，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：导管腺癌、浸润性导管癌、乳腺小叶癌、乳腺粘液腺癌、导管内和浸润性导管癌、盲肠中分化至低分化型腺癌、结肠高分化至低分化型腺癌、升结肠2级管状腺癌、结肠腺癌Duke分期C1、浸润性腺癌、直肠腺癌、直肠3级腺癌、直肠中分化型腺癌、直肠中分化型粘液腺癌、高分化至低分化型非小细胞癌、鳞状细胞癌：中分化型、中分化至低分化型鳞状细胞癌、中高分化型角化型鳞状细胞癌、大细胞腺癌、腺癌格利森分级7至9级、浸润性腺癌、中分化型腺癌、浆液性***状囊性癌、浆液性囊腺癌、4级星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、透明细胞性肾细胞癌、肝细胞癌、以及低级别肝细胞癌；附带条件是如果该癌症是卵巢癌，它不是卵巢颗粒细胞瘤，以及附带条件是如果该癌症是脑癌，它不是星形细胞瘤2级。
74.如权利要求71-73中任一项所述的用途或组合物，其中将该治疗与另一种用于治疗癌症的治疗剂或疗法相联合。
75.如权利要求74所述的用途或组合物，其中该疗法包括放射疗法、冷冻疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术、激素剥夺或使用常规药物的联合疗法中的一种或多种。
76.如权利要求74所述的用途或组合物，其中该治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、小分子、化学治疗剂、细胞毒性和细胞抑制剂、免疫调节剂、干扰素、白细胞介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、以及蛋白酶体抑制剂。
77.如权利要求71-76中任一项所述的用途或组合物，与一种或多种增效剂联合、同时或依次对一名受试者进行给药以获得一种治疗效果，其中所述一种或多种增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的常规/经典抗癌疗法、使抗肿瘤免疫应答增效的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、过继细胞转移。
78.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该常规/经典抗癌剂选自：铂基化合物、具有抗癌活性的抗生素、蒽环类、蒽二酮、烷化剂、抗代谢物、抗有丝***剂、紫杉烷、紫杉烷类二萜、微管抑制剂、长春花碱、叶酸拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、抗***、抗雄激素、芳香酶抑制剂、GnRh类似物、5α-还原酶抑制剂、二膦酸盐。
79.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该靶向疗法药剂选自下组，该组由以下各项组成：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、mTOR途径抑制剂、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、PI3K抑制剂、蛋白激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、细胞内信号转导的抑制剂、Ras/Raf信号转导的抑制剂、MEK抑制剂、AKT抑制剂、存活信号转导蛋白的抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、治疗性单克隆抗体、TRAIL途径激动剂、抗血管生成剂、金属蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂、免疫轭合物、抗体药物轭合物、抗体片段、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
80.如权利要求75所述的用途或组合物，其中该抗体选自：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、阿仑单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳妥珠单抗、阿波单抗、玛帕图木单抗、来沙木单抗、西他土珠单抗、替加珠单抗、卡妥索单抗、布李纳图木单抗、替伊莫单抗屈昔坦、托西莫单抗、布伦土昔单抗威多廷、吉妥珠单抗奥佐米星、克利维妥珠单抗四昔坦、佩姆图木单抗、曲妥珠单抗埃姆坦西尼、贝伐单抗、伊瑞西珠、伏洛昔单抗、雷姆齐鲁单抗、阿柏西普。
81.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自：抗有丝***药、环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、沙利度胺、沙利度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体而直接靶向Treg的耗减或杀伤抗体，抗CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体定向毒素、地尼白介素(Ontak)-一种人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的一种融合物、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径的药剂、胞外核苷酸酶抑制剂、或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式维甲酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、西地那非、ROS抑制剂以及硝基阿司匹林。
82.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该免疫刺激性抗体选自：靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一种或多种的拮抗性抗体，和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一种或多种的激动性抗体。
83.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗，这些外源性癌症疫苗包括用于对一种肿瘤抗原发起一种免疫原性应答的蛋白或肽，编码肿瘤抗原的重组病毒或细菌载体，编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗，被靶向至基于树突细胞的疫苗的蛋白，全肿瘤细胞疫苗，表达GM-CSF、ICOS和/或Flt3-配体的经基因修饰的肿瘤细胞，溶瘤病毒疫苗。
84.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该细胞因子疗法选自以下细胞因子中的一种或多种，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNα-2b、IFNβ、IFNγ，以及它们针对递送的不同策略。
85.如权利要求77所述的用途或组合物，其中该过继细胞转移疗法在离体治疗之后实施，该离体治疗选自患者自体的天然存在的肿瘤特异性T细胞的扩增或T细胞的遗传修饰以赋予针对肿瘤抗原的特异性。
86.一种用于确定是否将如权利要求71-85中任一项所述的用途或组合物的给予进行实施的诊断方法，包括根据如权利要求38-49中任一项所述的方法或用途实施该诊断方法。
87.如以上权利要求中任一项所述的用途或组合物，其中该癌症是非转移性的。
88.如以上权利要求中任一项所述的用途或组合物，其中该癌症是浸润性的。
89.如以上权利要求中任一项所述的用途或组合物，其中该癌症是转移性的。
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