JP2022523929A - ヒトｌａｇ－３に結合する抗体、その製造方法および用途 - Google Patents

ヒトｌａｇ－３に結合する抗体、その製造方法および用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＬＡＧ－３に特異的に結合しうる抗体又はその抗原結合断片を提供し、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、混合リンパ球反応を亢進させる生体活性を備え、癌免疫療法に適用可能な薬物の製造に有用である。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体工学の分野に属し、より具体的には、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体、その製造方法および用途に関する。
様々なタイプに分けられる悪性腫瘍は、人々の生命を脅かし、発症率も日増しに増加している。しかしながら、通常の臨床処置として手術治療、化学療法および放射線療法は、悪性腫瘍に対して一定の治療効果を示す傍らで患者の体に対して損害が大きく、中毒性副作用をもたらすのが一般的である。現段階の分子標的薬であるモノクロ－ナル抗体（例えば、ＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブ）および低分子キナ－ゼ阻害剤（例えば、一部のチロシンキナ－ゼを標的とするイマチニブ）は、腫瘍治療において期待以上の臨床効果を示すものの、特定の分子標的を発現する腫瘍のみに対して有効であり且つ治療可能な癌の種類が限られ、客観的な反応率が低く且つ耐薬性の問題が頻発し、腫瘍が再発したり、更に悪化したりする問題を抱えている。腫瘍免疫療法は、免疫学的原理と方法を利用して免疫活性を亢進させて腫瘍に対する免疫寛容状態を変えることにより、腫瘍抗原に対する免疫細胞の識別能を強化し、同時に腫瘍細胞に対する体の抗腫瘍免疫応答を誘起、増強して腫瘍細胞を抑制または殺傷し、最終的には腫瘍治療の目的を達成する療法である。近年、腫瘍免疫療法が腫瘍治療分野の焦点として注目を浴び、並びに画期的な進展を成し遂げている。例えば、プログラム細胞死受容体１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １、以下では「ＰＤ－１」とも称する）は癌免疫療法において最も注目される分子標的であり、ＰＤ－１を分子標的とする免疫チェックポイント阻害薬としてニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）およびペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）などのモノクロ－ナル抗体類薬物がメラノーマ、非小細胞肺がんなどの腫瘍の臨床治療において優れた抗腫瘍活性を示すため、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって臨床での使用許可が得られている。腫瘍免疫療法は、その優れた治療効果や革新性から２０１３年にＳｃｉｅｎｃｅ誌によって該年度の最も重要な科学的進歩と評され、手術治療、化学療法、放射線療法や分子標的治療に続く腫瘍治療分野の技術革新として期待されつつある。
Ｔ細胞は免疫系において重要な役割を果たすが、Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞が有害な外来抗原を消化してＴ細胞によって識別しうる抗原形態に変えることに依存する。Ｔ細胞および抗原提示細胞は、上記の活性化プロセスに関与する調節タンパク質を発現し、これらの調節タンパク質は、Ｔ細胞の受容体を仲介とするシグナル伝達を調節する機能を備える。これらの補助性受容体は２種類に分けられ、そのうちの一類は活性化シグナルを伝達する共刺激性受容体であり、別の一類は阻害シグナルを伝達する共抑制性受容体であり、現在、これらの抑制性分子は免疫チェックポイントの受容体およびリガンドと称されている。上記のＰＤ－１は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーに属し、典型的な免疫チェックポイントの受容体であり、その重要なリガンドとしてはプログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、以下では「ＰＤ－Ｌ１」とも称される）が挙げられる。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合は、Ｔ細胞を活性化させる共抑制シグナルを伝達することでＴ細胞の活性化および増殖を下方調節する。なお、陳列平らの研究によって初めてＰＤ－Ｌ１が腫瘍組織において高発現し、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を調節する役割を果たすことが解明されている。現在、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を分子標的とする免疫調節療法は、臨床現場の抗腫瘍治療において既に大きな成功を収めている。
リンパ球活性化遺伝子３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３、以下では「ＬＡＧ－３」とも称する）は、主に活性化したＴリンパ球において発現し、ＰＤ－１に類似する免疫負調節因子である。ＬＡＧ－３は、ＭＨＣ－ＩＩファミリーを主な結合リガンドとし、ＣＤ４分子と競合してＭＨＣ－ＩＩリガンドに高い結合力で結合することにより、細胞内部へ阻害シグナルを伝達し、ＰＤ－１に類似した分子機構を利用して細胞の活性化、増殖および動的バランスを下方調節し、かつＴ細胞の免疫寛容状態の維持にも寄与し、若しくは持続的に活性化状態にあるＴ細胞を疲弊状態に落とさせて内部環境を安定化させ、負の免疫制御に関与することで腫瘍の発生と進展に緊密に関わっている。そのため、ＬＡＧ－３関連の経路を遮断しうる抗体が免疫反応を亢進させ、ＰＤ－１抗体と併用するときの相乗的活性化効果が顕著であることが研究により解明され、抗ＬＡＧ－３抗体（以下、「ＬＡＧ－３抗体」とも称する）が癌の免疫治療において潜在力が大きいと考えられている。
ＬＡＧ－３を分子標的とするモノクロ－ナル抗体類薬物の開発は、多くが初期段階にあり、その先頭に立つのがＢＭＳ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）等といった国際的な大手製薬企業であり、中でもＢＭＳ社のＬＡＧ－３モノクロ－ナル抗体であるＢＭＳ－９８６０１６が第Ｉ相試験の段階にあり、この治験ではＰＤ－１抗体であるニボルマブと併用する際の安全性と有効性に対する確認がその主な研究目的になっており、かかる臨床研究からＢＭＳ－９８６０１６とニボルマブの併用がメラノーマの臨床治療において治療効果が良好であることが確認できた。なお、ＬＡＧ－３抗体は、自己免疫疾患の治療にも有用であることが実証され、自己免疫疾患を対象とするときの作用機序として抗体依存性細胞介在性の細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下では「ＡＤＣＣ」とも略称する）を利用して活性化したＴ細胞を殺傷し、免疫反応を抑制することが挙げられ、よって、自己免疫疾患を治療する目的を達成する。一方、ＬＡＧ－３を分子標的とし、特異性や有効性に優れた新規薬物に対する需要が依然として大きく、より多くの薬品が開発されて臨床免疫療法への実用化に期待されている。
上記の課題を解決するため、本発明者が抗原免疫からハイブリドーマの選別、抗体の発現と精製、生体活性評価に至るまで鋭意検討を重ねた結果、ヒトＬＡＧ－３に特異的に結合するマウス由来の１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体を選出し、さらに、マウス由来抗体に基づいてキメラ抗体１３４－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ、５Ｅ７－Ｃｈｉｍｅｒｉｃおよびヒト化抗体１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓ、５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４を構築することに至った。マウス由来の１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体は、斬新なエピトープを利用してヒトＬＡＧ－３に結合し、かつ細胞レベルでの実験からは、そのヒト化抗体である１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓ、５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４がＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞の結合を効率よく遮断し且つＳＥＡによって刺激されるＰＢＭＣのＩＬ－２分泌を増強することのできることが実証できた。したがって、本発明のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、癌免疫療法に適用可能な薬物の製造に有用であると認められる。
以上に鑑み、本発明の第１側面では、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明の第２側面では、もう１種のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明の第３側面では、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を提供する。
本発明の第４側面では、前記ヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを提供する。
本発明の第５側面では、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。
本発明の第６側面では、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。
本発明の第７側面では、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を含んでなる薬物組成物を提供する。
本発明の第８側面では、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片または前記薬物組成物の用途を提供する。
上記の目的を達成するため、本発明は、以下の技術案により構成される。
本発明の第１側面では、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、ヒトＬＡＧ－３における前記抗体又はその抗原結合断片の結合エピトープは、配列番号５０で表されるアミノ酸配列ＡＡＡＰＧＨＰＬＡを含む。
本発明の一好適な実施形態において、ヒトＬＡＧ－３における前記抗体又はその抗原結合断片の結合エピトープは、配列番号４８で表されるアミノ酸配列ＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡ、または配列番号４９で表されるアミノ酸配列ＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳを有する。
本発明の第２側面では、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、かかる抗体又は抗原結合断片は、
ａ）重鎖相補性決定領域として配列番号９で表されるＨＣＤＲ１、配列番号１０で表されるＨＣＤＲ２および配列番号１１で表されるＨＣＤＲ３と、軽鎖相補性決定領域として配列番号１２で表されるＬＣＤＲ１、配列番号１３で表されるＬＣＤＲ２および配列番号１４又は配列番号４３で表されるＬＣＤＲ３とを有し、又は
ｂ）重鎖相補性決定領域として配列番号１５で表されるＨＣＤＲ１、配列番号１６で表されるＨＣＤＲ２および配列番号１７で表されるＨＣＤＲ３と、軽鎖相補性決定領域として配列番号１８で表されるＬＣＤＲ１、配列番号１９で表されるＬＣＤＲ２および配列番号２０で表されるＬＣＤＲ３とを有する。
本発明によれば、前記抗体は、モノクロ－ナル抗体またはポリクロ－ナル抗体であり、好ましくは、モノクロ－ナル抗体である。
本発明によれば、前記抗体としてはマウス由来の抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体などであり、好ましくは、ヒト化抗体である。
本発明によれば、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片などからなる群より選ばれる少なくとも１種である。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有し、
ａ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、又は
ｂ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表され、又は
ｃ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２４で表され、又は
ｄ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２６で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８で表される。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を有し、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ２重鎖定常領域、ＩｇＧ３重鎖定常領域及びＩｇＧ４重鎖定常領域からなる群より選ばれ、前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域およびλ軽鎖定常領域からなる群より選ばれる。好ましくは、前記重鎖定常領域としてはＩｇＧ４重鎖定常領域であり、前記軽鎖定常領域としてはκ軽鎖定常領域である。より好ましくは、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号３０で表され、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号３４で表される。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖を有し、
ａ）前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号３２で表され、前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３６で表され、又は
ｂ）前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号３８で表され、前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号４０で表される。
本発明の第３側面では、ヌクレオチド配列を提供し、前記ヌクレオチド配列は、上記何れかのヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号１で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
ｂ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号５で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号７で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
ｃ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号２１で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２３で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
ｄ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号２５で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２７で表されるヌクレオチド配列を含む。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、重鎖定常領域をコードし且つ配列番号２９で表されるヌクレオチド配列、および配列番号３３で表される軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）重鎖をコードし且つ配列番号３１で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖をコードし且つ配列番号３５で表されるヌクレオチド配列を有し、又は
ｂ）重鎖をコードし且つ配列番号３７で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖をコードし且つ配列番号３９で表されるヌクレオチド配列を有する。
本発明の第４側面では、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、上記何れかのヌクレオチド配列を含む。
本発明の第５側面では、ホスト細胞を提供し、前記ホスト細胞は、前記発現ベクターを含む。
本発明の第６側面では、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供し、かかる製造方法は、発現条件下で前記ホスト細胞を培養することにより、前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、ステップａで発現した前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップｂと、を含む。
本発明の第７側面では、薬物組成物を提供し、前記薬物組成物は、上記何れかのヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体と含んでなる。
本発明の一好適な実施形態において、前記薬物組成物は、さらにＰＤ－１阻害剤を含む。好ましくは、前記ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
本発明の第８側面では、上記何れかのヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片または上記薬物組成物の、癌を治療するための薬物の製造における用途を提供する。
本発明によれば、前記癌は、メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、古典的ホジキンリンパ腫、尿路上皮がん、大腸がんおよび肝臓がんからなる群より選ばれる任意の１種である。
本発明に係るヒトＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、斬新なエピトープを利用してヒトＬＡＧ－３に結合し、かつ混合リンパ球反応を効果的に亢進させる生物活性を備えるため、癌免疫療法に適用可能な薬物の製造に用いることができ、臨床への実用化が有望である。
混合リンパ球反応に対するマウス由来のヒトＬＡＧ－３抗体の影響を示す図であり、そのうち図１Ａは、１次スクリーニングの結果を示し、図１Ｂは、２次スクリーニングの結果を示す。 ヒトＬＡＧ－３抗体としてヒト化抗体とキメラ抗体の相対結合性を比較するときの結果を示す図である。 ＰＢＭＣのＩＬ－２分泌に対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の増強効果を示す図であり、そのうち図３Ａおよび図３Ｂに示すＰＢＭＣは、異なるドナーから得られたものである。 細胞表面に局在するＬＡＧ－３に対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の結合特性を示す図である。 ヒトＬＡＧ－３抗体の結合エピトープを示す概略図である。 Ｒａｊｉ細胞とＬＡＧ－３の結合に対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の阻害作用を示す図である。 ＦＧＬ１とＬＡＧ－３の結合に対するヒトＬＡＧ－３抗体の阻害作用についてフローサイトメトリーを用いて測定するときの結果を示す図である。 遺伝子改変マウスＭＣ３８の移植腫瘍モデルに対するヒトＬＡＧ－３抗体の阻害効果を示す図である。
本発明において「ＬＡＧ－３」とは、リンパ球活性化遺伝子３（以下、「ＣＤ２２３」とも称する）を指す。
本発明において、「抗体（Ａｂ）」及び「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）」とは、構造特徴が同じである約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）で構成される。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンにおいて同型重鎖の間のジスルフィド結合数が異なる。各重鎖および軽鎖は規則的な間隔で鎖内ジスルフィド結合を有し、各重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）を有し、可変領域に続いて３つの構造ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる定常領域を有する。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）を有し、他端に１つの構造ドメインＣＬからなる定常領域を有する。軽鎖の定常領域と重鎖の第１定常領域が対向し、かつ軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が対向して構成される。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接に関与せず、例えば抗体依存性細胞介在性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するなど、他の生体機能を示す。重鎖の定常領域としてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域が挙げられ、軽鎖の定常領域としてはκまたはλ定常領域が挙げられる。
本発明の抗体としては、モノクロ－ナル抗体、ポリクロ－ナル抗体および少なくとも２種類の抗体からなる多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）などを含む。
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均一な群から得られる抗体を指し、すなわち極一部が自然変異を形成する以外、該群に含まれる単一抗体が同じであることを意味する。モノクローナル抗体は、１つの抗原サイトを高い特異性で認識して結合する。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基を認識しうる複数の抗体を含む）と異なり、各モノクローナル抗体は抗原における単一決定基を認識して結合する。こうした特異性に加え、モノクローナル抗体の優勢としてはハイブリドーマを培養することにより得られ、他の免疫グロブリンによって汚染されないことが挙げられる。なお、本発明において「モノクローナル」とは抗体の特性を指すものであり、すなわちほぼ均一な抗体群から得られ、何らの特別な方法で製造されるものと解釈してはいけない。
本発明において、「抗原結合断片」とは、抗原（例えば、ヒトＬＡＧ－３）に特異的に結合しうる抗体の断片を指す。本発明の抗原結合断片としはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片などが挙げられる。Ｆａｂ断片は、抗体をパパインで消化して得られ、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで消化して得られる。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が非共有結合を介して緊密に連結されたダイマーで形成される
本発明において、「Ｆｃフラグメント」とは、抗体をパパインで消化して２つの完全に一致するＦａｂフラグメントおよび１つのＦｃフラグメントにし、そのうちＦｃフラグメントとは結晶性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ，Ｆｃ）であり、抗体のＣＨ２とＣＨ３構造ドメインで構成される。Ｆｃフラグメントは、抗原への結合活性を示さず、抗体とそのエフェクター分子または細胞が相互作用する部位である。
本発明において、「可変」とは、抗体可変領域の一部に配列差異があり、特定抗原に対する各抗体の結合性や特異性を決定する構成である。可変度としては、抗体可変領域全体に渡って均一に分布するわけでなく、軽鎖および重鎖の可変領域における相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのフラグメントに集中して存在する。可変領域において保存性が比較的高い部分がフレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）であり、天然重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ４つのＦＲ領域を含む。これらのＦＲ領域はβ－折り畳み構造を形成し、接続リングを構成する３つのＣＤＲによって互いに連結され、若しくは場合によって部分的なβ－折り畳み構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して緊密に隣接し、かつ他鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合サイトを形成する［Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、第Ｉ巻第６４７～６６９頁（１９９１）］。
本発明の抗体としては、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。
本発明において「マウス由来抗体」とは、ラット由来抗体又はモウス由来抗体を指し、中でもマウス由来抗体が好ましい。本発明のマウス由来抗体は、ヒトＬＡＧ－３の細細胞外領域を抗原としてマウスを免疫し、さらにハイブリドーマ細胞をスクリーニングして得られる。好ましくは、本発明のマウス由来抗体としては１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体である。
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種に由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列と、別の種に由来の定常領域配列とからなる抗体を指し、例えばヒト定常領域と連結したマウス重鎖および軽鎖の可変領域を有する抗体が挙げられる。好ましくは、本発明のキメラ抗体としては、マウス由来１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列をそれぞれヒト定常領域と繋ぐことで得られる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体の重鎖は、マウス由来１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体の重鎖可変領域配列をそれぞれヒトのＩｇＧ４重鎖定常領域と繋ぐことで得られ、軽鎖は、マウス由来１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体の軽鎖可変領域配列をそれぞれヒトのカッパ（Ｋａｐｐａ）軽鎖定常領域と繋ぐことにより得ることができる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体としては１３４－Ｃｈｉｍｅｒｉｃおよび５Ｅ７－Ｃｈｉｍｅｒｉｃが挙げられる。
本発明において「ヒト化抗体」とは、ＣＤＲがヒト以外の動物（例えば、マウス）抗体に由来し、それ以外のフレームワーク領域や定常領域部分がヒト抗体に由来するものを指す。なお、結合性を維持する目的からフレームワーク領域の残基を変更することも可能である。好ましくは、本発明のヒト化抗体としてはマウス由来１３４号および２－３４号（すなわち、５Ｅ７）抗体のＣＤＲ領域とヒト抗体の非ＣＤＲ領域を組合わせ、さらに、埋め込み残基、ＣＤＲ領域に直接作用する残基、並びに１３４号および２－３４（すなわち、５Ｅ７）号抗体のＶＬおよびＶＨ構造に影響を与える残基に対して復帰変異を導入することで得られる。より好ましくは、本発明のヒト化抗体としては１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４を含む。
本発明において「エピトープ」および「ヒトＬＡＧ－３エピトープ」とは、ヒトＬＡＧ－３に位置し且つ抗体に特異的に結合する領域を指す。好ましくは、本発明のヒトＬＡＧ－３エピトープは、ヒトＬＡＧ－３の細細胞外領域に位置し、前記ヒトＬＡＧ－３の細細胞外領域は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のヒトＬＡＧ－３エピトープは、配列番号５０で表されるアミノ酸配列ＡＡＡＰＧＨＰＬＡを含む。より好ましくは、本発明のヒトＬＡＧ－３エピトープは、配列番号４８で表されるアミノ酸配列ＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡ、または配列番号４９で表されるアミノ酸配列ＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳを含む。
本発明において「ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体」または「ヒトＬＡＧ－３抗体」とは、ヒトＬＡＧ－３エピトープに特異的に結合する的抗体を指す。また、「特異的結合」とは、抗体が１×１０－７Ｍ未満、好ましくは１×１０－８Ｍ未満、より好ましくは１×１０－９Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満の解離定数（以下、「ＫＤ」とも称する）で結合することを意味する。本発明において、「ＫＤ」とは、特定の抗体と抗原が相互作用する際の解離定数であり、抗体と抗原の結合力を指すものである。解離定数が低いほど抗体と抗原の結合が強く、すなわち抗体と抗原の結合力が高くなる。例えば、使用表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）を利用し、ＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いて抗体与抗原の結合力を測定することができ、またはＥＬＩＳＡ法を利用して抗体と抗原が結合する際の相対結合力を測定することができる。
本発明において、発現ベクターについては特に制限がなく、例えばｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇ系、ｐＣＧＳ３系、ｐＣＤＮＡ系発現ベクターなど、並びに他の哺乳動物発現系に用いるベクターを使用することができ、発現ベクターには適切な転写調節配列や翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列が含まれる。
本発明に適用可能なホスト細胞としては、上記発現ベクターを発現しうる細胞が挙げられ、例えば哺乳類動物や昆虫ホスト細胞培養系の真核細胞を利用して本発明の融合タンパク質を発現することができ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫ及びこれらに由来の変性細胞などを本発明に利用可能である。
本発明において「薬物組成物」とは、本発明のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とで構成される薬物製剤を指し、本発明に係る薬物組成物は、安定な治療効果を確保すると同時に本発明のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸コア配列の構造完全性を維持することができ、さらに、タンパク質の多官能基を分解（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）から免れるようにすることができる。
以下、実施例や実験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例や実験例に制限されない。以下においてベクターやプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子をベクターやプラスミドに導入する方法、プラスミドをホスト細胞に導入する方法など、従来周知の操作については説明を省略することがある。これらの操作は当業者が熟知し、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどの出版物に詳細な説明がある。
実施例１：ヒトＬＡＧ－３タンパク質および抗ＬＡＧ－３陽性対照抗体の調製
ヒトＬＡＧ－３細胞外ドメインのアミノ酸配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１８６２７に登録され、アミノ酸配列が配列番号４１で表され、上海生工バイオテック社に委託してコドン最適化を行い、遺伝子を合成した。そして、合成された遺伝子断片をｐＵＣ５７ベクターに導入し、プライマーを設計してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりＬＡＧ－３細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）のコーディング領域（配列番号４１）及びヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃフラグメントのコーディング領域（配列番号５１）を増幅した。上記増幅された断片を回収し、組換えＰＣＲ法により上記断片を一体に繋ぎ、同時にシグナルペプチドとして配列番号４２で表されるＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡのコーディング領域を付け、その両端に更に対応する制限酵素サイトを追加した。制限酵素を用いてｐＴＴ５発現ベクター（ＮＲＣ生命工学研究機構製）および上記組換えＰＣＲ断片を分解し、分解産物を精製してからＤＮＡリガーゼで繋ぎ、大腸菌ＴＯＰ１０の受容株に導入してＬＢ培地プレート（＋Ａｍｐ）に播種して一晩培養した。シングルクロニーを拾って引続き拡大培養し、培養物からプラスミドを抽出し、制限酵素でプラスミドを分解することにより遺伝子断片の挿入があるかどうかを確認した。適切な陽性クローンを選出して配列測定を行い、配列が完全に正しいと確認できるところで当該クローンを増幅してプラスミドを抽出した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて上記ＬＡＧ－３発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞（ＮＲＣ生命工学研究機構製）に導入して発現させ、５日後に細胞培養液から上澄みを回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製して得られたタンパク質をＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈＦｃと命名し、マウス免疫および後のスクリーニングに備えた。化学成分が限定されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞を培養し、紫外分光光度法を利用してタンパク質を定量した。
陽性対照物であるＬＡＧ－３モノクロ－ナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、米国特許出願公開公報ＵＳ２０１４００９３５１１Ａ１に記載の配列番号１２および１４であり、上海生工バイオテック社に委託してコドン最適化を行い、遺伝子を合成した。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号２９で表され、アミノ酸配列が配列番号３０で表される）及びヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号３３で表され、アミノ酸配列が配列番号３４所示）と繋ぎ、さらに、配列番号４２で表されるシグナルペプチド配列を付けて完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を構築し、そして上述と同様の方法で重鎖および軽鎖の遺伝子をそれぞれｐＴＴ５発現ベクターに導入した。上述と同様の方法で重鎖および軽鎖の遺伝子を含むｐＴＴ５発現ベクターを組み合せ、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に導入して発現させ、５日後に細胞培養液から上澄みを回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて抗体を精製して得られた抗体をＬＡＧ３．５抗体と命名した。化学成分が限定されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞を培養し、紫外分光光度法を利用してタンパク質を定量した。
実施例２：ヒトＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈＦｃ抗原によるマウス免疫及びハイブリドーマの調製とスクリーニング
実施例１で得られたＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈＦｃを生理塩水で適切な濃度に希釈し、同量の完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社製）と混ぜ合わせて超音波で乳化させた後、４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック社製、動物製造認定証ＳＣＸＫ（滬）２０１３－００１８）に皮下多箇所にわたって注射した。３週間後、ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈＦｃを生理塩水で希釈し、同量の不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社製）と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化させた後、マウスに皮下多箇所にわたって注射し、２週間後にはかような処理を繰り返して行った。３回の免疫が終わってから７日目にマウスから少量の血液サンプルを取って血清を分離し、通常のＥＬＩＳＡ法で血清抗体価を測定した。血清抗体価が１００００を超えるマウスを選出し、７日後に各マウスに抗原タンパク質１０μｇを尾静脈経由で注射した。
静脈経由で抗原タンパク質を注射してから３日目に一定数のマウスを選んで処分し、解剖して脾臓を摘出、粉砕して脾細胞を回収し、細胞数を計測してハイブリドーマの調製に備えた。骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（中国科学院細胞バンクにより入手）をリガンドとし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータを用いて培養し、培地としてはＲＰＭＩ－１６４０完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０基本培地に１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加し、試薬はいずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製であった）を使用した。融合前日に培地を１回交換して細胞が良好な生長状態になるようにし、電気融合法を利用してハイブリドーマ細胞を調製した。電気融合およびハイブリドーマスクリーニングは、以下のように行った。つまり、脾臓細胞とＳｐ２／０細胞を２：１の割合で混ぜ合わせ、遠心した後に上澄みを捨て、細胞融合緩衝液（ＢＴＸ社製）で細胞を３回洗い流した。集めた細胞塊を１×１０７／ｍＬの密度で融合緩衝液に懸濁し、融合チャンバーに細胞懸濁液を２ｍＬ加えて電気融合装置ＥＣＭ２００１（ＢＴＸ社製）に設置し、ＡＣ６０Ｖ，３０秒～ＤＣ１７００Ｖ，４０微秒×３回、ＡＣ６０Ｖ，３秒の条件下で電気刺激を行った。そして、処理済みの細胞を予め３７℃に加温したＲＰＭＩ－１６４０完全培地に移し、室温、１時間静置してから細胞を１ウェル当たり１×１０４細胞、１００μＬずつ９６ウェルプレートに播種した。翌日、各ウェルに２×ＨＡＴ（５０×ＨＡＴはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製であり、使用時に培地で適切に希釈する）を含むＲＰＭＩ－１６４０完全培地を１００μＬ補充し、４日目および７日目に古い培地を１×ＨＡＴを含むＲＰＭＩ－１６４０完全培地に交換し、融合してから９日目にサンプルを取ってＥＬＩＳＡ法で検出し、陽性クローンを確認した。
陽性クローン（すなわち、ＬＡＧ－３抗体を分泌しうるクローン）の検出は、ＥＬＩＳＡ法を利用して以下のように行われた。つまり、ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈＦｃ抗原を用いて１ウェル当たり１００ｎｇの被覆量でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、室温、２時間インキュベートした後にＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。各ウェルに１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ溶液を２００μＬ加え、室温、１時間インキュベートすることによりブロッキング処理を行い、処理後にＰＢＳＴで洗浄し、プレートを軽く叩いて残液が残らないようにしてから冷蔵庫に静置して次の処理に備えた。検出は、以下のようにして行われた。つまり、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにハイブリドーマ培養液の上澄みを１００μＬずつ加えて１時間程度インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴでＨＲＰ標識のヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を適宜希釈してウェルに加え、室温、１時間程度インキュベートしてからＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルにＴＭＢを基質とする着色液を１００μＬ加え、そして２ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、即時にプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）で波長４５０ｎｍの吸光量ＯＤ４５０値を測定し、得られたデータに基づき陽性クローンを確定した。
スクリーニングによって得られた陽性クローンがモノクローナルでなく、若しくはクローン株が安定でないため、適時にサブクローニングを実施することでモノクローナル株を得ることが行われる。サブクローニングは、限界希釈法により行われ、具体的には以下の通りであった。陽性クローンと確定できたハイブリドーマ細胞を懸濁させ、具体的には、細胞をＨＴ培地（ＨＴ培地とは、ＲＰＭＩ－１６４０完全培地で１００×ＨＴ溶液を必要とされる濃度に希釈したものを指し、そのうち１００×ＨＴはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製であった）で１０個細胞または２０個細胞／ｍＬの濃度に希釈し、１ウェル当たりに０．２ｍＬの量で９６ウェルプレートに播種し、各ウェルにおけるハイブリドーマ細胞を平均２個または４個となるようにした。ＣＯ２インキュベータにおいて７～１０日間培養し、肉眼で確認可能なクローンが現われると、倒立顕微鏡で観察しながらシングルクローンが生えたウェルを標記し、かかるウェルから上澄みを取って上述と同様にしてＥＬＩＳＡ法で検出を行った。ＥＬＩＳＡ法によって陽性だと確認できたウェルからクローン株を拾って２４ウェルプレートで拡大培養し、限界希釈法を利用してサブクローニングをもう１回実施し、こうした操作から少なくとも２４個のクローン株を得た。ＥＬＩＳＡ法によって検出を行い、１００％陽性だと確認できた時点で目的抗体を安定に発現するモノクローナル株が得られ、これらのモノクローナル株を拡大培養し、冷凍保存した。
安定発現のモノクローナル株をＨｙｂｒｉＧＲＯ ＳＦ無血清培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）において５～７日程度かけて拡大培養し、培養物から上澄みを集めて遠心、濾過して沈降物を取り除き、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてマウス由来抗体を精製した。かような融合とスクリーニングを数回実施することにより、本発明では安定発現のモノクローナルハイブリドーマを約２００株得られ、さらに、これらのモノクローナル株からマウス由来抗体を精製して次の実験に備えた。
実施例３：混合リンパ球反応に対するマウス由来のヒトＬＡＧ－３抗体の影響
本実施例では、混合リンパ球反応（以下、「ＭＬＲ」とも称する）に対する影響を評価することでマウス由来ヒトＬＡＧ－３抗体の活性を確認し、このとき、市販の抗ＬＡＧ３．５抗体を陽性対照物とした。
ＭＬＲ実験は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてヒト血液から末梢血単核球（以下、「ＰＢＭＣ」とも称する）を分離し、そして接着法を利用してＰＢＭＣのサブポピュレーションを分離し、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦを併用することで単核球を樹状細胞に分化誘導し（ｐ３８ ＭＡＰＫ－ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４Ｊｕｎ ２４；５：４２２９． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ５２２９．）、７日後に接着細胞を消化して上述の樹状細胞を回収した。別のドナーの血液からも上述と同様にしてＰＢＭＣを分離し、そしてＭＡＣＳ磁気カラムおよびＣＤ４マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。上記樹状細胞（１０４個／ウェル）とＣＤ４陽性Ｔ細胞（１０５個／ウェル）を１０：１の割合で均一に混ぜ合わせ、９６ウェルプレートの各ウェルに１５０μＬずつ播種した。２時間後、ＡＩＭ－Ｖ培地で希釈したマウス由来ＬＡＧ－３抗体を９６ウェルプレートに５０μＬ加え、同時に抗ＬＡＧ３．５抗体およびＬＡＧ－３に結合しない同型抗体を加えてそれぞれ陽性対照、空白対照とした。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータに静置して３～４日間インキュベートし、適量の上澄みを取ってサンドイッチＥＬＩＳＡ法によってＩＬ－２分泌量を測定した（試薬は、何れもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製であった）。多機能プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を利用して波長４５０ｎｍの吸光量ＯＤ４５０値を測定し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成した。本実施例では、ＡＩＭ－Ｖ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて細胞培養を行った。
実験結果は図１Ａ～図１Ｂに示され、スクリーニングを２回実施することによりＭＬＲのＩＬ－２分泌を顕著に亢進させる２つのマウス由来ヒトＬＡＧ－３抗体が得られ、それぞれ１３４号および２－３４（すなわち、５Ｅ７）号抗体とした。
実施例４：マウス由来ヒトＬＡＧ－３抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列の測定
実施例３の通りスクリーニングを行った結果、モノクロ－ナル抗体として１３４号および５Ｅ７号抗体を候補として選出し、配列測定を行った。ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて１３４号および５Ｅ７号抗体に対応するハイブリドーマ株からトータルＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法によって文献（Ｒｏｌａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら編集、抗体工学第１巻のＰ３２３に記載されたプライマーペア）に記載されたプライマーペアを用いてマウス由来のヒトＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域遺伝子を増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＭＤ１８－Ｔベクターに導入し、配列測定を行って可変領域の遺伝子配列を解析した。
１３４号抗体の配列情報として重鎖可変領域の遺伝子は、配列全長が３６０ｂｐであり、１２０個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号１で表され、アミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域の遺伝子は、配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号３で表され、アミノ酸配列が配列番号４で表される。
１３４号抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＶＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＫＱＳＲＧＫＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２）であった。
１３４号抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＥＲＶＳＬＴＣＲＡＳＱＤＩＧＳＲＬＮＷＬＱＱＧＰＤＧＳＩＫＲＬＩＹＡＴＳＳＬＥＳＧＶＰＫＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＦＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＦＶＤＹＹＣＬＱＣＧＳＳＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４）であった。
５Ｅ７号抗体の配列情報として重鎖可変領域の遺伝子は、配列全長が３４８ｂｐであり、１１６個のアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド配列が配列番号５で表され、アミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域の遺伝子は、配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号７で表され、アミノ酸配列が配列番号８で表される。
５Ｅ７号抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＤＹＭＡＷＦＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＨＧＧＤＹＩＹＹＡＤＮＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＩＹＦＣＳＲＤＲＲＳＩＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号６）であった。
５Ｅ７号抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＩＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＤＧＴＩＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＤＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＲＫ（配列番号８）であった。
実施例５：マウス由来ヒトＬＡＧ－３抗体のヒト化
実施例４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に則って１３４号抗体および５Ｅ７号抗体の重鎖および軽鎖の３つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をそれぞれ確定した。
そのうち、１３４号抗体の重鎖相補性決定領域としてＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＡＹＹＭＮ（配列番号９）であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶ（配列番号１１）であり、軽鎖相補性決定領域としてＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＲＡＳＱＤＩＧＳＲＬＮ（配列番号１２）であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＡＴＳＳＬＥＳ（配列番号１３）であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＬＱＣＧＳＳＰＰＴ（配列番号１４）であった。
また、５Ｅ７号抗体の重鎖相補性決定領域としてＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＤＤＹＭＡ（配列番号１５）であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＩＳＨＧＧＤＹＩＹＹＡＤＮＬＫＧ（配列番号１６）であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＤＲＲＳＩＤＹ（配列番号１７）であり、軽鎖相補性決定領域としてＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳ（配列番号１８）であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号１９）であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＱＱＧＫＴＬＰＹＴ（配列番号２０）であった。
１３４号抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列については、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒト免疫グロブリンの可変領域の生殖系（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）配列と相同性対比を行い、１３４号抗体と相同性が最も高いＩＧＨＶ１－４６＊０１を重鎖可変領域のヒト化テンプレートとし、マウス由来１３４号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１－４６＊０１の関連ＣＤＲに置き換えることにより重鎖ＣＤＲ移植可変領域を構築した。同時に、相同性対比を行ってＩＧＫＶ１－３９＊０１生殖系配列を軽鎖可変領域のヒト化テンプレートとし、マウス由来１３４号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１－３９＊０１の関連ＣＤＲに置き換えることにより軽鎖ＣＤＲ移植可変領域を構築した。そして、重鎖および軽鎖ＣＤＲ移植可変領域に基づき、フレームワーク領域における一部のアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。このとき、復帰変異とはＣＤＲ移植可変領域のフレームワーク領域における一部のアミノ酸残基（抗体の構造や結合性に比較的重要なアミノ酸残基）をマウスフレームワーク領域における対応位置のアミノ酸残基に変更することを意味する。復帰変異に際してアミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、各アミノ酸の位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。本発明では、重鎖ＣＤＲ移植可変領域のＫＡＢＡＴナンバリング第４４位ＧをＳ、第４８位ＭをＩ、第６７位ＶをＡ、第６９位ＭをＬ、第７１位ＲをＶ、第７３位ＴをＫ、第７８位ＶをＡに復帰変異することが好ましく、また、軽鎖ＣＤＲ移植可変領域のＫＡＢＡＴナンバリング第３６位ＹをＬ、第４３位ＡをＳ、第４４位ＰをＩ、第４６位ＬをＲ、第６６位ＧをＲ、第６９位ＴをＳ、第７１位ＦをＹに復帰変異することが好ましい。配列番号１４で表される１３４号抗体の軽鎖ＣＤＲ３に、ＫＡＢＡＴナンバリング第９１位においてシステイン残基が１個余っており、該システイン残基に起因して抗体構造に異変が起こる恐れがあるため、該システイン残基をセリン残基に変えた（配列番号４３のＣ９１Ｓ）。上記復帰変異を携える重鎖および軽鎖ＣＤＲ移植可変領域の末端に、それぞれ配列番号４４で表されるアミノ酸配列ＷＧＱＧＴＫＶＥＩＫおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫを付けることにより、完全なヒト化重鎖および軽鎖可変領域を構築し、かかる遺伝子配列を上海生工バイオテック社に委託してコドン最適化を行い、遺伝子を合成した。
得られた１３４ヒト化重鎖可変領域（１３４－Ｈｕ－ＶＨ）は、遺伝子配列全長が３５４ｂｐであり、１１８個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号２１で表され、アミノ酸配列が配列番号２２で表され、１３４ヒト化軽鎖可変領域（１３４－Ｈｕ－ＶＬ－Ｃ９１Ｓ）は、遺伝子配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号２３で表され、アミノ酸配列が配列番号２４で表される。
１３４ヒト化重鎖可変領域（１３４－Ｈｕ－ＶＨ）のアミノ酸配列は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２で表され、そのうち下線が引かれた部分は重鎖相補性決定領域である）であった。
１３４ヒト化軽鎖可変領域（１３４－Ｈｕ－ＶＬ－Ｃ９１Ｓ）のアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＳＲＬＮＷＬＱＱＫＰＧＫＳＩＫＲＬＩＹＡＴＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＧＳＳＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２４で表され、そのうち下線が引かれた部分は軽鎖相補性決定領域である）であった。
上記と同様に、５Ｅ７号抗体についてもヒト化処理を行った。５Ｅ７号抗体と相同性が最も高いＩＧＨＶ３－２１＊０１を重鎖可変領域のヒト化テンプレートとし、マウス由来５Ｅ７号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ３－２１＊０１の関連ＣＤＲに置き換えることにより、重鎖ＣＤＲ移植可変領域を構築した。同様に、相同性対比を行ってＩＧＫＶ１－３３＊０１生殖系配列を軽鎖可変領域のヒト化テンプレートとし、マウス由来５Ｅ７号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１－３３＊０１の関連ＣＤＲに置き換えることにより軽鎖ＣＤＲ移植可変領域を構築した。そして、重鎖および軽鎖ＣＤＲ移植可変領域に基づき、フレームワーク領域における一部のアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。復帰変異に際してアミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、各アミノ酸の位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。本発明では、重鎖ＣＤＲ移植可変領域のＫＡＢＡＴナンバリング第３７位ＶをＦ、第４４位ＧをＲ、第４９位ＳをＡ、第９１位ＹをＦ、第９３位ＡをＳに復帰変異することが好ましく、また、軽鎖ＣＤＲ移植可変領域のＫＡＢＡＴナンバリング第４３位ＡをＴ、第４４位ＰをＩ、第７１位ＦをＹ、第８７位ＹをＦに復帰変異することが好ましい。上記復帰変異を携えた重鎖および軽鎖ＣＤＲ移植可変領域の末端に、それぞれ配列番号４４で表されるアミノ酸配列ＷＧＱＧＴＫＶＥＩＫおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫを付けることにより、完全なヒト化重鎖和軽鎖可変領域を構築し、かかる遺伝子配列を上海生工バイオテック社に委託してコドン最適化を行い、遺伝子を合成した。
得られた５Ｅ７ヒト化重鎖可変領域（５Ｅ７－Ｈｕ－ＶＨ）は、遺伝子配列全長が３５４ｂｐであり、１１８個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号２５で表され、アミノ酸配列が配列番号２６で表され、また、５Ｅ７ヒト化軽鎖可変領域（５Ｅ７－Ｈｕ－ＶＬ）は、遺伝子配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号２７で表され、アミノ酸配列が配列番号２８で表される。
５Ｅ７ヒト化重鎖可変領域（５Ｅ７－Ｈｕ－ＶＨ）のアミノ酸配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＤＹＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＨＧＧＤＹＩＹＹＡＤＮＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＳＲＤＲＲＳＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２６で表され、そのうち下線が引かれた部分は重鎖相補性決定領域である）であった。
５Ｅ７ヒト化軽鎖可変領域（５Ｅ７－Ｈｕ－ＶＬ）のアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＴＩＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２８で表され、そのうち下線が引かれた部分は軽鎖相補性決定領域であり）であった。
上述の１３４ヒト化重鎖可変領域を、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号２９で表され、アミノ酸配列が配列番号３０で表される）と繋ぐことにより完全な１３４ヒト化重鎖を構築し、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－ＨＣ（ヌクレオチド配列が配列番号３１で表され、アミノ酸配列が配列番号３２所示）と名付け、上述の１３４ヒト化軽鎖可変領域を、ヒト免疫グロブリンＫａｐｐａ鎖の定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号３３で表され、アミノ酸配列が配列番号３４で表される）と繋ぐことにより完全な１３４ヒト化軽鎖を構築し、１３４－Ｈｕ－ＬＣ－Ｃ９１Ｓ（ヌクレオチド配列が配列番号３５で表され、アミノ酸配列が配列番号３６で表される）と名付けた。
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の定常領域のアミノ酸配列は、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号３０）であった。
１３４ヒト化重鎖１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－ＨＣのアミノ酸配列は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号３２で表され、そのうち下線が引かれた部分は重鎖相補性決定領域である）であった。
ヒト免疫グロブリンＫａｐｐａ鎖の定常領域のアミノ酸配列は、ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３４）であった。
１３４ヒト化軽鎖１３４－Ｈｕ－ＬＣ－Ｃ９１Ｓのアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＳＲＬＮＷＬＱＱＫＰＧＫＳＩＫＲＬＩＹＡＴＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＧＳＳＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６で表され、そのうち下線が引かれた部分は軽鎖相補性決定領域である）であった。
上述の５Ｅ７ヒト化重鎖可変領域を、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号２９で表され、アミノ酸配列が配列番号３０で表される）と繋ぐことにより完全な５Ｅ７ヒト化重鎖を構築し、５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４－ＨＣ（ヌクレオチド配列が配列番号３７で表され、アミノ酸配列が配列番号３８で表される）と名付け、また、５Ｅ７ヒト化軽鎖可変領域を、ヒト免疫グロブリンＫａｐｐａ鎖の定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号３３で表され、アミノ酸配列が配列番号３４で表される）と繋ぐことにより完全な５Ｅ７ヒト化軽鎖を構築し、５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣ（ヌクレオチド配列が配列番号３９で表され、アミノ酸配列が配列番号４０で表される）と名付けた。
５Ｅ７ヒト化重鎖５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４－ＨＣのアミノ酸配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＤＹＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＨＧＧＤＹＩＹＹＡＤＮＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＳＲＤＲＲＳＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号３８で表され、そのうち下線が引かれた部分は重鎖相補性決定領域である）であった。
５Ｅ７ヒト化軽鎖５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣのアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＴＩＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４０で表され、そのうち下線が引かれた部分は軽鎖相補性決定領域である）であった。
上記１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－ＨＣ及び１３４－Ｈｕ－ＬＣ－Ｃ９１Ｓ遺伝子を、それぞれｐＴＴ５発現ベクターに導入し、構築済みの２つの発現ベクターをＰＥＩ法でＨＥＫ２９３Ｅ細胞に導入して一過的に発現させた。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３無血清発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で培養し、５日後に遠心して細胞培養液から上澄みを回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製して得られた抗体を１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓと名付けた。同じくして５Ｅ７ヒト化重鎖和軽鎖の発現ベクターを構築し、発現、精製して得られた抗体を５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４と名付けた。
なお、マウス由来１３４号抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、組換えＰＣＲ法を利用してそれぞれヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の重鎖定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号２９で表され、アミノ酸配列が配列番号３０で表される）およびカッパ（Ｋａｐｐａ）軽鎖の定常領域（ヌクレオチド配列が配列番号３３で表され、アミノ酸配列が配列番号３４で表される）と繋いでｐＴＴ５発現ベクターに導入し、上述と同様にして発現、精製し、得られたキメラ抗体を１３４－Ｃｈｉｍｅｒｉｃと名付けた。また、上述と同様にして５Ｅ７抗体のキメラ抗体として５Ｅ７－Ｃｈｉｍｅｒｉｃが得られた。
ＥＬＩＳＡ法を利用し、抗体と抗原の結合力に対するヒト化改良の影響を検討した。具体的には、ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－Ｈｉｓ（Ｈｉｓタグ付きのＬＡＧ－３細胞外ドメイン、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用い、１ウェル当たり１０ｎｇの量でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、室温、２時間インキュベートしてからＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で洗い流した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ溶液をブロッキング液とし、２００μＬを取って各ウェルに加えてブロッキング処理を行い、ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレート洗い流した後に軽く叩いて残液を取り除いた。ブロッキング液で段階的に希釈したヒトＬＡＧ－３抗体をＥＬＩＳＡプレートに加え、室温、１時間程度インキュベートした後にＥＬＩＳＡプレートを洗い流し、ブロッキング液で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｆｃ特異的なもの、Ｓｉｇｍａ社製）、室温で約１時間インキュベートしてからＥＬＩＳＡプレートを洗い流した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにＴＭＢを基質とする着色液１００μＬを加え、そして２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて波長４５０ｎｍの吸光量ＯＤ４５０値を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析図を作成し、ＥＣ５０を算出した。
図２に示すように、ＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓ、５Ｅ７－Ｃｈｉｍｅｒｉｃおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４は、何れもＬＡＧ－３に効果的に結合することができ、ＥＣ５０がそれぞれ２７．６３ｎｇ／ｍＬ、８．６８５ｎｇ／ｍＬ、８．７８２ｎｇ／ｍＬ、９．７４１ｎｇ／ｍＬおよび９．０７８ｎｇ／ｍＬであった。また、ヒト化抗体とそれに対応するキメラ抗体は、ＥＣ５０がほぼ一致し、ヒト化改良によって抗体と抗原の結合が変わらないのが実証され、このとき、同種対照物としてはＬＡＧ－３に結合しないＩｇＧ４抗体を用いた。
実施例６：ＰＢＭＣのＩＬ－２分泌に対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の増強効果
ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ）は、１種のスーパー抗原毒素であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＭＨＣ－ＩＩクラス分子およびＴ細胞表面に局在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と交差反応を起こすことにより、Ｔ細胞クローンを大量に亢進させて免疫反応を激化する作用がある。Ｔ細胞が活性化されるとＬＡＧ－３を発現し、ＬＡＧ－３は、ＡＰＣ表面のＭＨＣ－ＩＩクラス分子に結合して免疫阻害効果を示す。本実施例では、ＳＥＡでＰＢＭＣを刺激した後にヒトＬＡＧ－３抗体を加え、そしてＩＬ－２の分泌を検出することによりヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の機能活性を評価した。
具体的には、ヒスチジンタグ付きのＳＥＡ遺伝子をｐＥＴ２８ａベクターに導入し、大腸菌発現系でタンパク質を発現させ、ニッケルカラムでＳＥＡを精製した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いてヒト血液からＰＢＭＣを分離し、ＰＢＳで洗浄してから遠心し、そして１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で細胞を再懸濁させ、配列番号５２で表される自家製のＳＥＡを加えて終濃度が１ｎｇ／ｍＬとなるようにした。９６ウェルプレートにＰＢＭＣを１５０μＬずつ、１ウェル当たり２×１０５個細胞の量で播種し、各ウェルに更に段階的に希釈した抗ヒトＬＡＧ－３抗体を５０μＬ加えた。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータに静置して２日間インキュベートした後、培養液から適量の上澄みを取ってサンドイッチＥＬＩＳＡ法、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の検出キットを用いてＩＬ－２分泌量を検出し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）でＯＤ４５０値を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析図を作成した。
図３Ａおよび３Ｂに示すＰＢＭＣは、それぞれ異なるドナーから得られたものであった。ＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４が何れもＳＥＡ刺激によるＰＢＭＣのＩＬ－２分泌を亢進させ、図３Ａに示す実験ではＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４のＥＣ５０がそれぞれ９８．０９ｎｇ／ｍＬ、５０．７１ｎｇ／ｍＬおよび７８．１２ｎｇ／ｍＬであり、図３Ｂに示す実験ではこれらの抗体のＥＣ５０がそれぞれ１６．２１ｎｇ／ｍＬ、１０．８５ｎｇ／ｍＬおよび３．０６８ｎｇ／ｍＬであることが確認できた。また、２回に渡って実施された実験からは、ＰＢＭＣを刺激してＩＬ－２分泌を亢進させる活性からして１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４がＬＡＧ３．５抗体を上回ることが確認でき、このとき、同種対照物としてはＬＡＧ－３に結合しないＩｇＧ４抗体を用いた。
実施例７：細胞表面ＬＡＧ－３に対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の結合活性
ＳＥＡスーパー抗原毒素はＰＢＭＣに含まれるＴ細胞を活性化させ、活性化されたＴ細胞はＬＡＧ－３を発現することが既に知られている。そこで、本実施例ではフローサイトメトリーを用い、細胞表面ＬＡＧ－３に対する本発明のヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の結合活性を測定した。
具体的には、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いてヒト血液からＰＢＭＣを分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心して細胞を集めて回収した。１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で細胞を再懸濁させ、ＳＥＡを加えて終濃度が１ｎｇ／ｍＬとなるようにし、そして９６ウェルプレートにＰＢＭＣを１ウェル当たり２×１０５個細胞の量で播種した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータに静置して２日間インキュベートした後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、遠心して上澄みを捨てた。ビオチンＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（商品番号＆規格Ｈ１７５９－１００ＭＧ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いてメーカー提供のマニュアルに従って抗体をビオチン化し、段階的に希釈したビオチン標識のヒトＬＡＧ－３抗体を加えて約１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い流し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで適宜希釈したＰＥ標識ストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて更に約１時間インキュベートし、そしてＰＢＳで細胞を２回洗い流した。４％のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて細胞のＰＥ蛍光強度を検出し、フローサイトメーター専用の解析ソフトで実験データを処理して平均蛍光強度を算出し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析図を作成し、ＥＣ５０を算出した。
実験結果は図４に示され、ＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４が何れも細胞表面に局在するＬＡＧ－３に効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ７１．６８ｎｇ／ｍＬ、８０．４５ｎｇ／ｍＬおよび５３．１３ｎｇ／ｍＬであり、３者がほぼ同等レベルの結合活性を示すのが確認できた。このとき、同種対照物としてはＬＡＧ－３に結合しないＩｇＧ４抗体を用い、縦座標は平均蛍光強度を示す。
実施例８：ヒトＬＡＧ－３抗体のエピトープ解析
ＬＡＧ－３細胞外ドメインにおける第１免疫グロブリン様の構造は、外部へ露出する「ｅｘｔｒａ ｌｏｏｐ」を含む、そのアミノ酸配列はＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹ（配列番号４６）であり、該ペプチド部分がＬＡＧ－３とＭＨＣ－ＩＩクラス分子の結合に大きく寄与することが既に解明されている（Ｂａｉｘｅｒａｓ Ｅ，Ｈｕａｒｄ Ｂ，Ｍｉｏｓｓｅｃ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３－ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ ｎｅｗ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９２，１７６（２）：３２７－３３７）。本発明の抗ヒトＬＡＧ－３抗体と該ペプチドの結合特性を検証し、かつ各抗体の結合エピトープを確定するため、以下の通りにしてペプチドマッピング実験を実施した。具体的には、化学合成法を利用して一連の部分的に重なるペプチド断片を合成し、これらのペプチド断片は、「ｅｘｔｒａ ｌｏｏｐ」領域を完全に覆い且つそのＮ末端にそれぞれビオチン標識が付けられた。ストレプトアビジンを１ウェル当たり２００ｎｇの量でＥＬＩＳＡプレートに加えて被覆を行い、被覆が終わるとＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ブロッキング液として１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ溶液でブロッキングした。ビオチン化のペプチド断片をブロッキング液で１μｇ／ｍＬに希釈してからＥＬＩＳＡプレートに加え、室温、１時間インキュベートすることによりビオチン化のペプチド断片をストレプトアビジンで捕捉した。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、更にブロッキング液で段階的に希釈したヒトＬＡＧ－３抗体を加え、室温、約１時間インキュベートしてからＥＬＩＳＡプレートを洗い流した。ヒトＬＡＧ－３抗体とペプチド断片の結合強度を検出するに当たって、ブロッキング液で適宜希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｆｃ特異的なもの、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて室温、約１時間インキュベートした後、各ウェルにＴＭＢを基質とする着色液を１００μＬ加え、そして２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いてＯＤ４５０値を測定した。得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析図を作成し、ＥＣ５０を算出した。
ペプチドマッピング実験の結果は、下記表１に纏めて示す。
Figure 2022523929000001
Figure 2022523929000002
表１に示す実験結果から、ＬＡＧ３．５抗体のエピトープが配列番号４７で表されるＰＨＰＡＡＰＳＳＷであり、１３４号抗体のエピトープが配列番号４８で表されるＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡであり、かつ５Ｅ７号抗体のエピトープが配列番号４９で表されるＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳであることが確認できた。図５は、これらの結果を概略的に示す図である。
実施例９：Ｒａｊｉ細胞へのＬＡＧ－３結合に対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の阻害作用
Ｒａｊｉ細胞は、Ｂリンパ球に由来する１種のバーキットリンパ腫細胞であり、ＭＨＣ－ＩＩクラス分子を高発現する。本実施例ではフローサイトメトリーを用い、Ｒａｊｉ細胞表面に局在するＭＨＣ－ＩＩクラス分子とＬＡＧ－３の結合に対する本発明のヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体の阻害作用を測定した。
具体的には、Ｒａｊｉ細胞株（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）により入手、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８６ＴＭ（商標））をＰＢＳで２回洗い流し、丸底の９６ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０５個細胞の量で播種し、遠心して上澄みを捨てた。一方、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いてビオチン化ＬＡＧ－３（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を０．５μｇ／ｍＬに希釈し、同時に上記１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でヒトＬＡＧ－３抗体を段階的に希釈し、ビオチン化ＬＡＧ－３とヒトＬＡＧ－３抗体を含む混合溶液を調製して上記丸底の９６ウェルプレートに加えて室温、約１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い流した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで適宜希釈したＰＥ標識のストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて約１時間インキュベートし、反応が終わると細胞をＰＢＳで２回洗い流した。４％のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて細胞から発したＰＥ蛍光強度を測定し、測定が終わるとフローサイトメトリー専用の解析ソフトで実験データ処理し、平均蛍光強度を算出した。得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析図を作成し、ＥＣ５０を算出した。
実験結果は図６に示され、ＬＡＧ３．５抗体および１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓが何れもＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞の結合を効率よく遮断でき、ＩＣ５０がそれぞれ２５６．９ｎｇ／ｍＬおよび２８８．８ｎｇ／ｍＬであり、両者がほぼ同じ阻害特性を示すことが実証された。また、ＬＡＧ３．５抗体および１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓの場合と異なり、５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４は、高濃度の場合に限ってＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞の結合を部分的に遮断し、低濃度では逆にＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞の結合を促すことが確認できた。このとき、同種対照物としてはヒトＬＡＧ－３に結合しないＩｇＧ４抗体を用い、ＬＡＧ－３非存在下におけるＲａｊｉ細胞のバック蛍光値を陰性対照とした。
実施例１０：Ｂｉａｃｏｒｅ法による結合性評価
本実施例では、分子間相互作用解析装置としてＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４とＬＡＧ－３の結合性を評価した。
ＨＢＳ－ＥＰ＋溶液（ｐＨ７．４）を希釈液とし、ＬＡＧ－３抗体試料を濃度０．５μｇ／ｍＬに希釈し、組換えＬＡＧ－３（商品番号１６４９８－Ｈ０８Ｈ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を１．０２４ｎＭ、２．５６ｎＭ、６．４ｎＭ、１６ｎＭ、４０ｎＭおよび１００ｎＭに希釈し、同時に組換えＬＡＧ－３を含まない零濃度の試料も用意した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置においてＰｒｏｔｅｉｎ ＡチップでＬＡＧ－３抗体を捕捉し、そしてカラムに組換えＬＡＧ－３を注入することにより結合・解離グラフを取得し、カラム再生には６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液を用いた。得られたデータをＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ専用のＩｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトで解析し、結果を下記表２に纏めて示す。
Figure 2022523929000003

表２に示すように、ＬＡＧ－３に対するＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４の解離定数（ＫＤ）がそれぞれ５．６８Ｅ－１０Ｍ、４．７８Ｅ－１０Ｍおよび４．１７Ｅ－１２Ｍであり、ＬＡＧ－３に対する結合力からして１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４がＬＡＧ３．５抗体を上回ることが確認でき、そのうち５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）が最も小さく、解離定数（ＫＤ）も最も小さいことから、そのＬＡＧ－３に対する結合力が最も高いと認められた。
実施例１１：ＦＧＬ１とＬＡＧ－３の相互作用に対するヒトＬＡＧ－３抗体の阻害効果評価
陳列平らは、フィブリノゲン様タンパク質１（以下、「ＦＧＬ１」とも称する）がＬＡＧ－３の主なリガンドであり、かかる腫瘍阻害経路の基本的な作用機序を解明した（Ｗａｎｇ Ｊ，Ｓａｎｍａｍｅｄ Ｍ Ｆ，Ｄａｔａｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ＬＡＧ－３．Ｃｅｌｌ，２０１９，１７６（１－２）：３３４－３４７．ｅ１２．）。本実施例ではフローサイトメトリーを用い、ＦＧＬ１とＬＡＧ－３の相互作用に対するＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４の阻害効果を評価した。
組換えヒトＦＧＬ１タンパク質を、以下の通りにして調製した。具体的には、ヒトＦＧＬ１配列としてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ（Ｅｎｔｒｙ：Ｑ０８８３０）に登録されており、アミノ酸配列がＬＥＤＣＡＱＥＱＭＲＬＲＡＱＶＲＬＬＥＴＲＶＫＱＱＱＶＫＩＫＱＬＬＱＥＮＥＶＱＦＬＤＫＧＤＥＮＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ（配列番号５３）であり、上海生工バイオテック社に委託して上記アミノ酸配列をコードする遺伝子を合成した。組換えＰＣＲを利用してＦＧＬ１の遺伝子とヒト人ＩｇＧ１のＦｃフラグメント遺伝子を一体に繋ぎ、そして該Ｆｃ標識付きの遺伝子を哺乳動物発現ベクターに挿入し、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に導入して一括的に発現させた。発現開始から５日後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて培養液の上澄みから組換えタンパク質を精製し、紫外分光光度法を利用してタンパク質の濃度を測定し、得られたタンパク質をＦＧＬ１－ｈＦｃと命名した。ＦＧＬ１－ｈＦｃについては、さらに、以下の通りにしてビオチン標識を付けた。具体的には、無水ＤＭＳＯを用いてビオチンＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（商品番号Ｈ１７５９－１００ＭＧ、Ｓｉｇｍａ社製）を１００ｍＭの母液に調製し、かつＦＧＬ１－ｈＦｃの分子量および濃度に基づいて物質量と濃度を計算した上で適量のビオチンＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル溶液とＦＧＬ１－ｈＦｃを物質量２０：１の割合で均一に混ぜ合わせ、室温、１時間インキュベートした。試料を透析した後に紫外分光光度法を利用してタンパク質の濃度を測定し、得られたビオチン化タンパク質をＢｉｏｔｉｎ－ＦＧＬ１－ｈＦｃと命名した。
また、ヒトＬＡＧ－３を安定に発現するＣＨＯ－Ｓ細胞株は、以下の通りにして構築した。具体的には、ＣＨＯ－Ｓ細胞としてはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のものを使い、ヒトＬＡＧ－３の全長遺伝子をｐＣＨＯ１．０発現ベクターに挿入した後、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を利用して該発現ベクターをＣＨＯ－Ｓ細胞に導入した。そして、培地にメトトレキサートとピューロマイシンを加えてスクリーニングを行い、限界希釈法を利用してシングルクローンを分離してヒトＬＡＧ－３を安定に発現するＣＨＯ－Ｓ株を取得し、この細胞株をＣＨＯ－Ｓ－ＬＡＧ－３と命名した。
ＦＧＬ１とＬＡＧ－３の相互作用に対する抗体の阻害特性については、フローサイトメトリーを利用して以下の通り評価した。
丸底フタ付きの９６ウェルプレートに、ＣＨＯ－Ｓ－ＬＡＧ－３細胞を１ウェル当たり２０万個細胞の量で播種し、３００ｇ、５分間遠心してからピペットで上澄みを吸い取って捨て、各ウェルに１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液を２００μＬ加えて細胞を再懸濁させ、３００ｇで遠心してから上澄みを取り除いた。そして、段階的に希釈したＬＡＧ－３抗体と濃度が２μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ－ＦＧＬ１－ｈＦｃを加えて室温、１時間インキュベートした後、３００ｇで遠心して上澄みを取り除き、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を２回洗い流し、洗い流す度に３００ｇで遠心して上澄みを取り除いた。そして、各ウェルに１％のＢＳＡを含むＰＢＳで１：２０００の比例で希釈したＰＥ標識のストレプトアビジンを１ウェル当たり２００μＬ加え、室温、０．５時間インキュベートした。３００ｇで遠心して上澄みを取り除き、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を２回洗い流し、最後に２００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させた。フローサイトメトリーを用いて細胞が蒔かれている各ウェルのＰＥチャンネルにおける蛍光強度を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析図を作成し、ＩＣ５０を算出した。
図７に示すように、ＦＧＬ１とＬＡＧ－３の相互作用を阻害するに当たってＬＡＧ３．５抗体、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４のＩＣ５０がそれぞれ７８５．６ｎｇ／ｍＬ、９７．５７ｎｇ／ｍＬおよび９７．７１ｎｇ／ｍＬであり、かかる阻害活性からして１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓおよび５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４がＬＡＧ３．５抗体を上回ることが実証された。
実施例１２：遺伝子改変マウスＭＣ３８の移植腫瘍モデルに対するヒト化ＬＡＧ－３抗体の阻害効果
動物実験は、以下の通りにして行われた。つまり、ヒトＬＡＧ－３遺伝子改変マウス（遺伝的背景品系：Ｃ５７ＢＬ／６）およびＭＣ３８マウスの結腸直腸細胞株は、上海南方モデル動物研究センターにより入手し、該遺伝子改変マウスにおいて、マウスＬＡＧ－３細胞外ドメイン部分はヒトＬＡＧ－３遺伝子の相同部分によって置き換えられた。そのため、本発明のヒト化ＬＡＧ－３抗体は、該遺伝子改変マウスのＬＡＧ－３分子を認識することができる。
具体的には、以下の通りにして実験を行なった。ＭＣ３８細胞株を体外で拡大培養し、培地としては１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ウシ胎児血清およびＤＭＥＭ培地は、何れもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製であった）を用いた。拡大培養で得られたＭＣ３８をＬＡＧ－３遺伝子改変マウス１匹当たりに１×１０６個細胞接種し、腫瘍細胞体積が１００ｍｍ３にまで生長すると、動物をランダムで５つの組に分け、各組は５匹ずつとした。同種の対照組は同種の対照抗体を投与し、ｍＰＤ－１抗体組は、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ社製のｍＰＤ－１抗体（商品番号ＢＰ０１４６）を１０ｍｇ／ｋｇ投与し、また、別の投与組としてｍＰＤ－１抗体１０ｍｇ／ｋｇ＋ＬＡＧ３．５抗体２０ｍｇ／ｋｇ、ｍＰＤ－１抗体１０ｍｇ／ｋｇ＋１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓ抗体２０ｍｇ／ｋｇ、およびｍＰＤ－１抗体１０ｍｇ／ｋｇ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４抗体２０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ設定した。投与は、各組ごとに週２回の頻度、腹腔内注射にて３週間続けて行われ、腫瘍体積を毎週２回測定して記録した。図８は、各組の生長グラフを示す。Ｗｏｏらの研究（Ｗｏｏ Ｓ Ｒ，Ｔｕｒｎｉｓ Ｍ Ｅ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ Ｍ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＬＡＧ－３ ａｎｄ ＰＤ－１ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，７２（４）：９１７－９２７）によれば、ＬＡＧ－３モノクロ－ナル抗体を単独投与するときの抗腫瘍効果が比較的弱く、動物の生存状態を考慮してＬＡＧ－３モノクロ－ナル抗体の単独投与組を省略した。
図８に示すように、ｍＰＤ－１抗体は、対照組に比べてマウス体内のＭＣ３８腫瘍生長を著しく抑制することができ（Ｐ＝０．０２４９）、一方、ｍＰＤ－１抗体を単独投与する場合に比べ、ＬＡＧ３．５抗体とｍＰＤ－１抗体を併用した場合にＭＣ３８腫瘍生長を更に抑制することができるものの、統計学的な有意差がなかった（Ｐ＝０．１１７４、統計学的な有意差の指標であるＰ＜０．０５には至らなかった）。また、ｍＰＤ－１抗体を単独投与する場合に比べ、１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１ＳとＡｎｔｉ－ｍＰＤ－１を併用した場合にＭＣ３８腫瘍生長を更に抑制することができ（Ｐ＝０．０１５９）、５Ｅ７－Ｈｕ－ＩｇＧ４とＡｎｔｉ－ｍＰＤ－１を併用した場合においてもＭＣ３８腫瘍生長を更に抑制することのできることが確認できた（Ｐ＝０．０００３）。

Claims (25)

  1. ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
    ヒトＬＡＧ－３における前記抗体又はその抗原結合断片の結合エピトープは、配列番号５０で表されるアミノ酸配列ＡＡＡＰＧＨＰＬＡを含むことを特徴とする、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  2. ヒトＬＡＧ－３における前記抗体又はその抗原結合断片の結合エピトープは、配列番号４８で表されるアミノ酸配列ＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡ、または配列番号４９で表されるアミノ酸配列ＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳを含む、請求項１に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  3. ａ）重鎖相補性決定領域として配列番号９で表されるＨＣＤＲ１、配列番号１０で表されるＨＣＤＲ２および配列番号１１で表されるＨＣＤＲ３と、軽鎖相補性決定領域として配列番号１２で表されるＬＣＤＲ１、配列番号１３で表されるＬＣＤＲ２および配列番号１４又は配列番号４３で表されるＬＣＤＲ３とを有し、又は
    ｂ）重鎖相補性決定領域として配列番号１５で表されるＨＣＤＲ１、配列番号１６で表されるＨＣＤＲ２および配列番号１７で表されるＨＣＤＲ３と、軽鎖相補性決定領域として配列番号１８で表されるＬＣＤＲ１、配列番号１９で表されるＬＣＤＲ２および配列番号２０で表されるＬＣＤＲ３とを有することを特徴とする、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記抗体は、モノクロ－ナル抗体またはポリクロ－ナル抗体である、請求項１～３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記抗体は、モノクロ－ナル抗体である、請求項４に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記抗体は、マウス由来抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１～３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項６に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  9. 前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
    ａ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、又は
    ｂ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表され、又は
    ｃ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２４で表され、又は
    ｄ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２６で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８で表される、請求項１～３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み、
    前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ２重鎖定常領域、ＩｇＧ３重鎖定常領域およびＩｇＧ４重鎖定常領域からなる群より選ばれ、前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域およびλ軽鎖定常領域からなる群より選ばれる、請求項９に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  11. 前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ４重鎖定常領域であり、
    前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域である、請求項１０に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  12. 前記重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号３０で表され、
    前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号３４で表される、請求項１１に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  13. 前記ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖を含み、
    ａ）前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号３２で表され、前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３６で表され、又は
    ｂ）前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号３８で表され、前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号４０で表される、請求項９～１２の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  14. 請求項１～１３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
  15. 前記ヌクレオチド配列は、
    ａ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号１で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
    ｂ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号５で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号７で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
    ｃ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号２１で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２３で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
    ｄ）重鎖可変領域をコードし且つ配列番号２５で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２７で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のヌクレオチド配列。
  16. 前記ヌクレオチド配列は、重鎖定常領域をコードし且つ配列番号２９で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖定常領域をコードし且つ配列番号３３で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載のヌクレオチド配列。
  17. 前記ヌクレオチド配列は、
    ａ）重鎖をコードし且つ配列番号３１で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖をコードし且つ配列番号３５で表されるヌクレオチド配列を有し、又は
    ｂ）重鎖をコードし且つ配列番号３７で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖をコードし且つ配列番号３９で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１４～１６の何れか１項に記載のヌクレオチド配列。
  18. 請求項１４～１７の何れか１項に記載のヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
  19. 請求項１８に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
  20. 請求項１～１３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、
    発現条件下で請求項１９に記載のホスト細胞を培養することにより、ヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、
    前記ステップａで発現したヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップｂと
    を含むことを特徴とする、製造方法。
  21. 請求項１～１３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
  22. 前記薬物組成物は、ＰＤ－１阻害剤を更に含む、請求項２１に記載の薬物組成物。
  23. 前記ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１に結合する抗体又はその抗原結合断片である、請求項２２に記載の薬物組成物。
  24. 請求項１～１３の何れか１項に記載のヒトＬＡＧ－３に結合する抗体又はその抗原結合断片または請求項２１～２３の何れか１項に記載の薬物組成物の、癌を治療するための薬物の製造における用途。
  25. 前記癌は、メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、古典的ホジキンリンパ腫、尿路上皮がん、大腸がん、および肝臓がんからなる群より選ばれる任意の１種である、請求項２４に記載の用途。
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