CN110438172B - 一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于产油微生物培养技术领域，提供一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，首先将淀粉和预处理的木质纤维素原料按比例混合配制成C/N比适中的混合培养基，然后加入纤维素酶，接种斯达氏油脂酵母进行油脂发酵，发酵过程中淀粉和木质纤维素同时水解为可发酵性糖用于油脂的大量生产。本发明操作简单高效，很好地解决了当前木质纤维素原料发酵过程中油脂含量和油脂得率低、工艺流程复杂的突出问题，显著降低了微生物油脂的生产成本，提高了油脂产量和油脂得率，具有明显的综合技术优势。

Description

一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法
技术领域
本发明属于产油微生物的培养技术领域，尤其涉及一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法。
背景技术
自然界中某些产油酵母在特定条件下，能够以各种廉价的碳水化合物为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％(w/w，这里w/w表示质量比，下同)的酵母称为产油酵母。某些产油酵母胞内积累的油脂甚至超过其细胞干重的70％。产油酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，以C16-C18长链脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。微生物油脂不仅可以作为食用油或其他功能性油脂的替代品，还可以为生物柴油产业可持续发展提供原料。
木质纤维素原料是自然界中最丰富的资源，其中蕴含着丰富的碳水化合物资源。其中，我国各类农作物秸秆，包括玉米秸秆、稻草、小麦秸秆、棉花秆、油菜秆等年产量超过8亿吨，成为“用处不大”但必须处理掉的“废弃物”。长期以来，除少量用于垫圈、喂养牲畜，部分用于堆沤肥外，大部分都就地焚烧了，这不仅浪费了资源，还导致严重的环境污染。木质纤维素的化学成份主要是纤维素、半纤维素和木质素。其中的纤维素和半纤维素经酶水解后可转化为葡萄糖和其他可发酵性糖(木糖、***糖、甘露糖等)，这些可发酵性糖可进一步经生物转化为液体生物燃料和生物基化学品。利用木质纤维素水解液培养产油微生物，有可能大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的原材料得到保障。然而，当前利用秸秆水解液培养产油微生物存在油脂产量低的突出问题。要诱发产油酵母过量积累油脂，通常需要培养基中缺乏产油微生物生长繁殖的必要成分或培养条件，比如培养基中缺乏氮、磷、硫、铁、锌和溶氧等。目前，氮限制是实现产油微生物大量积累油脂最常用的策略。产油酵母油脂发酵过程中，随着氮源被耗尽，菌株生长受到抑制，碳水化合物主要导向油脂积累。木质纤维素原料中通常含油一定量的氮源，另外其降解过程中添加水解酶，也会引入一定量的氮源，导致水解液中C/N比较低。采用脱氮工艺，不仅增加工艺流程，还会造成碳水化合物的损失。在这样的水解液中产油微生物以菌体增殖为主，油脂产量和油脂得率较低。此外，木质纤维素原料生产微生物油脂需要经过预处理、纤维素酶的生产、酶水解、油脂发酵和油脂提取等诸多工艺环节，工艺流程较为复杂，生产成本很高。
产油酵母利用木质纤维素原料生产微生物油脂的方式，根据过程整合的程度，可分为分步水解发酵(SHF)、同步糖化发酵(SSF)和统和生物加工(CBP)等。SHF，酶水解和油脂发酵分开进行，可以使酶水解和油脂发酵均在最优条件下进行，充分糖化降低了物料黏度，便于输送及发酵搅拌；缺点是需要设备繁多，操作繁琐，糖化后期酶水解产物抑制纤维素酶活力，酶水解效率降低，生产周期长，总生产效率较低。SSF是在一个反应器内同时进行木质纤维素的酶水解和油脂发酵，酶水解的产物能及时被微生物消耗，不会造成产物的积累，显著降低设备投入。缺点是水解和发酵均在次优条件下进行，发酵初期酶水解成为限速步骤，酶水解产的糖供应严重不足，菌株发酵受到抑制。为了解决这一问题，通常在SSF前引入预水解过程，即在纤维素酶的最适温度和pH下预水解一段时间，产生一定浓度的可发酵糖，再将温度和pH调整至适宜细胞生长的条件，接种产油酵母进行同步糖化发酵。这种方法综合了SHF和SSF的优点，但操作复杂。此外，该技术虽然简化了工艺流程，但仍然没有解决木质纤维素制备油脂过程中油脂产量和得率较低的突出问题。CBP是将酶的生产、木质纤维素酶水解和油脂发酵高度整合在一起，可显著降低过程成本和设备成本。然而，具有CBP潜力的产油酵母非常少见。
为了更高效地利用木质纤维素资源，需要找到一种更简单、经济的方法，通过同步糖化发酵简化工艺流程的同时，显著提高油脂产量和油脂得率，提高微生物油脂的技术经济性。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，旨在解决现有同步糖化发酵方法存在工艺流程复杂、油脂产量低和油脂得率低的问题。
所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法包括下述步骤：
步骤S1：预处理木质纤维素原料；
步骤S2：向反应器中分别加入淀粉和步骤S1中预处理过的木质纤维素原料，再添加适量的营养物质，调节反应器内的pH，然后灭菌，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
步骤S3：将斯达氏油脂酵母在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液；
步骤S4：将步骤S3所得产油微生物种子液接种至步骤S2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，添加一定量的纤维素酶，在一定温度下通气培养一段时间，待培养基中的碳源总浓度低于5g/L时，终止发酵，通过固液分离收集含产油酵母的固相，然后从收集的固相中抽提获得油脂。
具体的，步骤S2中，所述淀粉的固液质量比为1％-5％，且淀粉中所含碳源占混合培养基中总碳源质量的5％-50％，所述木质纤维素原料的固液质量比为5％-15％，且木质纤维素中所含碳源占混合培养基中总碳源质量的50％-95％，控制混合培养基内碳氮摩尔比C/N为60-300。
具体的，步骤S2中，所述营养物质包括氮源、磷源、硫源中的一种或多种，所述氮源的添加量占混合培养基总质量的0.01％-0.1％，所述磷源的添加量占混合培养基总质量的0.01％-0.05％，所述硫源的添加量占混合培养基总质量的0.01％-0.05％，将反应器内的pH调整为4.0-7.0。
具体的，步骤S4中，所述产油微生物种子液体积占混合培养基体积的2％-20％，所述纤维素酶的添加量为5-25FPU/g木质纤维素，培养温度控制在30℃-34℃之间。
具体的，步骤S1中，所述木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的廉价生物质原料，包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、稻草、棉花杆、高粱杆、油菜杆其中的一种或多种。
具体的，步骤S1中，木质纤维素原料的预处理包括采用物理、化学、物理化学、生物其中的一种或多种方法进行处理。
具体的，步骤S2中，所述淀粉包括木薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉其中的一种或多种。
具体的，步骤S4中，抽提所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂。
本发明的有益效果是：
1、在本发明中，通过共利用淀粉和木质纤维素原料，实现了淀粉统合生物加工(淀粉酶的生产、酶水解淀粉制备可发酵性糖和产油酵母油脂发酵的高度整合)和木质纤维素同步糖化油脂发酵的耦合，与淀粉和木质纤维素分别作为原料生产微生物油脂相比，显著降低了过程成本和设备成本；
2、本发明所采用的斯达氏油脂酵母可以直接利用淀粉，不需要额外添加淀粉酶和糖化酶，在发酵初期，斯达氏油脂酵母产生淀粉酶能够迅速将淀粉水解，产生较多的可发酵性糖提供给产油酵母利用，提高发酵初期的油脂发酵效率，通过采用淀粉和木质纤维素共利用的方式，不再需要木质纤维素SSF的预水解过程，显著简化工艺流程；
3、淀粉原料中氮源匮乏，C/N比较高，而木质纤维素水解液中氮源较丰富，C/N比较低，本发明通过将两者混合，制备淀粉-木质纤维素混合培养基，将C/N比调节至合理的水平，使得淀粉与木质纤维素中的碳源主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量的积累；
本发明所采用的方法非常容易实现，显著简化了工艺流程、降低了设备成本、提高了油脂的生产效率、油脂产量和油脂得率、提升了微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔应用前景，本发明所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品，具有非常好的应用价值。
附图说明
图1是本发明提供的通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：预处理木质纤维素原料。
本步骤中，所述木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的廉价生物质原料，包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、稻草、棉花杆、高粱杆、油菜杆其中的一种或多种，木质纤维素原料所采用的预处理方法包括物理法、化学法、物理化学法、生物法其中的一种或多种。
步骤S2：淀粉-木质纤维素混合培养基的制备。
向反应器中分别加入淀粉和步骤S1中预处理过的木质纤维素原料，再添加适量的营养物质，调节反应器内的pH，然后灭菌，得到淀粉-木质纤维素混合培养基。
本步骤中，所述淀粉包括木薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉其中的一种或多种，其中淀粉的固液质量比为1％-5％，且淀粉中所含碳源占混合培养基中总碳源质量的5％-50％，所述木质纤维素原料的固液质量比为5％-15％，且木质纤维素中所含碳源占混合培养基中总碳源质量的50％-95％，控制混合培养基内碳氮摩尔比C/N为60-300。
本步骤中所述营养物质包括氮源、磷源、硫源中的一种或多种，所述氮源的添加量占混合培养基总质量的0.01％-0.1％，所述磷源的添加量占混合培养基总质量的0.01％-0.05％，所述硫源的添加量占混合培养基总质量的0.01％-0.05％，将反应器内的pH调整为4.0-7.0，培养基灭菌采用高温湿热灭菌法。
步骤S3：产油酵母种子液的制备。
在无菌操作环境中，将斯达氏油脂酵母接种于营养丰富的液体种子培养基中，在25℃～30℃的环境下通气培养24～48h，得到产油酵母种子液，其中液体种子培养基以葡萄糖或淀粉为主要碳源和能源，然后再添加适量的其它营养成分如酵母粉、蛋白胨、玉米浆等。
本步骤所采用的斯达氏油脂酵母可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)、英国国家菌株保藏中心(UKNCC)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)、或德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。
步骤S4：淀粉-木质纤维素共发酵。
将上述产油酵母种子液接种至淀粉-木质纤维素混合培养基中，添加一定量的纤维素酶，在一定温度下通气培养一段时间，待培养基中的碳源总浓度低于一定值时，终止发酵，通过固液分离收集含产油酵母的固相。
本步骤中，所述产油微生物种子液体积占混合培养基体积的2％-20％，所述纤维素酶的添加量为5-25FPU/g木质纤维素，培养温度控制在30℃-34℃之间，当培养基中的碳源总浓度低于5g/L时，终止发酵，固液分离收集含产油酵母的固相，固液分离可采用离心法或者过滤法。
步骤S5：提取微生物油脂。
上述步骤中所得到的固相为微生物菌体和木质纤维素残渣的混合物，从中抽提获得油脂，计算菌体油脂产量，微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油，比如在酸催化条件下转酯化制备生物柴油(该工艺为常规制备工艺，这里不再赘述)，另外，微生物油脂含有的不饱和脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。
下面通过具体实施例来对本发明进行说明，以下实施例选取了典型的秸秆和淀粉原料为材料培养典型产油微生物的例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油菌株。
实施例1：
1、称取过40目筛的玉米秸秆40g，加入80mL NaOH-CH3OH溶液中，在80℃下预处理1h，然后在相同温度下继续蒸发1h除去CH3OH；
2、配制20g/L木薯淀粉和80g/L预处理玉米秸秆，控制C/N比为199，将产油微生物培养基的pH调整为6.0，在121℃的环境下灭菌15min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母AS 2.1560(中国普通微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在28℃、200rpm的环境下振荡培养40h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为10％(v/v)，纤维素酶的添加量为15FPU/g秸秆，在30℃下通气培养96h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖的浓度为0.6g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共37g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为16.9g/L。
实施例2：
1、称取过40目筛的玉米秸秆40g，加入80mL NaOH-CH3OH溶液中，在80℃下预处理1h，然后在相同温度下继续蒸发1h除去CH3OH；
2、配制50g/L木薯淀粉和150g/L预处理玉米秸秆，控制C/N比为300，将产油微生物培养基的pH调整为6.0，在121℃的环境下灭菌15min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母AS 2.1560(中国普通微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在30℃、200rpm的环境下振荡培养40h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为15％(v/v)，纤维素酶的添加量为25FPU/g秸秆，在30℃下通气培养180h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖的浓度为0.6g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共77g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为31.2g/L。
实施例3：
1、参照文献(Zhao J,Xia LM.Fuel Process Technol,2009,90:1193–1197)，称取100g过20目筛的稻草，按1:8(w/w)的固液比加入0.8L浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，在80℃水浴锅中处理75min；
2、配制20g/L马铃薯淀粉和80g/L预处理稻草秸秆，控制C/N比为88，将产油微生物培养基的pH调整为5.5，在121℃的环境下灭菌20min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母NRRL 11558(美国农业研究菌种保藏中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在28℃、200rpm的环境下振荡培养40h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为5％(v/v)，纤维素酶的添加量为25FPU/g秸秆，在28℃下通气培养96h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和还原糖浓度分别为0.3g/L和1.8g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共40.5g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为14.2g/L。
实施例4：
1、参照文献(Ruan ZH,et al.Biotechnol Bioeng,2013,110:1039–1049)，称取50g直径小于1mm的稻草粉末，按固液比10％(w/w)加入500mL 2％(w/w)的稀硫酸，在130℃下处理60min；
2、配制30g/L甘薯淀粉和70g/L预处理稻草秸秆，控制C/N比为125，将产油微生物培养基的pH调整为5.0，在121℃的环境下灭菌20min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母CBS 1807(荷兰皇家科学艺术学院真菌多态性中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在25℃、200rpm的环境下振荡培养24h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为10％(v/v)，纤维素酶的添加量为20FPU/g秸秆，在30℃下通气培养120h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和还原糖浓度分别为0g/L和1.2g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共42.3g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为15.6g/L。
实施例5：
1、称取过20目筛的小麦秸秆50g，按100％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸润24h后，在190℃水蒸汽下汽爆处理3min；
2、配制50g/L玉米淀粉和50g/L预处理小麦秸秆，控制C/N比为245，将产油微生物培养基的pH调整为4.8，在121℃的环境下灭菌20min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母NRRL 11557(美国农业研究菌种保藏中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在30℃、200rpm的环境下振荡培养48h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为20％(v/v)，纤维素酶的添加量为5FPU/g秸秆，在30℃下通气培养120h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和还原糖浓度分别为0g/L和0.6g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共40.9g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为14.7g/L。
实施例6：
1、参照文献(Balan V,et al.Biotechnol Progr,2009,25:365–375)，将油菜杆洗净，干燥，粉碎过1mm筛，进行氨纤维***预处理；
2、配制40g/L木薯淀粉和60g/L预处理油菜杆，控制C/N比为60，将产油微生物培养基的pH调整为6.0，在121℃的环境下灭菌20min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母ATCC 56304(美国典型微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在25℃、200rpm的环境下振荡培养36h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为15％(v/v)，纤维素酶的添加量为5FPU/g油菜秆，在30℃下通气培养108h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和还原糖浓度分别为0.3g/L和1.1g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共41.6g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为12.5g/L。
实施例7：
1、参照文献(Zhang J,et al.Bioresour Technol,2011,102:4480–4488)，将棉花秸秆洗净，干燥，粉碎过2mm筛，进行微量酸“干”预处理；
2、配制50g/L木薯淀粉和150g/L预处理棉花杆，控制C/N比为300，将产油微生物培养基的pH调整为4.0，在121℃的环境下灭菌20min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母ATCC 56304(美国典型微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在30℃、200rpm的环境下振荡培养36h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为15％(v/v)，纤维素酶的添加量为10FPU/g棉花秆，在30℃下通气培养192h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和还原糖浓度分别为0.1g/L和0.7g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共75.2g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为27.5g/L。
实施例8：
1、将玉米芯干燥、粉碎过20目筛，按照1:8(w/v)固液比加入20g/L的NaOH溶液，于80℃水浴锅中处理1h，处理完毕后，用去离子水洗涤玉米芯；
2、配制10g/L木薯淀粉和50g/L预处理玉米芯，控制C/N比为300，将产油微生物培养基的pH调整为4.0，在121℃的环境下灭菌20min，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
3、将斯达氏油脂酵母ATCC 56304(美国典型微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在30℃、200rpm的环境下振荡培养36h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，接种量为2％(v/v)，纤维素酶的添加量为10FPU/g玉米芯，在34℃下通气培养84h后终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和还原糖浓度分别为0g/L和0.2g/L，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余玉米芯共28.5g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为10.3g/L。
对比例1：
1、称取过40目筛的玉米秸秆40g，加入80mL NaOH-CH3OH溶液中，在80℃下预处理1h，然后继续在相同温度下蒸发1h除去CH3OH；
2、将产油微生物培养基的pH调整为5.0，控制C/N比为300，调整固液比至10％(w/w)，在121℃的环境下灭菌20min；
3、将斯达氏油脂酵母AS 2.1560(中国普通微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在28℃、200rpm的环境下振荡培养48h，得到产油微生物种子液；
4、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤2产油微生物培养基中，接种量为10％(v/v)，纤维素酶的添加量为15FPU/g秸秆，在30℃下通气培养144h后终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖和木糖，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体和残余秸秆共32.3g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为5.8g/L。
对比例2：
1、配制50g/L木薯淀粉，控制C/N比为1158，将产油微生物培养基的pH调整为6.0，在121℃的环境下灭菌15min后备用；
2、将斯达氏油脂酵母AS 2.1560(中国普通微生物菌种保藏管理中心)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中培养，在28℃、200rpm的环境下振荡培养40h，得到产油微生物种子液；
3、将步骤3所得产油微生物种子液接种至步骤1所得产油微生物培养基中，接种量为10％(v/v)，在30℃下通气培养120h后终止发酵，此时发酵液中残余的糖浓度为14.5g/L当量的淀粉，通过固液分离收集含产油酵母的固相，得到干菌体7.0g/L，采用常规方法抽提油脂，所得油脂的产量为4.9g/L。
通过实施例与对比例可以看出，单独采用淀粉或木质纤维素作为原料来生产微生物油脂，所得油脂的产量比较低，而利用淀粉和木质纤维素作为共同原料，所得油脂的产量大幅度提高，原因在于淀粉原料中氮源匮乏，C/N比较高，而木质纤维素水解液中氮源较丰富，C/N比较低，本发明通过将两者混合，制备淀粉-木质纤维素混合培养基，将C/N比调节至合理的水平，使得淀粉与木质纤维素中的碳源水解后主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量的积累。
此外，在本发明实施例中，所采用的斯达氏油脂酵母可以直接利用淀粉，不需要额外添加淀粉酶和糖化酶，在发酵初期，斯达氏油脂酵母产生淀粉酶能够迅速将淀粉水解，产生较多的可发酵性糖提供给产油酵母利用，提高发酵初期的油脂发酵效率，通过采用淀粉和木质纤维素共利用的方式，不再需要木质纤维素SSF的预水解过程，显著简化工艺流程，同时实现了淀粉统合生物加工(淀粉酶的生产、酶水解淀粉制备可发酵性糖和产油酵母油脂发酵的高度整合)和木质纤维素同步糖化油脂发酵的耦合，与淀粉和木质纤维素分别作为原料生产微生物油脂相比，显著降低了过程成本和设备成本。
本发明提供了一种通过共利用淀粉和木质纤维素原料产油脂的方法，该方法操作简单高效，很好地解决了当前木质纤维素原料发酵过程中油脂含量和油脂得率低、工艺流程复杂的突出问题，显著降低了微生物油脂的生产成本，提高了油脂产量和油脂得率，具有明显的综合技术优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤S1：预处理木质纤维素原料；
步骤S2：向反应器中分别加入淀粉和步骤S1中预处理过的木质纤维素原料，再添加适量的营养物质，调节反应器内的pH，然后灭菌，得到淀粉-木质纤维素混合培养基；
步骤S3：将斯达氏油脂酵母在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液；
步骤S4：将步骤S3所得产油微生物种子液接种至步骤S2所得淀粉-木质纤维素混合培养基中，添加一定量的纤维素酶，在一定温度下通气培养一段时间，待培养基中的碳源总浓度低于5 g/L时，终止发酵，通过固液分离收集含产油酵母的固相，然后从收集的固相中抽提获得油脂；
步骤S2中，所述淀粉的固液质量比为1%-5%，且淀粉中所含碳源占混合培养基中总碳源质量的5%-50%，所述木质纤维素原料的固液质量比为5%-15%，且木质纤维素中所含碳源占混合培养基中总碳源质量的50%-95%，控制混合培养基内碳氮摩尔比 C/N为60-300。
2.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S2中，所述营养物质包括氮源、磷源、硫源中的一种或多种，所述氮源的添加量占混合培养基总质量的0.01%-0.1%，所述磷源的添加量占混合培养基总质量的0.01%-0.05%，所述硫源的添加量占混合培养基总质量的0.01%-0.05%，将反应器内的pH调整为4.0-7.0。
3.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S4中，所述产油微生物种子液体积占混合培养基体积的2%-20%，所述纤维素酶的添加量为5-25 FPU/g木质纤维素，培养温度控制在30℃-34℃之间。
4.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的廉价生物质原料，包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、稻草、棉花杆、高粱杆、油菜杆其中的一种或多种。
5.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S1中，木质纤维素原料的预处理包括采用物理、化学、物理化学、生物其中的一种或多种方法进行处理。
6.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S2中，所述淀粉包括木薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉其中的一种或多种。
7.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S3中，所述产油微生物为可直接利用淀粉的产油酵母斯达氏油脂酵母及其自然突变株和工程菌株。
8.如权利要求1所述通过共利用淀粉与木质纤维素原料产油脂的方法，其特征在于，步骤S4中，抽提所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂。
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