CN103898166A - 一种乙醇的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产乙醇的方法，采用YEPD培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至发酵液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇，其中发酵液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%，该方法克服了菌体生长慢，发酵时间长，转化率低的缺陷，有利于实现大规模的纤维素乙醇发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵含糖物质生产乙醇的方法，特别涉及一种共发酵含有五碳糖和六碳糖物质生产乙醇的方法，本发明还涉及发酵含有木质纤维素原料生产乙醇的方法。
背景技术
随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁能源已成为全球的研究热点，以木质纤维素为原料发酵生产燃料乙醇受到了广泛关注。木质纤维素类生物质水解产物中除葡萄糖外，还含有大量以木糖为主的五碳糖，因此发酵戊糖（半纤维素混合糖）生产乙醇是提高乙醇总收率、降低生产成本的重要措施之一。例如玉米秸秆，以葡萄糖含量约占40%，木糖含量约为20%来计算，木糖转化乙醇的产量可占到总乙醇产量的1/3。
自然界中高效产醇的微生物通常只能利用葡萄糖等六碳糖生产乙醇，不能利用木糖；而少数能利用木糖产醇的微生物，产醇能力低下，这限制了对自然界中木质纤维素的有效利用。近20多年来，研究人员对木糖在酿酒酵母的运输、木糖至木酮糖代谢途径的选择、木酮糖转化速率的提高、木糖醇积累的消除等方面进行了一系列代谢工程研究，并利用基因工程技术将一些真菌的木糖转运酶在酿酒酵母中进行表达，选择木糖异构酶（XI）途径或木糖还原-木糖醇氧化途径（XR-XDH）进行木酮糖转化，并将磷酸戊糖下游代谢路径进行修饰以强化木糖代谢转化乙醇的能力，得到了一些高效的木糖代谢重组发酵微生物。
然而，现有公开的C5/C6共发酵生产乙醇的方法仍然无法满足工业化生产乙醇的需要：
专利CN1966694A公开了一种利用重组酿酒酵母NAN127发酵葡萄糖和木糖生产酒精的方法，包括种子培养、扩大培养和种子发酵的步骤，其中种子培养和扩大培养采用YERD培养基，发酵培养为葡萄糖、木糖、蛋白胨的混合物。
专利CN101165166A中报道了利用热带假丝酵母Candida Tropicalis及其驯化菌株对木质纤维素水解产物进行发酵，能够代谢葡萄糖产乙醇并转化木糖成木糖醇，培养基选择酵母浸膏、麦芽提取物、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、胰蛋白胨。
专利WO200851348A、WO200958927A、WO200958938A中公开了使用经过改造的Zymomonas mobilis生产乙醇的方法，种子培养物在SM培养基中扩大培养，并且最终培养物包含一定pH条件下的葡萄糖和木糖的混合配制物。
专利WO9742307A中报道了用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母，其中采用YEPD培养基扩大培养，扩大培养后的重组酵母投入葡萄糖和木糖的混合物中。
现有技术中所公开的发酵微生物发酵原料均使用实验配制物，在其披露的菌株扩大培养以及发酵条件下菌体生长慢，发酵时间长，转化率低，无法实现大规模的乙醇生产，不能满足利用现有菌株从木质纤维素产生乙醇的工业化生产。
因此，本发明克服了现有技术中的缺陷，公开了一种大规模从含有五碳糖和六碳糖物质共发酵生产获得乙醇的方法以及从含木质纤维素原料发酵制备生产乙醇的工业化方法。
发明内容
本发明目的是一方面提供了生产乙醇的方法，解决了C5/C6共发酵微生物菌体生长慢，发酵时间长，乙醇转化率低的缺陷。
本发明的另一目的是提供了一种扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，并且提供了一种C5/C6共发酵微生物的培养基。
另一方面本发明还提供了一种从含木质纤维素原料发酵生产乙醇的方法，降低了乙醇的生产成本，实现了木质纤维素乙醇的工业化生产。
本发明首先提供了一种生产乙醇的方法，包括采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至发酵液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇，其中发酵液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%。
本发明还提供了一种生产乙醇的方法，包括采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h至（0.1-0.5）×109/ml，接种扩大培养至（0.1-1）×109/ml，将扩大培养后的微生物移至发酵液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇，其中发酵液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%。
本发所述的发酵液中葡萄糖含量优选为5-20%，更优选为6-12%，木糖含量优选为3-8%，更优选为3-6%。
在本发明的一个实施方式中所述的发酵培养液为木质纤维素原料酶解液，其中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%，优选的葡萄糖含量为5-20%，更优选为6-12%，木糖含量优选为3-8%，更优选为3-6%。同时，本领域技术人员了解木质纤维素原料酶解液中还允许可以存在少量的乙酸，一定浓度的乙酸可能对微生物细胞产生抑制作用，因而乙酸在发酵液中的含量优选为0.1-1%，更优选的范围为0.1-0.8%。
本发明所述的发酵液中还含有蛋白质、游离氨基酸、维生素、微量元素中的一种或几种。其中，蛋白质在发酵液中的含量为3-4g/L，其作用的一方面用于提供微生物生长所需要的氮源；所述游离氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸中的一种或几种；所述的微量元素包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙中的一种或几种；所述的维生素包括B族维生素，例如生物素、叶酸。在本申请的优选实施方案中，发酵液中含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆（其中干物质含量为40-60wt%）、鱼粉和/或酵母膏，提供蛋白质、游离氨基酸、维生素和/或微量元素，其含量为5-10g/L,优选为6-8g/L。
本发明的另一方面，发酵液中还含有无机盐和/或抑制剂。所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L，优选1-2.5g/L，在本发明的一个优选实施方式中发酵液中含有0.5g/L磷酸二氢钾和2g/L磷酸氢二铵。当发酵培养过程没有进入杂菌时，在发酵液中不需要添加抑菌剂，所述的抑制剂是用来抑制培养基中的杂菌，选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选青霉素和/或链霉素，发酵液中抑制剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。
本发明的另一方面提供了一种扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，采用种子培养基将发酵微生物培养12-24h培养至（0.1-0.5）×109/ml，然后接种扩大培养至（0.1-1）×109/ml。
本发明所述的发酵方法或扩大培养方法中，首先将C5/C6共发酵微生物采用种子培养基进行种子培养，该步骤的目的是为了快速扩增微生物，达到扩大培养所需要的菌体浓度，所述的种子培养基可以采用现有技术中已有的种子培养基，例如采用YEPD培养基培养发酵微生物，该步骤中优选培养时间为12-20h，特别特优的培养时间为14-16h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，优选培养至（0.2-0.25）×109/ml，该步骤为后面的扩大培养提供条件。
本发明中所述扩大培养能够为后续发酵提供足够的微生物菌数，其中扩大培养的培养基（即扩培液）是微生物获得生存的营养来源，对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影响。所述的扩大培养的培养基可以为蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计在2-10%，优选含量为4-6%。优选的，扩大培养的培养基含有4%葡萄糖（重量百分比）的培养基或以葡萄糖含量为4%（重量百分比）的玉米糖化醪或糖蜜。在本发明的另一优选实施方式中，所述的培养基可以为木质纤维素原料酶解液，其中酶解液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%，优选的葡萄糖含量为5-20%，更优选为6-12%，木糖含量优选为3-8%，更优选为3-6%，作为培养基时，其稀释浓度为10-75%（重量百分比），优选的培养基为20-30%稀释后的木质纤维素原料酶解液。所述培养基中和发酵液中还含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆（其中干物质含量为40-60wt%）、鱼粉和/或酵母膏，其含量为5-10g/L,优选为8-10g/L，其作用的一方面用于提供微生物生长所需要的氮源、包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸的游离氨基酸、包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙中的微量元素以及包括B族维生素在内的维生素。培养基中还可以含有尿素、无机盐和/或抑制剂，所述的尿素的含量为2-5g/L，优选为3-4g/L，所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L，优选1-3g/L，在本发明的一个优选实施方式中发酵液中含有1.5g/L磷酸二氢钾和1.5g/L磷酸氢二铵。通常情况下，微生物扩大发酵的过程没有杂菌进入时不需要添加抑菌剂，所述的抑制剂是用来抑制培养基中的杂菌，选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选青霉素或/链霉素，发酵液中抑制剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。
本发明另一个目的是提供一种C5/C6共发酵微生物的培养基，包括：（1）蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种；（2）黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆（其中干物质含量为40-60wt%、鱼粉或酵母膏中的一种或几种，其含量为5-10g/L,优选为6-8g/L；（3）任选的尿素，在培养基中含量可以为2-5g/L，优选为3-4g/L；（4）无机盐，选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，无机盐在培养基中的含量为0.5-4g/L，优选1-3g/L；（5）任选的抑制剂，选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选青霉素或/链霉素，抑制剂在培养基中的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL，所述培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计在2-10%，优选含量为4-6%。
本发明所述的扩大培养步骤中种子罐的级数对发酵同样产生影响，级数少可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒、值班工作量以及减少因种子罐生长异常而造成发酵的波动。本发明所述的扩大培养可以采用二级扩培、三级扩培或四级扩培。在本发明的一个优选的实施方式中，采用三级扩大培养方式，摇瓶种子培养后的发酵微生物接至50L扩培发酵罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至5立方扩培罐中，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml；在本发明的另一个实施方式中，采用四级扩培的方式，摇瓶种子培养后的发酵微生物接种至50L扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至5立方扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至30立方扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml。接种到扩大培养的微生物接种量可以为种子培养的5-20%，优选为5-10%。
微生物扩大培养和发酵条件中控制通气条件时，应考虑到既能满足菌种生长与合成酶的不同要求，又要节省电耗，以提高经济效益。通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度较一致，有利于营养物质和代谢物的分散。此外，选用挡板可使搅拌效果更好。在培养阶段的各个时期的通气量，可以根据菌种的特性、罐的结构、培养基的性质通过试验确定。在本发明的一个实施方式中扩培通气量应该控制在0.1-0.5vvm，每小时10-20min，优选的通气量控制在0.1vvm，每小时20min，扩培搅拌转速可以控制在50-100r/min，特别优选的搅拌速度为70r/min，发酵2-4h搅拌一次，每次5-20min，特别优选4h搅拌一次，每次10min。
同时，本发明所述的微生物扩大培养和发酵条件中温度可以选择微生物生长的适宜温度，例如在25-38℃范围内，在此温度范围内，微生物生长、繁殖最快。在本发明的优选实施方式中，所述的微生物扩大培养步骤中，温度控制在25-35℃范围内，优选在25-32℃，特别优选在28-32℃,所述的发酵过程温度控制在28-35℃范围内，优选在28-32℃。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长、繁殖，可减少污染杂菌的机会，减少夏季培养所需降温的辅助设备，对工业生产有很大的好处，例如在低于45℃条件下。处于迟滞期的细菌对于温度的影响十分敏感，将其置于最适生长温度附近，可以缩短其生长的迟滞期；将其置于较低的温度，则会延长其缓慢期；而且孢子萌发的时间在一定温度范围内也随温度的上升而缩短。处于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，其升温的破坏作用也显得较弱。
培养基的氢离子浓度对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH值。同一菌种合成酶的类型与酶系组成可随pH值的改变而产生不同程度的变化。本发明所述的微生物扩大培养和发酵条件中，pH值应该保持在pH5.0-7.0的范围内，在一个优选的实施方式中，pH值应该保持在pH4-6.5的范围内。本发明所述调节pH值的方法有三种，使用酸碱溶液、缓冲液以及各种生理缓冲剂（如生理酸性与生理碱性的盐类），优选使用碱溶液进行调节，包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠。
本发明在一个具体实施方式中提供了一种发酵生产乙醇的方法，采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h培养至（0.1-0.5）×109/ml，接种量5%-20%接种扩大培养至（0.2-0.3）×109/ml，将扩大培养后的微生物移至发酵液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇，其中发酵液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%、5-10g/L玉米浆、1.5g/L磷酸二氢钾和1.5g/L磷酸氢二铵。其中所述的扩大培养采用三级扩培或四级扩培。优选三级扩大培养方式为种子培养后的发酵微生物接至50L扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至5立方扩培罐中，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml；采用四级扩培的方式，种子培养后的发酵微生物接种至50L扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至5立方扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml，移至30立方扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×109/ml。
本发明还提供了一种从含木质纤维素原料发酵制备乙醇的方法，包括：（1）将含木质纤维素原料经过酶解处理后得到木质纤维素原料酶解液；（2）采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h；（3）接种扩大培养；（4）将扩大培养后的微生物移至木质纤维素原料酶解液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇。
本发明还提供了一种从含木质纤维素原料发酵制备乙醇的方法，包括：（1）将含木质纤维素原料经过酶解处理后得到木质纤维素原料酶解液；（2）采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h培养至（0.1-0.5）×109/ml；（3）接种扩大培养至（0.1-1）×109/ml；（4）将扩大培养后的微生物移至木质纤维素原料酶解液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇。
优选的，本发明所述从含木质纤维素原料发酵制备乙醇的方法步骤（4）中发酵过程还加入蛋白质、游离氨基酸、维生素、微量元素中的一种或几种。其中，蛋白质在发酵液中的含量为3-4g/L；所述游离氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸中的一种或几种；所述的微量元素包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙中的一种或几种；所述的维生素包括B族维生素，例如生物素、叶酸。在本发明的一个实施方案中，发酵过程中加入黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆（其中干物质含量为40-60wt%）、鱼粉和/或酵母膏，提供蛋白质、游离氨基酸、维生素和/或微量元素，其含量为5-10g/L,优选为6-8g/L。优选的，发酵过程中还加入有无机盐和/或抑制剂。所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L，优选1-2.5g/L，在本发明的一个优选实施方式中发酵液中含有0.5g/L磷酸二氢钾和2g/L磷酸氢二铵。通常情况下，微生物扩大发酵的过程没有杂菌进入时不需要添加抑菌剂，所述的抑制剂是用来抑制培养基中的杂菌，选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选青霉素或/链霉素，发酵液中抑制剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。
本发明的优选实施方式中，从含木质纤维素原料发酵制备乙醇的方法还包括清洗、预处理的步骤，所述的清洗包括采用水洗、筛分、风选等方式。所述的预处理步骤包括本领域常用的木质纤维素预处理方法，例如蒸煮法、酸浸法、碱处理、蒸汽***、胶体磨粉碎等。
本发明中所指C5/C6共发酵微生物指自然界分离得到的微生物以及经过遗传工程改造后的C5/C6共发酵微生物，包括细菌、真菌和酵母酿酒。酵母包括酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、嗜鞣管囊酵母Pachysolentannophilus、树干毕赤酵母Pichia stipitis、休哈塔假丝酵母Candida shehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纤细假丝酵母Candida tenuis、热带假丝酵母Candida tropicalis和赛沟毕赤酵母Pichia segobiensis；真菌包括多动拟杆菌Bacteroidespolypragmatus、菊欧文氏杆菌Erwinia chrysanthem、植物克雷伯杆菌Klebsiella planticola、嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus、球状螺旋体Spirochaeta coccoidessp.、植物发酵梭菌Clostridiumphytofermentassp.；真菌包括尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、粗糙脉孢菌Neurospora crassa和燕麦镰刀菌Fusarium avenaceum。
经过遗传工程改造的微生物包括重组酿酒酵母S.cerevisiae、重组运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis，以及重组大肠杆菌Escherichia coli。重组酿酒酵母S.cerevisiae是通过真菌的木糖转运酶在酿酒酵母中进行表达，选择木糖异构酶（XI）途径或木糖还原-木糖醇氧化途径（XR-XDH）进行木酮糖转化，并将磷酸戊糖下游代谢路径进行修饰以强化木糖代谢转化乙醇的能力，可利用的酿酒酵母菌记载在专利WO9742307A、WO9513362A、US20110027847、CN1966694A、CN101205525A所公开的菌株；对运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis改造可将E.coli的xylA(木糖异构酶基因)、xylB(木酮糖激酶基因)、talB(转酮醇酶基因)、tktA(转醛醇酶基因)导入到Z.mobilis中，例如专利US5843760、US5514583、WO200851348A、WO200958927A、WO200944868A或WO200958938A；将含有PET操纵子(携带运动发酵单胞菌丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因)的质粒转化到E.coli菌株可以使重组E.coli的已糖和戊糖代谢形成的中心代谢物-丙酮酸转向乙醇生产，例如专利CN101875912A中所报道的菌株。在本发明的优选实施例中，优选的C5/C6共发酵微生物选自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis和/或大肠杆菌E.coli，特别优选为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis。
本发明中所指的YEPD培养基是指培养基成分为酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，经分装灭菌后混合制备得到。
本发明中所指的含木质纤维素原料包括玉米秸秆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦秆、小麦杆、树叶、棉籽絮、报纸、柳枝、燕麦壳等。从结构上看，木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素和木质素。在优选实施方案中，含木素纤维素原料包含至少30wt％，优选至少50wt％，更优选至少70wt％，甚至更优选至少90wt％的木质纤维素。应理解的是，含木质纤维素原料中还可以包含其它组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。优选的，本发明中所指含木质纤维素原料为玉米秸秆。
本发明中所述的酶解过程中的酶包括：纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶等，其中纤维素酶包括但不限于纤维二糖水解酶（纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II）以及内切葡聚糖和β-葡糖苷酶。
在本申请的一个实施方式中，从发酵液中分离乙醇可以采用本领域已知的常规方法，例如采用蒸馏，可采用本领域中所描述的常规蒸馏设备，例如具有双流塔板和横流塔板的蒸馏塔。然而，因为发酵含酒精产物的高悬浮固体含量，一般来说，双流筛塔板或横流阀塔板是优选的。在各种优选的实施方案中，包括横流阀塔板的塔是优选的，因为通过横流阀塔板往往提供更高的极限负荷比和更高的效率。
本发明所述的发酵生产乙醇的方法能够使木糖的利用率和总糖的转化率达到70%以上，发酵后发酵液中含有乙醇的浓度在50g/L左右，克服了菌体生长慢，发酵时间长，转化率低的缺陷，有利于实现大规模的纤维素乙醇发酵生产。
具体实施方式
实施例1假丝酵母二级扩培发酵乙醇实验
菌种：热带假丝酵母Candida tropicalis，市售获得
扩培培养基：一级与二级扩培相同，为4%葡萄糖扩培培养基，含有葡萄糖4%（质量百分比）、玉米浆（干物质含量40%）15g/L、KH2PO41.5g/L、(NH4)2HPO41.5g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素。
发酵培养基：葡萄糖8wt%、木糖4.5wt%、KH2PO40.5g/L、(NH4)2HPO42g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合。
发酵方法：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种至YEPD培养基，培养20h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，按接种量5%接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30°C，转速200rpm，培养时间16h，第一级菌体5%接种至第二级扩培培养基培养，扩培温度30°C，转速200rpm，扩培16h后菌体以10%接种至含有发酵液的发酵罐中发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。
实施例2-4酿酒酵母扩培发酵乙醇实验（不同扩培培养基与同一发酵培养基比较试验）
菌种：重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)（如Cellulosic ethanolproduction from AFEX-treated corn stover using Saccharomyces cerevisiae424A(LNH-ST),M.W.Lau,B.E.Dale,Proc Natl Acad Sci USA,106(2009),pp.1368-1373；Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethanolusing commercial enzymes and Saccharomyces cerevisiae424A(LNH-ST),M.Jin,M.W.Lau,V.Balan,B.E.Dale,Bioresour Technol,101(2010),pp.8171-8178等报道）
扩培培养基：
实施例2采用木质纤维素原料酶解液扩培培养基：其中含有用水稀释至30wt%木质纤维素原料酶解液、玉米浆（干物质含量40%）15g/L、KH2PO41.5g/L、(NH4)2HPO41.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素；
实施例3采用4%葡萄糖扩培培养基：其中含葡萄糖4wt%，玉米浆（干物质含量40%）15g/L、KH2PO41.5g/L、(NH4)2HPO41.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素；
实施例4采用玉米糖化醪扩培培养基：含玉米糖化醪4wt%，灭菌后加入3g/L尿素；
发酵培养基：
实施例2-4均采用木质纤维素原料酶解液进行发酵，含有用水稀释至30wt%木质纤维素原料酶解液、玉米浆（干物质含量40wt%）7.5g/L、KH2PO40.5g/L，(NH4)2HPO42g/L，发酵开始前调节pH为6.0；
发酵方法：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种至YEPD培养基，培养14h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，按接种量5%接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30°C，转速200rpm，培养时间12-14h，以10%的接种量接入发酵摇瓶中，发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。
实施例5-6酿酒酵母二级扩培发酵乙醇实验（同一扩培培养基和不同发酵培养基比较试验）
菌种：重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)，同实施例2-4中菌株来源
扩培培养基：4%葡萄糖扩培培养基，其中葡萄糖含量4wt%，玉米浆15g/L，KH2PO41.5g/L，(NH4)2HPO41.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合加入3g/L尿素；
发酵培养基：
实施例5：葡萄糖10wt%、木糖5wt%、玉米浆7.5g/L、KH2PO40.5g/L、(NH4)2HPO42g/L，用去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合。发酵开始前调节pH为6.0。
实施例6：木质纤维素酶解液（含葡萄糖9.5wt%、木糖4.5wt%）、玉米浆7.5g/L、KH2PO40.5g/L、(NH4)2HPO42g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合。发酵开始前调节pH为6.0。
发酵方法：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种至YEPD培养基，培养14h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，按接种量5%接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30°C，转速200rpm，培养时间14h，以10%的接种量接入发酵摇瓶中，调节pH至6.0，发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。
实施例7运动发酵单胞菌二级扩培发酵试验
菌种：运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis，在Z.mobilis中同时表达E.coli的木糖异构酶基因(xylA)、木酮糖激酶基因(xylB)、转醛酶基因(tal)、转酮酶基因(tktA)，将上述基因分为2组，即xylA和xylB,tal和tktA，组成2个操纵子，分别置于Z.mobilis自身的3-P-甘油醛脱氢酶启动子和烯醇酶启动子下，并将这2个操纵子构建成1个质粒。
扩培培养基：4%葡萄糖扩培培养基，含有葡萄糖含量4%（质量百分比）、玉米浆（40%干固含量）15g/L、KH2PO41.5g/L、(NH4)2HPO41.5g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素。
发酵培养基：葡萄糖10wt%、木糖10wt%、玉米浆7.5g/L、KH2PO40.5g/L、(NH4)2HPO42g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，。
发酵方法：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种至YEPD培养基，培养20h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，按接种量5%接种到含有扩培培养基的发酵罐中，扩培温度37°C，转速200rpm，培养时间16h，第一级菌体5%接种至二级扩培培养基培养，扩培温度37°C，转速200rpm，扩培结束接种至含有发酵培养基的发酵摇瓶中发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。
实施例8假丝酵母扩培发酵乙醇对照实验
采用CN101165166A中公开的方法
菌种：热带假丝酵母Candida tropicalis
培养基：酵母浸膏3g/L、KH2PO43g/L、麦芽提取物3g/L、(NH4)2SO41g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、胰蛋白胨3g/L，其余为木质纤维素水解产物原液，pH5.0-5.5。
培养条件：连续发酵培养，30℃，80rpm，接种量为10％。
实施例9酿酒酵母发酵玉米秸秆制备乙醇实验（三级扩培）
扩培培养基：一级及二级扩培培养基参考实施例4，三级扩培培养基参考实施例2。
发酵培养基：参考实施例2-4。
步骤（1）：将玉米秸秆破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；
步骤（2）：在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量2%的稀释硫酸溶液，进入酸混合罐混合后得到酸性纤维素原料；
步骤（3）：步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPa(G)的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面。
步骤（4）：将生物质处理产物水洗，调节pH值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合搅拌72h，得到酶解液。
步骤（5）：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种YEPD培养基，培养14h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，按接种量5%，将菌体接至50L扩培发酵罐中，14h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，移至500L发酵罐中扩培16h，扩培至（0.2-0.3）×109/ml，之后移至5立方扩培发酵罐中，16h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，移至30立方发酵罐中发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度。
实施例10酿酒酵母发酵玉米秸秆制备乙醇实验（四级扩培）
扩培培养基：一级及二级扩培培养基参考实施例4，三级及四级扩培培养基参考实施例2。
发酵培养基：参考实施例2-4。
步骤（1）：将玉米秸秆破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；
步骤（2）：在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量2%的稀释硫酸溶液，进入酸混合罐混合后得到酸性纤维素原料；
步骤（3）：步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPaG的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面。
步骤（4）：将生物质处理产物水洗，调节pH值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合72h，得到酶解液。
步骤（5）：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种YEPD培养基，培养20h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，按接种量5%，接种至50L扩培罐，14h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，移至500L扩培罐中扩培14h，扩培至（0.2-0.3）×109/ml，移至5立方扩培罐，16h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，移至30立方扩培罐，16h扩培至（0.2-0.3）×109/ml，移至100立方发酵罐中发酵72h，
获得发酵产物，检测乙醇浓度。
实施例11试验结果
Claims (47)
1.一种生产乙醇的方法，包括采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种至扩大培养基中扩大培养，将扩大培养后的微生物移至发酵培养液中发酵24-72h，分离发酵培养液获得乙醇，其中发酵培养液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%。
2.权利要求1所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的发酵培养液为木质纤维素原料酶解液。
3.权利要求1-2任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述发酵培养液中含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏一种或几种，含量为5-10g/L。
4.权利要求3所述的发酵生产乙醇的方法，其特征在于黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏一种或几种的含量为6-8g/L。
5.权利要求3-4任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述发酵培养液中含有玉米浆。
6.权利要求1-5任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述发酵培养液中含有无机盐，所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L。
7.权利要求6任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述发酵培养液中含有无机盐，所述的无机盐在发酵液中的含量为1-2.5g/L。
8.权利要求6-7任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述发酵培养液中含有无机盐，所述的无机盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二铵。
9.权利要求1-8任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于扩大培养采用二级扩大培养、三级扩大培养或四级扩大培养。
10.权利要求9所述的生产乙醇的方法，其特征在于采用三级扩大培养：YEPD培养基培养后，接种5-20%的微生物至50L扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×109/ml，移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至(0.1-0.5)×109/ml，移至5立方扩培罐中，12-24h扩培至(0.1-0.5)×109/ml。
11.权利要求9所述的生产乙醇的方法，其特征在于采用四级扩培，YEPD培养基培养后，接种5-20%的微生物至50L扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×109/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至(0.1-0.5)×109/ml，移至5立方扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×109/ml，移至30立方扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×109/ml。
12.权利要求1-11任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计含量2-10%。
13.权利要求12任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计含量为4-6%。
14.权利要求12所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基为按重量百分比含有葡萄糖1-25%和木糖1-10%的木质纤维素原料酶解液。
15.权利要求12-14所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基中还含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、蛋白胨和/或酵母膏中的一种或几种，其含量为5-10g/L。
16.权利要求12-15任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基中还含有尿素、无机盐，所述的尿素的含量为2-5g/L，所述的无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L。
17.权利要求16所述的生产乙醇的方法，其特征在所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种。
18.权利要求17所述的生产乙醇的方法，其特征在所述的无机盐为1.5g/L磷酸二氢钾和1.5g/L磷酸氢二铵。
19.权利要求1-18任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养步骤中pH值为pH4-6.5。
20.权利要求1-19任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的种子培养基为YEPD培养基。
21.权利要求1-20所述的生产乙醇的方法，其特征在所述的于所述的C5/C6共发酵微生物为细菌、真菌和酵母酿酒中的一种或几种。
22.权利要求21所述的生产乙醇的方法，其特征在所述的于所述的C5/C6共发酵微生物选自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、嗜鞣管囊酵母Pachysolen tannophilus、树干毕赤酵母Pichia stipitis、休哈塔假丝酵母Candida shehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纤细假丝酵母Candida tenuis、热带假丝酵母Candida tropicalis和赛沟毕赤酵母Pichiasegobiensis、多动拟杆菌Bacteroides polypragmatus、菊欧文氏杆菌Erwiniachrysanthem、植物克雷伯杆菌Klebsiella planticola、嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus、球状螺旋体Spirochaeta coccoidessp.、植物发酵梭菌Clostridiumphytofermentassp.、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、粗糙脉孢菌Neurospora crassa和燕麦镰刀菌Fusarium avenaceum、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis和大肠杆菌Escherichia coli中的一种或几种。
23.权利要求22所述的发酵生产乙醇的方法，其特征在所述的于所述的C5/C6共发酵微生物选自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis。
24.一种生产乙醇的方法，其特征在于包括采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至发酵培养液中发酵24-72h，分离发酵培养液获得乙醇，其中发酵培养液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%、5-10g/L玉米浆、1-2g/L磷酸二氢钾和1-2g/L磷酸氢二铵。
25.一种生产乙醇的方法，其特征在于采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种量5%-20%接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至发酵培养液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇，其中发酵培养液中为木质纤维素原料酶解液，并且发酵培养液中含有5-10g/L玉米浆、1-2g/L磷酸二氢钾和1-2g/L磷酸氢二铵。
26.一种生产乙醇的方法，其特征在于采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h培养至(0.1-0.5)×109/ml，接种量5%-20%接种扩大培养至(0.2-0.3)×109/ml，将扩大培养后的微生物移至发酵培养液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇，其中发酵培养液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%、5-10g/L玉米浆、1-2g/L磷酸二氢钾和1-2g/L磷酸氢二铵。
27.权利要求24-26任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养步骤中培养基含有以质量百分比计4-6%葡萄糖、10-20g/L玉米浆、KH2PO41-2g/L，(NH4)2HPO41-2g/L，尿素1-3g/L。
28.权利要求24-26任意项所述的生产乙醇的方法，其特征在于所述的扩大培养步骤中的培养基含有玉米糖化醪，尿素1-3g/L，所述玉米糖化醪浓度以葡萄糖计质量百分比为4-6%。
29.一种扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，其特征在于采用种子培养基将发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，所述的扩大培养的培养基含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计含量2-10%。
30.权利要求29所述的一种扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，其特征在于采用种子培养基将发酵微生物培养2-24h培养至(0.1-0.5)×109/ml，接种扩大培养至(0.1-1)×109/ml。
31.权利要求29-30任意项所述的扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计含量为4-6%。
32.权利要求29-31任意项所述的扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基为按重量百分比含有木糖1-10%的木质纤维素原料酶解液。
33.权利要求29-32任意项所述的扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基中还含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉和/或酵母膏中的一种或几种，其含量为5-10g/L。
34.权利要求29-33任意项所述的扩大培养C5/C6共发酵微生物的方法，其特征在于所述的扩大培养的培养基中还含有尿素和/或无机盐，所述的尿素的含量为2-5g/L，所述的无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L。
35.一种用于C5/C6共发酵微生物的培养基，包括：（1）玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种；（2）黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、蛋白胨或酵母膏中的一种或几种，其在培养基中含量为5-10g/L；任选的含有（3）尿素，其在培养基中含量为2-5g/L；（4）无机盐，选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，其在培养基中为0.5-4g/L；（5）任选的含有抑制剂，选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，所述的抑制剂工作浓度为2-20单位/mL，所述培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计为2-10%。
36.权利要求35所述的用于C5/C6共发酵微生物的培养基，其特征在于：（2）黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种的含量为6-8g/L。
37.权利要求35-36任意项所述的用于C5/C6共发酵微生物的培养基，其特征在于（3）尿素的含量为3-4g/L。
38.权利要求35-37任意项所述的用于C5/C6共发酵微生物的培养基，其特征在于（4）无机盐的含量为磷酸二氢钾和磷酸氢二铵。
39.权利要求35-38任意项所述的用于C5/C6共发酵微生物的培养基，其特征在于所述培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计为4-6%。
40.权利要求35-39任意项所述的用于C5/C6共发酵微生物的培养基，其特征在于（5）抑制剂为青霉素或/链霉素，所述的抑制剂工作浓度为2-20单位/mL。
41.一种从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，包括：（1）将含木质纤维素原料经过酶解处理后得到木质纤维素原料酶解液；（2）采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h；（3）接种扩大培养；（4）将扩大培养后的微生物移至木质纤维素原料酶解液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇。
42.权利要求41所述的一种从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，其特征在于：（2）采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h培养至(0.1-0.5)×109/ml；并且（3）接种扩大培养至(0.1-1)×109/ml。
43.权利要求41-42任意项所述的从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，其特征在于：步骤（4）中木质纤维素原料酶解液中还加入黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏一种或几种，含量为5-10g/L。
44.权利要求43所述的从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，其特征在于步骤（4）中木质纤维素原料酶解液中还加入玉米浆。
45.权利要求41-44所述的从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，其特征在于步骤（4）中木质纤维素原料酶解液中还加入无机盐，所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L。
46.权利要求45所述的从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，其特征在于所述的无机盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二铵。
47.权利要求41-46所述的从含木质纤维素原料制备乙醇的方法，其特征在于步骤（3）中扩大培养的培养基含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种；蛋白胨、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种，其在培养基中含量为5-10g/L；任选的尿素，其在培养基中含量为2-5g/L；无机盐，选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，其在培养基中为0.5-4g/L。
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