CN105543301B - 粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于产油微生物培养技术领域，提供一种粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法，具体的，将生物柴油副产物粗甘油和木质纤维素水解液按比例混合调配，使混合物的C/N比适中，这样原料混合液中的甘油和碳水化合物均彻底转化且主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量积累。本方法实现非常简单，可以有效避免粗甘油作为原料油脂发酵过程中需额外添加氮源营养，以及木质纤维素水解液作为原料进行油脂发酵前需脱氮和/或除磷处理的问题，很大程度上降低了原料成本和过程操作成本，具有明显的综合技术优势。从产油微生物菌体提取的微生物油脂可作为制备生物柴油和油脂化工产品的原料。
Description
技术领域
本发明属于产油微生物的培养技术领域，尤其涉及一种粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法。
背景技术
自然界中某些微生物在特定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物、二氧化碳等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％(w/w，这里w/w表示质量比，下同)的微生物称为产油微生物。某些产油微生物胞内积累的油脂甚至超过其细胞干重的70％。微生物油脂，尤其是产油真菌产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，以C14-C22长链脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。微生物油脂不仅可以作为食用油或其他功能性油脂的替代品，还可以为生物柴油产业可持续发展提供原料。
培养基中缺乏产油微生物生长繁殖的必要成分或培养条件时，比如培养基中缺乏氮、磷、硫、铁、锌和溶氧等时，产油微生物生长繁殖被限制，会诱导油脂积累。通过氮限制实现产油微生物油脂积累是最常用的策略。油脂发酵过程中，随着氮源被耗尽，产油酵母生长受到抑制，碳水化合物主要导向油脂积累。然而，由于微生物油脂是胞内产物，合成大量的油脂，需要足够量的菌体。因此，当营养极其丰富时，碳水化合物不会导向油脂合成，当营养过度匮乏，菌体数量受到限制，均不利于油脂的大量生产。
2014年全球生物柴油生产量达到3000万吨，其生产过程中的副产物粗甘油超过300万吨，已经超过了市场的需求。虽然甘油是很多精细化工中必不可少的平台化合物，但粗甘油中存在着大量的酸、碱、无机盐、甲醇、有机酸、甚至一些重金属，不能够被直接应用于化学工业，而且纯化成本非常高。在一些国家和地区，粗甘油甚至被当做废水直接处理掉，不仅造成了资源的浪费，也引发了环境的污染。近年来，将生物柴油产业的副产物粗甘油转化为微生物油脂，作为生物柴油的原料，成为了研究热点。然而，由于粗甘油中氮源极度匮乏，导致菌体几乎不增殖，过少的菌体也不利于油脂的大量生产。目前主要通过添加适量的氮源营养，如酵母粉、蛋白胨、玉米浆以及其它富氮组分等，使产油微生物适量增殖，从而大量合成油脂。
木质纤维素材料来源广泛、是自然界中最丰富的可再生资源之一，全球年产高达1500亿吨，其化学成份主要是纤维素、半纤维素和木质素。纤维素完全水解主要产物为葡萄糖；半纤维素水解可得到木糖、***糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等的混合物。利用木质纤维素水解液培养产油微生物，有可能大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的原材料得到保障。然而，木质纤维素原料通常氮含量高，另外其降解过程中添加水解酶，也会引入一定量的氮源，导致水解液中C/N比很低，产油微生物以菌体增殖为主，油脂产量和油脂得率非常低，当前利用木质纤维素水解液培养产油微生物存在油脂产量低的突出问题。
因此目前产油微生物方法中，在粗甘油中添加氮源营养额外增加了成本；而木质纤维素水解液的脱氮除磷则不仅增加了工艺流程，还会造成碳水化合物的损失。以上两种原料各自用于微生物油脂生产时，所需成本均较高。为了充分利用粗甘油和木质纤维素资源，需要找到一种更简单、经济的方法，显著提高油脂产量和得率，提高微生物油脂的技术经济性。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法，旨在解决现有方法成本过高的技术问题。
在培养基中，过高或者过低的C/N比均不利于产油微生物积累油脂。粗甘油中由于氮源极度匮乏导致C/N比过高，而木质纤维素水解液中氮源丰富导致C/N比过低，两者分别作为原料独立培养产油微生物时，油脂产量均很低，本发明提出一种粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法，具体包括如下步骤：
预处理木质纤维素，按照2％-20％(w/w)的固液比，并添加适量的木质纤维素降解酶进行降解反应，得到木质纤维素水解液，所述水解液中包含有由木质纤维素降解得的可发酵性生物质糖；
将粗甘油与所述木质纤维素水解液按比例混合，得到产油微生物培养基，将产油微生物培养基的pH值调整为4.0-9.0，然后灭菌备用；其中所述粗甘油所含碳源占总碳源质量的20％-90％，所述生物质糖所含碳源占总碳源质量的10％-80％，控制C/N比为35-400；
取产油微生物并在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液；
将所述产油微生物种子液接种至所述产油微生物培养基中，接种量为2％-20％(v/v，体积比，下同，即种子液体积占产油微生物培养基体积的2％-20％)，于20℃-37℃通气培养，直至发酵液中残余甘油和糖的浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集产油微生物菌体。
必要时，还可以在产油微生物培养添加一些营养物质，比如占产油微生物培养基总质量0.01％-2％的氮源、占产油微生物培养基总质量0.01％-2％的磷源、占产油微生物培养基总质量0.01％-1％的硫源、占产油微生物培养基总质量0.001％以内的维生素，任取其一或者它们之间的任意组合。
本发明的有益效果是：由于粗甘油中氮源极度匮乏，C/N比过高，木质纤维素水解液中氮源丰富，C/N比过低，两者分别作为原料培养产油微生物时，油脂产量均很低。本发明提供了一种培养产油微生物的新的方法，将粗甘油和木质纤维素水解液混合，使碳源中粗甘油中的碳源占碳源总量的20％-90％，木质纤维素中的碳源占碳源总量的10％-80％，合理调整C/N比至35-400，使得甘油和碳水化合物均彻底转化且主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量的积累；方法极其简单，显著提高了原料的转化率和微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔应用前景；该方法获得的产油微生物具体含有一种或多种脂肪酸及其衍生物，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品；与粗甘油和木质纤维素水解液分别作为原料制备微生物油脂技术相比，本发明同时转化利用粗甘油和木质纤维素制备微生物油脂，可节约设备及占地成本，具有非常好的应用前景。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明通过将粗甘油和木质纤维素混合调配，使混合物的C/N比适中，这样原料中的甘油和碳水化合物均可彻底利用且主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量的积累。方法极其简单，从而避免了两者各自作为原料油脂发酵过程中粗甘油中额外添加氮源营养，以及木质纤维素水解液的脱氮和/或除磷，大大降低了原料成本和过程操作成本，具有明显的综合技术优势。
本发明方法具体包括如下步骤：
步骤S101、预处理木质纤维素，按照2％-20％(w/w)的固液比，并添加适量的木质纤维素降解酶进行降解反应，得到木质纤维素水解液，所述水解液中包含有由木质纤维素降解得的可发酵性生物质糖。
本步骤采用常用的物理、化学、物理化学或生物的方法预处理木质纤维素，按照2％-20％(w/w)的固液比，添加适量的木质纤维素降解酶，将预处理的木质纤维素中的纤维素和半纤维素降解成可发酵性生物质糖，包括但不限于葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖、甘露糖、纤维寡糖、木寡糖、半乳糖醛酸等。
本发明所适用的木质纤维素为主要成份为纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料。包括玉米秸秆、玉米芯、稻草、稻壳和麦秆等农业生物质，树木、枝杈和锯末等林业生物质，甘蔗渣、甜菜渣和甜高粱渣等工业生物质，水葫芦和稗子等杂草，柳枝稷和芒草等能源植物中的一种或二种以上组合。所述木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、果胶酶等的一种或它们的组合。
步骤S102、将粗甘油与所述木质纤维素水解液按比例混合，得到产油微生物培养基，将产油微生物培养基的pH值调整为4.0-9.0，然后灭菌备用；其中所述粗甘油所含碳源占总碳源质量的20％-90％，所述生物质糖所含碳源占总碳源质量的10％-80％，控制C/N比为35-400。
本步骤将粗甘油与所述木质纤维素水解液按比例混合，制备产油微生物培养基。所述粗甘油为各种动植物油脂(如动物油、屠宰场含油下脚料、大豆油、玉米油、蓖麻油、菜籽油、棕榈油等)，地沟油和微生物油脂等与短链醇经酯化或转酯化工艺制备生物柴油过程的副产物，主要成分为甘油水溶液，还含有一定量的酸、碱、甲醇和无机盐等杂质。在产油微生物培养基中不添加或添加少量营养物质，包括氮源、磷源、硫源和维生素，如酵母粉、蛋白胨、铵盐、硫酸盐、磷酸盐、硫胺素等或它们的组合，其中氮源占产油微生物培养基总质量的0.01％-2％、磷源占产油微生物培养基总质量的0.01％-2％、硫源占产油微生物培养基总质量的0.01％-1％、维生素占产油微生物培养基总质量的0.001％以内。
在选择粗甘油与所述木质纤维素水解液的混配比例时，粗甘油所含碳源占总碳源质量的20％-90％，所述生物质糖所含碳源占总碳源质量的10％-80％，使得混合液中C/N比为35-400，这样甘油和碳水化合物均彻底利用且主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量积累。
然后调整产油微生物培养基pH为4.0-9.0之间，然后灭菌备用。
步骤S103、取产油微生物并在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液。
所述产油微生物为经发酵后菌体油脂含量可超过细胞干重20％的真核微生物，它们包括但不限于下列之一：油脂酵母(如斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi)、红酵母(如圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、粘红酵母Rhodotorula glutinis和掷孢酵母Sporobolomyces roseus)、丝孢酵母(如皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum和发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans)、隐球酵母(如白色隐球酵母Cryptococcus albidus和弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus)、霉菌(如伯顿拟内孢霉Endomycopsis burtonii、健强地霉Geotrichum robustum、深黄被孢霉Mortierella isabellina和卷枝毛霉Mucorcircinelloides)。这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、或英国国家菌株保藏中心(UKNCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。
在种子培养基中接入所述产油微生物，温度设置为30℃，200rpm振荡培养24h，得到产油微生物种子液。
步骤S104、将所述产油微生物种子液接种至所述产油微生物培养基中，接种量为2％-20％(v/v)，于20℃-37℃通气培养，直至发酵液中残余甘油和糖的浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集产油微生物菌体。
向产油微生物培养基中接种产油微生物种子液，接种量2％-20％(v/v)，在20℃-37℃下通气培养，至发酵液中残余甘油和残糖浓度低于5g/L，终止发酵，发酵液经离心、洗涤，收集菌体沉淀。菌体在105℃干燥至恒重，即得干菌体。如有需要，还可以使用酸热-有机溶剂法从收集的菌体中抽提获得油脂，计算菌体油脂含量。进一步的，还可以将收集到的产油微生物菌体制备成所需的微生物油脂。所述微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油，比如在酸催化条件下转酯化制备生物柴油；或参照文献(里伟，等.过程工程学报,2007,7(1):137–140)的方法，提取微生物油脂，在酶催化条件下转酯化制备生物柴油。另外，微生物油脂含有的不饱和脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。
下面通过具体实施例来对本发明进行说明。以下实施例选取了典型的木质纤维素和粗甘油原料为材料培养典型产油微生物的例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油菌株。
对比例1
1)将地沟油经两阶段法制备生物柴油，所得副产物粗甘油稀释至50g/L，C/N比1244，调节pH至6.0，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养72h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余的甘油浓度为24g/L，发酵第48h开始，甘油基本不再消耗；固液分离收集菌体，得干菌体7.0g/L，油脂量4.9g/L，油脂含量70.1％(w/w)。
对比例2
1)玉米秸秆水解液的制备：称取100g过20目筛的玉米秸秆，加入1L 2％(w/w)的稀硫酸中，固液比10％(w/w)，于120℃预处理60min；调整固液比至8％(w/w)，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清液，得到培养基，其中葡萄糖和木糖浓度分别为22.1g/L和15.5g/L，C/N比27，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；
2)在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养72h；
4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖和木糖；固液分离收集菌体，得干菌体14.8g/L，油脂量3.7g/L，油脂含量25.2％(w/w)。
实施例1
1)粗甘油和玉米秸秆水解液混合物的制备：玉米秸秆预处理和酶水解同对比例2的步骤1)，添加粗甘油(地沟油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为40g/L，得到产油微生物培养基，C/N比76，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；
2)弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)在液体培养基(甘油20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L)中，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养120h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油、葡萄糖和木糖浓度分别为0g/L、0g/L和1.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体27.6g/L，油脂量14.8g/L，油脂含量53.6％(w/w)。
实施例2
1)粗甘油和稻草水解液混合物的制备：参照文献(Zhao J,Xia LM.Fuel ProcessTechnol,2009,90:1193–1197)，称取100g过20目筛的稻草，按1:8(w/w)的固液比加入0.8L0.5mol的NaOH，于80℃水浴锅中处理75min；调整固液比至10％(w/w)，添加纤维素酶20FPU/g、β-葡萄糖苷酶40CBU/g和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为31.2g/L和19.5g/L，添加粗甘油(大豆油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为30g/L，得到产油微生物培养基，C/N比88，调整pH至7.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)掷孢酵母Sporobolomyces roseus IAM 13481(购自日本JCM菌株保藏中心)接种在种子培养基(葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L)中，30℃，200rpm振荡培养24h，得微生物种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在30℃下通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油、葡萄糖和木糖浓度分别为2.8g/L、0g/L和1.0g/L；固液分离收集菌体，得干菌体21.9g/L，油脂量13.1g/L，油脂含量59.4％(w/w)。
实施例3
1)粗甘油和甘蔗渣水解液混合物的制备：参照文献(Li BZ,et al.BioresourTechnol,2010,101:1285–1292)，称取50g过40目筛的甘蔗渣，氨和甘蔗渣质量比2:1(w/w)，于140℃氨爆处理5min；调整固液比至20％(w/w)，添加纤维素酶30FPU/g、β-葡萄糖苷酶60CBU/g和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为56.2g/L和35.1g/L，添加粗甘油(菜籽油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为22.8g/L，得产油微生物培养基，C/N比42，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)健强地霉Geotrichum robustum CICC 1256(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，25℃，200rpm振荡培养28h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在25℃下通气培养180h；
4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到甘油和葡萄糖，残余木糖浓度为1.8g/L；固液分离收集菌体，得干菌体33.7g/L，油脂量17.2g/L，油脂含量51.1％(w/w)。
实施例4
1)粗甘油和甜菜渣水解液混合物的制备：参照文献(Ruan ZH,et al.BiotechnolBioeng,2013,110:1039–1049)，称取50g直径小于1mm的甜菜渣粉末，加入500mL 2％(w/w)的稀硫酸中，固液比10％(w/w)，于130℃处理60min；调整固液比至5％(w/w)，添加纤维素酶10FPU/g、β-葡萄糖苷酶20CBU/g和果胶酶100U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖、***糖和半乳糖醛酸浓度分别为10.2g/L、8.6g/L和6.5g/L，添加粗甘油(棕榈油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为80g/L，得到产油微生物培养基，C/N比195，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在液体种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L)中，32℃，200rpm振荡培养20h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在32℃下通气培养192h，得种子液；
4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸，甘油残余2.8g/L；固液分离收集菌体，得干菌体28.1g/L，油脂量17.4g/L，油脂含量61.9％(w/w)。
实施例5
1)粗甘油和玉米芯水解液混合物的制备：称取50g过20目筛的玉米芯，按100％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸润24h后，190℃水蒸汽气爆处理3min；调整固液比至15％(w/w)，添加纤维素酶20FPU/g、β-葡萄糖苷酶40CBU/g和木聚糖酶200U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为38.1g/L和34.4g/L，添加粗甘油(菜籽油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为60g/L，得到产油微生物培养基，C/N比132，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，20℃，200rpm振荡培养28h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量12％(v/v)，在20℃下通气培养240h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、木糖和甘油的浓度分别为0g/L，1.5g/L和3.4g/L；固液分离收集菌体，得干菌体36.9g/L，油脂量24.2g/L，油脂含量65.8％(w/w)。
实施例6
1)粗甘油和锯末水解液混合物的制备：参照文献(Krishnan C,et al.BiotechnolBioeng.2010,107:441–450)，以锯末为原料，粉碎过20目筛，加水成150％(w/w)的固液比，按2:1(w/w)混合氨水和稻草，140℃氨膨胀处理30min，冷却至50℃时，调整固液比为2％(w/w)，调pH 5.3，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶40U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为5.5g/L和4.4g/L，添加粗甘油(棕榈油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为90g/L，得到产油微生物培养基，C/N比400，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，玉米浆5g/L)中，37℃，200rpm振荡培养24h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在37℃下通气培养192h；
4)终止发酵，此时发酵液中检测不到葡萄糖和木糖，残余甘油为2.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体22.7g/L，油脂量16.5g/L，油脂含量72.8％(w/w)。
实施例7
1)粗甘油和云杉水解液混合物的制备：参照文献(Xie HB,et al.GreenChem.2012,14:1202–1210)，以20g云杉为原料，粉碎过20目筛，按照10％(w/w)的固液比加入乙基甲基咪唑醋酸液和N-甲基吡咯烷酮的混合液，140℃处理60min，冷却至50℃时，用甲醇再生麦秆，按照固液比20％(w/w)，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶40U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；上清中葡萄糖和木糖浓度分别为86.5g/L和40.4g/L，添加粗甘油(棕榈油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为31.7g/L，得到产油微生物培养基，C/N比59，调整pH至4.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)深黄被孢霉Mortierella isabellina ATCC 42613(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)接种在PDA种子培养基中，34℃，200rpm振荡培养24h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在34℃下通气培养252h；
4)终止发酵，此时发酵液中检测不到葡萄糖和木糖，残余甘油为2.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体44.7g/L，油脂量27.5g/L，油脂含量62.2％(w/w)。
实施例8
1)粗甘油和小麦杆水解液混合物的制备：参照文献(Perez JA,et al.Fuel,2008,87:3640–3647)的优化方法，称取50g过20目筛的小麦杆，进行高温水热预处理；调整固液比至4％(w/w)，添加纤维素酶10FPU/g和β-葡萄糖苷酶20CBU/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解24h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为10.2g/L和6.6g/L，添加粗甘油(光皮树果油脂制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为60g/L，得到产油微生物培养基，C/N比214，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)卷枝毛霉Mucor circinelloides AS 3.2208(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在PDA种子培养基中，25℃，200rpm振荡培养28h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在25℃下通气培养108h；
4)终止发酵，此时发酵液中未检测到葡萄糖、木糖和甘油；固液分离收集菌体，得干菌体20.9g/L，油脂量14.2g/L，油脂含量67.9％(w/w)。
实施例9
1)粗甘油和甜高粱渣水解液混合物的制备：参照文献(Perez JA,et al.Fuel,2008,87:3640–3647)的优化方法，称取50g过40目筛的甜高粱渣，进行高温水热预处理；调整固液比至5％(w/w)，添加纤维素酶10FPU/g和β-葡萄糖苷酶20CBU/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解24h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为13.1g/L和10.2g/L，添加粗甘油(弯曲隐球酵母油脂制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为25g/L，得到产油微生物培养基，C/N比68，调整pH至7.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，30℃，200rpm振荡培养28h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量2％(v/v)，在30℃下通气培养72h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余木糖0.5g/L；固液分离得干菌体20.1g/L，油脂量9.6g/L，油脂含量47.8％。
实施例10
1)粗甘油和柳枝稷水解液混合物的制备：参照文献(Varga E,et al.ApplBiochem Biotechnol,2004,113,509–523)的气爆方法，称取50g过40目筛的柳枝稷，进行气爆预处理；调整固液比至2％(w/w)，添加纤维素酶10FPU/g和β-葡萄糖苷酶20CBU/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为5.8g/L和3.2g/L，添加粗甘油(小桐子油脂制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为90g/L，得到产油微生物培养基，C/N比324，调整pH至8.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型培养物保藏中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L)中，28℃，200rpm振荡培养24h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在28℃下通气培养180h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油1.5g/L；固液分离收集菌体，得干菌体32.1g/L，油脂量18.5g/L，油脂含量57.8％(w/w)。
实施例11
1)粗甘油和芒草水解液混合物的制备：参照文献(Park JY,et al.BioresourTechnol,2010,101:6805–6811)，称取50g过40目筛的芒草进行生石灰预处理；调整固液比至8％(w/w)，添加纤维素酶10FPU/g和β-葡萄糖苷酶20CBU/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为21.2g/L和13.2g/L，添加粗甘油(猪油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为30g/L，得到产油微生物培养基，C/N比102，调整pH至4.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L)中，28℃，200rpm振荡培养48h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基种接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在28℃下通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为0g/L、1.3g/L和0g/L，最终得干菌体20.8g/L，油脂量11.7g/L，油脂含量56.3％(w/w)。
实施例12
1)粗甘油和稻壳水解液混合物的制备：参照文献(Zhang J,et al.BioresourTechnol,2011,102:4480–4488)，以稻壳为原料，干燥，粉碎过40目筛，并用2.5％的硫酸浸渍18h,190℃蒸汽处理3min后，稀释至料液比为10％(w/w)，调pH 4.8；添加纤维素酶10FPU/g，β-葡萄糖苷酶20CBU/g，木聚糖酶40U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为32g/L和19.2g/L，添加粗甘油(废餐饮油制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为12.8g/L，得到产油微生物培养基，C/N比35，调整pH至9.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型培养物保藏中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，25℃，200rpm振荡培养28h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量2％(v/v)，在25℃下通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中未检测到葡萄糖、木糖和甘油，最终得干菌体24.1g/L，油脂量11.8g/L，油脂含量49.1％(w/w)。
实施例13
1)粗甘油和水葫芦水解液混合物的制备：参照文献(Zhu SD,et al.Biosyst Eng,2006,94:437–442)，以水葫芦为原料，洗净，干燥，粉碎过40目筛，进行微波辅助碱预处理，调整料液比为5％(w/w)；添加纤维素酶10FPU/g，β-葡萄糖苷酶20CBU/g，木聚糖酶40U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；离心得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为11.4g/L和8.8g/L，添加粗甘油(深黄被孢霉制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为80g/L，得到产油微生物培养基，C/N比186，调整pH至4.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC 1368(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，32℃，200rpm振荡培养28h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量12％(v/v)，在32℃下通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油2.7g/L，最终得干菌体27.7g/L，油脂量17.8g/L，油脂含量64.3％(w/w)。
实施例14
1)粗甘油和棉花秆水解液混合物的制备：参照文献(Singh P,et al.Word JMicrobiol Biot,2008,24,667–673)生物预处理的方法，称取50g过40目筛的棉花秆，采用白腐真菌固态发酵预处理；调整固液比至7％(w/w)，添加纤维素酶10FPU/g，β-葡萄糖苷酶20CBU/g和木聚糖酶50U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；真空抽滤得水解上清，上清中葡萄糖和木糖浓度分别为18.8g/L和11.5g/L，添加粗甘油(小桐子油脂制备生物柴油过程的副产物)至终浓度为50g/L，得到产油微生物培养基，C/N比92，调整pH至7.5后于121℃灭菌20min后备用；
2)弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型培养物保藏中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L)中，37℃，200rpm振荡培养24h；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在37℃下通气培养148h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油1.5g/L；固液分离收集菌体，得干菌体26.1g/L，油脂量14.5g/L，油脂含量55.6％(w/w)。
实施例15
参照文献(Liu B,Zhao ZK.J Chem Technol Biotechnol,2007,82(8):775–780)的方法，以实施例1获得的干菌体1.0g为材料，制备生物柴油，得生物柴油0.50g，收率为92％，所得生物柴油的辛烷值为58，适合作为柴油的替代品。
实施例16
参照文献(Li YH,et al.Enzyme Microb Technol,2007,41:312–317)的方法，从实施例10获得菌体中提取微生物油脂，得到0.30g。参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007,7(1),137–140)的方法，取0.25g油脂在酶催化条件下转酯化制备和纯化生物柴油，得到0.23g，生物柴油收率91％，所得生物柴油的辛烷值为59，适合作为柴油的替代品。
上述对比例1、2和实施例1-14的结果如下表所示：
通过比较对比例1、2和实施例1的实验结果发现，将粗甘油和木质纤维素水解液混合后，生物量(即干菌体含量)和油脂量都显著提高，并且大于对比例两者之和，且甘油和木质纤维素水解液中的主要碳水化合物葡萄糖和木糖基本可被彻底利用，总的油脂得率也明显提高。实施例2-14表明，采用粗甘油和木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂方法，能够实现甘油和碳水化合物的完全利用且主要导向油脂合成。因此，采用本发明方案培养产油微生物的油脂产量和原料利用效率均有提高，当大量生产时，可以明显降低成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
称取50g过20目筛的玉米芯，按100％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸润24h后，190℃水蒸汽气爆处理3min；调整固液比至15％(w/w)，添加纤维素酶20FPU/g、β-葡萄糖苷酶40CBU/g和木聚糖酶200U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；
真空抽滤水解液得到水解上清液，添加粗甘油至最终浓度为60g/L，得到产油微生物培养基，控制碳氮摩尔比C/N为132，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用，所述粗甘油是菜籽油制备生物柴油过程的副产物；
取白色隐球酵母，保藏号ATCC 56298，接种在YEPD种子培养基中，于20℃、200rpm振荡培养28h，得到产油微生物种子液，所述YEPD种子培养基中，葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L；
将所述产油微生物种子液接种至产油微生物培养基中，接种量12％(v/v)，在20℃下通气培养240h，终止发酵，固液分离收集产油微生物菌体。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，将收集到的产油微生物菌体提取油脂，作为制备生物柴油的原料。
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