CN112941120B - 一种利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于产油微生物培养技术领域，提供一种利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，该方法将VFAs预处理的木质纤维素原料和碱预处理的木质纤维素原料直接中和，其中含有高浓度的VFAs，可直接作为碳源发酵产油脂，预处理后的木质纤维素原料结构疏松，孔隙繁多，能吸附一定量的游离VFAs，使主体溶液中VFAs毒性降低，随着发酵进行，被吸附的VFAs缓慢释放至溶液中，可以有效避免高浓度VFAs作为原料油脂发酵过程中对细胞生长及油脂积累的负面影响；预处理后的木质纤维素原料经纤维素酶水解后，得到的糖液可直接被产油微生物利用；利用VFAs破胞，正己烷提取油脂后分离的液体中残留的VFAs可继续用于木质纤维素原料的预处理，大大降低了成本，具有显著的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于产油微生物培养技术领域，尤其涉及一种利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法。
背景技术
自然界中某些微生物在特定条件下，能够利用各种碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％(w/w，这里w/w 表示质量比，下同)的微生物称为产油微生物。某些产油酵母胞内积累的油脂甚至超过其细胞干重的80％。微生物油脂，尤其是产油酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，以C14-C22长链脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。微生物油脂不仅可以作为食用油或其他功能性油脂的替代品，还可以为生物柴油产业可持续发展提供原料。
由于微生物发酵过程中使用的碳源成本过高等原因，导致当前微生物油脂生产成本仍然高于植物油和动物油。可以考虑利用一些来源广泛、含量丰富、成本低廉和可持续发展的工农业废弃物，如木质纤维类生物质、粗甘油、VFAs 和各种废水等，可以降低微生物油脂生产的成本，同时缓解了环境污染问题。
对于挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)，其主要成分是乙酸，其次是丙酸和丁酸。近年由厌氧发酵制氢废水、食物残渣、人或动物粪便、工业废水和废物活性污泥等各种有机废弃物的厌氧发酵产生的VFAs逐渐增多，将废弃物产生的VFAs在一定的培养条件下，由产油微生物生物转化为高附加值的微生物油脂，可以降低油脂生产成本。且相对于糖类物质，VFAs转化为油脂的重要前体的途径相对更短，是一种较好的油脂积累的候选物质。
但是VFAs作为碳源物质，当VFAs的浓度高于10g/L时，会对产油微生物的细胞生长产生不利影响，VFAs的利用率和油脂产量急剧下降。VFAs对微生物细胞的不良影响主要是由酸分子的非解离形式引起的。亲脂性非解离型 VFAs渗透到质膜中，在细胞内解离成氢离子和相应的阴离子，导致细胞酸化，对细胞代谢产生应激。产油微生物具有一系列调控机制来控制氢离子进入和离开细胞，以维持接近中性的细胞内环境。然而，这种能力是有限的适应和调节。因此如果用VFAs作为碳源，从目前技术思路来看，利用VFAs产微生物油脂效果仍不理想。
另外，目前也有通过木质纤维素产微生物油脂的方法。木质纤维素材料来源广泛，是自然界中最丰富的可再生资源之一，其化学成份主要是纤维素、半纤维素和木质素，蕴藏着巨大的碳水化合物资源。纤维素完全水解主要产物为葡萄糖；半纤维素水解可得到木糖、***糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等的混合物。廉价的木质纤维素原料主要有以玉米秸秆、玉米芯、稻草和麦秆为代表的农业废弃物，以树木、枝杈和锯末为代表的林业废弃物，以甘蔗渣和甜高粱渣等为代表的工业废弃物等。然而，基于生物质的抗降解特性，当前木质纤维类原料生物转化的技术经济性不如传统的糖质原料。木质纤维素通常需要先经过预处理，破坏其抗降解结构，提高木质纤维素的酶解效率，获得可发酵性糖。预处理是木质纤维素生物转化的共性难题。预处理过程通常需要加入化学试剂或者投入较高的能耗，成本较高。
因此目前产油微生物方法中，高浓度VFAs作为碳源会对细胞生长及油脂积累的负面影响。而木质纤维素原料为碳源，存在生产成本高、废水处理以及副产物资源化利用困难等突出问题。为了充分利用VFAs和木质纤维素资源，需要找到一种更简单、经济的方法，显著提高油脂产量和得率，提高微生物油脂的技术经济性。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，旨在解决现有利用VFAs产微生物油脂效率和产量低、利用木质纤维素原料产微生物油脂成本高的技术问题。
本发明采用如下技术方案：
所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，包括下述步骤：
步骤S1、通过厌氧发酵制备VFAs溶液；
步骤S2、将木质纤维素原料与一定量VFAs溶液混合均匀并高温预处理，然后补水得到酸性再生木质纤维素原料；
步骤S3、将木质纤维素原料与一定量碱溶液混合均匀并高温预处理，然后补水得到碱性再生木质纤维素原料；
步骤S4、将酸性碱性两种再生木质纤维素原料直接中和，调整pH值为中性，然后进行灭菌处理，得到产油微生物培养基；
步骤S5、取产油微生物于种子培养基中培养，得到产油微生物种子液；
步骤S6、将所述产油微生物种子液接种至所述产油微生物培养基中通气发酵培养，直至发酵培养液中残余VFAs的浓度低于5g/L；
步骤S7、调整pH值并加入适量木质纤维素降解酶，将再生木质纤维素原料水解成可发酵性生物质糖，同时继续发酵，直至发酵液中残余总糖浓度低于 5g/L后终止发酵；
步骤S8、固液分离收集产油微生物菌体，利用VFAs溶液，在高温下处理产油微生物菌体，裂解菌体细胞，然后用提取剂提取油脂，提取后剩余液相中残留有VFAs，调整VFAs浓度后返回步骤S2预处理木质纤维素。
进一步的，所述步骤S1具体过程为：选取不同来源的有机废弃物置于发酵罐中，调整pH值为4.5-6.5，反应温度为30℃-40℃，厌氧发酵，经固液分离，得到高浓度的VFAs溶液，所述VFAs溶液中包含可供产油微生物利用的短链 VFAs。
进一步的，VFAs溶液为短链脂肪酸的混合物，包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸，总浓度为10g/L-70g/L，混合物中乙酸含量最高，然后为丙酸和丁酸。
进一步的，步骤S2中，木质纤维素原料与VFAs溶液按照固液质量比10％-30％混合均匀并高温预处理，补水至固液质量比5％-20％得到酸性再生木质纤维素原料；步骤S3中，木质纤维素原料与质量浓度0.5％-5％的碱溶液按照固液质量比10％-30％混合均匀并高温预处理，补水至固液质量比5％-20％得到碱性再生木质纤维素原料，碱溶液由氧化钙或氢氧化钙制备得到。
进一步的，步骤S2、S3中，高温预处理的温度为80℃-180℃，时间为15 min-4h。
进一步的，步骤S6中，产油微生物种子液的接种量为2％-20％，接种量为体积比，于20℃-37℃通气培养；步骤S7中，调整pH值为4-8。
进一步的，步骤S8中，VFAs溶液在高温70℃-85℃下处理产油微生物菌体裂解菌体细胞0.5h-2h。
进一步的，木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、果胶酶中的一种或一种以上的组合，水解得到的可发酵性生物质糖包含葡萄糖和木糖，还含有***糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖和半乳糖醛酸。
本发明的有益效果是：本发明将经过VFAs预处理的木质纤维素原料与经过碱预处理的木质纤维素原料直接中和，简单调节pH和灭菌后作为产油微生物培养基，木质纤维素原料经过VFAs预处理后，木质纤维素原料结构疏松，孔隙繁多，可以吸附一定量的游离VFAs，使得发酵液中VFAs分子相对浓度降低，随着发酵时间变化，游离VFAs慢慢释放继续发酵，因此发酵液中可以保持较低浓度VFAs以降低对细胞的毒性，发酵效率大大提高，从而实现油脂的大量积累，减少了后续脱毒、中和的过程，操作过程比较简单；另外，VFAs 和碱溶液分别预处理介质处理木质纤维素原料，可显著提高木质纤维素的酶可及性；此外，VFAs还可以用于裂解菌体细胞，促进油脂提取，液相部分残留的大量的VFAs可回收利用，提高了VFAs利用效率。
因此本发明提供的利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，油脂转化效率高、产量高，还可以实现原料循环利用，大大降低了成本，具有非常好的应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明提供的利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，包括下述步骤：
步骤S1、通过厌氧发酵制备VFAs溶液。
选取不同来源的有机废弃物置于发酵罐中，有机废弃物包括食物残渣、人类或动物粪便、活性污泥、高含量有机废水之一等或者以上组合进行厌氧发酵。调整pH值为4.5-6.5，反应温度为30℃-40℃，厌氧发酵，经固液分离，得到高浓度的VFAs溶液，所述VFAs溶液中包含可供产油微生物利用且具有挥发性短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸，VFAs浓度可以达到10g/L-70g/L，混合物中乙酸含量最高，质量百分含量达到了 40％-70％，然后为丙酸和丁酸。
步骤S2、将木质纤维素原料与一定量VFAs溶液混合均匀并高温预处理，然后补水得到酸性再生木质纤维素原料。
取一定量VFAs溶液，将木质纤维素原料与VFAs溶液按照固液质量比 10％-30％混合均匀并高温预处理，高温预处理的温度为80℃-180℃，时间为15 min-4h，补水至固液质量比5％-20％，得到酸性再生木质纤维素原料。
木质纤维素为主要成份为纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料。包括玉米秸秆、玉米芯、稻草、稻壳和麦秆等农业生物质，树木、枝杈和锯末等林业生物质，甘蔗渣、甜菜渣和甜高粱渣等工业生物质，水葫芦和稗子等杂草，柳枝稷和芒草等能源植物中的一种或二种以上组合。
步骤S3、将木质纤维素原料与一定量碱溶液混合均匀并高温预处理，然后补水得到碱性再生木质纤维素原料。
将木质纤维素原料与质量浓度0.5％-5％的碱溶液按照固液质量比10％-30％混合均匀并高温预处理，高温预处理的温度为80℃-180℃，时间为15min-4h，补水至固液质量比5％-20％，得到碱性再生木质纤维素原料，碱溶液由氧化钙或氢氧化钙制备得到。
步骤S4、将酸性碱性两种再生木质纤维素原料直接中和，调整pH值为中性，然后进行灭菌处理，得到产油微生物培养基。
步骤S5、取产油微生物于种子培养基中培养，得到产油微生物种子液。
所述产油微生物为经发酵后菌体油脂含量可超过细胞干重20％的真核微生物，它们包括但不限于下列之一：油脂酵母(如毛孢子油脂酵母 Cutaneotrichosporonoleaginosum和斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi)、红酵母(如圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、粘红酵母Rhodotorula glutinis 和掷孢酵母Sporobolomyces roseus)、丝孢酵母(如皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum)、隐球酵母(如白色隐球酵母Cryptococcus albidus)、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica、霉菌(如健强地霉Geotrichum robustum和深黄被孢霉 Mortierella isabellina)。这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、或英国国家菌株保藏中心(UKNCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。
在种子培养基中接入所述产油微生物，温度设置为30℃，200rpm振荡培养24h，得到产油微生物种子液。
步骤S6、将所述产油微生物种子液接种至所述产油微生物培养基中通气发酵培养，直至发酵培养液中残余VFAs的浓度低于5g/L。
产油微生物种子液的接种量为2％-20％，接种量为体积比，于20℃-37℃通气培养。
步骤S7、调整pH值至4-8，并加入适量木质纤维素降解酶，将再生木质纤维素原料水解成可发酵性生物质糖，同时继续发酵，直至发酵液中残余总糖浓度低于5g/L后终止发酵。
木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、果胶酶中的一种或一种以上的组合，水解得到的可发酵性生物质糖包含葡萄糖和木糖，还含有***糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖和半乳糖醛酸。
步骤S8、固液分离收集产油微生物菌体，利用VFAs溶液，在高温下处理产油微生物菌体裂解菌体细胞，然后用提取剂提取油脂，提取后剩余液相中残留有VFAs，调整VFAs浓度后返回步骤S2预处理木质纤维素。
发酵终止后发酵液经离心、洗涤，收集菌体沉淀。菌体在105℃干燥至恒重，即得干菌体，使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，计算菌体油脂含量。具体的，利用高浓度VFAs溶液，在高温70℃-85℃下处理0.5h-2h裂解菌体细胞，然后用正己烷提取油脂，液相回收利用，液相中残留有VFAs，调整浓度 (比如通过浓缩提高VFAs的浓度)返回步骤S2再循环用于预处理木质纤维素。这里微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油。微生物油脂含有的不饱和脂肪酸、奇数碳脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。
本发明中，再生木质纤维素原料能够吸附一定量的游离VFAs，使发酵液中的VFAs分子相对浓度降低，随着发酵时间变化，游离VFAs慢慢释放，发酵液对细胞毒性降低，发酵效率大大提高，从而实现油脂的大量积累。VFAs 溶液和碱溶液作为预处理介质处理木质纤维素原料，可显著提高木质纤维素的酶可及性，VFAs可先后作为木质纤维素的预处理介质和产油微生物的碳源被转换为微生物油脂；木质纤维素原料边水解边发酵，减少了葡萄糖效应。VFAs 溶液在高温条件下也能使细胞裂解，促进油脂提取。液相部分残留了大量的VFAs可回收利用，再次用于预处理木质纤维素和细胞裂解。
因此，综上本发明通过将VFAs预处理的木质纤维素原料与经过碱预处理的木质纤维素原料木质纤维素原料直接中和，降低高浓度VFAs对细胞的毒性，后续酶水解获得大量可发酵性糖，VFAs和糖可作为碳源，强化油脂发酵过程，生产微生物油脂。
下面通过具体实施例和对比例来对本发明进行说明。以下实施例选取了典型的VFAs和木质纤维素原料为材料培养典型产油微生物的例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油菌株。
对比例1
1)将有机废水置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为5.5，反应温度为37℃，厌氧发酵48h，经固液分离，得到高浓度VFAs溶液，将 VFAs溶液稀释至10g/L，调节pH至7.0，所得发酵液作为培养基于121℃灭菌15min后备用；
2)在种子培养基(葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L)中接入毛孢子油脂酵母Cutaneotrichosporon oleaginosum ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在43℃下通气培养72h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余的VFAs浓度为1.8g/L，发酵过程中，VFAs消耗速率较低，固液分离收集菌体，得干菌体2.0g/L；
5)将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温80℃下处理2h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量0.9g/L，油脂含量45％(w/w)。
对比例2
1)玉米秸秆水解液的制备：称取100g过20目筛的玉米秸秆，加入1L 2％ (w/w)的稀硫酸中，固液比10％(w/w)，于120℃预处理60min；调整固液比至10％(w/w)，添加纤维素酶15FPU/g，β-葡萄糖苷酶15CBU/g和木聚糖酶100U/g,调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清液，得到培养基，其中葡萄糖和木糖浓度分别为22.1g/L和15.5g/L，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；
2)在种子培养基(葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L)中接入毛孢子油脂酵母C.oleaginosum ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养240h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余糖的浓度为0g/L，固液分离收集菌体，得干菌体12.8g/L；
5)将干菌体用质量浓度为5％的VFAs溶液，在高温80℃下处理2h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量5.5g/L，油脂含量43％(w/w)。
实施例1：
1)废弃果皮厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生玉米秸秆的制备：将废弃果皮置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为5.5，反应温度为 35℃，厌氧发酵36h，经固液分离，得到含有65g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g过20目筛的玉米秸秆，按照固液比20％(w/w)加入至VFAs 溶液中，于120℃预处理60min，然后加水至固液质量比10％，得到偏酸性的再生秸秆；再称取100g过20目筛的玉米秸秆，按照固液比10％(w/w)加入至浓度为2％(w/w)的氢氧化钙溶液中，于100℃预处理60min，然后加水至固液质量比5％，得到偏碱性的再生秸秆；两种再生秸秆直接中和，调整pH至 7.0后于121℃灭菌15min后备用；
2)毛孢子油脂酵母C.oleaginosum ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)在液体培养基(葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L) 中，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养120h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为0g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶20FPU/g，β-葡萄糖苷酶15CBU/g 和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 120h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0.7g/L，固液分离收集菌体，得干菌体20.7g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温80℃下处理2h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量11.4g/L，油脂含量55.1％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理和细胞的裂解提油。
实施例2
1)工业废水厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生稻草的制备：将工业废水置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为5.5，反应温度为37℃，厌氧发酵30h，经固液分离，得到含有70g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g过20目筛的稻草，按照固液比10％(w/w)加入至VFAs溶液中，于 140℃预处理60min，然后加水至固液质量比5％，得到偏酸性的再生稻草；再称取100g过20目筛的稻草，按照固液比10％(w/w)加入至浓度为2％(w/w) 的氢氧化钙溶液中，于100℃预处理120min，然后加水至固液质量比5％，得到偏碱性的再生稻草；两种再生稻草直接中和，调整pH至7.0后于121℃灭菌 20min后备用；
2)掷孢酵母Sporobolomyces roseus IAM 13481(购自日本JCM菌株保藏中心)接种在种子培养基(葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L)中，30℃，200rpm振荡培养24h，得微生物种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在30℃下通气培养120h，此时发酵液中未检测到 VFAs；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶25FPU/g，β-葡萄糖苷酶25CBU/g 调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养160h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为1g/L，固液分离收集菌体，得干菌体28.6g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温80℃下处理2h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量17.4g/L，油脂含量60.8％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例3
1)厨余垃圾厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生稻壳的制备：将厨余垃圾置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为5.5，反应温度为37℃，厌氧发酵40h，经固液分离，得到含有65g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g的稻壳，按照固液比10％(w/w)加入至VFAs溶液中，于120℃预处理120min，然后加水至固液质量比5％，得到偏酸性的再生稻壳；再称取100 g的稻壳，按照固液比20％(w/w)加入至浓度为5％(w/w)的氢氧化钙溶液中，于100℃预处理60min，然后加水至固液质量比10％，得到偏碱性的再生稻壳；两种再生稻壳直接中和，调整pH至7.0后于121℃灭菌15min后备用；
2)健强地霉Geotrichum robustum CICC 1256(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，25℃，200rpm振荡培养28h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在25℃下通气培养180h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为1.7g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶25FPU/g，β-葡萄糖苷酶25CBU/g 调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养240h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为1.8g/L，固液分离收集菌体，得干菌体19.9g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温78℃下处理1.5h 裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量10.5g/L，油脂含量52.8％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例4
1)工业废水厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生小麦杆的制备：VFAs制备同实施例2的步骤1)，称取80g直径小于1mm的小麦杆，按照固液比10％ (w/w)加入VFAs溶液中，于130℃预处理80min，然后加水至固液质量比 5％，得到偏酸性的再生小麦杆；再称取80g直径小于1mm的小麦杆，按照固液比10％(w/w)加入浓度为5％(w/w)的氧化钙溶液中，于120℃预处理 70min，然后加水至固液质量比5％，得到偏碱性的再生小麦杆；两种再生小麦杆直接中和，调整pH至7.0后于121℃灭菌20min后备用；
2)皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在液体种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L)中，32℃，200rpm振荡培养20h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在32℃下通气培养192h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为0g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶20FPU/g，木聚糖酶200U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养160h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0g/L，固液分离收集菌体，得干菌体25.9g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温80℃下处理2h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量15.2g/L，油脂含量58.7％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例5
1)废弃果皮厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生玉米芯的制备：VFAs制备同实施例1的步骤1)；称取100g过20目筛的玉米芯，按照固液比20％(w/w) 加入至VFAs溶液中，于120℃预处理60min，然后加水至固液质量比15％，得到偏酸性的再生玉米芯；再称取100g过20目筛的玉米芯，加入0.5L 5％ (w/w)的氢氧化钙溶液中，固液比20％(w/w)，于100℃预处理60min，然后加水至固液质量比15％，得到偏碱性的再生玉米芯；再生玉米芯直接中和，调整pH至7.0后于121℃灭菌15min后备用；
2)白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨 20g/L)中，20℃，200rpm振荡培养28h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量12％(v/v)，在20℃下通气培养130h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为0g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶15FPU/g，β-葡萄糖苷酶10CBU/g 和木聚糖酶200U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 150h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为1.5g/L，固液分离收集菌体，得干菌体26.9g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温75℃下处理1h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量14.2g/L，油脂含量52.8％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例6
1)活性污泥厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生甘蔗渣的制备：将活性污泥置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为5.0，反应温度为40℃，厌氧发酵38h，经固液分离，得到含有50g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g过40目筛的甘蔗渣，按照固液比20％(w/w)加入至VFAs溶液中，于160℃预处理60min，然后加水至固液质量比10％，得到偏酸性的再生甘蔗渣；再称取100g过40目筛的甘蔗渣，按照固液比20％(w/w)加入至浓度为 5％(w/w)的氧化钙溶液中，固液比20％(w/w)，于100℃预处理120min，然后加水至固液质量比10％，得到偏碱性的再生甘蔗渣；两种再生甘蔗渣直接中和，调整pH至7.0后于121℃灭菌30min后备用；
2)圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(葡萄糖20g/L，玉米浆5g/L)中， 37℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在37℃下通气培养144h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为0g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶15FPU/g，β-葡萄糖苷酶10CBU/g 和木聚糖酶200U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 144h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0g/L，固液分离收集菌体，得干菌体26.4g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温78℃下处理1h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量15.1g/L，油脂含量57.2％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例7
1)制氢废水厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生棉花杆的制备：将制氢废水置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为4.5，反应温度为30℃，厌氧发酵32h，经固液分离，得到含有62g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g过40目筛的棉花杆，按照固液比10％(w/w)加入至VFAs溶液中，于150℃预处理80min，然后加水至固液质量比8％，得到偏酸性的再生棉花杆；再称取100g过40目筛的棉花杆，按照固液比10％(w/w)加入至浓度为 3％(w/w)的氢氧化钙溶液中，于100℃预处理60min，然后加水至固液质量比8％，得到偏碱性的再生棉花杆；两种再生棉花杆直接中和，调整pH至7.0 后于121℃灭菌20min后备用；
2)深黄被孢霉Mortierella isabellina ATCC 42613(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)接种在PDA种子培养基中，34℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在35℃下通气培养180h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为0g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶20FPU/g，β-葡萄糖苷酶8CBU/g 和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 140h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0g/L，固液分离收集菌体，得干菌体23.7g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温78℃下处理1h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量12.9g/L，油脂含量54.4％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例8
1)厨余垃圾厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生锯末的制备：将厨余垃圾置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为5.0，反应温度为40℃，厌氧发酵2天，经固液分离，得到含有58g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取80g过20目筛的锯末，按照固液比10％(w/w)加入至VFAs溶液中，于 200℃预处理30min，然后加水至固液质量比5％，得到偏酸性的再生锯末；再称取80g过20目筛的锯末，按照固液比10％(w/w)加入至浓度为5％(w/w) 的氢氧化钙溶液中，于120℃预处理120min，然后加水至固液质量比5％，得到偏碱性的再生锯末；两种再生锯末直接中和，调整pH至7.0后于121℃灭菌 20min后备用；
2)解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica Po1g(购自中国台湾Yeastern BiotechCo., Ltd.)接种在PDA种子培养基中，25℃，200rpm振荡培养28h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在25℃下通气培养108h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为3.2g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶15FPU/g，β-葡萄糖苷酶10CBU/g 和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 120h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0g/L，固液分离收集菌体，得干菌体17.8g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温78℃下处理1h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量7.5g/L，油脂含量42.1％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例9
1)活性污泥厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生甜菜渣的制备：将活性污泥置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为4.5，反应温度为38℃，厌氧发酵30h，经固液分离，得到含有47g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g过40目筛的甜菜渣，按照固液比10％(w/w)加入至VFAs溶液中，于130℃预处理60min，然后加水至固液质量比5％，得到偏酸性的再生甜菜渣；再称取100g过40目筛的甜菜渣，按照固液比10％(w/w)加入至浓度为 5％(w/w)的氢氧化钙溶液中，于100℃预处理120min，然后加水至固液质量比5％，得到偏碱性的再生甜菜渣；两种再生甜菜渣直接中和，调整pH至7.0 后于121℃灭菌20min后备用；
2)粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨 5g/L)中，28℃，200rpm振荡培养20h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量2％(v/v)，在30℃下通气培养72h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为1.1g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶10FPU/g，β-葡萄糖苷酶20CBU/g 和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 120h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0.5g/L，固液分离收集菌体，得干菌体16.1g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温78℃下处理1h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量8.6g/L，油脂含量53.4％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
实施例10
1)制氢废水厌氧发酵生产的高浓度VFAs和再生水葫芦的制备：将制氢废水置于6L含有夹套的发酵罐中，调整发酵罐的pH值为4.9，反应温度为37℃，厌氧发酵2天，经固液分离，得到含有61g/L VFAs的高浓度VFAs溶液；称取100g过20目筛的水葫芦，按照固液比10％(w/w)加入至VFAs溶液中，于130℃预处理60min，然后加水至固液质量比5％，得到偏酸性的再生水葫芦；再称取100g过20目筛的水葫芦，按照固液比10％(w/w)加入至浓度为 5％(w/w)的氧化钙溶液中，于140℃预处理120min，然后加水至固液质量比5％，得到偏碱性的再生水葫芦；两种再生水葫芦直接中和，调整pH至7.0 后于121℃灭菌20min后备用；
2)斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3 g/L)中，28℃，200rpm振荡培养48h，得种子液；
3)向步骤1)所得产油微生物培养基中接入步骤2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在28℃下通气培养180h，此时发酵液中残余VFAs 浓度为1.5g/L；
4)向步骤3)所得发酵液添加纤维素酶20FPU/g，β-葡萄糖苷酶8CBU/g 和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.8，在30℃下通气培养，边水解边发酵培养 120h；
5)终止发酵，此时发酵液中残余糖浓度为0g/L，固液分离收集菌体，得干菌体22.1g/L，将干菌体用高浓度VFAs溶液，在高温80℃下处理1h裂解细胞，然后用正己烷提取油脂，油脂量12.5g/L，油脂含量56.6％(w/w)；液相中获得含VFAs的溶液，调整浓度，再循环用于木质纤维素的预处理。
上述对比例1、2和实施例1-10的结果如下表所示：
通过比较对比例1、2和实施例1的实验结果发现，本发明将用VFAs预处理的木质纤维素原料和用碱预处理的木质纤维素原料直接中和后，生物量(即干菌体含量)和油脂量都显著提高，且VFAs和木质纤维素水解液中的主要碳水化合物葡萄糖和木糖基本可被彻底利用，总的油脂得率也明显提高。
此外，实施例2-10表明，采用VFAs和木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂方法，能够实现VFAs和碳水化合物的完全利用且主要导向油脂合成。因此，采用本发明方案培养产油微生物的油脂产量和原料利用效率均有提高，当大量生产时，可以明显降低成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
步骤S1、通过厌氧发酵制备VFAs溶液；
步骤S2、将木质纤维素原料与一定量VFAs溶液混合均匀并高温预处理，然后补水得到酸性再生木质纤维素原料；
步骤S3、将木质纤维素原料与一定量碱溶液混合均匀并高温预处理，然后补水得到碱性再生木质纤维素原料；
步骤S4、将酸性碱性两种再生木质纤维素原料直接中和，调整pH值为中性，然后进行灭菌处理，得到产油微生物培养基；
步骤S5、取产油微生物于种子培养基中培养，得到产油微生物种子液；
步骤S6、将所述产油微生物种子液接种至所述产油微生物培养基中通气发酵培养，直至发酵培养液中残余VFAs的浓度低于5g/L；
步骤S7、调整pH值并加入适量木质纤维素降解酶，将再生木质纤维素原料水解成可发酵性生物质糖，同时继续发酵，直至发酵液中残余总糖浓度低于5g/L后终止发酵；
步骤S8、固液分离收集产油微生物菌体，利用VFAs溶液，在高温下处理产油微生物菌体，裂解菌体细胞，然后用提取剂提取油脂，提取后剩余液相中残留有VFAs，调整VFAs浓度后返回步骤S2预处理木质纤维素。
2.如权利要求1所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述步骤S1具体过程为：选取不同来源的有机废弃物置于发酵罐中，调整pH值为4.5-6.5，反应温度为30℃-40℃，厌氧发酵，经固液分离，得到高浓度的VFAs溶液，所述VFAs溶液中包含可供产油微生物利用的短链VFAs。
3.如权利要求2所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，VFAs溶液为短链脂肪酸的混合物，总浓度为10g/L-70g/L，包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸，混合物中乙酸含量最高，然后为丙酸和丁酸。
4.如权利要求1所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，步骤S2中，木质纤维素原料与VFAs溶液按照固液质量比10％-30％混合均匀并高温预处理，补水至固液质量比5％-20％得到酸性再生木质纤维素原料；步骤S3中，木质纤维素原料与质量浓度0.5％-5％的碱溶液按照固液质量比10％-30％混合均匀并高温预处理，补水至固液质量比5％-20％得到碱性再生木质纤维素原料，碱溶液由氧化钙或氢氧化钙制备得到。
5.如权利要求4所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，步骤S2、S3中，高温预处理的温度为80℃-180℃，时间为15min-4h。
6.如权利要求1所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，步骤S6中，产油微生物种子液的接种量为2％-20％，接种量为体积比，于20℃-37℃通气培养；步骤S7中，调整pH值为4-8。
7.如权利要求1所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，步骤S8中，VFAs溶液在高温70℃-85℃下处理产油微生物菌体裂解菌体细胞0.5h-2h。
8.如权利要求7所述利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法，其特征在于，木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、果胶酶中的一种或一种以上的组合，水解得到的可发酵性生物质糖包含葡萄糖和木糖，还含有***糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖和半乳糖醛酸。
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