CN110408567B - 一株耐盐碱甲基营养型芽孢杆菌及其活菌制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱甲基营养型芽孢杆菌及其活菌制剂与应用。本发明自盐碱地辣椒根际土壤分离到一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YJJK‑5，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17952。该菌株耐盐碱能力强，在盐碱土壤中定植率高，对苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸等均有较好的降解效果，可缓解酚酸类自毒物质引起的连作障碍。该菌株发酵后向发酵液加入没食子酸丙酯、β‑环糊精与生化黄腐酸粉，喷雾干燥，得到活菌制剂。其制备方法科学，发酵液菌浓度高，喷雾干燥过程中活菌损失少，活菌制剂在保存过程中的稳定性高。

Description

一株耐盐碱甲基营养型芽孢杆菌及其活菌制剂与应用

技术领域

本发明涉及一株耐盐碱甲基营养型芽孢杆菌及其活菌制剂与应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

辣椒，别名：牛角椒、长辣椒、菜椒、灯笼椒，为木兰纲、茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物，是我国最广为种植的蔬菜之一。连作障碍是影响辣椒产量与品质主要制约因素之一，且随着连续种植年限的增加，连作障碍问题日益严重。引起连作障碍的原因复杂，主要包括：土壤板结与次生盐渍化、土壤养分分布不均衡、土壤微生态***劣化、土传病虫害加重、植物自毒作用等。其中，植物自毒作用作为引发连作障碍的主要因素之一越来越受到关注。

所谓自毒作用是由植物产生的、可对同种或同科植物具有毒害作用的化学物质。这些化学物质可通过植物体的地上部淋溶、根系分泌物和植物残茬等途径释放到环境中，进而影响下茬作物的生长。酚酸类物质是辣椒产生的主要自毒物质，包括苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸等，对辣椒生长具有显著的抑制作用，可引起连作障碍。

土壤中酚酸类物质分解的主要途径是生物降解，其中微生物是引发生物降解作用的主要生物类群。从土壤中筛选对酚酸类物质降解作用强的微生物，制成活菌制剂，用于降解土壤中的酚酸类自毒物质，以减轻连作障碍，是一种很有前途的生物防治措施。据报道，很多微生物均具有降解酚酸类物质的能力，包括黄孢原毛平革菌、粘质沙雷菌、生脂固氮螺菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和黄赭色链霉菌等20多个属，但罕有耐盐碱的甲基营养型芽孢杆菌降解酚酸类物质的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YJJK-5及其活菌制剂与应用。甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5分离自盐碱地辣椒根际土壤，具有耐盐碱、降解苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸，促进植物生长等多种优良特性，可用于生产微生物肥料。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一株分离自盐碱地辣椒根际土壤的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)YJJK-5，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC NO.17952；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年6月18日。

所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的菌落及菌体特征：在NA培养基37℃培养3天后，菌落呈圆形、突起、不透明、光滑、乳白色。菌体呈杆状，产芽孢，芽孢圆形，不膨大，无伴孢晶体，革兰氏染色阳性。

所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的生理生化特征：革兰氏染色试验阳性、运动性试验阳性、过氧化氢酶试验阳性、氧化酶试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、酪蛋白水解试验阳性、明胶水解试验阳性、淀粉水解试验阴性、甘露醇试验阳性、果糖试验阳性、半乳糖试验阳性、麦芽糖试验阳性、海藻糖试验阳性。

本发明还公开了一种以甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5为主要有效成分的活菌制剂。

所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株活菌制剂的制备方法，其特征是，将甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5经扩大培养(采用NB培养基)后，接种于发酵培养基(接种量2-5％)，35-37℃培养24-28h，得到甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5发酵液。向甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5发酵液中加入没食子酸丙酯0.01-0.02％(w/w)、β-环糊精1-2％(w/w)、生化黄腐酸粉5-7％(w/w)，搅拌均匀，喷雾干燥，获得活菌制剂原粉；活菌制剂原粉与可溶性淀粉按1:(5～10)的质量比混匀，即为甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂。

所述发酵培养基的配方为：豆粕粉20-25g、玉米浆干粉20-25g、玉米粉15-20g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、复合酶制剂0.2g、水1000mL，初始pH8.5。所述复合酶制剂的组成为：按重量计，碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶20％、纤维素酶20％、木聚糖酶10％。

甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂的使用方法：甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂加水稀释100～200倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。

本发明的有益效果：

本发明甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5能够同时降解苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸等植物自毒物质，培养7d后，对上述四种酚酸类物质的降解率分别为81.9％、77.2％、68.6％和91.4％。该菌株耐盐碱能力强，可在盐碱土壤中存活，其活菌制剂适用于降解辣椒产生的自毒物质，减轻辣椒连作障碍。

本发明甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂的生产方法科学，发酵液活菌数高，生产成本低。发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对豆粕、玉米浆干粉、玉米粉等原料进行水解，可缩短发酵延迟期，提高原料利用率，提高发酵液中的活菌浓度与芽孢生成率。喷雾干燥时加入抗氧化剂没食子酸丙酯、包埋剂环糊精和对活菌具有保护作用的生化黄腐酸粉，可以减少喷雾干燥过程中活菌数量的损失，并可提高活菌制剂在保存过程中的稳定性。

附图说明

图1为甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的菌落形态；

图2为甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5的菌体形态；

图3为基于16S rDNA部分序列构建的***发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5的筛选

(1)耐盐碱菌株的筛选

甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5分离自辣椒根际土壤。土壤取样于山东省东营市垦利区，为盐碱土壤。具体分离方法为：称取10g土壤样品，加入到装有90mL 0.9％生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶中，于37℃、180rpm振荡30min。取土壤悬液1mL进行10^-1-10^-7系列浓度梯度稀释，然后取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度涂布至含选择培养基的平板上，于35～37℃倒置培养2d。分别挑取单菌落划线至含选择培养基的平板上，于37℃倒置培养2d。挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，于37℃培养2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共筛选到耐盐碱菌株194株。

所述选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH9.0，121℃灭菌20min。

所述保藏培养基采用NA培养基，即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL，pH 7.0～8.0。

(2)苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸等植物自毒物质降解菌株的筛选

分别挑取步骤(1)筛选出的耐盐碱菌的单菌落划线至含选择培养基的平板上，于35℃倒置培养3d。挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，于35℃培养3d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共分离出7株菌落特征与菌体形态存在差异的菌株。

所述选择性培养基的配方为：邻苯二甲酸1000mg、硫酸铵0.5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20g、磷酸氢二钾1.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH7.0。所述保藏培养基的配方为：对羟基苯甲酸1000mg、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml、pH7.0。

将7株分离物分别转接入添加1000mg/L对羟基苯甲酸、1000mg/L苯甲酸、1000mg/L肉桂酸或1000mg/L阿魏酸的基础培养基中，于35℃、180rpm振荡培养3d后，采用高效液相色谱法测定苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸或阿魏酸的降解率，筛选出1株对四种自毒物质均具有较好降解效果的菌株，即YJJK-5。

所述基础培养基的配方为：蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml、pH 7.0。

高效液相色谱法测定苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸与阿魏酸降解率时采用的条件为：以乙腈和水(用乙酸调节pH2.8)为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。采用梯度洗脱，0-30min，乙腈从5％提高到40％，30-40min，乙腈保持40％，40-45min，乙腈从40％下降到5％。

实施例2甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5的鉴定

(1)形态与生理生化特特征

所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的菌落及菌体特征：在NA培养基37℃培养3天后，菌落呈圆形、突起、不透明、光滑、乳白色，如图1所示。菌体呈杆状，产芽孢，芽孢圆形，不膨大，无伴孢晶体，革兰氏染色阳性，如图2所示。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0～8.0。

所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的生理生化特征：革兰氏染色试验阳性、运动性试验阳性、过氧化氢酶试验阳性、氧化酶试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、酪蛋白水解试验阳性、明胶水解试验阳性、淀粉水解试验阴性、甘露醇试验阳性、果糖试验阳性、半乳糖试验阳性、麦芽糖试验阳性、海藻糖试验阳性。

(2)16S rDNA序列分析

将YJJK-5菌株接种到NB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h。所述NB培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml、pH 7.0。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序，所得序列如序列表SEQ No.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA 7.0软件进行多序列同源性分析，并构建***发育树，如图3所示。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为甲基营养型芽孢杆菌，命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YJJK-5。该菌株已于2019年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.17952。

实施例3甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的耐盐碱能力

采用不同盐碱度的择性培养基验证甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株的耐盐碱能力。所述选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20～100g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH8～10，121℃灭菌20min。将甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株从斜面培养基划线接种于不同盐碱度的选择性培养基平板上，于35～37℃培养2～3d，以甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5是否长出来判断该菌株是否耐相应的盐碱度。甲基型芽孢杆菌YJJK-5在高盐、高碱的培养基上的生长情况如下表1所示，甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5具有较强的耐盐碱能力，可以在含盐量10％、pH10的高盐碱培养基上生长。

表1甲基型芽孢杆菌YJJK-5在高盐、高碱的培养基上的生长情况

实施例4甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌剂的制备

所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌株活菌制剂的制备方法包括以下步骤：

1)菌种活化：将甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5转接入NA培养基试管斜面，于35℃培养24h进行活化。所述NA培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml，pH 7.0。

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5菌苔，接种于NB培养基中，35℃培养24h。所述NB培养基即营养肉汤培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml，pH 7.0。

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以2％的接种量转接入装有6L NB培养基的10L种子罐中，于35℃培养20h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风比为6L/min。

4)发酵培养：将种子罐菌种以2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基中300L，35℃培养28h，即为甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5的发酵液。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。发酵结束后，发酵液中甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5的活菌数为(1～2)×10¹⁰cfu/ml，芽孢生成率为90％～95％。

步骤4)所述发酵培养基的配方为：豆粕粉20g、玉米浆干粉20g、玉米粉15g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、复合酶制剂0.2g、水1000mL，初始pH8.5。所述复合酶制剂的组成为：按重量计，碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶20％、纤维素酶20％、木聚糖酶10％。中性蛋白酶与碱性蛋白酶由泰安信得利生物科技有限公司生产，产品规格分别为5万U/g与10万U/g，其酶活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》。纤维素酶与木聚糖酶由山东隆大生物科技有限公司生产，产品规格分别为10万U/g与5万U/g，纤维素酶的酶活力单位定义与检测方法执行中华人民共和国轻工行业标准QB 2583-2003《纤维素酶制剂》，木聚糖酶的酶活力单位定义与检测方法执行中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4483-2013《木聚糖酶制剂》。

步骤4)所述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至52℃，保温1.5h，然后升温至121℃，保温25min进行灭菌。

5)活菌制剂的制备：向步骤4)所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01％(w/w)、β-环糊精1％(w/w)、生化黄腐酸粉5％(w/w)，搅拌均匀，然后于进口温度200℃，出口温度80℃的条件下进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉。所述生化黄腐酸粉由山东泉林嘉有肥料有限责任公司生产，其黄腐酸含量为40％。

甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂原粉与可溶性淀粉按质量比1:7.5的比例混匀，即为甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂，其活菌含量优选为1.5×10¹⁰cfu/g。

实施例5甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5对苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸的降解试验

制备含苯甲酸的培养基，其配方为：苯甲酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20g、水1000ml，pH 7.0。

制备含对羟基苯甲酸的培养基，其配方为：对羟基苯甲酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20g、水1000ml，pH 7.0。

制备含肉桂酸的培养基，其配方为：肉桂酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20g、水1000ml，pH 7.0。

制备含阿魏酸的培养基，其配方为：阿魏酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)20g、水1000ml，pH 7.0。

将甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5转接入上述四种培养基中，于35℃、180rpm振荡培养7d。取培养液10mL，3500r/min离心15min，弃沉淀，上清液采用10mL二氯甲烷萃取。萃取相采用真空旋转蒸发仪蒸干，残留物用1mL甲醇溶解，备用。

采用高效液相色谱法检测样品中苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸的残留量，并计算降解率。参数条件为：以乙腈和水(用乙酸调节pH2.8)为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。采用梯度洗脱，0-30min，乙腈从5％提高到40％，30-40min，乙腈保持40％，40-45min，乙腈从40％下降到5％。

高效液相色谱法检测结果表明，甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5培养7天，对自毒物质苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸的降解率分别为81.9％、77.2％、68.6％和91.4％。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱甲基营养型芽孢杆菌及其活菌制剂与应用

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<213> 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）YJJK-5的16S rDNA 基因

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tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

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tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

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ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cagc 1414

Claims (7)

1.一株耐盐碱甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）YJJK-5，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.17952。

2.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5在降解苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸或阿魏酸中的应用。

3.一种以权利要求1 所述甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5为主要有效成分的活菌制剂。

4.权利要求3所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，将甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5经扩大培养后，接种于发酵培养基，35-37℃培养24-28h，得到甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5发酵液，然后进一步制成活菌制剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述发酵培养基为：豆粕粉20-25g、玉米浆干粉20-25g、玉米粉15-20g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、复合酶制剂0.2g、水1000mL，初始 pH8.5；所述复合酶制剂的组成为，按重量计：碱性蛋白酶50%、中性蛋白酶20%、纤维素酶20%、木聚糖酶10%。

6.如权利要求4或5所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，向甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5发酵液中加入没食子酸丙酯0.01-0.02%、β-环糊精 1-2%、生化黄腐酸粉 5-7%，搅拌均匀，喷雾干燥，获得活菌制剂原粉；活菌制剂原粉与可溶性淀粉按1:（5～10）的质量比混匀，即为甲基营养型芽孢杆菌YJJK-5活菌制剂。

7.权利要求3所述的活菌制剂在降解苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸或阿魏酸中的应用。

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