CN107541468B - 一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用 - Google Patents
一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用。所述短密木霉在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.14123，保藏日期为2017年05月10日。本发明的短密木霉、短密木霉菌剂可以有效的降解土壤中的咪唑乙烟酸，短密木霉对液体培养基中咪唑乙烟酸的降解率达65.3％，短密木霉菌剂对含500mg/kg咪唑乙烟酸土壤中咪唑乙烟酸的降解率达78.38％。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用。
背景技术
随着化学农药尤其是除草剂的大面积广泛的使用，土壤污染、水污染和后茬作物生长受到抑制等问题接踵而来。咪唑乙烟酸就是其中的典型之一。咪唑乙烟酸除草剂虽具有高效广谱的优点，但其残留半衰期较长，不易分解，长期使用会造成后茬作物药害，并对作物的轮作造成很多困扰。
咪唑乙烟酸被称为豆田除草剂的“四大天王”之一，具其他除草剂不可替代的独特魅力。自九十年代，我国开始进口咪唑乙烟酸并在黑龙江省大面积推广使用，并且消耗量量持续增涨。特别是相关国产除草剂的上市，由于其低廉的价格，良好的除草效果，故咪唑乙烟酸除草剂的推广使用迅速席卷东北地区，成为内蒙古地区与黑龙江省大豆田的主要除草剂品种。
咪唑乙烟酸一般在土壤中不易发生化学、物理方面的降解作用，所以其残留的去除主要还是依靠微生物的降解作用。目前，已经有丙酸杆菌属、海球菌属、节细菌属、芽孢杆菌属、酸单胞杆菌属、产碱菌属、无色杆菌属等细菌被发现对咪唑乙烟酸有降解作用。
通过分离、筛选能够高效降解咪唑乙烟酸残留物质的微生物，来加速土壤中残留农药的降解，从而实现污染土壤的微生物修复，对维持生态平衡、保护环境和提高大豆田经济价值具有重要意义。
发明内容
本发明提供的一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用，短密木霉对咪唑乙烟酸具有良好的降解效果，具有良好的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种短密木霉，所述短密木霉在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.14123，保藏日期为2017年05月10日，分类命名为短密木霉(Trichoderma brevicompactum)。
本发明的第二个目的是提供一种应用上述短密木霉制备而成的短密木霉菌剂，由短密木霉菌分生孢子粉、腐植酸、蛭石按照10：1-5：85-90的质量比例混合后，加水至含水量为10-15％，制得短密木霉菌剂。
本发明的第三个目的是提供一种上述短密木霉菌剂的制备方法，具体按照以下步骤制备：
(1)一级菌种的制备：在MEA平板上接种短密木霉原始菌种，放在28℃培养箱中培养，待短密木霉孢子长满后，得到一级菌种；
(2)二级菌种的制备：接种一级菌种到装有MEA液体培养基的三角瓶中28℃，160r/min，震荡培养7天；
(3)固体发酵：制备固体培养基，固体培养基的成分及质量比例为：玉米渣：稻壳：麦数＝3：20：15，加水至固体培养基的含水量为50％；接种二级菌种，接种量为每100g固体培养基接种7g二级菌种；在28℃温室中发酵培养7天；
(4)取培养后的固体培养基，放入30℃的干燥箱烘干；最后粉碎机磨碎，制成短密木霉菌分生孢子粉，向短密木霉菌分生孢子粉中加入相当于分生孢子粉重量8倍的无菌水，混匀，制成孢子液，备用；
(5)将蛭石进行粉碎，控制其细度为40-60目，加水调节含水量为8-12％，向蛭石中加入腐植酸，调配均匀后得到基质混合物，将(4)中的孢子液均匀喷洒到基质混合物上，混匀，其中，短密木霉菌分生孢子粉、腐植酸、蛭石的重量配比为10：1-5：85-90，最后30℃烘干至含水量为10-15％，得到短密木霉菌剂。
本发明的第四个目的是提供一种上述短密木霉在降解土壤中咪唑乙烟酸中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种上述短密木霉菌剂在降解土壤中咪唑乙烟酸中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用，具有以下有益效果：
通过分离、筛选能够高效降解咪唑乙烟酸残留物质的微生物短密木霉pf3，来加速土壤中残留农药的降解，从而实现污染土壤的微生物修复，对维持生态平衡、保护环境和提高大豆田经济价值具有重要意义。本发明的短密木霉、短密木霉菌剂可以有效的降解土壤中的咪唑乙烟酸，短密木霉对液体培养基中咪唑乙烟酸的降解率达65.3％，短密木霉菌剂对含500mg/kg咪唑乙烟酸土壤中咪唑乙烟酸的降解率达78.38％。
附图说明
图1是pf3筛选时对照组液相色谱检测色谱图；
图2是pf3降解后培养基的高效液相色谱图；
图3是pf3的菌落图；
图4是pf3镜检孢子结构；
图5是不同咪唑乙烟酸初始浓度降解效果；
图6是C实验组咪唑乙烟酸初始浓度高效液相色谱图；
图7是C实验组实验后咪唑乙烟酸浓度高效液相色谱图。
生物材料保藏信息说明
短密木霉，已于2017年05月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14123，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为短密木霉(Trichoderma brevicompactum)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.短密木霉菌株分离
在采集土样前先除去落叶和表土等，采集离地面下2-10cm的土壤作为样品，按生物统计方法采集5样点，每份不少于50g，将土样装入密封袋中，4℃冰箱保存样本备用。
分别称取待测土样10g，置于烘箱中105℃下烘干至恒重，待冷却后称出质量，计算土壤含水量。
土壤含水量＝(湿土质量-干土质量)/湿土质量×100％
称取相当于5g(以土壤干重计、不计算水分)土壤样品放入45ml无菌水中加玻璃珠160r/min震荡30min制成土壤浸出液。将所得土壤浸出液移取1ml至盛有9ml无菌水的试管中，稀释10倍，吸打均匀；再移取1ml 10倍稀释液至另一盛有9ml无菌水的试管中，稀释102倍，吸打均匀；循环操作直至菌液稀释到103倍。将稀释到102和103倍的菌液移取20μl至倒有孟加拉红培养基的平板上，用涂布器涂布均匀。封口，置于25℃恒温培养箱培养。
培养3-7天后，用接种针将各菌落分别挑取适量菌丝纯化到PDA培养基上。封口，25℃恒温培养箱培养。3-7天后，取单菌落再划线纯化，直至得到纯化的单一菌落。将其保存到PDA培养基制作的斜面试管里，4℃冰箱保存。
将分离纯化得到的真菌菌种用打孔器制取菌饼，每个菌株各取10个菌饼分别接种于盛有100ml PD培养基的锥形瓶中，25℃，160r/min，摇培7天得富集菌液。
取富集菌液10ml加入到盛有90ml咪唑乙烟酸含量为100mg/kg无机盐培养基(咪唑乙烟酸是其中唯一碳源)的250ml锥形瓶中，以不加任何菌株并加入10ml无菌水的咪唑乙烟酸含量为100mg/kg无机盐培养基(咪唑乙烟酸是其中唯一碳源)作为空白对照。然后将锥形瓶置于25℃，转速160r/min的摇床上培养7天。对摇培液进行高效液相色谱检测。
经过菌株分离和降解率检测，获得黑龙江省某药厂排水口污土土样分离得到真菌有14株，分别命名为pf1-14。其中，真菌中降解效率最高的是pf3，图1是对照组液相色谱检测色谱图，图2是pf3降解后培养基的高效液相色谱图。对比图1-2可知，经过pf3降解后培养基中咪唑乙烟酸的含量明显降低，降解率为45.93％。
2.pf3的驯化培养
将上述富集菌液后接种至盛有90ml咪唑乙烟酸含量为100mg/kg无机盐培养基(咪唑乙烟酸是其中唯一碳源)的250ml锥形瓶中，25℃，160r/min摇床培养72h，移取培养液10ml加入到盛有90ml咪唑乙烟酸含量为200mg/kg无机盐培养基(咪唑乙烟酸是其中唯一碳源)的250ml锥形瓶中，升高咪唑乙烟酸浓度至300mg/L，置于25℃，160r/min摇床培养72h。上述步骤循环操作直至咪唑乙烟酸浓度为500mg/kg。
取咪唑乙烟酸浓度为500mg/kg的培养基中的10ml菌悬液分别接种到已知咪唑乙烟酸浓度为100mg/L的90ml基础盐无碳源培养基中。以不加任何菌株的无机盐培养基(咪唑乙烟酸是其中唯一碳源)作为空白对照。置于25℃，160r/min摇床培养7天。然后用高效液相色谱法检测并计算出驯化后的降解率为65.30％，降解率提高了近20％。这就说明反复的对降解菌进行刺激有助于增强其对咪唑乙烟酸的降解作用。驯化培养后的pf3的保藏编号为CGMCC No.14123。
3.高效降解菌的鉴定
分子方法鉴定：
驯化后的pf3摇培7天后，用8层无菌纱布过滤菌液得到菌丝，再用DNA quickPlant System快捷型植物基因组DNA提取***(非离心柱型)试剂盒方法提取其真菌总DNA，用真菌通用引物ITS1和ITS4对ITS序列进行PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后，将其PCR产物送至上海生物公司进行双向测序，得到测序结果如下，到NCBI网上进行比对，得鉴定结果真菌菌株pf3是短密木霉(Trichoderma brevicompactum)。
pf3的ITS序列如下：
GCGAATTGGGTTCCTCCAACCCCATGTGACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATTTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAATTTACAAACTCTTTTGTATATCCCATCGCGGATTCTTTACATTCTGAGCTTTCTCGGCGCTCCTAGCGAGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCACTTACCTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGGCCGTAAAACAACCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
pf3的菌株形态学鉴定：
取出25℃恒温培养箱中的培养皿进行菌落特征观察，在解剖镜下挑取真菌的菌丝体，制成临时载片，并放置于显微镜下进行观察。主要观察各个真菌的菌丝类型、产孢结构、载孢体、孢子形态，再结合真菌分类学相关资料进行鉴定。
根据形态学观察如图3和图4，图3是pf3的菌落图，pf3在MEA培养基上培养5天25℃下菌落直径6-8cm，蛛丝状，白色，散射光下由于产孢表面呈绿色，背面无色。图4是pf3镜检孢子结构，多分枝的树状分生孢子梗无色，形成相当疏松的菌丛。侧生瓶梗3-5个，轮生，瓶梗基部略缢缩，中部膨大，向上渐狭成瓶颈，4-6×2-3μm。瓶梗孢子成球状分生孢子头，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，绿色，1.9-3.2μm×2.2-2.7μm。因此，真菌菌株pf3符合短密木霉(T.brevicompactum)的形态学特征。
4.短密木霉菌剂制备
利用pf3制备降解咪唑乙烟酸的菌肥，具体步骤如下：
(1)一级菌种的制备：在MEA平板上接种短密木霉原始菌种，放在28℃培养箱中培养，待短密木霉孢子长满培养皿后，得到一级菌种；
(2)二级菌种的制备：接种一级菌种到装有MEA液体培养基的三角瓶中28℃，160r/min，震荡培养7天；
(3)固体发酵：制备固体培养基，固体培养基的成分及质量比例为：玉米渣：稻壳：麦数＝3：20：15，加水至固体培养基的含水量为50％；将二级菌种按接种量7％(w/w)接种；在28℃温室中发酵培养7天，直至固体培养基满载短密木霉菌分生孢子；
(4)取出满载短密木霉菌分生孢子的固体培养基，放入30℃的干燥箱烘干；最后用万能粉碎机磨碎制成短密木霉菌分生孢子粉，向短密木霉菌分生孢子粉中加入相当于分生孢子粉重量8倍的无菌水，混匀，制成孢子液，备用；
(5)将蛭石(作为载体)进行粉碎，控制其细度为40-60目，加水调节含水量为8-12％，向蛭石载体中加入紫外保护剂腐植酸，调配均匀后得到基质混合物，备用，将(4)中的孢子液均匀喷洒到基质混合物上，混匀，其中，短密木霉菌分生孢子粉、腐植酸、蛭石的重量配比为10：1-5：85-90，最后30℃烘干至含水量为10-15％，密封包装保存即得短密木霉菌剂。
需要说明的是，本发明说明书和权利要求中所述的含水量均指的是水分的质量百分比含量。
5、盆栽实验
用制备好的短密木霉菌剂200g均匀地搅拌混合进28kg从未施加过咪唑乙烟酸的黑土土壤里，将混匀的土壤平均分3份，加入不等量的豆施乐(5％，w/w，咪唑乙烟酸水剂)，分别制成咪唑乙烟酸含量为100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg的污染土。将3kg不同咪唑乙烟酸浓度的土壤装入到规格75×60×30cm的带有盆托(防止咪唑乙烟酸流失)的花盆中。咪唑乙烟酸对大豆还是有一定抑制作用的，易出现苗弱、死苗情况，所以我们种植10棵大豆(选取饱满的大豆种子，用40℃的温水浸泡5小时，在25℃下黑暗中催芽，待种子发芽后选择发芽一致的种子播种于育苗容器中)。实验设置如表1，每个实验组设3个重复。
表1不同咪唑乙烟酸浓度的土壤的实验设计简明表
三组装盆种植培养30天后用五点取样法分别取各盆土样，干燥后研磨，过20目筛，进行液相色谱样品前处理，然后用高效液相色谱仪检测咪唑乙烟酸含量，并计算降解率。获得结果如图5所示。可以说明实验前后咪唑乙烟酸可以被有效降解。从图中可以看出A、B、C实验组土壤中咪唑乙烟酸初始浓度分别为100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg时，咪唑乙烟酸都有降解效果。C实验组，当咪唑乙烟酸初始浓度为500mg/kg时，降解率为78.38％，降解率最高。图6是C实验组咪唑乙烟酸初始浓度高效液相色谱图，图7是C实验组实验后咪唑乙烟酸浓度高效液相色谱图。可以看出短密木霉菌剂降解前后咪唑乙烟酸浓度变化明显。
最重要的是，农田咪唑乙烟酸残留不会高达500mg/kg。咪唑乙烟酸初始浓度为100mg/kg时的降解率为72.68％。综合整体实验效果来看，短密木霉制剂对土壤中的咪唑乙烟酸残留具有有效的降解作用，对于降解农田咪唑乙烟酸残留，避免后茬作物药害具有实用价值。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种短密木霉，其特征在于，所述短密木霉在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.14123，保藏日期为2017年05月10日，分类命名为短密木霉(Trichoderma brevicompactum)，所述短密木霉用于降解咪唑乙烟酸。
2.应用权利要求1所述的短密木霉制备而成的短密木霉菌剂，其特征在于，由短密木霉菌分生孢子粉、腐植酸、蛭石按照10：1-5：85-90的质量比例混合后，加水至含水量为10-15％，制得短密木霉菌剂。
3.根据权利要求2所述的短密木霉菌剂的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤制备：
(1)一级菌种的制备：在MEA平板上接种短密木霉原始菌种，放在28℃培养箱中培养，待短密木霉孢子长满后，得到一级菌种；
(2)二级菌种的制备：接种一级菌种到装有MEA液体培养基的三角瓶中28℃，160r/min，震荡培养7天；
(3)固体发酵：制备固体培养基，固体培养基的成分及质量比例为：玉米渣：稻壳：麦数＝3：20：15，加水至固体培养基的含水量为50％；接种二级菌种，接种量为每100g固体培养基接种7g二级菌种；在28℃温室中发酵培养7天；
(4)取培养后的固体培养基，放入30℃的干燥箱烘干；最后粉碎机磨碎，制成短密木霉菌分生孢子粉，向短密木霉菌分生孢子粉中加入相当于分生孢子粉重量8倍的无菌水，混匀，制成孢子液，备用；
(5)将蛭石进行粉碎，控制其细度为40-60目，加水调节含水量为8-12％，向蛭石中加入腐植酸，调配均匀后得到基质混合物，将(4)中的孢子液均匀喷洒到基质混合物上，混匀，其中，短密木霉菌分生孢子粉、腐植酸、蛭石的重量配比为10：1-5：85-90，最后30℃烘干至含水量为10-15％，得到短密木霉菌剂。
4.根据权利要求1所述的短密木霉在降解土壤中咪唑乙烟酸中的应用。
5.根据权利要求2所述的短密木霉菌剂在降解土壤中咪唑乙烟酸中的应用。
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