CN112111432B - 一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法与应用。本发明首先自盐碱土壤分离到一株庆盛芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)PAPM‑10，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20120。庆盛芽孢杆菌PAPM‑10菌株具有较强的耐盐碱、产蛋白酶、解钾、产ACC脱氨酶和拮抗水稻纹枯病致病菌立枯丝核菌的能力。将庆盛芽孢杆菌PAPM‑10发酵液与双源腐植酸混合均匀得到双源腐植酸生物肥料，可以防治水稻纹枯病。

Description

一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法与应用，属于农业生物技术领域。
背景技术
水稻是世界上种植面积最大的粮食作物之一。世界上近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。中国水稻播种面积占全国粮食作物的1/4。中国水稻种植面积为3千万公顷左右，居世界第二，水稻年产量高达2亿万吨以上，占全国粮食作物总产量的一半以上。
纹枯病一直是制约水稻优质栽培和高产稳产的关键因素之一，也是一种危害遍布全球的水稻病害。纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的一种真菌病害。立枯丝核菌主要以形成菌核的方式在土壤中越冬，也能以菌丝体和菌核的形态在病稻草和其他寄主残体上越冬。土壤中的菌核第二年漂浮出水面，萌发并侵入稻株，形成病斑，再长出菌丝，向四周蔓延。菌核有多次萌发的特征，可随水漂流，造成多次侵染，严重影响水稻的产量和质量。纹枯病在水稻生长的任何阶段均有发生，危害期长，可导致水稻减产30％～50％，甚至绝收。
长期以来，水稻纹枯病的防治以化学法为主，并结合选育抗病品种、优化栽培管理等技术措施。化学防治以50％甲基托布津、2％速保利、32％敌力脱可湿性粉剂以及5％井冈霉素可溶性粉等药物为主。大量使用化学农药对人类健康、食品安全和环境保护存在巨大风险，已引起社会的普遍关注。发展生物防治技术，减量使用化学农药，是生态农业发展的必然趋势。
生物防治是利用有益生物或其代谢产物来防治病虫害的方法，具有不污染环境、对人和其他生物安全、节约能源、保持生态平衡等特点，是发展绿色食品、保护人身健康的重要手段。目前，井岗霉素、金色毛壳菌、哈茨木霉等有益微生物已用于水稻纹枯病的生物防治，但由于防治效果有限，未能在农业生产中大面积推广应用。
水稻具有较强的耐盐碱能力，是盐碱地广为栽培的作物之一。据农科院南京土壤所报道，我国盐碱地和盐碱障碍耕地总面积超过5亿亩，其中具有农业利用潜力的多达2亿亩，占中国耕地面积的10％左右，主要分布在我国西北、东北及东部沿海地区。盐碱地水稻纹枯病的生物防治，除要求所用菌株具有较好的防病促生效果外，还要求其具有较强的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中存活。因此，针对盐碱地水稻生产，筛选耐盐碱水稻纹枯病生防菌株，具有重要意义。
腐植酸具有改良土壤、促进作物生长发育、增强作物抗病抗逆能力等作用，可分为矿源腐植酸和生物腐植酸两大类，前者主要来源于褐煤、风化煤和泥炭，后者是生物质原料经微生物发酵而产生的，在堆肥产品中广泛存在。为取得更好的应用效果，矿源腐植酸和生物腐植酸常常配合使用，共同用于产品研发，并称之为双源腐植酸。生物肥料产业中，双源腐植酸是常用的生产原料之一，具有“优质载体”和“生物刺激素”等多种有益作用。
针对上述现状，本发明提供了一种以耐盐碱庆盛芽孢杆菌为功能性成分的双源腐植酸生物肥料，用于水稻纹枯病的生物防治，特别是用于盐碱地栽培的水稻纹枯病的生物防治。
发明内容
本发明的目的是提供一种以庆盛芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)PAPM-10为主要有效成分的双源腐植酸生物肥料及其制备方法与应用。庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株分离自盐碱地水稻根际土壤，具有耐盐碱、产蛋白酶、解钾和产ACC脱氨酶的能力，同时，对水稻纹枯病具有较好的生防作用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：一株分离自盐碱地水稻根际土壤的庆盛芽孢杆菌PAPM-10，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.20120；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年06月22日。
所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株的形态特征：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落呈圆形***且菌落湿润、有皱褶、不透明、奶白色；菌体呈杆状。
所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株的生理生化特征：革兰氏阳性杆状菌；过氧化氢酶试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，V-P试验阴性，明胶水解试验阳性，淀粉水解试验阳性，D-葡萄糖发酵试验阳性，D-甘露醇发酵试验阳性，乳糖发酵试验阳性，蔗糖发酵试验阳性。
本发明还公开了一种以庆盛芽孢杆菌PAPM-10为主要有效成分的双源腐植酸生物肥料。
所述双源腐植酸生物肥料的制备方法，包括以下步骤：庆盛芽孢杆菌PAPM-10经扩大培养后，接种到发酵培养基中，于35-38℃培养24-48h，获得庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液。将所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液与双源腐植酸按重量比1:4-6混合均匀，获得双源腐植酸生物肥料。
所述发酵培养基的配方为(重量比)：麦芽糊精5％、蛋白胨1.5％、酵母膏0.5％、KH2PO40.2％、Na2HPO4 0.05％、MgSO4 0.1％、ZnCl2 0.1％、柠檬酸三钠0.1％，初始pH值7.0-8.0，121℃灭菌20-30min。
所述双源腐植酸的制备方法为：
1)原料：食用菌菌糠70±5份，风化煤粉30±5份，庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液1±0.5份；所述食用菌菌糠为灵芝、金针菇、双孢菇等食用菌采收后剩余的栽培基质；所述风化煤粉的总腐植酸含量为≥45％；
2)将风化煤粉采用KOH溶液进行化学活化处理；
3)将食用菌菌糠和庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液与经活化后的风化煤粉混合均匀，即为发酵基质，控制其含水量55-60％；然后堆肥发酵30-60d，使有机原料彻底腐熟；堆肥结束后，发酵基质经风干、粉碎后，即为双源腐植酸，其总腐植酸含量≥10％。
本发明还公开了耐盐碱庆盛芽孢杆菌PAPM-10在产蛋白酶、解钾和产ACC脱氨酶，拮抗水稻纹枯病致病菌——立枯丝核菌方面的应用。
本发明还公开了上述的双源腐植酸生物肥料在防治水稻纹枯病方面的应用。
上述双源腐植酸生物肥料的使用方法：作为底肥或追肥使用，每亩用量为5-40kg。
本发明的有益效果：本发明双源腐植酸生物肥料所采用的庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株分离自盐碱地土壤，具有较强的耐盐碱、产蛋白酶、解钾和产ACC脱氨酶能力，并对水稻纹枯病具有较好的生防作用，可减少水稻纹枯病的发生，提高水稻产量和质量，并特别适用于盐碱地水稻。
附图说明
图1为庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株的菌体形态图；
图2为基于16S rDNA部分序列构建的***发育树；
图3为庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株在脱脂奶粉培养基上的解蛋白圈示意图；
图4为庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株在硅酸盐细菌培养基上的生长图；从图中可以看出：形成光滑透明油滴状菌落；
图5为庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株在以ACC为唯一氮源的培养基上的生长图片；从图中看可以看出：庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株能够在以ACC为唯一氮源的培养基上生长，说明其具有产ACC脱氨酶的能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：庆盛芽孢杆菌PAPM-10的筛选
(1)耐盐碱菌株的筛选
庆盛芽孢杆菌PAPM-10于2018年7月分离自水稻根际土壤。土壤取样于山东省滨州市滨城区，为中度盐碱土壤。具体分离方法为：土样混匀，称取5g，放入盛有95mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于37℃、180rpm振荡30min。取土壤悬液1mL进行10-1-10-7系列浓度梯度稀释，然后取10-5、10-6、10-7三个稀释度涂布至含选择培养基的平板上，于37℃恒温培养48-72h。分别挑取单菌落再次划线至含选择培养基的平板上，于37℃倒置培养2-4d。然后，挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，于37℃培养2-4d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共筛选到耐盐碱菌株92株。
所述选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH8.0，121℃灭菌20min。
所述保藏培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.5，121℃灭菌20min。
(2)产蛋白酶菌株的筛选
采用平板透明圈法进行蛋白酶产生菌的筛选。将步骤(1)所分离纯化得到的菌株分别接种到脱脂奶粉培养基平板上，于37℃恒温培养48-72h，反复验证三次之后，挑取能稳定产生透明圈的菌株，即为初筛菌株。对初筛菌株采用同样方法进行复筛，测量菌落直径d和透明圈直径D，并计算D/d值，该值越大，说明菌株产蛋白酶能力越强。共筛选出产蛋白酶菌株52株。所述脱脂奶粉培养基配方为：脱脂奶粉3.0g，琼脂1.6％，去离子水200mL，108℃灭菌15min，pH＝7.0～7.2。
(3)具有解钾能力的菌株的筛选
将步骤(2)筛选到的具有产蛋白酶能力的菌株接种到硅酸盐细菌培养基平板上，37℃恒温培养48-72h，挑取在平板上能生长的菌株，即为初筛菌株。再对初筛菌株按同样方法进行复筛，选取生长速度快，菌落厚、大的菌株。所述硅酸盐细菌培养基配方为：蔗糖5g、MgSO40.5g、CaCO3 0.1g、Na2HPO4 2g、FeCl3 0.005g、玻璃粉1g、琼脂1.6％，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min，pH＝7.0。共筛选出具有解钾能力的菌株11株。
(4)产ACC脱氨酶菌株的筛选
将步骤(3)中筛得的解钾菌株接种到以ACC为唯一氮源的ADF培养基平板中，37℃恒温培养48-72h，能够正常生长的菌株即为具有产ACC脱氨酶能力菌株。所述ADF培养基配方为：KH2PO4 4.0g、NaH2PO4 6.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.lg、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸钠2.0g、柠檬酸2.0g，微量元素组分A与微量元素组分B各0.1mL，蒸馏水1000mL，琼脂20.0g，pH 7.2。将配制的ACC溶液通过0.2μm的细菌过滤器灭菌后，以3mmo1/L终浓度加入到上述培养基中。
所述微量元素组分A的配方：CuSO4·5H2O 78.22mg，MoO3 10mg，H3BO3 10mg，ZnSO4·7H2O 124.6mg，MnSO4·H2O 11.9mg，以上溶解于100mL无菌蒸馏水中。
所述微量元素组分B的配方：FeSO4·7H2O 100mg，将其溶于10mL已灭菌的蒸馏水中，充分振荡。
所述微量元素组分A和B的溶液均置于-4℃保存备用。
(5)对峙培养法筛选对水稻纹枯病致病菌具有拮抗作用的菌株
将直径5mm水稻纹枯病致病菌——立枯丝核菌菌块接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心2.5cm处等距离处接种上述所筛菌株，以不接种上述所筛菌株的平板为对照，每个处理3次重复，28℃培养10d，选取抑菌圈直径较大的菌株，保存备用。
所述PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。
通过上述多重筛选，综合考虑菌株的生长速度、产蛋白酶能力、解钾能力、产ACC脱氨酶能力和对水稻纹枯病致病菌——立枯丝核菌的拮抗能力，筛选出一株耐盐碱能力强，具有产蛋白酶、解钾、产ACC脱氨酶能力、对立枯丝核菌具有拮抗作用的菌株，编号为PAPM-10。
实施例2：庆盛芽孢杆菌PAPM-10的鉴定
(1)形态与生理生化特征
所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株的形态特征：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落呈圆形***且菌落湿润、有皱褶、不透明、奶白色；菌体呈杆状，如图1所示。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0。
所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株的生理生化特征：革兰氏阳性杆状菌；过氧化氢酶试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，V-P试验阴性，明胶水解试验阳性，淀粉水解试验阳性，D-葡萄糖发酵试验阳性，D-甘露醇发酵试验阳性，乳糖发酵试验阳性，蔗糖发酵试验阳性。
(2)16S rDNA序列分析
将PAPM-10菌株接种到NB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h。所述NB培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml、pH 7.0。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序。将所测16S rDNA序列(SEQ No.1)与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA7.0软件进行多序列同源性分析，并构建***发育树，如图2所示。
通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为庆盛芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)，命名为庆盛芽孢杆菌PAPM-10。该菌株已经于2020年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.20120。实施例3庆盛芽孢杆菌PAPM-10的有益功能
(1)产蛋白酶的能力
用灭菌牙签将庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株接种到脱脂奶粉培养基平板上，37℃恒温培养48-72h，测量菌落直径d和透明圈直径D，并计算HC值(D/d)。庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株在脱脂奶粉培养基上产生的解蛋白透明圈直径为26.26mm，菌落直径为10.32mm，HC值为2.54，这说明该菌株具有较强的蛋白分解能力，如图3所示。所述脱脂奶粉培养基的配方为：脱脂奶粉3.0g；琼脂1.6％；去离子水200mL；108℃灭菌15min，pH＝7.0～7.2。
(2)解钾能力
用接种环采用三区划线的方式将庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株接种到硅酸盐细菌培养基平板上，37℃培养48-72h。庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株可以在硅酸盐细菌培养基上生长并形成菌落，这说明其具有解钾能力，如图4所示。所述硅酸盐细菌培养基的配方为：蔗糖5g、MgSO4 0.5g、CaCO3 0.1g、Na2HPO4 2g、FeCl3 0.005g、玻璃粉1g、琼脂1.6％，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min，pH＝7.0。
(3)产ACC脱氨酶的能力
用灭菌牙签将庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌株接种到以ACC为唯一氮源的ADF培养基平板中，37℃培养48-72h。菌株PAPM-10在以ACC为唯一氮源的ADF培养基平板上能够正常生长并形成菌落，这说明该菌株具有产ACC脱氨酶的能力，如图5所示。
所述ADF培养基配方为：KH2PO4 4.0g、NaH2PO4 6.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O0.lg、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸钠2.0g、柠檬酸2.0g，微量元素组分A与微量元素组分B各0.1mL，蒸馏水1000mL，琼脂20.0g，pH 7.2。将配制的ACC溶液通过0.2μm的细菌过滤器灭菌后，以3mmo1/L终浓度加入到以上培养基中。
所述微量元素组分A的配方：CuSO4·5H2O 78.22mg，MoO3 10mg，H3BO3 10mg，ZnSO4·7H2O 124.6mg，MnSO4·H2O 11.9mg，以上溶解于100mL无菌蒸馏水中。
所述微量元素组分B的配方：FeSO4·7H2O 100mg，将其溶于10mL已灭菌的蒸馏水中，充分振荡。
所述微量元素组分A和B均置于-4℃保存备用。
实施例3：庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液的制备
所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液的制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将低温保藏的庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌种转接至NA培养基试管斜面，于37℃培养24-48h进行活化。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0。
2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的庆盛芽孢杆菌PAPM-10菌苔，接种于NB培养基中，37℃培养24-48h。所述NB培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、pH 7.0。
3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以体积比2％的接种量转接入装有6L NB培养基的10L种子罐中，于37℃培养24-48h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风量为6L/min。
4)发酵培养：将种子罐菌种以体积比4％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基300L，37℃培养24-48h，获得庆盛芽孢杆菌PAPM-10的发酵液。全程搅拌转速为240rpm，0-6h通风量为200L/min，6-48h通风量为300L/min。发酵结束后，发酵液中庆盛芽孢杆菌PAPM-10的活菌数为(1～2)×1010cfu/ml。
所述发酵培养基的配方为：麦芽糊精5％、蛋白胨1.5％、酵母膏0.5％、KH2PO40.2％、Na2HPO4 0.05％、MgSO4 0.1％、ZnCl2 0.1％、柠檬酸三钠0.1％，初始pH值7.0-8.0，121℃灭菌20-30min。
实施例4：双源腐植酸的制备
原料：食用菌菌糠70份，风化煤粉30份，实施例3制备庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液1份。所述食用菌菌糠为灵芝、金针菇、双孢菇等食用菌采收后剩余的栽培基质；所述风化煤粉的总腐植酸含量为≥45％。
取组方量的风化煤粉原料，按重量比1：1加入质量分数10％的KOH溶液，混合均匀，45℃堆积4h，进行化学活化处理。
将组方量的食用菌菌糠和庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液与经活化后的风化煤粉混合均匀，即为发酵基质，控制其含水量55-60％。
将上述调制好的发酵基质进行堆肥发酵30-60d，使有机原料彻底腐熟。
堆肥结束后，发酵基质经风干、粉碎后，即为双源腐植酸，其总腐植酸含量≥10％。
实施例5：双源腐植酸生物肥料的制备
将所述庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液与双源腐植酸按重量比1:5混合均匀，即为所述双源腐植酸生物肥料，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×109cfu/g。
实施例6双源腐植酸生物肥料对水稻纹枯病的防治作用
盆栽实验采用盆口内径、底内径和高分别为15cm、13cm、15cm的陶盆，每盆内装入土壤3kg。盆栽试验共设3个处理组(T1～T3)和2个对照组(CK1～CK2)，每个处理25盆。处理组T1～T3完全相同，每盆作为底肥施用本发明所述双源腐植酸生物肥料0.2％(有机肥干重/土壤干重)，对照组CK1和CK2每盆作为底肥施用预灭菌的本发明所述双源腐植酸生物肥料0.2％(有机肥干重/土壤干重)。每盆种植两株水稻，处理组T1～T3和对照组CK1每盆灌根50mL立枯丝核菌孢子悬浮液(1×106孢子/mL)，对照组CK2每盆灌根50mL预灭菌的立枯丝核菌孢子悬浮液(1×106孢子/mL)。病原菌灌根5天、10天、20天、30天后，观察症状并统计病害严重度和防效。
纹枯病分级标准：0级：全株无病；1级：第4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第1片叶)；3级：第3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死。
病情指数＝∑[(各级病叶数×各级代表值)/(9×总株数)]×100。
防效＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100％。
试验结果如表1所示，接种立枯丝核菌5天后，对照组CK1个别植株上叶鞘始见暗绿色模糊病斑，而处理组T1～T3植株无任何症状。10天后，对照组CK1植株底部第1～2叶片基部有明显病斑，处理组T1～T3植株有个别植株上叶鞘暗绿色水渍状模糊病斑。三个处理组T1～T3植株病情指数分别为0.44、1.11和0.67，而对照组CK1病情指数达到了8.44，防效分别为94.79％、86.85％和92.06％。20天后，对照组CK1植株外部叶片有1/3～1/2腐烂，而处理组T1～T3植株有个别植株底部第1～2叶片基部有明显病斑，处理组T1～T3植株病情指数分别为3.33、3.56和4.22，而对照组CK1病情指数达到18.00，防效分别为81.50％、80.22％和76.56％。30天后，对照组CK1植株出现外部叶片全部腐烂，有一株整株腐烂，处理组T1～T3植株有个别植株底部第1～2叶片基部有明显病斑。三个处理组T1～T3植株病情指数分别为3.78、4.00和4.89，而对照组CK1病情指数达到了28.22，防效分别为86.61％、85.83％和82.68％。
表1双源腐植酸肥料对水稻纹枯病的防治作用
Figure BDA0002711239680000081
Figure BDA0002711239680000091
SEQUENCE LISTING
<110> 山东佐田氏生物科技有限公司
<120> 一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法与应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> 庆盛芽孢杆菌（Bacillus qingshengii）PAPM-10的16S rDNA 序列
<400> 1
gcgtgggggc gtgctataca tgcaagtcga gcgaactgat tagaagcttg cttctatgac 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctgcc tgtaagactg ggataacttc 120
gggaaaccga agctaatacc ggataggatc ttctccttca tgggagatga ttgaaagatg 180
gtttcggcta tcacttacag atgggcccgc ggtgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc aacgatgcat agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420
aagaacaagt acaagagtaa ctgcttgtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagaga aaagcggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt tttggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca actctagaga tagagcgttc cccttcgggg gacagagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggatg gtacaaaggg ctgcaagacc gcgaggtcaa gccaatccca 1260
taaaaccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc tggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtggagt aaccgtaagg agctagccgc 1440
ctaaggtgac agtt 1454

Claims (9)

1.一株耐盐碱的庆盛芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)菌株PAPM-10，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.20120。
2.权利要求1所述的耐盐碱的庆盛芽孢杆菌菌株PAPM-10在产蛋白酶和产ACC脱氨酶，拮抗立枯丝核菌方面的应用。
3.权利要求1所述的耐盐碱的庆盛芽孢杆菌菌株PAPM-10的发酵方法，其特征是，庆盛芽孢杆菌菌株PAPM-10经扩大培养后，接种到发酵培养基中，于35-38℃培养24-48h，获得庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液。
4.如权利要求3所述的耐盐碱的庆盛芽孢杆菌菌株PAPM-10的发酵方法，其特征是，所述发酵培养基的组分及重量比为：麦芽糊精5％、蛋白胨1.5％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.2％、Na2HPO4 0.05％、MgSO4 0.1％、ZnCl2 0.1％、柠檬酸三钠0.1％，初始pH值7.0-8.0。
5.一种以庆盛芽孢杆菌PAPM-10为主要有效成分的双源腐植酸生物肥料，其特征是，由权利要求3所制备的庆盛芽孢杆菌PAPM-10的发酵液与双源腐植酸复配而成。
6.如权利要求5所述的双源腐植酸生物肥料，其特征是，
所述双源腐植酸由下述方法制备而成：
1)原料：食用菌菌糠70±5份，风化煤粉30±5份，庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液1±0.5份；
2)将风化煤粉采用KOH溶液进行化学活化处理；
3)将食用菌菌糠和庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液与经活化后的风化煤粉混合均匀，即为发酵基质，控制其含水量55-60％；然后堆肥发酵30-60d，使有机原料彻底腐熟；堆肥结束后，发酵基质经风干、粉碎后，得到双源腐植酸。
7.如权利要求6所述的双源腐植酸生物肥料，其特征是，所述食用菌菌糠为食用菌采收后剩余的栽培基质；所述风化煤粉的总腐植酸含量为≥45％。
8.如权利要求6所述的双源腐植酸生物肥料，其特征是，将庆盛芽孢杆菌PAPM-10发酵液与双源腐植酸按重量比1:4-6混合均匀，得到双源腐植酸生物肥料。
9.权利要求5-8中任一项所述的双源腐植酸生物肥料防治水稻纹枯病方面的应用。
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