CN110384247A - 一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病生物控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病生物控制方法，涉及植物病害生物防治技术领域。所述生物控制方法在烟叶烘烤前用保藏号为CGMCC No.5724的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011菌液或含其菌株YN2011的微生物制剂喷洒或浸泡烟叶，再进行烘烤。喷洒烟叶处理对烘烤过程中烟叶霉烂病的相对防效可达86.22％以上，浸泡烟叶处理对烘烤过程中烟叶霉烂病的相对防效可达97.90％以上，效果显著。本发明方法成本低，操作方便，且无毒、无污染、无残留，是一种环境友好型的方法。

Description

一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病生物控制方法
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及用一株胶质芽孢杆菌菌株及其制剂控制烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病。
背景技术
烟叶霉烂病是烟叶烘烤期发生的一种重要的侵染性病害(曾婷英等.烘烤期烟叶霉烂病的病原鉴定.中国烟草学报，2014，第20卷第4期：65-68)。烟株在整个生长过程中一直暴露于土壤和空气中，受着各种霉菌的威胁，因烟草在生长后期，叶片里富含营养物质，极易滋生各种微生物。在烟叶烘烤期间和存储过程中，一旦条件适宜，烟叶易发生霉烂变质，基本上丧失了利用价值，给当地烟农和烟叶生产带来重大经济损失。研究表明，个别烤房在烟叶烘烤期间烟叶霉变率达到50％以上。据日本沟口和宪等研究，烟叶霉变后，烟叶内含物质被迅速分解，正常结构和内含物遭受破坏，外观色泽暗淡，发出浓烈的霉酸恶臭，吸味严重恶化，霉变严重时，完全变成黑污色具恶臭的腐烂物，失去了使用价值，并且在霉烂过程中还产生霉菌毒素，严重影响人体健康，如引起人体过敏和哮喘等。
烟草中含有微生物生长所需的各种营养物质，广泛存在烤房的空气，烟杆，烟叶表面。烟叶受到霉菌污染，因烟叶本身营养丰富，在适宜的温湿度条件下，就会引发烟叶霉变。云南省报道，红花大金元烟叶在烘烤过程中发生叶柄端部霉变，主要是霉菌引起。曾婷英等对福建省烘烤期烟叶霉烂的病原菌进行鉴定，首次确认烘烤期烟叶霉烂是由米根霉(Rhizopusoryzae Went et Geerligs)引起的侵染性病害。影响烟叶霉变的因素很多，除了周围空气中，烘烤设施、烟叶表面含有大量霉菌外，最主要的理化因素有温度，空气相对湿度，光照等。有研究表明，烘烤过程霉烂病的病原菌米根霉最适宜的生长温度是32～40℃，相对湿度在75％～85％，该温度与烟叶烘烤变黄期温度一致，最有利用米根霉的生长和侵染，病害迅速扩展蔓延。
目前，有关烘烤期间烟叶霉变防治技术报道的不多，大多数烟叶霉变防治技术集中在烟叶贮藏期间。目前报道的烟草生产中较常用的防霉剂主要有苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸，但是这些防霉剂只能抑制部分霉菌的生长，且抑菌效果较小。王永栋等利用二氧化氯和三氯异氰尿酸有效防治了烘烤期间的烟叶霉烂病，但是利用该方法防治烘烤过程霉烂病，烟叶氯离子含量往往超标。目前，缺乏好的生防制剂或产品来防治烘烤期间烟叶霉变。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病生物控制方法，该方法包括：烟叶烘烤前用有效活菌数为1×108cfu/ml的胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)菌株YN2011的0-100倍液喷洒或浸泡烟叶，然后再按常规将烟叶编在竹竿上，晾干烟叶表面水分后，按常规放入烤房烘烤，所述的胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)菌株YN2011的保藏号为：CGMCC No.5724。
本发明提供的另一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的生物控制方法包括：烟叶烘烤前用含胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的微生物制剂喷洒或浸泡烟叶，然后再按常规将烟叶编在竹竿上，晾干烟叶表面水分后，按常规放入烤房烘烤，所述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的保藏号为：CGMCC No.5724。
所述微生物制剂为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的发酵液，所述发酵液中胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数为1×106cfu/ml以上。
所述发酵液通过下述方法制备得到：
(1)将-80℃保存的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011接1～2环到种子培养基中，32℃培养24h，得活化的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011，按1％接种量，将活化的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011接种到种子培养基，在培养温度32℃、转速160rpm条件下，摇床培养12h，得到一级种子液，所述种子培养基为：蔗糖5～10g/L，酵母浸膏0.4～1g/L，硫酸铵1～2.5g/L，碳酸钙1～2g/L，七水硫酸镁0.5～1g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，pH 7.0～7.5；
(2)按1～3％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在30～34℃，转速100rpm，通气量为1500L/h，罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养12h，得到二级种子液；所述二级种子培养基与步骤(1)中所述的种子培养基相同；
(3)按1～3％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35～38℃，转速100rpm，通气量为1500L/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养46～48h，培养至发酵液中胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数≧1×106cfu/ml，所述发酵培养基与步骤(1)中所述的种子培养基相同。
上述生物控制方法，在浸泡烟叶时，整个叶片进行浸泡，浸泡时间为10分钟以上。
上述生物控制方法，在喷洒烟叶时，包括叶柄端部、叶背和叶面的喷洒，喷施量以叶片滴水为止。
上述生物控制方法，将编在竹杆上的烟叶放入普通气流上升式3～4层密集式烤房内烘烤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的生物控制方法能使胶质芽孢杆菌菌株YN2011在烟草内定殖，从而达到防病、抗病的目的。用胶质芽孢杆菌菌株YN2011菌液或其微生物制剂浸泡或喷洒待烘烤的烟叶来控制烟叶霉烂病，喷洒烟叶，在烘烤过程中烟叶霉烂病的相对防效可达86.22％以上，浸泡烟叶，在烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的相对防效可达97.90％以上。
2.本发明方法是一种环境友好型的生物控制方法，具有生产成本低，操作方便，无毒、无污染、无残留等优点。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，各实施例无特殊说明为常规方法。
实施例1胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的分离纯化、鉴定和保藏
1胶质芽孢杆菌菌株YN2011的分离纯化
1.1材料
采自种植烟草的田间土壤。
1.2培养基制备
硅酸盐细菌固体培养基为：蔗糖5.0g/L，磷酸钠2.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，六水氯化铁5.0mg/L，琼脂粉15g/L，pH 7.0。将上述硅酸盐细菌固体培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成平板，用于分离和保存细菌。
1.3分离培养
在无菌条件下，称取采自种植烟草的田间土壤10g土样溶于90mL的无菌水充分振荡并梯度稀释成l0-2、10-3、l0-4倍的土壤悬液，然后每个稀释度各取100μL分别均匀涂布于上述硅酸盐细菌固体培养基平板上，37℃倒置培养3d。挑选无色、透明、半玻璃状并富有弹性的菌落，进一步纯化直至获得纯培养为止。最后将所获得的纯培养菌株转入终浓度为25％w/w的甘油中并密封保存于-80℃冰箱。
2胶质芽孢杆菌菌株YN2011的鉴定
2.1形态学鉴定
取1.3中保存的菌株用上述硅酸盐细菌固体培养基培养，32℃培养36小时，进行形态观察鉴定，菌落均呈边缘整齐的圆形凸起，无色透明，半玻璃状，表面光滑湿润，富有弹性难于挑起，粘稠易拉成丝。菌体为杆状。在牛肉膏蛋白胨培养基上生长不良。在显微镜下观察，菌体不运动，有端生芽孢，在无氮培养基上产生丰厚荚膜。与《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的胶质芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断该菌株属于胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，编号为YN2011，简称：菌株YN2011。
2.2生理生化鉴定
菌株YN2011革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、V-P反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。
2.3分子鉴定结果
根据16S rDNA通用引物扩增序列，依据测序结果，菌株YN2011的16S rDNA序列经与NCBI数据库BLAST比对，菌株YN2011序列与菌株编号为YNUCC0001(AY571332)的胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus的相似度最高，达99％，结合菌株的形态特征，生理生化特性及16S rDNA序列，将菌株YN2011鉴定为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011。
3胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的保藏
所述的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5724，分类命名：胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
实施例2本发明微生物制剂的制备，包括以下步骤：
(1)将-80℃保存的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011接1～2环到种子培养基中，32℃培养24h，得活化的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011，按1％接种量，将活化的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011接种到种子培养基，在培养温度32℃、转速160rpm条件下，摇床培养12h，得到一级种子液；所述的种子培养基的组成为：蔗糖8g/L，酵母浸膏0.7g/L，硫酸铵1.5g/L，碳酸钙1g/L，七水硫酸镁0.8g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH 7.5。
(2)按2％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在32℃，转速100rpm，通气量为1500L/h，罐压保持在0.05MPa条件下培养12h，得到二级种子液；所述二级种子培养基与步骤(1)中所述的种子培养基相同。
(3)按3％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在32℃，转速100rpm，通气量为1500L/h、罐压保持在0.05MPa条件下培养46～48h，培养至发酵液中胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数≧1×106cfu/ml时，该发酵液即为所述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的发酵液，所述发酵液即为本发明微生物制剂；所述发酵培养基与步骤(1)中所述的种子培养基相同。
实施例3浸泡处理待烤烟叶生物控制烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病方法
1.试验时间：2018年8月-2018年9月
2.试验地点：云南省曲靖市宣威市格宜镇宜兴烤烟合作社
3.供试材料：供试烟草品种为云烟105，当天采摘成熟良好烟叶。
4.试验设计：供试烤房为普通气流上升式4层密集式烤房，烤房的规格是长×宽×高为8m×2.7m×4.1m，循环风机为7号轴流风机，控制器为辽宁海帝升机械有限公司HDS-6型密集烤房控制器，烤房装烟量45kg·m-3。烤房的第4层是霉烂病发病最严重的区域，试验在第4层进行。
5.分别用无菌水将实施例2制备的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×108cfu/mL的微生物制剂原液(以下简称：微生物制剂)稀释成10倍液、50倍液及100倍液，共3个浓度浸泡处理待烤烟叶，以直接采摘未处理烟叶为空白对照。各处理用微生物制剂浸泡烟叶时，整个叶片进行浸泡10min。每个处理总共有6杆，每杆编70～80片烟叶，在烤房的第4层分左右边放置，一边3杆，处理与处理之间用两杆正常未处理的烟叶隔开，按当地常规烘烤工艺进行烧烤。试验处理为：
CK：直接采摘的烟叶。
处理1：微生物制剂×10，即用无菌水稀释微生物制剂为10倍的稀释液，其胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×107cfu/mL。
处理2：微生物制剂×50，即用无菌水稀释微生物制剂为50倍的稀释液，其胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为2.0×106cfu/mL。
处理3：微生物制剂×100，即用无菌水稀释微生物制剂为100倍的稀释液，其胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×106cfu/mL。
6.调查方法：每一处理中随机取3组，记录其发病情况。所记录的病情参考王永栋的调查方法(王永栋等.烘烤期烟叶霉烂病的侵染源于防治.安徽农业科学，2017，45(19)138-142)进行分级，分为0、1、2、3、4、5六个级别。0级为没有发病；1级为叶柄发霉小于1cm，叶片不发病；2级是叶柄发霉大于1cm，叶片不发病；3级是叶柄发霉，叶片发霉面积小于25％；4级是叶柄发霉，叶片发霉面积达25％～50％；5级是叶柄发霉，叶片发霉面积大于50％。
计算公式：
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)×100/(调查总株数×最高级值)
相对防效(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)×100/对照区病情指数
表1实施例3浸泡待烤烟叶对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的防治效果
注：表1中数字后的英语字母，表示在P≤0.05水平下差异显著。
7.试验结果：烟叶经过7天的烘烤，对其病害发生程度进行统计(见表1)，本发明方法用稀释10倍的微生物制剂对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的防治效果达到99.22％，稀释50倍的微生物制剂对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的防治效果达到99.08％，稀释100倍的微生物制剂对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的防治效果达到97.90％。
实施例4喷洒处理待烤烟叶生物控制烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病方法
分别用实施例2制备的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×108cfu/mL的微生物制剂原液(以下简称：微生物制剂)，以及用无菌水将前述微生物制剂稀释成10倍液、100倍液，共3个浓度喷洒处理待烤烟叶，以直接采摘未处理烟叶为空白对照。各处理用微生物制剂喷洒烟叶时，包括叶柄端部、叶背和叶面的喷洒，喷洒量以叶片滴水为止。每个处理总共有6杆，每杆编70～80片烟叶，在烤房第4层分左右边放置，一边3杆，处理与处理之间用两杆正常未处理的烟叶隔开，按当地常规烘烤工艺进行烧烤。试验处理为：
CK：直接采摘的烟叶。
处理1：微生物制剂，其胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×108cfu/mL。
处理2：微生物制剂×10，即用无菌水稀释微生物制剂为10倍的稀释液，其胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×107cfu/mL。
处理3：微生物制剂×100，即用无菌水稀释微生物制剂为100倍的稀释液，其胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数含量为1.0×106cfu/mL。
其他与实例3相同的处理方法，不再赘述。
试验结果：烟叶经过7天的烘烤，对其烟叶霉烂病病害发生程度进行统计(见表2)。本发明方法采用微生物制剂原液喷施待烤烟叶对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的的防治效果达到95.08％，采用微生物制剂10倍液喷施待烤烟叶对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的的防治效果达到90.07％，采用微生物制剂100倍液喷施待烤烟叶对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的防治效果达到86.22％。
表2实施例4喷洒待烤烟叶对烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的防治效果
注：表2中数字后的英语字母，表示在P≤0.05水平下差异显著。

Claims (9)

1.一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的生物控制方法，其特征在于：烟叶烘烤前用有效活菌数为1×108cfu/ml的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的0-100倍液喷洒或浸泡烟叶，然后再按常规将烟叶编在竹竿上，晾干烟叶表面水分后，按常规放入烤房烘烤，所述的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的保藏号为：CGMCCNo.5724。
2.一种烟叶烘烤过程中烟叶霉烂病的生物控制方法，其特征在于：烟叶烘烤前用含胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的微生物制剂喷洒或浸泡烟叶，然后再按常规将烟叶编在竹竿上，晾干烟叶表面水分后，按常规放入烤房烘烤，所述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的保藏号为：CGMCC No.5724。
3.根据权利要求2所述的生物控制方法，其特征在于，所述微生物制剂为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的发酵液，所述发酵液中胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数为1×106cfu/ml以上。
4.根据权利要求3所述的生物控制方法，其特征在于：所述发酵液通过下述方法制备得到：
(1)将-80℃保存的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011接1～2环到种子培养基中，32℃培养24h，得活化的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011，按1％接种量，将活化的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011接种到种子培养基，在培养温度32℃、转速160rpm条件下，摇床培养12h，得到一级种子液，所述种子培养基为：蔗糖5～10g/L，酵母浸膏0.4～1g/L，硫酸铵1～2.5g/L，碳酸钙1～2g/L，七水硫酸镁0.5～1g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，pH 7.0～7.5；
(2)按1～3％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在30～34℃，转速100rpm，通气量为1500L/h，罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养12h，得到二级种子液；所述二级种子培养基与步骤(1)中所述的种子培养基相同；
(3)按1～3％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35～38℃，转速100rpm，通气量为1500L/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养46～48h，培养至发酵液中胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌株YN2011的有效活菌数≧1×106cfu/ml，所述发酵培养基与步骤(1)中所述的种子培养基相同。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的生物控制方法，其特征在于，将编在竹杆上的烟叶放入普通气流上升式3～4层密集式烤房内烘烤。
6.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的生物控制方法，其特征在于，浸泡烟叶时，整个叶片进行浸泡，浸泡时间为10分钟以上。
7.根据权利要求6所述的生物控制方法，其特征在于，将编在竹杆上的烟叶放入普通气流上升式3～4层密集式烤房内烘烤。
8.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的生物控制方法，其特征在于，喷洒烟叶时，包括叶柄端部、叶背和叶面的喷洒，喷施量以叶片滴水为止。
9.根据权利要求8所述的生物控制方法，其特征在于，将编在竹杆上的烟叶放入普通气流上升式3～4层密集式烤房内烘烤。
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