CN103045515B - 一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的保藏登记号为CGMCCNo.6793的甲基营养型芽孢杆菌，该菌株是从烟草根际土壤分离得到的，通过菌株的分离、纯化以及筛选步骤获得的。本发明进一步提供所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法、由该方法制备所得的发酵产物，以及基于该发酵产物的生物菌剂及其制备方法，进一步地还提供所述生物菌剂防治多种植物病害的用途。该生物菌剂环境相容性好，有效活孢子数达50亿/克以上，具有很高的生物活性，特别是对由烟草青枯病具有较好的防效，其对烟草青枯病、白菜软腐病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病和棉花角斑病的防效高达80％以上。
Description
技术领域
本发明属于植物病害生物防治领域，特别是利用有益微生物对植物病害进行生物防治，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，以及利用该菌株制备生物菌剂以及所述生物菌剂防治植物病害的应用。
背景技术
植物病害的流行不但引起作物减产，给人类造成重大经济损失，甚至带来灾难性后果。植物病害的危害还会导致农产品品质低劣，不堪使用或加工，甚至导致人畜中毒。在植物病害的防治中，化学农药因为具有成本低、见效快、省时省力等优点曾一度成为人们的首选，但是，化学农药一般不可降解，随着化学农药的大量使用，引发了环境污染、生态破坏、食品污染等事件。这使研究开发利用生物农药成为植物保护工作者的重要研究课题。生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，具有安全、高效、无污染等特点，与保护生态环境和社会协调发展的要求相吻合，是未来农药发展的必然趋势。
微生物农药是生物农药中应用最为广泛的一类，也是生物防治的重要材料。微生物源农药的主要成分是微生物活体及其次生代谢产物，由于微生物种类多样，其活性也很广泛，包括杀虫、杀菌、除草以及植物生长调节作用等。自然界中用于生防细菌的，主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属。特别是近几年，利用微生物防治植物真菌性病害由于对环境安全，可以减缓病原菌产生抗药性，已经成为当前防治植物病害的主流方法。
甲基营养型芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，该菌在自然界中广泛存在，具有独特的一碳代谢途径，能够将自然界中取之不尽的一碳化合物如甲醇、甲醛等转变为菌体自身所需的营养物质，同时又会产生多种有益的代谢副产物L.丝氨酸、维生素B12、聚p羟基丁酸盐等。对人畜无毒无害，不污染环境，具备生命力强，繁殖快速能产生多种抗菌素和酶，具有抗菌活性和极强的抗高温、抗强酸强碱能力。甲基营养型芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎内部。甲基营养型芽孢杆菌通过成功定殖于烟草、水稻等植物根际、体表或体内，改变其周围菌群环境和种类，与病原菌竞争植物周围的位点，并且分泌多种抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御***抵御病原菌入侵，从而达到改良土壤和生防的目的，具有防病和促生作用。
烟草青枯病是一种由青枯劳尔氏菌(Ralatoniasolanacearum)引起的、以土壤传播为主的、毁灭性的细菌性病害。此病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、湖南、四川及贵州烟区危害较重。目前，在生产中主要采用化学农药防治，但是无法有效防止该病发生，而且长期大量施用化学农药既容易使病菌产生抗药性，又容易造成严重的环境污染。
水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)引起的，是水稻三大病害之一，在世界上几乎所有的水稻种植区均有发生，我国除新疆、西藏和东北的北部以外均有不同程度的发生，长江以南和江淮平原籼稻产区是常发区，严重影响水稻产量，目前主要依赖化学农药防治，但是长期使用，使病菌容易产生抗药性，并且严重污染环境。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的甲基营养型芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法，以及由该方法制备所得的发酵产物。
本发明的另一目的在于提供甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供利用所述甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治植物病害的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种甲基营养型芽孢杆菌，其属于芽孢杆菌属，其命名为Bacillusmethylotrophicus；保藏登记号为CGMCCNo.6793，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路；保藏时间为2012年11月07日。
本发明的上述甲基营养型芽孢杆菌是从烟草根际土壤分离得到的，通过菌株的分离、纯化以及筛选步骤获得的。
菌株鉴定：采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法，以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)。
本发明所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法，所述方法包括下述步骤：
步骤一：菌种活化：将保藏登记号为CGMCCNo.6793的甲基营养型芽孢杆菌菌种接种到LB固体培养基上面，于30℃活化培养48h，所述LB固体培养基配方为酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.4～7.6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用；
步骤二：种子液的制备：从LB固体培养基上挑取菌种接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB液体培养基配方为：酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.4～7.6；培养条件：30℃，48h；
步骤三：发酵培养：将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤分别如下：
种子罐发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：35-37℃，42h，接种量：6％，通气量：2.5L/min，搅拌转速：200r/min；
大规模工业发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：35-37℃，60-70h，接种量：6％，通气量：2.0L/min，搅拌转速：220r/min；
其中在种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养中，种子液的接种量均占液体培养基总量的6-8％；
所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉1.5％，蔗糖1％，KH2PO40.05％，MgSO40.02％，NaCl0.1％，其余为水，所列百分比为重量百分比。
优选地，若在步骤三的发酵培养过程中有泡沫产生，可滴加敌消泡。
进一步地，本发明提供由上述技术方案所述的甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法制备所得的发酵产物。
进一步地，根据上述发酵产物，本发明还提供一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂，所述生物菌剂是通过如下步骤制得的：
步骤一：过滤并浓缩产物：将采用上述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法制备所得的发酵产物用草酸调节pH至6.5-7.0后，将发酵产物通过截留分子量40000-100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为35-37℃，膜通量为50-60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍，制得经浓缩的芽孢溶液，所述浓缩方法为使用50万Da的分子筛膜，蠕动泵流速为4档，通量为420ml/min，出液口压力为0.08MPa；
步骤二：喷雾干燥：向步骤一的经浓缩的芽孢溶液中添加1.0％的填料，随后将芽孢溶液经喷雾制成粉末，喷雾干燥的进口温度为170-190℃，出口温度为65-85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa，即得到本发明的甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂；所述填料为白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙。
进一步地，本发明提供将上述甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治植物病害的用途；特别是用于防治烟草、白菜、水稻、棉花作物中的病害；
优选地，所述烟草病害为烟草青枯病，该病害是由烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)引起的；所述白菜病害为白菜腐烂病，该病害是由软腐细菌(Erwiniacarotovora)引起的；所述水稻病害为水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病，所述病害均是由水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)引起的；所述棉花病害为棉花角斑病，所述病害是棉角斑病黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv.malvacearum(E.F.Smith)Dowson)引起的。
除非另有说明，本申请说明书中的“％”均为重量百分比。
本发明具有以下有益效果：
1、由本发明的甲基营养型芽孢杆菌所制得的生物菌剂，其环境相容性好，具有很高的生物活性，特别是对由烟草青枯病具有较好的防效，通过实验证明，该甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂对烟草青枯病、白菜软腐病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病和棉花角斑病的防效高达80％以上。
2、由本发明的甲基营养型芽孢杆菌制得的生物菌剂是采用新型工艺发酵、先进超滤浓缩分离技术研发的新型高活性高浓度生物菌剂，有效活孢子数达50亿/克以上。
附图说明：
图1为本发明的甲基营养型芽孢杆菌的16SrDNA同源序列比对分析树状图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例作进一步的说明。
实施例1：本申请甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)的分离与筛选：
(1)、芽孢杆菌的分离：
称取烟草根际土壤10g，倒入装有90ml灭菌水的锥形瓶中，200r/min振荡20min，80℃水浴30min，10倍比稀释，涂布分离。
(2)、芽孢杆菌的纯化：根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至LB固体培养基上，采用划线分离的方法纯化；纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、G+的分离物为芽孢杆菌；所述LB固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨8g，NaCl5g，琼脂15g，水1000ml，pH7.4。
(3)、拮抗芽孢杆菌的筛选：
用TTC培养基选择具有活性的烟草青枯病菌作为指示菌，将烟草青枯病菌配成2×108cfu/ml浓度的菌悬液，转接到BPA培养基上，制成青枯病菌含菌培养基。待吹干后，在平板中央接上述已分离纯化的芽孢杆菌菌株，30℃培养2-3d，测定抑菌圈直径和抑菌带(从活性菌菌落的边缘到抑菌圈的外缘)的大小。所述TTC培养基的配方为：胰蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，氯化钠2.5g，葡萄糖6.0g，硫乙醇酸钠0.5g，L-胱氨酸0.25g亚硫酸钠0.1g琼脂16.0g；所述BPA培养基的配方为：牛肉浸膏3-5g，蛋白胨5-10g，蔗糖10-12g，酵母浸膏1-2g，琼脂17-20g，加水至1L。
分离筛选获得本申请的甲基营养型芽孢杆菌，实验室编号为LW-6。
实施例2：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)的鉴定：
对实施例1所得的甲基营养型芽孢杆菌的鉴定过程为：
(1)、形态特征：在NA固体培养基上LW-6菌落呈现奶白色，菌落表面粗糙，边缘呈现锯齿状，透过电镜显示LW-6呈杆状，革兰氏阳性，周生鞭毛，单个细胞大小为0.5-0.6um×2.0-2.5um。所述NA固体培养基的配方为：牛肉浸膏2-3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5-3g，琼脂16-18g，加水至1000ml。
(2)、生理生化实验：通过对甲基营养型芽孢杆菌的生理生化特性试验(如表1所示)并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》(Buchanan&Gibbons，1984)和《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定该菌株为芽孢杆菌属。
表1本申请甲基营养型芽孢杆菌的生理生化特征
注：“+”表示阳性反应，“”表示阴性反应。
菌株生理生化特征表明：本申请的菌株LW-6可以使明胶液化；能水解淀粉和还原硝酸盐；葡萄糖、***糖、木糖、甘露糖、接触酶、脂肪酶、脲酶及氧化酶均呈阳性；V-P试验为阳性；不利用柠檬酸盐。最高生长温度为60℃，最低生长温度为10℃，最适生长温度为30℃；最高pH值为11.0，最低pH值为3.0，最适pH值为7.0；具有耐盐性，可以在15％的NaCl培养基中生长。
(3)、分子生物学鉴定：以LW-6基因组DNA为模板，用引物7f和1540r进行PCR扩增，测得该菌株的16SrDNA核苷酸序列长度为1454bp，GenBank登录号为JX220980。通过与NCBI中模式菌株的16SrDNA序列比对分析和***发育树的构建(图1)，得知LW-6菌株与甲基营养型芽孢杆菌BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)(GenBank登录号为EU194897)同源性最近，相似性为100％。
综合LW-6细菌的形态、培养特征、生理生化测定和16SrDNA同源序列比对分析，初步鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌
实施例3：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)的培养
(1)、菌株活化：
培养基：LB固体培养基，所述LB固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨8g，NaCl5g，琼脂20g，水1000ml，pH7.4；
培养条件：30℃，48h；
连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到发酵液中使用。
(2)、种子液的制备(摇瓶发酵或茄子瓶发酵)：
培养基：LB液体培养基，所述的LB液体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨8，NaCl5g，水1000ml，pH7.4(烧瓶体积250ml，装液量50ml)；
培养条件：30℃，48h；
接种量：6-8％。
(3)、种子罐发酵：
培养基：FJ液体培养基，所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉1.5％，蔗糖1％，KH2PO40.05％，MgSO40.02％，NaCl0.1％，其余为水，所列百分比为重量百分比。
装料系数：0.7；
培养条件：35-37℃，48h；
接种量：6％；
通气量：2.5L/min；
搅拌转速：200r/min；
(4)、工业发酵：
液体培养基：FJ液体培养基(20-36T)，所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉1.5％，蔗糖1％，KH2PO40.05％，MgSO40.02％，NaCl0.1％，其余为水，所列百分比为质量分数；
装料系数：0.7；
培养条件：35-37℃，48h；
接种量：6％；
通气量：2.0L/min；
搅拌转速：220r/min；
实施例4：本申请甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂的制备
(1)、发酵液浓缩：将采用实施例3制得的发酵产物用草酸调节至6.5-7.0后，将发酵产物通过截留分子量40000-100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为35-37℃，膜通量为50-60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6倍，制得经浓缩的芽孢溶液，所述浓缩方法为使用50万Da的分子筛膜，蠕动泵流速为4档，通量为420ml/min，出液口压力为0.08MPa。
(2)、喷雾干燥：
向上述经浓缩的芽孢溶液中添加1.0％的白炭黑，将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到本发明的甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂。
实施例5：本申请甲基营养型芽孢杆菌对烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、白菜软腐病菌的皿内拮抗实验：
分别以烟草青枯病菌Ralstoniasolanacearum、水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.Oryzae和白菜软腐病菌Erwiniacarotovora为供试病原菌，用LB培养基选择具有活性的指示菌，将病菌配成2×108cfu/ml浓度的菌悬液，转接到LB培养基上，制成含菌培养基。待吹干后，在平板中央接上述已分离纯化的芽孢杆菌菌株，30℃培养2-3d，测定抑菌圈直径和抑菌带(从活性菌菌落的边缘到抑菌圈的外缘)的大小。本申请的甲基营养型芽孢杆菌对不同病原细菌的抑菌情况如表2所示
表2本申请的甲基营养型芽孢杆菌对不同病原菌的抑菌情况
| 病原菌 | 抑菌圈直径/mm |
| 烟草青枯病菌 | 21.05 |
| 白菜软腐病菌 | 15.05 |
| 水稻白叶枯病菌 | 18.90 |
由表2用抑菌圈大小测定甲基营养型芽孢杆菌对烟草青枯病菌Ralstoniasolanacearum、水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.Oryzae和白菜软腐病菌Erwiniacarotovora的抑制情况，发现本菌株对这些病原菌抑制情况显著，尤其是对烟草青枯病和水稻白叶枯病抑制效果更为突出。
实施例6：本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂的活性测定
供试病原菌：烟草青枯病菌Ralstoniasolanacearum，在TTC培养基上培养，制成1×106cfu/ml菌悬液，待用。
供试化学药剂：72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂。
方法：试验用土为灭菌的混配营养土V(土壤)∶V(营养土)＝1∶l。将灭菌土培育烟苗至4～5叶期，将幼苗取出。
处理1：空白对照，烟苗根部在清水中浸根30min。
处理2：化学药剂对照，烟苗根部在72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂2000倍液中浸根30min，接种1d后，灌根法接种烟草青枯菌，接种量为5ml/株。
处理3：于实施例4的甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂200倍稀释液中浸根30min，接种1d后，灌根法接种烟草青枯菌，接种量为5ml/株。
每处理设3次重复，每重复10株烟苗，处理移栽至装有灭菌土的苗钵中，处理放置于温室28～36℃条件下，15天后调查烟草植株发病情况，统计发病率和病情指数。
分级标准：
0级：全株无病
1级：茎部偶有褪绿病斑或在条斑一侧有少数叶片凋萎
3级：茎部黑色病斑。但未达到顶部，或病侧5％叶片凋萎
5级：茎部黑色病斑达植株顶部。或病侧2/3叶片凋萎
7级：病株茎部枯死
本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对烟草青枯病的温室防效研究结果如表3：
表3本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对烟草青枯病的温室防治效果
实施例7：本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对水稻白叶枯病防效实验：
供试病原菌：水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)，在LB培养基上培养，制成1×106cfu/ml菌悬液，待用。
供试化学药剂：春雷霉素水剂。
方法：试验用土为灭菌的混配营养土V(土壤)∶V(营养土)＝1∶1。将灭菌土培育水稻秧苗至4～5叶期，将幼苗取出。
处理1：空白对照，水稻苗根部在清水中浸根30min。
处理2：化学药剂对照，水稻苗根部在春雷霉素600倍液中浸根30min，接种1d后，灌根法接种水稻白叶枯病原菌菌悬液，接种量为5ml/株。
处理3：于实施例4的甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂200倍稀释液中浸根30min，接种1d后，灌根法接种水稻白叶枯菌，接种量为5ml/株。
每处理设3次重复，每重复10株水稻苗，处理移栽至装有灭菌土的苗钵中，处理放置于温室28～36℃
条件下，15天后调查烟草植株发病情况，统计发病率和病情指数。
分级标准：
0级：无病；
1级：病斑面积为叶面积的1/5以下；
2级：病斑面积为叶面积的1/3的以下；
3级：病斑面积为叶面积的1/2以下；
4级：病斑面积为叶面积的3/5以下；
5级：病斑面积为叶面积的3/5以上
本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对水稻白叶枯病的温室防效研究结果如表4：
表4本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对水稻白叶枯病的温室防治效果
实施例8：本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对白菜软腐病原菌防效实验：
供试病原菌：白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)，在LB培养基上培养，制成1×106cfu/ml菌悬液，待用。
供试化学药剂：农用链霉素可湿性粉剂。
方法：试验用土为灭菌的混配营养土V(土壤)∶V(营养土)＝1∶1。将灭菌土培育白菜至4～5叶期，将幼株取出。
处理1：空白对照，白菜根部在清水中浸根30min。
处理2：化学药剂对照，白菜根部在农用链霉素4000倍液中浸根30min，接种1d后，灌根法接种白菜软腐病原菌菌悬液，接种量为5ml/株。
处理3：于实施例4的甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂200倍稀释液中浸根30min，接种1d后，灌根法接种白菜软腐细菌，接种量为5ml/株。
每处理设3次重复，每重复10株白菜，处理移栽至装有灭菌土的苗钵中，处理放置于温室28～36℃条件下，15天后调查烟草植株发病情况，统计发病率和防治效果。
本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对白菜软腐病的温室防效研究结果如表5所示：
表5本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对白菜软腐病的温室防治效果
实施例9：本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂防治烟草青枯病、水稻白叶枯病、白菜软腐病的田间小区实验：
为验证本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对烟草青枯病、水稻白叶枯病、白菜软腐病的防效，我们在2012年6月至8月进行大田推广试验，实验条件如下：
(1)、烟草：试验用地选在陕西宝鸡，试验地面积900m2(1.36亩)，土质为轻壤土，有机质含量为1.01％，pH值7.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。本实验设甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂200倍液、72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂和不施药清水共3个处理，每个处理4个重复，共12个小区，各小区随机排列，每个小区40m2小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。2010年4月进行播种，平均株距8cm，播种后分别于2010年5月5日、15日和25日根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
气象条件
第一次施药(5月5日)当日少云，风力3级，最高气温25℃，最低气温15℃，相对湿度为80％。第二次施药(5月15日)当日阴，风力3级，最高气温23℃，最低气温15℃，相对湿度为80％。第一次施药(5月25日)当日少云，风力5级，最高气温25℃，最低气温14℃，相对湿度为80％。
最后一次施药后7天进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：全株无病
1级：茎部偶有褪绿病斑或在条斑一侧有少数叶片凋萎
3级：茎部黑色病斑。但未达到顶部，或病侧5％叶片凋萎
5级：茎部黑色病斑达植株顶部。或病侧2/3叶片凋萎
7级：病株茎部枯死
调查结果如下表6所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，本申请的甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对烟草青枯病的平均防效达。
表6本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对烟草青枯病田间试验防治情况
(2)、水稻：试验用地选在陕西洋县，试验用地800m2(1.21亩)，土质为轻壤土，有机质含量为1.2％，pH值7.5，所有试验小区栽培条件及管理措施一致；本实验设本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂200倍液、春雷霉素600倍液和不施药清水共3个处理，每个处理4个重复，共12个小区，各小区随机排列，每个小区60m2小区间及试验地周围设置0.5m宽的隔离带。2010年3月进行播种，平均株距7cm，播种出苗后分别于2010年4月15日、5月5日和25日分别根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
气象条件
第一次施药(4月15日)当日少云，风力3级，最高气温14℃，最低气温1℃，相对湿度为30％。第二次施药(5月15日)当日阴，风力3级，最高气温19℃，最低气温3℃，相对湿度为30％。第一次施药(5月25日)当日少云，风力5级，最高气温23℃，最低气温10℃，相对湿度为20％。
最后一次施药后7天进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：无病；
1级：病斑面积为叶面积的1/5以下；
2级：病斑面积为叶面积的1/3的以下；
3级：病斑面积为叶面积的1/2以下；
4级：病斑面积为叶面积的3/5以下；
5级：病斑面积为叶面积的3/5以上
调查结果如下表7所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对水稻白叶枯病的平均防效达70％，高于春雷霉素水剂的防效。
表7本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对水稻白叶枯病田间试验防治情况
(3)、白菜：试验用地选在陕西杨凌，试验用地800m2(1.21亩)，土质为轻壤土，有机质含量为1.07％，pH值7.2，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。本实验设本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂200倍液、农用链霉素4000倍液和不施药清水共3个处理，每个处理4个重复，共12个小区，各小区随机排列，每个小区40m2小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。2010年7月进行播种，平均株距8cm，播种后分别于2010年8月5日、15日和25日根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
气象条件
第一次施药(8月5日)当日少云，风力3级，最高气温25℃，最低气温15℃，相对湿度为80％。第二次施药(8月15日)当日阴，风力3级，最高气温23℃，最低气温15℃，相对湿度为80％。第一次施药(8月25日)当日少云，风力5级，最高气温25℃，最低气温14℃，相对湿度为80％。
最后一次施药10天后进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：全株无病
1级：茎部偶有褪绿病斑或在条斑一侧有少数叶片凋萎
3级：茎部黑色病斑。但未达到顶部，或病侧5％叶片凋萎
5级：茎部黑色病斑达植株顶部。或病侧2/3叶片凋萎
7级：病株茎部枯死
调查结果如下表8所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，本申请甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂对白菜软腐病的平均防效达74.1％，高于农用链霉素4000倍液。
表8甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂对白菜软腐病的田间试验防治情况
本发明的一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (1)
1.一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治烟草青枯病的用途，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌，其属于芽孢杆菌属，其命名为Bacillusmethylotrophicus；保藏登记号为CGMCCNo.6793，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年11月07日；所述菌株是从烟草根际土壤分离得到的；
所述生物菌剂是通过如下步骤制得的：
步骤一：菌种活化：将上述菌种接种到LB固体培养基上面，于30℃活化培养48h，所述LB固体培养基配方为酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.4～7.6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用；
步骤二：种子液的制备：从LB固体培养基上挑取菌种接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB液体培养基配方为：酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.4～7.6；培养条件：30℃，48h；
步骤三：发酵培养：将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤分别如下：
种子罐发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：35-37℃，42h，接种量：6％，通气量：2.5L/min，搅拌转速：200r/min；
大规模工业发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：35-37℃，60-70h，接种量：6％，通气量：2.0L/min，搅拌转速：220r/min；
所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉1.5％，蔗糖1％，KH2PO40.05％，MgSO40.02％，NaCl0.1％，其余为水，所列百分比为重量百分比；
将上述发酵产物进一步制备生物菌剂：
(1)：过滤并浓缩产物：将上述发酵产物用草酸调节pH至6.5-7.0后，将发酵产物通过截留分子量40000-100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为35-37℃，膜通量为50-60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍，制得经浓缩的芽孢溶液，所述浓缩方法为使用50万Da的分子筛膜，蠕动泵流速为4档，通量为420ml/min，出液口压力为0.08MPa；
(2)：喷雾干燥：向(1)的经浓缩的芽孢溶液中添加1.0％的填料，随后将芽孢溶液经喷雾制成粉末，喷雾干燥的进口温度为170-190℃，出口温度为65-85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa，即得到甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂；所述填料为白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙；
所述烟草青枯病是由烟草青枯病菌( Ralstoniasolanacearum)引起的。
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|---|---|---|---|---|
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| ES2561908B2 (es) * | 2014-07-31 | 2016-12-01 | Universidad De Granada | Uso de Bacillus methylotrophicus como estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico, y cepas aisladas de dicha especie |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102732469A (zh) * | 2012-07-12 | 2012-10-17 | 云南农业大学 | 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用 |
| CN102787084A (zh) * | 2012-07-17 | 2012-11-21 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-l-16及其应用 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102732469A (zh) * | 2012-07-12 | 2012-10-17 | 云南农业大学 | 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用 |
| CN102787084A (zh) * | 2012-07-17 | 2012-11-21 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-l-16及其应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112400901A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-26 | 安徽丰乐农化有限责任公司 | 一种杀菌组合物及应用 |
| CN112400901B (zh) * | 2020-11-30 | 2021-12-24 | 安徽丰乐农化有限责任公司 | 一种杀菌组合物及应用 |
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