CN102827790B - 一种枯草芽孢杆菌菌株a97、菌剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株A97，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5840。本发明还提供了基于枯草芽孢杆菌菌株A97的微生物菌剂、该微生物菌剂的制备方法以及使用方法和该微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。本发明具有高效、广谱杀菌活性，能用于防控果蔬采后储藏期真菌侵染。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌株A97、菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株A97、菌剂及制备方法和应用。

背景技术

水果和蔬菜因富含碳水化合物、有机酸、维生素及无机盐而受到人们的欢迎，但是由于自身低pH值、高水分、高养分以及采收时易受机械创伤等特点，在采收后极易受真菌病害侵染，由此导致的腐烂会严重地影响到产品的最终消费。据统计，我国作为世界第一果蔬生产大国（产量约占全球总量的14%），每年由于采收后真菌侵染导致果蔬产品的经济损失率高达产值的20%～30%，价值超过700多亿元。

针对果蔬采收后病害的防治，国内外常用的方法主要有低温法、气调法、化学杀（抑）菌剂处理等方法。前两种方法投资大、能耗高，且对于病害真菌的抑制作用有限，所以目前仍然以施用化学杀菌剂为主要防治手段，常用的方法有50%抑霉唑乳剂500倍液、50%扑海因可湿性粉剂500倍液浸果1～2min；50%多菌灵、50%托布津或75%代森锰锌500～800倍液喷施等。但随着全世界对于食品安全和环境污染的日益关注，以及长期使用化学农药处理导致大量病原菌产生耐药性等问题的出现，使得开发新型防治技术的呼声不断高涨。利用生防菌进行果蔬采后病害的生物防治具有无毒害、无污染、环境可控性强、使用方法简便等优点，该技术已经成为目前国内外果蔬贮藏保鲜研究的热点。在这一领域中，美国、以色列和南非等国处于领先地位，并已有相关的成果被商品化应用，如Aspire，Bio-save，Yield Plus等。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有生长迅速，易分离培养，能产生抗逆性强的芽孢，贮藏期长及使用方便等特点，此外作为自然界中广泛存在的非致病菌，枯草芽孢杆菌对人畜无害且不会造成环境污染，以上优势使其成为一种理想的生防微生物。自1945年Johnson发现枯草芽孢杆菌可以产生抗菌物质后，芽孢杆菌便成为各国学者广泛关注的一类生防细菌，并在多种农作物上进行了广泛的抗病实验。大量的研究实验表明枯草芽孢杆菌对于多种农作物具有显著的抗病增产作用，而且与化学农药的相容性也明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌。而且由于芽孢杆菌能够形成内生芽孢，具有极强的抗逆能力，利于菌剂的生产和使用。因此，筛选对于病原菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌菌株A97，具有高效、广谱杀菌活性，用于防控果蔬采后储藏期真菌侵染。

本发明的目的还在于提供基于枯草芽孢杆菌菌株A97的微生物菌剂、该微生物菌剂的制备方法以及使用方法和该微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。

本发明所采用的技术方案是，一种枯草芽孢杆菌菌株A97（Bacillussubtilis A97），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5840。

一种微生物菌剂，活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A97菌体及其胞外代谢产物。

所述微生物菌剂为液态菌剂。

所述微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：

步骤1、菌种活化：

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在28℃～33℃下培养20～24小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在28℃～33℃下培养20～24小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液；

步骤2、种子液的制备：

在经过高压湿热灭菌的种子培养基中接入步骤1得到的接种液，所用种子培养基和接种液的体积比为1：0.1%～1：1%，在28℃～33℃且初始pH值为7.0～8.0的条件下震荡培养12～16小时，得到种子液；

步骤3、发酵培养：

将步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基和种子液的体积比为1：1%～1：10%，在28℃～33℃且初始pH值在7.0～8.0条件下进行搅拌状态下的液体发酵，直至发酵液中芽孢产生率不低于90%且菌体浓度不低于10¹⁰CFU/ml；

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂，所用添加剂中各组分分别与发酵液的比例为：几丁质0.1%～0.5%Kg/L，普鲁兰多糖0.5%～5%Kg/L，羧甲基纤维素钠0.5%～2%Kg/L，CaCl₂0.5%～3%Kg/L。

步骤2中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖2%～4%，可溶性淀粉2%～4%，蛋白胨2%～5%，NaCl 0.3%～0.5%，CaCO₃0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O 0.02%～0.04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。

步骤3中，所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：玉米粉2%～4%，豆饼粉2%～4%，鱼骨粉0.5%～1%，NaCl 0.3%～0.5%，KH₂PO₄0.01%～0.03%，MgSO₄·7H2O 0.02%～0.04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。

步骤4中，所用几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl₂均为食品级。

所述微生物菌剂的使用方法，将微生物菌剂按1：10～1：100的体积比例用水稀释，然后将稀释后的微生物菌剂液体于果实采收前进行喷雾，或在果实采收分拣后浸果处理1min～3min。

所述的微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。

本发明的有益结果是：

本发明枯草芽孢杆菌菌株A97和微生物菌剂能用于广谱高效防治多种病原菌引起的果蔬腐烂，为果蔬储藏期的防腐保鲜提供了一种生物防治的新途径。其抑菌效果显著，对病原真菌的抑菌效果达到了60.58%～95.30%；抑菌谱广，对于多种植物（包括单子叶植物和双子叶植物）的常见真菌病害都有较好的抑制作用；无污染，无毒害，无残留，对环境友好，对于减少果蔬采后损失和提高产品质量具有重要作用，同时可提高我国农产品的国际竞争力。

本发明制备方法简单、成本低廉、易于推广应用。

附图说明

图1是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的对于靶标菌的抑菌效果图；

图2是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的16SrRNA序列构建的***发育树；

图3是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的在果实伤口处对病原菌的抑制作用图。

本发明枯草芽孢杆菌菌株A97在2012年3月2日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5840，生物学命名Bacillus subtilis，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的筛选分离过程：

枯草芽孢杆菌菌株A97由陕西省微生物研究所从秦岭野生银杏树组织中分离得到。2008年陕西省微生物研究所自太白山自然保护区内采集野生银杏组织样本，将所采样品以蒸馏水清洗干净后进行表面除菌，用经过灭菌处理的枝剪、解剖刀及打孔器将经过表面消毒的叶片、树皮打孔成约1cm2的小块，根、茎、枝则切成约0.5cm～1cm左右的小段（两端均需有切口）。组织块表面消毒采用三步法，表面消毒方法及处理时间具体如下表所示。

将经过表面消毒的组织块用无菌研钵研磨，并用4层灭菌纱布过滤。滴加200μL滤汁与MEA培养基平板上，涂布均匀后于28℃培养3～15天，分别进行细菌、真菌和放线菌的分离纯化，并以拓展青霉（Penicilliumexpansum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）以及番茄早疫病（Alternariasolani）为靶标菌进行拮抗菌的筛选，结果从中筛选出一株对各供试病原菌均具有明显抑菌效果的菌株，定名为枯草芽孢杆菌菌株A97。

本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的特征：

（1）形态特征

在营养琼脂培养基上培养菌体为杆状，具鞭毛，大小约0.8×3.0μm；芽孢为柱状，中生或近中生，孢子囊无明显膨胀。培养初期菌落为淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落***成馒头状，表面湿润，直径1mm～2mm；培养后期菌落呈淡黄色，边缘不规则，表面干燥有褶皱；在液体培养基中静置培养，表面形成白色菌膜。

（2）16S rRNA序列测定

用于扩增细菌16S rRNA的引物为：

Primer A:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；

Primer H:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；

PCR扩增反应条件为：95℃2min；95℃1min；50℃2min，72℃2.5min，共35次循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检查，并以QIAEX II Gel Extraction System(Qiagen)回收纯化后进行序列测定。采用DDBJ（DNA Date Bank of Japan）中FASTA程序对所测DNA序列与Bacillus subtilis的16S rRNA进行同源性比较，并利用ClustalX 1.83及MEGA 4.0软件进行***发育分析。结果表明，枯草芽孢杆菌菌株A97与Bacillus subtilis的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99%以上。

（3）生理生化特征

参考《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版中文）》（R.E.布坎南等科学出版社，1984年）所述方法对枯草芽孢杆菌菌株A97进行生理生化检测。结果如下表所示，枯草芽孢杆菌菌株A97的生理生化特征与文献所述枯草芽孢杆菌生理生化特征基本一致。同时，如图2所示，16S rDNA序列同源比对及所构建的***发育树进一步确认生理生化鉴定结果，鉴定该菌株为属于一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

鉴别特征	枯草芽孢杆菌菌株A97
		革兰氏染色	+
芽孢染色	+
		运动性	+
厌氧生长	+
		接触酶	+
D-葡萄糖产酸	+
		葡萄糖产气	-
V.P	+
		淀粉水解	+
硝酸盐还原	+
		明胶液化	+
酪蛋白水解	+
		柠檬酸盐利用	+
卵黄反应	-
		55℃生长	+

注：＋：阳性反应；－：阴性反应

本发明枯草芽孢杆菌菌株A97在2012年3月2日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5840，生物学命名Bacillus subtilis，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2

微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：

步骤1、菌种活化：

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在33℃下培养24小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在33℃下培养24小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液。

步骤1中所述的低温是指通常用于保存菌种所用的温度，本领域技术人员根据常识可知。本实施例枯草芽孢杆菌菌株A97保存在-80℃的环境中。

营养琼脂平板培养基及营养琼脂斜面培养基的pH值为7.0～7.4，且组分及其质量百分比均为：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%，水96%，制备方法可参照国标GB/T 4789.28-2003进行制备。

步骤2、种子液的制备：

在250mL三角瓶中装入种子培养基60mL，高压湿热灭菌，待冷却至室温后，加入步骤1中制备得到的接种液0.6mL，此时，所用种子培养基和接种液的体积比为1：1%；在摇床上进行震荡培养，转速200rpm，并在30℃且初始pH值为7.5的条件下培养16小时，得种子液。

其中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖2%，可溶性淀粉2%，蛋白胨5%，NaCl 0.5%，CaCO₃0.03%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，水90.45%。种子培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖，可溶性淀粉，蛋白胨，NaCl，CaCO₃和MgSO₄·7H₂O，混合后，再加水即得。

步骤3、发酵培养：

在10L发酵罐中加入6L发酵培养基，将60mL步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，此时，所用发酵培养基和种子液的体积比为1：1%，在30℃且初始pH值在7.5条件下进行搅拌状态下的液体发酵，搅拌转速为180rpm，罐压0.05～0.06Mpa，通气条件分别为：0～5h，6.3m³/h；6～12h，10.5m³/h；12h后，21m³/h进行培养。24h以后，每隔1h从发酵罐中取样镜检，对视野内的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢产生率；直至发酵液中芽孢产生率不低于90%且菌体浓度不低于10¹⁰CFU/ml。通常，发酵时间为36～48h。

所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：玉米粉2%，豆饼粉2%，鱼骨粉1%，NaCl 0.3%，KH₂PO₄0.03%，MgSO₄·7H₂O 0.04%，水94.63%。发酵培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取玉米粉、豆饼粉、鱼骨粉、NaCl、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O，混合后，再加水即可。

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的6L发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。其中，所用添加剂为：几丁质6g，普鲁兰多糖30g，羧甲基纤维素钠30g，CaCl₂30g。几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl₂均为食品级。

实施例3

微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：

步骤1、菌种活化：

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在28℃下培养20小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在28℃下培养20小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液。

本实施例枯草芽孢杆菌菌株A97保存在-80℃的环境中。

营养琼脂平板培养基及营养琼脂斜面培养基的pH值为7.0～7.4，且组分及其质量百分比均为：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%，水96%，制备方法可参照国标GB/T 4789.28-2003进行制备。

步骤2、种子液的制备：

分别在两个1L三角瓶中装入种子培养基250mL，高压湿热灭菌，待冷却至室温后，加入步骤1中制备得到的接种液1mL，此时，所用种子培养基和接种液的体积比为1：0.4%；在摇床上进行震荡培养，转速200rpm，并在28℃且初始pH值为7.0的条件下培养12小时，得种子液。

其中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖4%，可溶性淀粉3%，蛋白胨2%，NaCl 0.3%，CaCO₃0.01%，MgSO₄·7H₂O 0.03%，水90.66%。种子培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖，可溶性淀粉，蛋白胨，NaCl，CaCO₃和MgSO₄·7H₂O，混合后，再加水即得。

步骤3、发酵培养：

在20L发酵罐中加入10L发酵培养基，将500mL步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，此时，所用发酵培养基和种子液的体积比为1：5%，在28℃且初始pH值在7.0条件下进行搅拌状态下的液体发酵，搅拌转速为180rpm，罐压0.05～0.06Mpa，通气条件分别为：0～5h，6.3m³/h；6～12h，10.5m³/h；12h后，21m³/h进行培养。24h以后，每隔1h从发酵罐中取样镜检，对视野内的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢产生率；直至发酵液中芽孢产生率不低于90%且菌体浓度不低于10¹⁰CFU/ml。通常，发酵时间为36～48h。

所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：玉米粉4%，豆饼粉4%，鱼骨粉0.5%，NaCl 0.5%，KH₂PO₄0.01%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，水90.97%。发酵培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取玉米粉、豆饼粉、鱼骨粉、NaCl、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O，混合后，再加水即可。

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的10L发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。其中，所用添加剂为：几丁质25g，普鲁兰多糖250g，羧甲基纤维素钠100g，CaCl₂150g。几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl₂均为食品级。

实施例4

微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：

步骤1、菌种活化：

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在30℃下培养22小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在30℃下培养22小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液。

本实施例枯草芽孢杆菌菌株A97保存在-80℃的环境中。

营养琼脂平板培养基及营养琼脂斜面培养基的pH值为7.0～7.4，且组分及其质量百分比均为：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%，水96%，制备方法可参照国标GB/T 4789.28-2003进行制备。

步骤2、种子液的制备：

在两个1L三角瓶中分别装入种子培养基250mL，高压湿热灭菌，待冷却至室温后，分别加入步骤1中制备得到的接种液0.25mL，此时，所用种子培养基和接种液的体积比为1：0.1%；在摇床上进行震荡培养，转速200rpm，并在33℃且初始pH值为8.0的条件下培养14小时，得种子液。

其中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖3%，可溶性淀粉4%，蛋白胨4%，NaCl 0.4%，CaCO₃0.02%，MgSO₄·7H₂O 0.04%，水88.54%。种子培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖，可溶性淀粉，蛋白胨，NaCl，CaCO₃和MgSO₄·7H₂O，混合后，再加水即得。

步骤3、发酵培养：

在10L发酵罐中加入5L发酵培养基，将500mL步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，此时，所用发酵培养基和种子液的体积比为1：10%，在33℃且初始pH值在8.0条件下进行搅拌状态下的液体发酵，搅拌转速为180rpm，罐压0.05～0.06Mpa，通气条件分别为：0～5h，6.3m³/h；6～12h，10.5m³/h；12h后，21m³/h进行培养。24h以后，每隔1h从发酵罐中取样镜检，对视野内的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢产生率；直至发酵液中芽孢产生率不小于90%且菌体浓度不低于10¹⁰CFU/ml。通常，发酵时间为36～48h。

所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：玉米粉3%，豆饼粉3%，鱼骨粉0.8%，NaCl 0.4%，KH₂PO₄0.02%，MgSO₄·7H₂O 0.03%，水92.75%。发酵培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取玉米粉、豆饼粉、鱼骨粉、NaCl、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O，混合后，再加水即可。

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的5L发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。其中，所用添加剂为：几丁质25g，普鲁兰多糖250g，羧甲基纤维素钠100g，CaCl₂150g。几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl₂均为食品级。

本发明微生物菌剂的使用方法：将微生物菌剂按1：10～1：100的体积比例用水稀释，然后将稀释后的液体微生物菌剂于果实采收前进行喷雾，或在果实采收分拣后浸果处理1～3min。

本发明微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。

实施例5

本实验在陕西省微生物研究所代谢产物研究中心实验室进行，选用拓展青霉（Penicillium expansum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）以及番茄早疫病（Alternaria solani）作为靶标菌进行苹果果实抗病实验。上述病原菌由陕西省微生物研究所从致病的苹果果实中分离、鉴定及保藏。新鲜苹果果实采集自陕西省澄城县王庄乡金碧苑果园。

选取外形无损、大小和成熟度接近且无病虫害的新鲜苹果，用2%NaClO溶液表面消毒后，用无菌水清洗多次后自然晾干。在果实表面刺一伤口（3mm×3mm），分别接种实施例1中制备的枯草芽孢杆菌菌株A97菌剂20μL（浓度为10⁸CFU/mL）和致病菌孢子悬液20μL（浓度为10⁷个/mL），对照组中仅加入相同量的致病菌孢子悬液；晾干后将果实于装箱并外附保鲜膜以保持95%左右的相对湿度，25℃下贮藏10d后统计果实的发病率和病斑直径。每个处理30个果实，重复3次。

如下表所示，统计结果表明：经过本发明微生物菌剂处理的果实在室温下贮藏30天后，其三类病原菌在果实上的腐烂率均明显小于对照组。

注：邓肯氏复极差检验p=0.05

由图3所示，对照组果实出现明显软化、萎蔫及色泽暗淡等典型的腐败老化症状，且多数果实伤口处有病斑及大量孢子形成；而经本发明微生物菌剂处理后的果实经30天贮存后其外观正常、色泽鲜亮，伤口处未发生明显病变。说明在果实伤口处及果实表面，枯草芽孢杆菌A97可以有效抑制镰刀菌属、链格孢霉属及青霉属等多种病原菌的侵染及生长，从而减少由此引发的腐败及病变。

实施例6

本实验在陕西省澄城县王庄乡金碧园果园的储藏窖中进行，保藏实验用果实均为当季该果园内新采收的红富士及红星苹果，储藏时间为2011年11月5日至2012年3月5日。将采收后的苹果在实施例1中制备的微生物菌剂中浸果处理1min后晾干，装入30cm×40cm的聚乙烯水果保鲜袋中。以300倍甲基布托津溶液浸果处理1min作为对照，实验组和对照组各20袋，于贮藏窖中自然温度下保藏4个月。对比结果如下表所示：

可以看出，本发明微生物菌剂在传统窖藏条件下，对于防止苹果腐烂效果显著，其腐烂率明显低于对照组，且主要指标及产品外观均优于对照组。

实施例7

本实验在西安森卓生物科技有限公司果蔬保鲜实验室进行。保藏实验用果实均为陕西洛川地区当季新采收的红富士及红星苹果，储藏时间为2011年10月15日至2012年3月15日。将采收后的苹果在实施例2中制备的微生物菌剂中浸果处理1min后晾干，装入30cm×40cm的聚乙烯水果保鲜袋中。以300倍的多菌灵溶液浸果处理1min作为对照，实验组和对照组各10袋，于人工气候箱中4℃～6℃，相对湿度75%～95%条件下保藏6个月。

对比结果如下表所示：

从实施结果来看，本发明微生物菌剂在模拟低温冷藏条件下，对于防止苹果腐烂效果显著，其腐烂率明显低于对照组，且主要指标及产品外观均优于对照组。

实施例8

采用平板渗透法检测本发明微生物菌剂对12种不同农作物病原菌的抑制作用，包括：棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、小麦纹枯病（Rhizoctoniacerealis）、柑橘炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、小麦赤霉病（Gibberella saubinetti）、苹果轮纹病（Macrophoma spp.）、番茄灰霉病（Botrytis cinerea）、甘薯干腐病（Fusarium oxysporum）、苹果落叶病（Alternaria alternate）及番茄早疫病（Alternaria solani）的抑菌谱。以上12种病原真菌由陕西省微生物研究所代谢产物研究中心提供。具体方法如下：

枯草芽孢杆菌A97发酵产物抑制病原真菌的效果检测采用平板渗透法，取本实验室保藏的12种病原真菌，在PDA培养基上活化5d，以无菌水将其稀释成10⁷个/mL病原菌孢子悬液，将经过高压灭菌的马铃薯琼脂（PDA）培养基冷却至50℃后，按照1:50的比例（体积比）将病原菌孢子悬液与PDA培养基充分混匀后倒入培养皿中，待培养基冷却后于中央位置打孔（d=7mm）,加入50ul枯草芽孢杆菌A97发酵液后于33℃下培养2～3d，测定各供试菌株的抑菌圈直径。

实验结果如图1所示，枯草芽孢杆菌A97的发酵液对于上述12种病原真菌均具有显著的抑制作用，对于各病原菌的抑菌圈直径在2.1cm～3.2cm之间，说明本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的发酵产物具有较广的抗菌谱。

Claims (8)

1.一种枯草芽孢杆菌菌株A97（Bacillus subtilis A97），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5840。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A97菌体。

3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液态菌剂。

4.一种权利要求2或3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1、菌种活化：

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在28℃～33℃下培养20～24小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在28℃～33℃下培养20～24小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液；

步骤2、种子液的制备：

在经过高压湿热灭菌的种子培养基中接入步骤1得到的接种液，所用种子培养基和接种液的体积比为1：0.1%～1：1%，在28℃～33℃且初始pH值为7.0～8.0的条件下震荡培养12～16小时，得到种子液；

步骤3、发酵培养：

将步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基和种子液的体积比为1：1%～1：10%，在28℃～33℃且初始pH值在7.0～8.0条件下进行搅拌状态下的液体发酵，直至发酵液中芽孢产生率不小于90%且菌体浓度不低于10¹⁰CFU/ml；

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂，所用添加剂及其分别与发酵液的比例为：几丁质0.1%～0.5%Kg/L，普鲁兰多糖0.5%～5%Kg/L，羧甲基纤维素钠0.5%～2%Kg/L，CaCl₂0.5%～3%Kg/L。

5.按照权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，步骤2中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖2%～4%，可溶性淀粉2%～4%，蛋白胨2%～5%，NaCl0.3%～0.5%，CaCO₃0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O0.02%～0.04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。

6.按照权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，步骤3中，所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：玉米粉2%～4%，豆饼粉2%～4%，鱼骨粉0.5%～1%，NaCl0.3%～0.5%，KH₂PO₄0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O0.02%～0.04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。

7.按照权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，步骤4中，所用几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl₂均为食品级。

8.权利要求2所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，将微生物菌剂按1：10～1：100的体积比例用水稀释，然后将稀释后的液体微生物菌剂于果实采收前进行喷雾，或在果实采收分拣后浸果处理1min～3min。

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