CN110382529B - 工程化的异源二聚体蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了异源二聚体抗体及其片段以及它们的制备方法，其中重链和轻链的配对得到改善。界面残基发生突变，使得当两条不同的重链和两条不同的轻链在同一细胞中共转染并共表达以组装为功能性异源二聚体抗体或其片段时，每条轻链强烈偏向于其同源重链。

Description

工程化的异源二聚体蛋白质
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且将该序列表通过援引以其整体特此并入。所述ASCII副本创建于2018年2月20日，名称为PAT057505-WO-PCT_SL.txt并且大小为201,737字节。
技术领域
本发明涉及包含促进正确的重链和轻链配对的修饰的异源二聚体抗体及其片段，以及它们的制备方法。
背景技术
异源二聚体抗体(特别是作为人疾病的治疗剂的双特异性抗体)的施用具有巨大的临床潜力，但异源二聚体抗体的稳健生成，尤其是纯的且可开发的异源二聚体抗体的产生仍然具有挑战性。抗体重链以混杂方式结合抗体轻链，使得给定的重链可以与λ和κ轻链类别的许多轻链序列配对(Edwards BM等人,(2003)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]334:103-18)。先前的工作已经表明，重链和轻链的配对是随机进行的(Brezinschek HP等人,(1998)J.Immunol.[免疫学杂志]160:4762-7)。作为这种结合的结果，两条抗体重链和两条抗体轻链的伴随表达自然导致重链-轻链配对的杂混；然而，同质配对是可制造性和生物功效的基本要求。异源二聚体抗体形式如DVD-Ig(Wu C等人,(2007)Nat.Biotech.[自然生物技术]25(11):1290-7)、CrossMab(Schaefer W等人,(2011)PNAS[美国国家科学院院刊]108(27):11187-92)或“二合一”抗体(Bostrom J等人,(2009)Science[科学]323(5921):1610-4)允许产生双特异性抗体，但具有不同的缺陷。尽管存在这些近期发展，但本领域仍然需要具有正确的重链和轻链配对的改善的异源二聚体抗体形式，以及用于实现这种同质配对以避免生成错配污染物的方法。
发明内容
在本发明中，为了改善异源二聚体抗体的重链和轻链的配对，应用静电转向机制对抗体和抗体片段的子集的重链和轻链进行工程化。界面残基发生突变，使得当两条不同的重链和两条不同的轻链在同一细胞中共转染并共表达以组装为功能性异源二聚体双特异性抗体时，每条轻链强烈偏向于其同源重链。
用于对重链-轻链配对进行工程化的设计策略包括鉴定代表性Fab。代表性Fab的标准是它是常用的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)亚组的成员，如VH3和Vκ1或Vλ1。对于电荷工程化，考虑几个标准。所选氨基酸应不与构象结构中的可变结构域CDR接触，因为与CDR的相互作用接触可最终导致结合丧失，因此应避免。所选位置在大多数常见抗体家族内应是高度保守的，以便能够生成任何给定亚家族的异源二聚体。另外，通过避免VH与VL，以及重链恒定结构域1(CH1)与轻链恒定结构域(CL)的界面中心的位置，并选择该界面边缘处的位置，可以通过在结构域的末端产生盐桥并从而产生接近正确的重链-轻链形成的“夹持效应(clip-effect)”来实现强烈促进异源二聚体形成的效果。这种“夹持效应”用于稳定蛋白质并减少恒定结构域CH1和CL的界面的不稳定。因此，在VH和VL结构域的末端处以及CH1和CL结构域的起点和末端处引入带电残基。在CH1和CL结构域的末端处选择用于电荷工程化的残基是基于相应主链之间最多至的观察距离，这与基于侧链相互作用来选择用于修饰的残基截然不同。
在一个方面，本发明提供了一种异源二聚体抗体或其片段，所述异源二聚体抗体或其片段包含在某些位置处包含多个取代的工程化的VH和CH1结构域以及工程化的VL和CL结构域。所有取代位置的编号均依照EU编号。
在一个实施例中，本发明提供了一种异源二聚体抗体或其片段，所述异源二聚体抗体或其片段包含：在第39位、第147位和第165位包含带电或中性氨基酸的工程化的VH结构域和CH1结构域；以及在第38位、第124位和第169/170位包含带电或中性氨基酸(EU编号)的工程化的VL结构域和CL结构域，其中VH和CH1结构域中的所述氨基酸，以及VL和CL结构域中的界面的相应氨基酸成对地具有相反电荷或为带电的/中性的，并形成在静电方面有利于异源二聚化的界面。为了确保指定位置处的氨基酸具有适当的电荷(负电荷、正电荷或中性/不带电)，可能必需用不同电荷的氨基酸取代野生型序列中特定位置处的氨基酸。例如，野生型序列中的氨基酸可以是中性的、碱性的或酸性的，并且取代导致电荷的变化。更具体地，中性氨基酸可被碱性或酸性氨基酸取代，碱性氨基酸可被中性或酸性氨基酸取代，或酸性氨基酸可被中性或碱性氨基酸取代。
在一个实施例中，在VH结构域中，第39位的中性氨基酸谷氨酰胺(Q)可被碱性或酸性氨基酸取代。碱性氨基酸(正电荷)的示例包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)并且酸性氨基酸(负电荷)的示例包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具体地，取代是从Q到R、K或D。在CH1结构域中，第147位的碱性氨基酸K可保持不变，即具有正电荷或可被中性或酸性氨基酸取代。具体地，取代是取代成酸性氨基酸并且是从K到D。此外，第165位的中性氨基酸丝氨酸(S)可保持不带电，即，是中性的或可被碱性或酸性氨基酸取代。具体地，取代是从S到R或D。在一个实施例中，VH结构域来自VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亚家族。在一个具体实施例中，VH结构域来自VH3亚家族。
在其中轻链属于κ(kappa)亚型的一个实施例中，在VL结构域中，第38位的中性氨基酸Q可被碱性或酸性氨基酸取代。碱性氨基酸的示例包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)并且酸性氨基酸的示例包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具体地，取代是从Q到R、K或D。在CL结构域中，第124位的中性氨基酸Q可保持不带电，即，是中性的或可被碱性或酸性氨基酸取代。具体地，取代是从Q到K或D。另外，第169位的碱性氨基酸K可保持不变，即具有正电荷或可被中性或酸性氨基酸取代，具体地讲取代是取代成酸性氨基酸并且是从K到D。在一个实施例中，κ轻链属于Vκ1或Vκ3亚家族。
在其中轻链属于λ(lambda)亚型的一个实施例中，在VL结构域中，第38位的中性氨基酸Q可被碱性或酸性氨基酸取代。碱性氨基酸的示例包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)并且酸性氨基酸的示例包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具体地，取代是取代成碱性氨基酸并且是从Q到K。在CL结构域中，第124位的酸性氨基酸E可被中性、碱性或另一酸性氨基酸取代。具体地，取代是取代成另一酸性氨基酸并且是从E到D。此外，第170位的中性氨基酸N可保持不带电，即，是中性的或可被碱性或酸性氨基酸取代。具体地，取代是取代成碱性氨基酸并且是从N到K或从N到R。在一个实施例中，λ轻链属于Vλ1、Vλ2或Vλ3亚家族。
在一个实施例中，工程化的VH和CH1结构域可在第39位、第147位和第165位包含带电或中性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在界面的相应的第38位、第124位和第169/170位包含带电或中性氨基酸(EU编号)。因此，本发明提供了一种具有工程化的VH和CH1结构域以及工程化的VL和CL结构域的异源二聚体抗体或其片段，其中：
(i)工程化的VH和CH1结构域在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含碱性氨基酸并且在第169/170位包含碱性氨基酸；
(ii)工程化的VH和CH1结构域在第39位包含碱性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含碱性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域在第38位包含酸性氨基酸、在第124位包含酸性氨基酸并且在第169/170位包含酸性氨基酸；
(iii)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含碱性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含碱性氨基酸并且在第169/170位包含酸性氨基酸；
(iv)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含碱性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含酸性氨基酸、在第124位包含酸性氨基酸并且在第169/170位包含碱性氨基酸；
(v)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含酸性氨基酸并且在第169/170位包含碱性氨基酸；
(vi)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含碱性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含碱性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含酸性氨基酸、在第124位包含碱性氨基酸并且在第169/170位包含酸性氨基酸；
(vii)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含酸性氨基酸并且在第169/170位包含中性氨基酸；
(viii)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含碱性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含中性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含酸性氨基酸、在第124位包含碱性氨基酸并且在第169/170位包含碱性氨基酸；或
(ix)工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含中性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含中性氨基酸并且在第169/170位包含碱性氨基酸。
在一个实施例中，工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含碱性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含中性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含酸性氨基酸、在第124位包含碱性氨基酸并且在第169位包含碱性氨基酸(EU编号)。替代性地，工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含中性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含中性氨基酸并且在第169位包含碱性氨基酸(EU编号)。替代性地，工程化的VH和CH1结构域可在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含碱性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且工程化的VL和CL结构域可在第38位包含碱性氨基酸、在第124位包含酸性氨基酸并且在第1709位包含中性氨基酸(EU编号)。
在一个具体实施例中，本发明提供了一种具有工程化的VH和CH1结构域的异源二聚体抗体或其片段，所述工程化的VH和CH1结构域分别在第39位、第147位和第165位(EU编号)包含酸性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸，因此分别在这些位置处产生负电荷、正电荷和负电荷，或反之亦然。相应的工程化的VL和CL结构域在第38位、第124位和第169/170位(EU编号)包含具有与相应重链界面氨基酸的电荷相反的电荷的氨基酸。例如，如果工程化的重链在第39位包含酸性氨基酸，在第147位包含碱性氨基酸，并且在第165位包含酸性氨基酸，则相应的轻链将在第38位包含碱性氨基酸，在第124位包含酸性氨基酸并且在第169/170位包含碱性氨基酸(EU编号)。替代性地，如果工程化的重链在第39位包含碱性氨基酸，在第147位包含酸性氨基酸，并且在位置包含碱性氨基酸，则相应的轻链将在第38位包含酸性氨基酸，在第124位包含碱性氨基酸并且在第169/170位包含酸性氨基酸(EU编号)。
在一个实施例中，本发明提供了一种异源二聚体抗体或其片段，所述异源二聚体抗体或其片段包含选自由以下各项组成的组的取代：
i.VH和CH1中的Q39D、S165D，以及VL中的Q38K，
ii.VH和CH1中的Q39K、K147D，以及κVL和CL中的Q38D、Q124K；
iii.VH和CH1中的Q39D、S165D，以及κVL和CL中的Q38K、Q124D；
iv.VH和CH1中的Q39K、K147D、S165R，以及κVL和CL中的Q38D、Q124K、K169D；
v.VH和CH1中的Q39D、S165D，以及λVL和CL中的Q38K、E124D、N170K；
vi.VH和CH1中的Q39D、S165D，以及λVL和CL中的Q38K、N170R。
在一个实施例中，本发明提供了一种包含至少两个Fab的异源二聚体抗体或其片段，其中每个Fab结合抗原上的不同表位。表位可处于相同抗原上，或替代性地，表位可处于不同抗原上。在一个实施例中，异源二聚体抗体或其片段可以是多特异性的(如双特异性的或三特异性的)。在这种多特异性抗体中，VH和CH1与相应的VL和CL的界面处的氨基酸需要具有相反电荷或电荷/为中性的，以确保形成在静电方面有利于异源二聚化的界面。例如，在双特异性抗体或其片段中，结合第一表位的Fab可具有分别在第39位、第147位和第165位(EU编号)包含酸性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸的工程化的VH和CH1结构域，并且相应的工程化的VL和CL结构域在第38位、第124位和第169/170位(EU编号)包含具有与相应重链界面氨基酸的电荷相反的电荷的氨基酸。因此，结合第二表位的Fab可具有分别在第39位、第147位和第165位(EU编号)包含碱性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸的工程化的VH和CH1结构域，并且相应的工程化的VL和CL结构域在第38位、第124位和第169/170位(EU编号)包含具有与相应重链界面氨基酸的电荷相反的电荷的氨基酸。因此，工程化的轻链将仅与相应电荷的其同源重链缔合以确保正确的重链-轻链配对。
在一个具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗体或其片段，所述双特异性抗体或其片段包含：第一Fab，所述第一Fab包含含有取代Q39K、K147D和S165R的工程化的VH和CH1结构域，以及含有取代Q38D、Q124K和K169D的工程化的VL和CL结构域；以及第二Fab，所述第二Fab包含含有取代Q39D和S165D的工程化的VH和CH1结构域，以及含有取代Q38K和Q124D的工程化的κVL和CL结构域，或含有取代Q38K、Q38K和N170R或Q38K、E124D和N170K的工程化的λVL和CL结构域。
在另一方面，本发明提供了一种包含Fc区的异源二聚体抗体或其片段。在一个实施例中，Fc区包含工程化的CH3结构域，所述工程化的CH3结构域包含根据“杵臼结构(knobs-into-holes)”方法的修饰(如例如Ridgway JBB等人,(1996)Protein Engineering[蛋白质工程化],9(7):617-21和US 5,731,168中所述)。已经显示该方法促进重链的异源二聚体的形成并阻碍相应的重链同源二聚体的组装。在该方法中，通过用较大的氨基侧链替换CH3结构域之间的界面处的小氨基侧链来产生杵，而通过用较小的侧链替换大的侧链来构建臼。在一个实施例中，“杵”突变包括T366W，并且“臼”突变包括T366S、L368A和Y407V(Atwell S等人,(1997)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]270:26-35)。在一个具体实施例中，“杵”突变包括T366W、S354C，并且“臼”突变包括T366S、L368A、Y407V和Y349C，以使在相应的半胱氨酸残基S354C和Y349C之间形成二硫键，从而进一步促进异源二聚体形成。
本发明的另一方面提供了一种制备包含工程化的VH和CH1结构域以及工程化的VL和CL结构域的异源二聚体抗体或其片段的方法，所述方法包括取代VH和CH1结构域中的至少两个氨基酸，使得工程化的结构域在第39位、第147位和第165位(EU编号)包含带电或中性氨基酸，以及取代VL和CL结构域中的氨基酸，使得工程化的结构域在第38位、第124位和第169/170位(EU编号)包含带电或中性氨基酸，并且其中VH和CH1结构域中的所述氨基酸和VL和CL结构域中的界面的相应氨基酸成对地具有相反电荷或为带电的/中性的并形成在静电方面有利于异源二聚化的界面。
在本发明的又另一方面，促进异源二聚体抗体及其片段的正确重链和轻链配对的如本文所述的静电转向机制与对异源二聚体抗体的VH-VL和CH1-CL界面进行修饰以工程化链间二硫键相组合。这种链间二硫键进一步促进同源重链和轻链配对。此外，工程化的二硫键有利于对异源二聚体抗体进行谱分析(profiling)的分析程序，从而允许通过基于电泳的简单程序容易地鉴定和定量错误组装的分子。这产生了用于筛选具有正确的重链-轻链配对的异源二聚体抗体及其片段的稳健的高通量平台。
附图说明
图1示出在非还原条件下进行电泳的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其中已上样经纯化的双特异性抗体。具有相应双特异性抗体臂修饰的孔的细节在表9中示出。在孔2至5中，双特异性抗体的杵臂包含与电荷工程化相关的修饰，并且臼臂包含与电荷工程化加二硫键工程化相关的修饰。在孔7至10中，杵臂和臼臂不包含与电荷工程化相关的修饰，但臼臂包含与二硫键工程化相关的修饰。如与孔2至5相比，对于孔7至10可观察到的，仅二硫键工程化不足以实现正确的重链-轻链配对。第1、6和11行示出分子量标记。
具体实施方式
本文披露了具有高异源二聚化程度的、包含突变重链和轻链的异源二聚体抗体或其片段。本文还披露了利用静电转向来选择界面残基的方法，所述界面残基在突变时导致轻链与其同源重链的正确配对增加。突变的重链和轻链在同一细胞中的共转染和共表达导致功能性异源二聚体抗体或抗体片段的组装。
定义
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体”包括，例如，单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)。在一个实施例中，抗体包含全长抗体、或全长免疫球蛋白链。在一个实施例中，抗体包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能性片段。
在一个实施例中，抗体可以包含重(H)链可变结构域序列(在本文缩写为VH)、和轻(L)链可变结构域序列(在本文缩写为VL)。在一个实施例中，抗体包含重链和轻链(在本文中称为半抗体)或由其组成。在另一个示例中，抗体包含两个VH序列和两个VL序列，从而形成两个抗原结合位点(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(二价和双特异性)、以及嵌合(例如，人源化)抗体)，它们可通过修饰完整抗体或使用重组DNA技术从头合成的抗体产生。这些功能抗体片段保留了与其各自的抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何类别的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，以及来自任何亚类的抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体的制剂可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外产生的抗体。抗体可以具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可以具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(Ig)与术语“抗体”在本文中可互换地使用。
在一个实施例中，抗体包含抗体的抗原结合片段。此类片段的示例包括：(i)Fab片段，该片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，该片段是包含两个在铰链区由二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构组组成的双抗体(dAb)片段；(vi)骆驼科(camelid)或骆驼化(camelized)可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)(参见例如Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人,(1988)PNAS USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)；(viii)单一结构域抗体。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
如本文所用的Fab是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可指处于分离形式，或作为处于全长抗体或抗体片段的背景中的多肽的该多肽区域。
如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，该序列可包括天然存在的可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以包括或可以不包括一个、两个或更多个N-或C-末端氨基酸，或者可以包括与蛋白质结构的形成相容的其他改变。
术语“抗原结合位点”是指抗体的一部分，该部分包含形成与抗原或其表位结合的界面的决定簇。关于蛋白质(或蛋白质模拟物)，抗原结合位点典型地包括形成与抗原多肽结合的界面的一个或多个环(具有至少四个氨基酸或氨基酸模拟物)。典型地，抗体分子的抗原结合位点包括至少一个或两个CDR和/或高变环，或更典型地至少三个、四个、五个或六个CDR和/或高变环。
在一个实施例中，可以重组地产生抗体，例如通过噬菌体展示或通过组合方法产生。用于产生抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域已知的(如描述于例如，Ladner等人US5,223,409；Kang等人,WO 92/18619；Dower等人,WO 91/17271；Winter等人,WO 92/20791；Markland等人,WO 92/15679；Breitling等人,WO 93/01288；McCafferty等人,WO 92/01047；Garrard等人,WO 92/09690；Ladner等人,WO 90/02809；Fuchs等人,(1991)Bio/Technology[生物技术]9:1370-1372；Hay等人,(1992)Hum Antibody Hybridomas[人抗体杂交瘤]3:81-85；Huse等人,(1989)Science[科学]246:1275-1281；Griffths等人,(1993)EMBO J[欧洲分子生物学学会会刊]12:725-734；Hawkins等人,(1992)J Mol Biol[分子生物学杂志]226:889-896；Clackson等人,(1991)Nature[自然]352:624-628；Gram等人,(1992)PNAS[美国国家科学院院刊]89:3576-3580；Garrard等人,(1991)Bio/Technology[生物技术]9:1373-1377；Hoogenboom等人,(1991)Nuc Acid Res[核酸研究]19:4133-4137；以及Barbas等人,1991PNAS[美国国家科学院院刊]88:7978-7982，所有文献的内容通过援引并入本文)。
在一个实施例中，抗体是全人抗体(例如，在已经基因工程化为从人免疫球蛋白序列产生抗体的小鼠中制备的抗体或从人中分离的抗体)，或非人抗体，例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如，猴)、骆驼抗体。可以使用携带人免疫球蛋白基因而不是小鼠***的转基因小鼠产生人单克隆抗体。使用来自用目标抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤，所述人单克隆抗体对来自人蛋白质的表位具有特异性亲和力(参见，例如，Wood等人,WO 91/00906；Kucherlapati等人,WO 91/10741；Lonberg等人,WO 92/03918；Kay等人,WO 92/03917；Lonberg,N.等人,(1994)Nature[自然]368:856-859；Green,L.L.等人,(1994)Nature Genet.[自然遗传学]7:13-21；Morrison,S.L.等人,(1994)PNAS USA[美国国家科学院院刊]81:6851-6855；Bruggeman等人,(1993)Year Immunol[免疫学年评]7:33-40；Tuaillon等人,(1993)PNAS[美国国家科学院院刊]90:3720-3724；Bruggeman等人,(1991)Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]21:1323-1326)。
抗体可以是可变区或其一部分(例如，CDR)在非人生物(例如，大鼠或小鼠)中产生的抗体分子。嵌合抗体、CDR移植抗体、和人源化抗体属于本发明。在非人生物(例如，大鼠或小鼠)中产生并且然后在例如可变框架或恒定区中修饰以降低在人中的抗原性的抗体属于本发明。嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生(参见Robinson等人,WO 87/002671；Akira等人,EP184187A1；Taniguchi,M.,EP171496A1；Morrison等人,EP173494A1；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,US 4,816,567；Cabilly等人,EP125023A1；Better等人,(1988)[科学]240:1041-1043；Liu等人,(1987)PNAS[美国国家科学院院刊]84:3439-3443；Liu等人,(1987),J.Immunol.[免疫学杂志]139:3521-3526；Sun等人,(1987)PNAS[美国国家科学院院刊]84:214-218；Nishimura等人,(1987),Canc.Res.[癌症研究]47:999-1005；Wood等人,(1985)Nature[自然]314:446-449；以及Shaw等人,(1988),J.Natl Cancer Inst.[国立癌症研究所杂志]80:1553-1559)。
人源化抗体或CDR移植抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。抗体可以被至少一部分非人CDR替换，或者仅一些CDR可以被非人CDR替换。仅需要替换人源化抗体与靶抗原结合所需的CDR的数量。优选地，供体是啮齿动物抗体(例如大鼠或小鼠抗体)，并且受体将是人框架或人共有框架。典型地，提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施例中，供体免疫球蛋白是非人类(例如啮齿动物)。受体框架是天然存在的(例如人类)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高、优选90％、95％、99％或更高同一性的序列。
如本文所用，术语“共有序列”是指由相关序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones[从基因到克隆](德国魏因海姆出版社(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany)1987))。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置被在该家族中该位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸同样频繁出现，则任一个均可以包括在共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。
抗体可以通过本领域已知的方法人源化(参见例如Morrison,S.L.,(1985),Science[科学]229:1202-1207；Oi等人,(1986),BioTechniques[生物技术]4:214，以及Queen等人,US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，所有文献的内容通过援引特此并入)。可以通过CDR移植或CDR取代产生人源化抗体或CDR移植抗体，其中免疫球蛋白链的一个、两个或所有CDR可以被替换。参见例如US 5,225,539；Jones等人,(1986)Nature[自然]321:552-525；Verhoeyan等人,(1988)Science[科学]239:1534；Beidler等人,(1988)J.Immunol.[免疫学杂志]141:4053-4060以及Winter US 5,225,539，所有文献的内容明确地通过援引特此并入。人源化抗体也在本发明的范围内，其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加。从供体中选择氨基酸的标准描述于US 5,585,089，例如US 5,585,089的第12-16栏中，其内容通过援引特此并入。用于人源化抗体的其他技术描述于Padlan等人,EP 519596A1中。
在又其他实施例中，抗体具有重链恒定区，该重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的重链恒定区；具体地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人)重链恒定区。在另一个实施例中，抗体分子具有选自例如κ或λ的(例如人)轻链恒定区的轻链恒定区。恒定区可以被改变，例如突变，以改变抗体的特性(例如，增加或减少下列中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能、和/或补体功能)。在一个实施例中，抗体具有效应功能并且可以固定补体。在其他实施例中，抗体不募集效应细胞或固定补体。在另一个实施例中，抗体具有降低的结合Fc受体的能力或没有该能力。例如，它是亚型、同种型、片段或其他突变体，不支持与Fc受体的结合，例如，具有诱变或缺失的Fc受体结合区。
用于改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。具有改变功能(改变的对效应配体(如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和力)的抗体可以通过用不同的残基替换抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基而产生(参见例如EP 388151A1、US 5,624,821和US 5,648,260，所有专利的内容通过援引特此并入)。可以描述类似类型的改变，所述改变如果应用于鼠或其他物种免疫球蛋白将减少或消除这些功能。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H))、酸性侧链(例如，天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))、不带电的极性侧链(例如甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C))、非极性侧链(例如丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W))、β-支链侧链(例如苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I))以及芳族侧链(例如，酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H))。
异源二聚体抗体
在一个实施例中，抗体是异源二聚体抗体，例如该抗体包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在另一个实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施例中，异源二聚体抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施例中，异源二聚体抗体是双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
在一个具体实施例中，异源二聚体抗体是双特异性抗体或其片段。双特异性抗体对不多于两个表位具有特异性。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施例中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施例中，第一表位和第二表位重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施例中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施例中，双特异性抗体或其片段包含对第一表位具有结合特异性的Fab和对第二表位具有结合特异性的Fab。
用于产生异源二聚体抗体，特别是双特异性抗体的最常用方法是通过在不同宿主细胞中单独表达组分抗体，然后纯化并组装为功能性IgG。然而，这种方法成本高并且涉及复杂的制造工艺。因此，单个宿主细胞表达***是优选的，但是与重链和轻链配对问题相关。
重链配对问题反映了重链在单个宿主细胞中表达时形成同源二聚体以及异源二聚体的能力。IgG中的两条重链的同二聚化是由CH3结构域之间的相互作用介导的。产生以用于改善重链的异源二聚化的初始方法之一利用了“杵臼结构”策略(Ridgway等人,(1996)同上)。改善重链异源二聚化的其他方法尤其包括静电转向突变的合理设计(Gunasekaran等人,(2010)JBC[生物化学杂志],285:19637-46；Strop等人,(2012)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]420:204-19)、计算设计的使用(Moore等人,(2011)mAbs[单克隆抗体],3:546-557；Von Kreudenstein等人,(2013)mAbs[单克隆抗体]5:646-54)、IgG和IgA的CH3结构域的序列分歧性但结构相似性的利用(链交换工程化结构域(Strand Exchange EngineeredDomains，SEED)平台；Davis等人,(2010)Protein Eng.Des.Sel.[蛋白质工程化设计和选择],23:195-202)以及共同重链的使用(Fischer等人,(2015)Nat Commun.[自然通讯]6:6113)。WO 16/118742(礼来公司(Eli Lilly and Co))中描述的近期工作涉及在两个CH3结构域中均包含取代以实现重链异源二聚化的双特异性抗体。这些取代也与对VH和VL结构域以及CH1和CL结构域的取代组合，如Lewis等人,(2014)Nat.Biotech.[自然生物技术]32:191-8和WO 14/150973(礼来公司；下文讨论)中所述。
为了解决轻链-重链错配问题，先前的方法已包括使用单一轻链产生双特异性抗体。这需要重链-轻链工程化或利用限制多样性的单一轻链的新型抗体文库(Merchant等人,(1998)Nat.Biotech.[自然生物技术]16(7):677-81)。此外，已经从具有单一轻链的转基因小鼠中鉴定了具有共同轻链的抗体(WO 11/097603再生元(Regeneron)；Dhimolea和Reichert(2012)mAbs[单克隆抗体],4:4-13)。另一种方法是将一条重链的CH1结构域与其同源轻链的CL结构域互换(Crossmab technology[Crossmab技术]，Schaefer等人,(2011)同上)，它也可包括“杵臼结构”方法以确保重链异源二聚化(Merchant等人,(1998)同上)。还可以设计正交的CH1-CL界面(Lewis SM等人,(2014)同上)或使用静电转向机制来工程化抗体轻链-重链界面残基(Liu Z等人,(2015)JBC[生物化学杂志],290:7535-62)。Fab界面的分析揭示氢键和范德华相互作用是主要的，而轻链与重链之间的静电相互作用是罕见的。
用于产生异源二聚体抗体的另外的方案包括但不限于例如：静电转向Fc配对，如例如WO 09/089004、WO 06/106905和WO 10/129304中所述；Fab臂交换，如例如WO 08/119353、WO 11/131746和WO 13/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如在US 4,433,059中所述；通过对两条重链之间的二硫键进行还原和氧化的循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇，如例如在US 4,444,878中所述；三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个Fab’片段，如例如在US 5,273,743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C-末端尾优选通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的scFv对，如例如在US 5,534,254中所述；双功能抗体，例如具有不同结合特异性的Fab片段，这些Fab片段通过已经替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US 5,582,996中所述；双特异性和寡特异性单价受体和寡价受体，例如两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区，这些VH-CH1区通过在一个抗体的CH1区与另一个抗体的VH区(典型地具有相关联的轻链)之间的多肽间隔区连接，如例如在US 5,591,828中所述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过DNA的双链段交联，如例如在US 5,635,602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US 5,637,481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有Ig重链可变区结合区的第一结构域和Ig轻链可变区结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双抗体(还披露更高级结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子)，如例如在US 5,837,242中所述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，它可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US 5,837,821中所述；用短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接的或在任一取向上完全没有接头连接的VH和VL结构域，这些VH和VL结构域可以形成二聚体以形成双特异性双抗体；三聚体和四聚体，如例如在US 5,844,094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，该串通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5,864,019中所述；具有经肽接头连接的VH和VL结构域二者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5,869,620中所述。
电荷工程化
使用电荷工程化生成双特异性抗体分子的具体示例包括SEED异源二聚体形成，如例如在WO 07/110205(默克公司(Merck))中所述，以及WO 09/089004(安进公司(Amgen))、EP 1870459B1(日健公司(Chugai))、WO 10/129304(肿瘤药物制药公司(Oncomed))、WO 14/150973(礼来公司和北卡罗来纳大学(University of North Carolina))以及WO 16/118742(礼来公司)中所述的技术。
如WO 07/110205(默克公司)中所述的SEED异源二聚体包含IgA和IgG的工程化的CH3结构域，其中第一工程化结构域和第二工程化结构域优先于形成同源二聚体而彼此形成异源二聚体。此外，可以有差别地对Fc区加标签以利用人IgG3同种型不能结合蛋白A，从而能够有效纯化异源二聚体(US 8,586,713)。
WO 09/089004(安进公司)描述并举例说明了用于制备双特异性抗体分子的方法，该方法在CH3结构域中使用电荷工程化以相比于同源二聚体形成在静电方面有利于重链异源二聚体形成。该申请进一步表明，为了增加每条轻链的保真度以结合恰当的重链，重链的CH1结构域和轻链的恒定区也可以被工程化为有利于二聚化。他们对轻链-重链相互作用的分析揭示了可以将电荷对引入序列中以增强特定轻链和重链对的结合的位置。这些位置包括λ轻链的T112和重链的A141、λ轻链的E156和重链的S176，以及λ轻链的S171和重链的S183。另外的位置在WO 09/089004的表4和5中以粗体示出。
EP 1870459B1(日健公司)报道了VH与VL之间的缔合可以通过用带电氨基酸取代VH-VL界面处存在的氨基酸来调节，这比“杵臼结构”技术更有效地形成异源分子。他们认为这不仅可以应用于调节VH与VL之间的缔合，而且还可以应用于调节任意多肽之间的缔合。所建议的修饰是在sc(Fv)2的VH/VL界面中。VH/VL界面修饰的sc(Fv)2的制剂包含VH的Q39和VL的Q38以及VL的P44处的修饰。
在WO 10/129304(肿瘤药物制药公司(Oncomed Pharmaceuticals.Inc.))中描述了一种方法，其中异源二聚体分子中的多肽之间改变的静电和/或疏水/亲水相互作用相比于同多聚体有利于重链异多聚体的形成。选择在两个多肽之间的界面处相互作用的氨基酸进行修饰。参与亲水性相互作用的氨基酸残基被更具疏水性的氨基酸残基替换和/或参与电荷相互作用的氨基酸被另一氨基酸替换。选择人IgG2的CH3结构域中的第236、245、249、278、286和288位进行取代。
WO 14/150973(礼来公司和北卡罗来纳大学)中描述的工作涉及在VH和VL结构域与CH1和CL结构域的界面中具有经过设计的残基的Fab和双特异性抗体。在VH中的第62位和VL中的第1位和/或VH中的第39位和VL中的第38位(卡巴特(Kabat)编号)进行取代。在CH1中的第172位和/或第174位以及CL中的第135位和/或第176位进行进一步的取代。还进行了重链中的K228D和轻链中的D122k的进一步“电荷交换(charge swop)”取代，以尝试并改善正确的重链-轻链配对。即使使用这些取代的各种组合，可以实现的正确重链-轻链配对的百分比仍将低于90％。
WO 16/118742(礼来公司)中描述的最近工作涉及基于计算和合理设计在两个CH3结构域中均包含取代以改善重链异源二聚化的双特异性抗体，尤其是在以下位置处：407与366、409；407、399与366、409；360、399、407与345、347、366、409；349、370与357、364；以及349、366、370、409与357、364、407。另外，如上文详述，如在Lewis等人,(2014)同上和WO 14/150973中所描述的，对VH和VL结构域进行了突变。只有使用这些另外的CH3突变才可实现重链-轻链结合的改善，优于在WO 14/50973中所观察到的。
虽然静电工程化的概念也已用于本发明，但发明人已经将特定标准应用于电荷修饰的位置选择。选择重链-轻链配对界面边缘而不是相互作用中心的位置，通过经由强盐桥对准正确的重链-轻链形成而实现了“夹持效应”，从而有利于正确的重链-轻链配对。取代可变结构域末端以及CH1结构域和CL区的起点和末端处的带电残基(酸性或碱性，在适当时)还降低CH1和CL界面的去稳定化。此类修饰已导致实现重链与其同源轻链最高至100％的正确配对并且仅实现相互作用结构域的最小去稳定化。
二硫键工程化
先前的工作已经描述了通过用工程化的链间二硫键替换一个CH1-CL界面内的天然链间二硫键可以实现同源LC和HC配对的增强(US 20140348839(医学免疫公司(MedImmune)))。在本发明的一个实施例中，已经应用了电荷工程化和二硫键工程化的组合。使用基于文献中广泛描述的稳定化VH44-VL100二硫键的Fv的设计，用VH-VL界面内的键替换天然链间二硫键(Reiter等人,(1996)[自然生物技术]14:1239-45；Weatherill等人,(2012)Protein Eng.Des.Sel.[蛋白质工程化设计和选择]25(7):321-9)。这种修饰旨在共价锁定期望的特定HC/LC配对，并且另外促进谱化分析双特异性抗体制剂所需的分析程序。使用基于电泳的简单程序可以容易地鉴定和定量错误组装的分子，这进一步增加了本文所述的静电工程化方法的严格性，以实现正确配对的双特异性抗体。通过对已经通过静电工程化修饰但未显示100％的正确同源配对的重链和轻链对添加二硫键工程化，可以消除错误组装的分子，从而产生具有最高至100％的重链与其同源轻链的正确配对的双特异性抗体。
核酸和表达***
本发明还涵盖编码本文所述的重链和/或轻链恒定和/或可变结构域的核酸。本发明的核酸分子包括单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段的组合。本发明的核酸衍生自人来源，但本发明包括衍生自非人物种的核酸。
“分离的核酸”是在从天然存在的来源分离的核酸的情况下，与分离了核酸的生物体的基因组中存在的相邻遗传序列分开的核酸。在以酶促方式从模板或以化学方式合成的核酸(如PCR产物、cDNA分子、或寡核苷酸)的情况下，应理解，由此类过程产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选实施例中，核酸基本上不含污染性的内源材料。核酸分子优选地衍生自以基本上纯的形式和以使得能够通过标准生物化学方法(如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1989)中概述的那些)鉴定、操纵和回收其组分核苷酸序列的量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。此类序列优选以不被通常存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的可读框的形式提供和/或构建。非翻译DNA的序列可以存在于可读框的5’或3’，其中所述序列不干扰编码区的操纵或表达。
变体序列可以通过以下方式制备：使用盒或PCR诱变或本领域熟知的其他技术进行编码多肽的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变，以产生编码变体的DNA，然后如本文所概述的那样在细胞培养物中表达重组DNA。
本发明还提供了包含至少一种如上所述的多核苷酸的呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达***和构建体。此外，本发明提供了包含此类表达***或构建体的宿主细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种制备包含工程化的VH和CH1结构域以及工程化的VL和CL结构域的异源二聚体抗体或其片段的方法，其中VH和CH1结构域在第39位、第147位和第165位(EU编号)包含带电氨基酸并且VL和CL结构域在第38位、第124位和第169/170位(EU编号)包含带电氨基酸，该方法包括以下步骤：(a)培养包含编码所述工程化的VH和CH1结构域多肽的核酸和包含所述工程化的VL和CL结构域多肽的核酸的宿主细胞，其中所培养的宿主细胞表达所述工程化的多肽；以及(b)从宿主细胞培养物中回收异源二聚体抗体。
用于本发明的表达载体可由起始载体(如可商购获得的载体)构建。在构建载体并将编码轻链、重链或轻链和重链序列的核酸分子***载体的恰当位点之后，可将完成的载体***合适的宿主细胞中以用于扩增和/或多肽表达。表达载体到所选宿主细胞中的转化可通过熟知方法完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、或其他已知技术。所选方法将部分地取决于有待使用的宿主细胞类型的功能。这些方法和其他合适的方法是技术人员公知的，并且阐述于例如Sambrook等人,2001,同上。
典型地，宿主细胞中所用的表达载体将含有用于质粒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施例中，此类序列，统称为“旁侧序列”，通常将包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于***编码有待表达的多肽的核酸的多接头区、以及选择标记元件。
当在适当条件下培养时，宿主细胞可以用于表达双特异性抗体，所述抗体随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果不是分泌性的)。适当宿主细胞的选择将取决于各种因素，如期望的表达水平、活性(如糖基化或磷酸化)期望或必需的多肽修饰以及折叠成生物活性分子的便宜性。宿主细胞可以是真核或原核细胞。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，并且本领域已知的表达***中使用的任何细胞系均可以用于制备本发明的重组多肽。一般来讲，用包含编码期望双特异性抗体的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可采用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(bacilli)。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括COS-7细胞、L细胞、Cl27细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或在无血清培养基中生长的它们的衍生物和相关细胞系、HeLa细胞、BHK细胞系、CVIIEBNA细胞系、人胚胎肾细胞(如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织的体外培养的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地，当期望在各种信号转导或报告蛋白测定中使用多肽时，哺乳动物细胞系(如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49)可以用于多肽的表达。替代性地，可以在低等真核生物(如酵母)或在原核生物(如细菌)中产生多肽。合适的酵母包括酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、克鲁维酵母属菌株、假丝酵母属、或能够表达异源多肽的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、或能够表达异源多肽的任何细菌菌株。如果双特异性抗体在酵母或细菌中制备，则可能期望修饰其中产生的产物，例如通过适当位点的磷酸化或糖基化，以便获得功能性产物。此类共价附接可以使用已知的化学或酶促方法实现。
实例
实例1：合理设计
使用合理设计策略产生一组蛋白质以鉴定表现出期望特性(如正确的重链-轻链配对)的突变。用于对重链-轻链配对进行工程化的设计策略包括鉴定代表性Fab。代表性Fab的标准是：其是常用VH和VL亚组的成员，如VH3和VK1、或λ轻链。在选择Fab(抗c-Kit重链SEQ ID NO:7和轻链SEQ ID NO:21)之后，进行Fab界面的计算机模拟分析以鉴定对重链与轻链之间的可能的相互作用重要的残基。
在可变结构域VH和VK以及恒定结构域CH1和CK中引入一组突变之后，使用AMBER99力场用建模软件MOE(化学计算集团公司(Chemical Computing Group Inc.))生成模型。使用Blastp 2.2.30+程序针对PDB数据库运行突变结构域。选择具有最高同一性的pdb X-射线结构对最佳变体建模(pdb 3KDM)。
1.1残基位置的选择
为了确保轻链与其同源重链的正确配对，研究了用以控制重链-轻链组装的方法。优选方法是通过VH-VL和CH1-CL结构域的电荷工程化来控制组装。在该实例中，通过人引导的设计选择用于电荷工程化的适当位置，并应用几个标准。所选氨基酸应不与CDR接触，并且如果可能，它们在大多数常见抗体家族中应是高度保守的。应避免界面中心的位置；相反，它们应处于界面边缘，以实现“夹持效应”。一个臂应具有一组带电残基，并且另一个臂应在相应的3D位置处具有反电荷或中性电荷。符合工程化标准的残基列于下表1中，并且探索了这些中的一些以制备异源二聚体抗体。应用同源建模来检查能量最小化后所选侧链的距离。使用AMBER99力场，用建模软件MOE(化学计算集团公司)生成模型。对于进一步的实验，仅考虑小于的侧链距离。例如，K147D与T129R的距离为/>并且未进一步进行这种配对。
表1
实例2：工程化Fab的表达和纯化
重链和轻链DNA在基因艺术公司(GeneArt)(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成并使用基于限制酶-连接的克隆技术克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒共转染到HEK293T细胞中。对于Fab的瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；目录号24765，聚合科学公司(Polysciences,Inc.))将每种工程化链的等量载体共转染到悬浮适应的HEK293T细胞中。典型地，用含有50μg编码工程化重链的表达载体和50μg编码工程化轻链的表达载体的DNA转染以1-2Mio细胞/ml的密度悬浮的100ml细胞。然后将重组表达载体引入宿主细胞中，并通过进一步培养细胞7天的时段来产生构建体，以允许分泌到补充有0.1％普朗尼克酸(pluronic acid)、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml抗生素的培养基(HEK，无血清培养基)中。然后使用免疫亲和色谱从无细胞上清液中纯化所产生的构建体。将经过过滤的条件培养基与300μl蛋白A树脂(CaptivA PriMabTM，瑞普利金公司(Repligen))混合，用pH 7.4的PBS缓冲液平衡。用15倍柱体积的PBS pH 7.4洗涤树脂三次，然后用10倍柱体积的蛋白A洗脱缓冲液(50mM柠檬酸盐、90mM NaCl，pH 2.5)洗脱Fab。
对于概念验证研究，选择内部产生的抗c-Kit抗体的Fab。进行竞争研究，其中两个工程化轻链具有结合两个不同工程化重链的选择。为了有利于验证，将两个另外的丙氨酸残基与某些轻链或重链的C-末端融合，而其他轻链和重链保持仅作为电荷工程化实体。具有或不具有两个丙氨酸残基的这些不同的电荷工程化链导致不同的质量，如表2所示。
表2
*Q39K例如表示第39位从Gln到Lys的突变。Q39例如表示在第39位没有发生突变。
实例3：工程化Fab的质谱分析
通过液相色谱-质谱法(LC-UV-ESI-MS)进行Fab变体的正确重链-轻链配对的评估。简而言之，将纯化的蛋白质使用旋转浓缩器(3000MWCO，密理博公司(Millipore))浓缩至100μL，并且在UPLC(Acquity UPLC I类，沃特世公司(Waters))上，使用100％水、0.05％三氟乙酸(TFA)和100％乙腈、0.04％TFA通过反相色谱法(柱BEH C4 1.7μm 2.1*50mm，沃特世公司)进行分析。通过施加5％-10％乙腈的第一梯度，0.2分钟内0.04％和10％至45％乙腈的第二梯度，4分钟内0.04％，在80℃下分离Fab变体。通过UV(210-450nm)检测洗脱的Fab变体并通过电喷雾电离(ESI)进行电离，然后通过QTOF(Xevo G2-S QTof，沃特世公司)分析它们的质量。最后，通过对UV信号和质量强度进行二重积分来确定注入的Fab混合物的相对组成。
不同HC-LC组合的配对结果在表3中示出。右侧列示出正确HC-LC配对的百分比。100％的值表示没有错配，并且100％的轻链与其同源重链结合。例如，95％的值表明95％的轻链与其同源重链结合，但存在5％的错配，其中轻链不与其同源重链结合。
表3
实例4：转换至具有两条κ轻链(VH3-VK_VH3-VK)的IgG
将几个优选的突变组引入多个IgG1的可变区和恒定区中。除抗c-Kit抗体(SEQ IDNo:29和30)之外，还使用抗HER3(SEQ ID NO:31和32)和抗IL-17(SEQ ID NO:33和34)抗体来评估IgG1环境中的HC-LC配对。所有三种抗体都是亚组VH3/VK1的成员。为了正确组装重链，将“杵臼结构”技术(Ridway等人,同上)与引入抗体CH3结构域的突变一起使用。根据下表4，将另外的突变引入抗体的可变、CH1和CL结构域中。
表4
在同一细胞中使用标准瞬时HEK表达产生包含突变组的异源二聚体抗体，并评估其正确组装以及生物化学和生物物理特性。此外，针对抗原的同时结合，对工程化的异源二聚体抗体进行评估。与亲本未突变IgG1的比较在表5中示出。通过液相色谱-质谱法(LC-UV-ESI-MS；如实例3中所述)来确定Fab异源二聚化的百分比。例如，如针对IL-17/HER3异源二聚体抗体所观察到的，72％的值表示72％的IL-17和HER3轻链与其同源重链结合，但是存在28％的错配，其中IL-17轻链与HER3重链结合并且HER3轻链与IL-17重链结合。100％的值表示没有错配并且100％的轻链与其同源重链结合，如针对突变IL-17/突变HER3，以及突变IL-17/突变c-Kit和突变c-Kit/突变HER3异源二聚体抗体所观察到的。
表5
实例5：转换至具有一个κ和一个λ轻链(VH3-VK_VH3-VL)的IgG
为了评估将电荷引入抗体的Fab部分中的效果，将具有κ轻链的抗体与含有λ轻链的抗体混合。将优选的突变组引入IgG1中。除了抗c-Kit抗体(SEQ ID NO:29和30)之外，使用抗HER3(SEQ ID NO:31和32)、抗IL-17(SEQ ID NO:33和34)、抗IL-18(SEQ ID NO:35和36)抗体评估IgG1环境中的重链-轻链配对。c-Kit、HER3和IL-17抗体是亚组VH3-VK1的成员，而IL-18抗体含有轻链，它为亚组VL1的成员。为了确保正确组装重链，将“杵臼结构”技术(同上)与引入抗体CH3结构域的突变一起使用。根据下表6，将另外的突变引入抗体的可变、CH1和CL结构域中。
表6
产生包含突变组的异源二聚体抗体并评估其正确组装。与亲本未突变IgG1的比较在表7中示出。右侧栏示出如使用液相色谱-质谱法(LC-UV-ESI-MS；如实例3中所述)确定的Fab异源二聚化的百分比。如针对IL-17/IL-18异源二聚体抗体所观察到的，71％的值表示71％的IL-17和IL-18轻链与其同源重链结合，但是存在29％的错配，其中IL-17轻链与IL-18重链结合并且IL-18轻链与IL-17重链结合。100％的值表示没有错配并且100％的轻链与其同源重链结合，如针对突变IL-17/突变IL-18和突变c-Kit/突变IL-18异源二聚体抗体所观察到的。
表7
实例6：表面等离子体共振(SPR)结合分析
进行直接结合测定以表征工程化抗体对其抗原的结合。使用重组人抗原作为分析物，在蛋白A捕获的蛋白质上测量动力学结合亲和常数(KD)。在室温下在T200(瑞士格拉特布鲁格的GE医疗公司(GE Healthcare,Glattbrugg,Switzerland))上进行测量。对于亲和力测量，将蛋白质在10mM NaP、150mM NaCl、0.05％Tween 20(pH 5.8)中稀释并根据制造商的建议(GE医疗公司)使用标准胺偶联程序固定在CM5研究级传感器芯片(GE医疗公司，编号BR-1000-14)的流动池上。为了用作参考，将一个流动池空白固定。通过随后在参考和测量流动池上注入分析物稀释液系列获得结合数据。纳入零浓度样品(仅运行缓冲液)以允许在数据评估期间进行双重参考。对于数据评估，使用双重参考传感图并通过稳态分析进行分析以产生平衡解离常数(KD)。结果汇总于表5中(/>(nM)列。
实例7：差示扫描量热法(DSC)
使用如表5所示的量热测量比较工程化异源二聚体抗体和其亲本抗体的热稳定性(DSC-Tm(℃)列)。在差示扫描微量热计(Nano DSC，TA仪器(TA instruments))上进行量热测量。池体积为0.5ml并且加热速率为1℃/min。所有蛋白质以在PBS(pH 7.4)中1mg/ml的浓度使用。通过与含有相同缓冲液的重复样品(其中省略了蛋白质)进行比较来估计每种蛋白质的摩尔热容。使用标准程序分析部分摩尔热容和熔融曲线。对热谱图进行基线校正和浓度标准化。
实例8：将电荷工程化转换到具有不同框架的IgG中
为了评估将电荷引入具有不同框架的抗体的Fab中的效果，将具有轻链框架VK1、VK3、VL1、VL2、VL3和重链框架VH1、VH2、VH3、VH5和VH6的抗体与含有κ轻链VK1和重链VH3的抗体混合。人源的框架区的序列可获自Marie-Paule Lefranc、Gerard Lefranc,AcademicPress[学术出版社]2001,ISBN 012441351的The Immunoglobulin Factsbook[免疫球蛋白丛书]。将优选的突变组引入IgG1中并与其相应的非工程化亲本抗体进行比较。将针对HER2和五种其他抗原A-E的抗体与抗IL-17抗体组合，并用于评估IgG1环境中的重链-轻链错配。为了确保重链的正确组装，使用了“杵臼结构”技术(同上)。
产生双特异性抗体，所述抗体具有靶向抗原HER2或在此列为抗原A-E的多个其他抗原的第一结合臂，以及靶向IL-17的第二结合臂。针对HER2的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39D和S165D以及κVL和CL结构域中的Q38K和Q124D或λVL和CL结构域中的Q38K和N170R。针对抗原A的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39D和S165D以及λVL和CL结构域中的Q38K或Q38K和N170R。针对抗原B、D和E的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39D和S165D以及λVL和CL结构域中的Q38K和N170R。针对抗原C的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39D和S165D以及λVL结构域中的Q38K。针对IL-17的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39K、K147D和S165R以及κVL和CL结构域中的Q38D、Q124K和K169D。工程化双特异性抗体与亲本双特异性抗体的重链-轻链配对的比较在下表8中示出。对于所产生的大多数工程化双特异性抗体，完全消除了通过液相色谱-质谱法作为Fab异源二聚化的百分比测量得到的错配。与对应的亲本双特异性抗体相比，对于3种工程化的双特异性抗体，仅观察到最多至最大值5％的错配。该实例清楚地表明，通过使用如本文披露的特异性静电工程化突变，几乎可以消除双特异性异源二聚体抗体的重链-轻链错配的发生率，并且不限于包含特定框架区的双特异性异源二聚体抗体。
实例9：将电荷工程化加二硫键工程化转换到具有不同框架的IgG中
评估了除了将电荷引入双特异性抗体的Fab中之外，还在双特异性抗体的一个Fab中用工程化的VH-VL二硫键替换天然LC-HC链间二硫键的效果。将具有轻链框架VL2或VL3和重链框架VH1、VH2和VH5的抗体与含有κ轻链VK1和重链VH3的抗体混合。人源的框架区的序列可获自[免疫球蛋白丛书](同上)。通过向一个Fab中添加工程化的VH-VL二硫键将优选的静电突变组引入IgG1中。将在一个Fab中具有带电残基和非天然二硫键的这些工程化抗体与被工程化为仅在一个臂中具有非天然二硫键的相应亲本抗体进行比较。将针对四种抗原(抗原F、G、H和I)的抗体与抗IL-17抗体组合，并用于评估IgG1环境中的重链-轻链错配。为了确保重链的正确组装，使用了“杵臼结构”技术(同上)。
产生双特异性抗体，所述抗体具有靶向在此列为抗原F至I的抗原的第一结合臂，以及靶向IL-17的第二结合臂。针对抗原F至I的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39D和S165D以及λVL和CL结构域中的Q38K和N170R。针对IL-17(SEQ ID NO:73和74)的工程化抗体包含VH和CH1结构域中的取代Q39K、G44C、K147D、S165R和C220A以及κVL和CL结构域中的Q38D、Q100C、Q124K、K169D和C214A。为了比较，仅具有二硫键工程化的抗IL-17抗体对应地包含VH-CH1结构域中的取代G44C和C220A以及LC中的Q100C、C124A(SEQ ID NO:75和76)。比较的结果在图1中示出，其中孔内容物和工程化位置的细节在下表9中给出。
使用该方法极大地简化了用于检测和定量正确配对相对于错配双特异性抗体的分析程序，因为只有正确组装的双特异性抗体可以在SDS-PAGE或任何类似的基于电泳的***上作为全长抗体(150kDa)迁移。在错配的情况下，其中轻链和重链不共价连接，凝胶上出现不完整分子和游离轻链。对于在没有电荷工程化的情况下产生的双特异性抗体观察到错配，其中在凝胶上检测到游离的未配对的轻链(25kDa条带)和不完整的分子(125kDa条带)(图1；孔7至10)。相反，组合了二硫键和电荷工程化的双特异性抗体仅显示这些条带的痕迹(图1；孔2至5)。该实例清楚地表明，通过在双特异性抗体的一个Fab中与LC-HC链间二硫键工程化组合地使用如本文披露的特异性静电工程化突变，可以消除双特异性异源二聚体抗体的重链-轻链错配的发生率。二硫键工程化本身似乎不足以驱动正确的LC-HC配对。此外，由于可以通过电泳测量重链-轻链错配，因此简化了分析程序，这使得能够通过其同源重链和轻链的正确组装来高通量筛选双特异性候选物。
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表10：序列表
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Claims (22)

1.一种IgG类型的异源二聚体抗体，所述异源二聚体抗体包含至少两个Fab，其中至少一个Fab包含：
(a)属于VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亚型的工程化的重链可变结构域（VH）和恒定结构域1（CH1），其在第39位为酸性氨基酸、在第147位为碱性氨基酸并且在第165位为酸性氨基酸，以及属于κVL1或κVL3亚家族的或属于λVL1、λVL2或λVL3亚家族的工程化的轻链可变结构域（VL）和恒定结构域（CL），其在第38位为碱性氨基酸、在第124位为酸性氨基酸并且在κVL1或κVL3亚家族的第169位或λVL1、λVL2或λVL3亚家族的170位为碱性氨基酸；或
(b)属于VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亚型的工程化的VH结构域和IgG CH1结构域，其在第39位为碱性氨基酸、在第147位为酸性氨基酸并且在第165位为碱性氨基酸，以及属于κVL1或κVL3亚家族的或属于λVL1、λVL2或λVL3亚家族的工程化的VL结构域和CL结构域，其在第38位为酸性氨基酸、在第124位为碱性氨基酸并且在κVL1或κVL3亚家族的第169位或λVL1、λVL2或λVL3亚家族的第170位为酸性氨基酸，
其中所述VH和CH1结构域以及所述VL和CL结构域中的所述氨基酸成对地具有相反电荷，并且相对应以形成在静电方面有利于异源二聚化的界面；
其中所述碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)，并且所述酸性氨基酸选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
其中所述异源二聚体抗体包含选自由以下各项组成的组的取代：
i.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述VL中的Q38K；
ii.所述VH和CH1中的Q39K和K147D，以及所述κVL和CL中的Q38D和Q124K；
iii.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述κVL和CL中的Q38K和Q124D；
iv.所述VH和CH1中的Q39K、K147D和S165R，以及所述κVL和CL中的Q38D、Q124K和K169D；
v.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述λVL和CL中的Q38K、E124D和N170K；以及
vi.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述λVL和CL中的Q38K和N170R；
并且其中所述位置编号为根据EU编号；
并且其中通过液相色谱-质谱法所确定，实现至少95%的异源二聚化。
2.如权利要求1所述的异源二聚体抗体，包含IgG Fc区。
3.如权利要求2所述的异源二聚体抗体，其中所述IgG Fc区包含在第366位具有取代的第一CH3区和在第366位、第368位和第407位具有取代的第二CH3区。
4.如权利要求2所述的异源二聚体抗体，其中所述IgG Fc区包含在第366位和第354位具有取代的第一CH3区和在第366位、第368位、第407位和第349位具有取代的第二CH3区。
5.如权利要求4所述的异源二聚体抗体，其中所述第一CH3区包含取代T366W和S354C，并且所述第二CH3区包含取代T366S、L368A、Y407A和Y349C。
6.如权利要求1-5中任一项所述的异源二聚体抗体，其中通过液相色谱-质谱法所确定，实现最多至100%的异源二聚化。
7.如权利要求1-5中任一项所述的异源二聚体抗体，其中另外的Fab包含：
属于VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亚型的工程化的重链可变结构域（VH）和恒定结构域1（CH1），其在第39位、第147位为带电氨基酸并且在第165位为带电或中性氨基酸；以及
属于κVL1或κVL3亚家族的或属于λVL1、λVL2或λVL3亚家族的工程化的轻链可变结构域（VL）和恒定结构域（CL），其在第38位为带电氨基酸并且在第124位和κVL1或κVL3亚家族的第169位或λVL1、λVL2或λVL3亚家族的第170位为带电或中性氨基酸，
其中所述VH和CH1结构域以及所述VL和CL结构域中的所述氨基酸成对地具有相反电荷或为带电的/中性的，并且相对应以形成在静电方面有利于异源二聚化的界面；并且
其中一个Fab的所述工程化的VH中的第39位、第147位和第165位中的每一个处的电荷与所述另外的Fab的所述工程化的VH中的第39位、第147位和第165位中的每一个处的电荷不同；并且
其中所述位置编号为根据EU编号。
8.如权利要求7所述的异源二聚体抗体，其中一个Fab由所述VH和CH1中的取代Q39K、K147D和S165R以及所述VL和CL中的取代Q38D、Q124K和K169D组成；并且所述另外的Fab由所述VH和CH1中的取代Q39D和S165D以及所述VL和CL中的选自以下各项的取代：(i) 所述κVL和CL中的Q38K和Q124D；(ii) 所述λVL中的Q38K；(iii) 所述λVL和CL中的Q38K和N170R；或(iv) 所述λVL和CL中的Q38K、E124D和N170K 组成。
9.如权利要求7所述的异源二聚体抗体，其中所述另外的Fab中的链间二硫键被工程化的VH-VL链间二硫键替换。
10.如权利要求9所述的异源二聚体抗体，其中一个Fab由所述VH和CH1中的取代Q39K、K147D和S165R以及所述VL和CL中的取代Q38D、Q124K和K169D组成；并且所述另外的Fab由所述VH和CH1中的取代Q39D、G44C、S165D和C220A以及所述VL和CL中的选自以下各项的取代：(i) 所述κVL和CL中的Q38K、Q100C、Q124D和C214A；(ii) 所述λVL中的Q38K、G100C和C214A；(iii) 所述λVL和CL中的Q38K、G100C、N170R和C214A；或 (iv) 所述λVL和CL中的Q38K、G100C、E124D、N170K和C214A 组成。
11.一种制备IgG类型的异源二聚体抗体的方法，所述异源二聚体抗体包含相对应以形成界面的工程化的属于VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亚型的VH和CH1结构域以及工程化的属于κVL1或κVL3亚家族的或属于λVL1、λVL2或λVL3亚家族的VL和CL结构域，所述方法包括取代所述VH和CH1结构域中的至少两个氨基酸，使得所述工程化的结构域在第39位为酸性氨基酸、在第147位为碱性氨基酸并且在第165位为酸性氨基酸，以及取代所述VL和CL结构域中的氨基酸，使得所述工程化的结构域在第38位为碱性氨基酸、在第124位为酸性氨基酸并且在κVL1或κVL3亚家族的第169位或λVL1、λVL2或λVL3亚家族的第170位为碱性氨基酸，并且其中所述VH和CH1结构域中的所述酸性氨基酸或碱性氨基酸和所述VL和CL结构域中的所述界面中的所述酸性氨基酸或碱性氨基酸成对地具有相反电荷，并且形成在静电方面有利于异源二聚化的界面；其中所述碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)，并且所述酸性氨基酸选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
其中所述异源二聚体抗体包含选自由以下各项组成的组的取代：
i.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述VL中的Q38K；
ii.所述VH和CH1中的Q39K和K147D，以及所述κVL和CL中的Q38D和Q124K；
iii.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述κVL和CL中的Q38K和Q124D；
iv.所述VH和CH1中的Q39K、K147D和S165R，以及所述κVL和CL中的Q38D、Q124K和K169D；
v.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述λVL和CL中的Q38K、E124D和N170K；以及
vi.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述λVL和CL中的Q38K和N170R；
并且其中所述位置编号为根据EU编号；
并且其中通过液相色谱-质谱法所确定，实现至少95%的异源二聚化。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述异源二聚体抗体包含IgG Fc区。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述IgG Fc区包含在第366位具有取代的第一CH3区和在第366位、第368位和第407位具有取代的第二CH3区。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述IgG Fc区包含在第366位和第354位具有取代的第一CH3区和在第366位、第368位、第407位和第349位具有取代的第二CH3区。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一CH3区包含取代T366W和S354C并且所述第二CH3区包含取代T366S、L368A、Y407A和Y349C。
16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中通过液相色谱-质谱法所确定，实现最多至100%的异源二聚化。
17.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述异源二聚体抗体包含另外的Fab，所述另外的Fab包含：
属于VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亚型的工程化的重链可变结构域（VH）和恒定结构域1（CH1），其在第39位、第147位为带电氨基酸并且在第165位为带电或中性氨基酸；以及
属于κVL1或κVL3亚家族的或属于λVL1、λVL2或λVL3亚家族的工程化的轻链可变结构域（VL）和恒定结构域（CL），其在第38位为带电氨基酸并且在第124位和κVL1或κVL3亚家族的第169位或λVL1、λVL2或λVL3亚家族的第170位为带电或中性氨基酸，
其中所述VH和CH1结构域以及所述VL和CL结构域中的所述氨基酸成对地具有相反电荷或为带电的/中性的，并且相对应以形成在静电方面有利于异源二聚化的界面；并且
其中一个Fab的所述工程化的VH中的第39位、第147位和第165位中的每一个处的电荷与所述另外的Fab的所述工程化的VH中的第39位、第147位和第165位中的每一个处的电荷不同；并且
其中所述位置编号为根据EU编号。
18.如权利要求17所述的方法，其中一个Fab由所述VH和CH1中的取代Q39K、K147D和S165R以及所述VL和CL中的取代Q38D、Q124K和K169D组成；并且所述另外的Fab由所述VH和CH1中的取代Q39D和S165D以及所述VL和CL中的选自以下各项的取代：(i) 所述κVL和CL中的Q38K和Q124D；(ii) 所述λVL中的Q38K；(iii) 所述λVL和CL中的Q38K和N170R；或 (iv)所述λVL和CL中的Q38K、E124D和N170K 组成。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述另外的Fab的天然LC-HC链间二硫键被工程化的VH-VL链间二硫键替换。
20.如权利要求19所述的方法，其中一个Fab由所述VH和CH1中的取代Q39K、K147D和S165R以及所述VL和CL中的取代Q38D、Q124K和K169D组成；并且所述另外的Fab由所述VH和CH1中的取代Q39D、G44C、S165D和C220A以及所述VL和CL中的选自以下各项的取代：(i) 所述κVL和CL中的Q38K、Q100C、Q124D和C214A；(ii) 所述λVL中的Q38K、G100C和C214A；(iii)所述λVL和CL中的Q38K、G100C、N170R和C214A；或 (iv) 所述λVL和CL中的Q38K、G100C、E124D、N170K和C214A 组成。
21.一种制备如权利要求1-8中任一项所述的异源二聚体抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养包含编码所述工程化的VH和CH1结构域多肽的核酸和包含所述工程化的VL和CL结构域多肽的核酸的宿主细胞，其中所培养的宿主细胞表达所述工程化的多肽；以及
(b)从宿主细胞培养物中回收所述异源二聚体抗体。
22.一种制备如权利要求9或权利要求10所述的异源二聚体抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养包含编码所述工程化的VH和CH1结构域多肽的核酸和包含所述工程化的VL和CL结构域多肽的核酸的宿主细胞，其中所培养的宿主细胞表达所述工程化的多肽；
(b)从宿主细胞培养物中回收所述异源二聚体抗体；以及
(c)使用电泳***确定正确的重链-轻链配对。
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