CN107636012A - 蛋白质纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种回收单体形式的含人VH3结构域的抗体的方法。具体而言，本发明提供了一种新的方法，该方法允许从含有单体和多聚体形式的抗体的混合物中回收单体的含人VH3结构域的抗体。

Description

蛋白质纯化方法
发明领域
本发明属于蛋白质纯化领域，更具体地涉及抗体纯化领域。
发明背景
在治疗领域中，蛋白质和抗体以及特别是抗体衍生分子的使用一直在不断地增加和突显重要性，因此对受控制造过程的需求也在同时发展。治疗性蛋白质的商业化需要其大量生产。为此，蛋白质经常在宿主细胞中表达，随后必须在其制备成可施用形式之前回收和纯化。
最常见的一类抗体分子是免疫球蛋白G(IgG)，一种由两条重链和两条轻链组成的异源四聚体。IgG分子可细分为两个功能性亚基：(1)构成抗体尾部并与细胞表面受体相互作用以激活免疫应答的可结晶片段(Fc)，和(2)抗原结合片段(Fab)，其介导抗原识别。Fc区包含来自两条配对重链的两对恒定结构域(CH2和CH3)，而Fab区由与来自轻链的可变结构域和恒定结构域(分别为VL和CL)配对的来自重链的可变结构域和恒定结构域(分别为VH和CH1)组成。Fc和Fab区通过铰链区划分，其中铰链区含有将两条链保持在一起的二硫键。传统上使用包括使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A进行的亲和色谱的捕获步骤的方法来纯化IgG类别的全长抗体。蛋白A与抗体的Fc区之间的高特异性结合使得这种模式的色谱能够在一个步骤中直接从复杂的溶液(例如细胞培养收获培养基)中移除超过98％的杂质。从该工艺步骤获得的大净化因子有助于简化整个下游纯化工艺。通常，在该纯化步骤后，只有微量污染物(高分子量聚集体，残余的宿主细胞蛋白质，浸出的蛋白A)仍然需要被除去，并且这通常可以在一到两个随后的色谱步骤中实现。
此外，已经在包含人重链可变区的特定框架亚组3的抗体(Sasso等人J.Immunol1991,147:1877-1883,Human IgA and IgG F(ab’)2 that bind to staphylococcalprotein A belong to the VHIII subgroup)中描述了用于结合蛋白A的“替代结合”位点，也称为可变重链结构域VH3，并且经常被分类为第二相互作用。尽管蛋白A(A，B，C，D，E)的全部五个结构域通过它们的Fc-区结合IgG，但只有结构域D和E展现出显著的VH3结合。在使用蛋白A亲和色谱的IgG纯化(其是基于IgG的Fc结构域和蛋白A之间的相互作用)的背景下，这些VH3结构域与蛋白A的相互作用被认为是不期望的，因为它们影响待纯化的抗体的蛋白A的洗脱特征谱，并且已经开发了仅包含蛋白A的结构域B的替代树脂且其在市场上是可获得的，例如来自GE Healthcare的
然而，目前可用和/或正在开发的许多抗体和抗体衍生的分子不含有Fc区，并且需要进一步调整其纯化方法。上述通过VH3区的蛋白A的结合可以使得能够使用蛋白A来制造这样的抗体。
抗体纯化的特定要求是回收单体形式或基本上不含较高分子量物种如二聚体和三聚体的所需抗体或抗体衍生分子。
某些抗体分子具有形成多聚体的较高趋势，所述多聚体由可变结构域与邻近分子中可变结构域的混杂配对产生。在使用不同感兴趣的结构域之间的接头区的更复杂的抗体衍生分子的情况下更是如此。
因此，本领域仍然需要制备和纯化单体形式的抗体和抗体衍生分子的其它方法，特别是在这些分子不含Fc区的情况下。
附图简述
图1是显示来自蛋白A树脂的A26Fab-645dsFv通过pH梯度洗脱的洗脱谱的色谱图。
图2显示了通过SEC-HPLC分析的在图1所示色谱中得到的每个级分中存在的总蛋白、单体和多聚体A26Fab-645dsFv的量。
图3是显示来自蛋白A树脂的Fc构建体通过pH梯度洗脱的洗脱谱的色谱图。
图4显示了通过SEC-HPLC分析的在图3所示色谱中得到的每个级分中存在的总蛋白质、单体和多聚体形式的量。
图5是显示来自蛋白A树脂的A26Fab-645dsFv通过pH阶梯洗脱的洗脱谱的色谱图。
图6显示了由图5中描述的蛋白A色谱得到的级分的SEC-HPLC分析。虚线代表在pH3.8洗脱的级分的分析，而不间断线代表在pH 3.0洗脱的级分的分析。
图7显示图5所示的通过pH阶梯洗脱从A26Fab-645dsFv的蛋白A色谱回收的级分的非还原性SDS-PAGE分析。泳道1显示分子量标记物，泳道2显示加载到蛋白A色谱上的澄清的细胞培养上清液的样品，泳道3显示从蛋白A色谱回收的流通级分，泳道4显示在pH3.8洗脱后回收的级分，和泳道5显示在pH 3.0洗脱后回收的级分。
图8显示了从A26Fab-645dsFv的蛋白A色谱通过图5所示的pH阶梯洗脱回收的部分的还原性SDS-PAGE分析。泳道1显示分子量标记物，泳道2显示如上所述的澄清的细胞培养上清液的样品对于蛋白A色谱，泳道3显示从蛋白A色谱回收的流通级分，泳道4在pH3.8洗脱后回收的级分，泳道5在pH3.0洗脱后回收的级分。
图9显示了如实施例4所述通过梯度洗脱从A26Fab-645dsFv的蛋白A色谱回收的级分的SEC-UPLC分析，显示了总蛋白、单体和多聚体A26Fab-645dsFv的量。
图10显示了如实施例5中所述通过梯度洗脱从A26Fab-645dsFv的蛋白A色谱回收的级分的SEC-UPLC分析，显示了总蛋白质、单体和多聚体A26Fab-645dsFv的量。
图11显示了如实施例6所述通过梯度洗脱从A26Fab-645dsFv的蛋白A色谱回收的级分的SEC-UPLC分析，显示了总蛋白、单体和多聚体A26Fab-645dsFv的量。
图12显示了单体Fab-dsFv和Fab-dsFv的多聚体形式以及其基本组分Fab和dsFv的示意图。该图举例说明了可能的单体、二聚体和三聚体。然而，在二聚体和三聚体形成环状结构的情况下，所有接头在现实中都是相同的长度。
图13至20显示了各种抗体分子序列及其组分。
图21显示了色谱图，其显示来自蛋白A树脂的TrYbe通过pH梯度洗脱的洗脱谱。
图22显示了从图21中描述的蛋白A色谱得到的级分的SEC-HPLC分析。
图23显示了图21所示的通过pH梯度洗脱从TrYbe的蛋白A色谱回收的级分的非还原性(A)和还原性(B)SDS PAGE分析。
图24显示了通过SEC-HPLC分析的从图21中描述的色谱得到的每个级分中存在的总蛋白质、单体和多聚体TrYbe的量。
图25显示了色谱图，其显示来自蛋白A树脂的BYbe通过pH梯度洗脱的洗脱谱。
图26显示了从图25中描述的蛋白A色谱得到的级分的SEC-HPLC分析。
图27显示了图25中所示的通过pH梯度洗脱从BYbe的蛋白A色谱回收的级分的非还原性(A)和还原性(B)SDS PAGE分析。
图28显示了通过SEC-HPLC分析的从图25中描述的色谱得到的每个级分中存在的总蛋白质、单体和多聚体BYbe的量。
图29显示了易于根据本发明的方法纯化的替代性单体Fab-scFv形式的示意图。
图30显示了易于根据本发明的方法纯化的替代性单体Fab-2x dscFv和Fab-dsscFv-dsFv形式的示意图。
发明详述
本发明通过提供用于回收单体形式的含人VH3结构域的抗体的新方法来解决上文所述的需求。在人VH3结构域和蛋白A的结合之间现已观察到亲合力效应。鉴于尚未描述Fc区和蛋白A之间的相互作用，这一发现是令人惊讶的，并且导致了开发新的方法，其允许从含有抗体的单体形式和多聚体形式的混合物中回收单体的含人VH3结构域的抗体。
在第一个实施方案中，本发明涉及获得单体形式的含人VH3结构域的抗体的方法，包括：
a)在允许所述抗体与蛋白A结合的条件下，将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，和
b)回收单体形式的含人VH3结构域的抗体，
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
在第二可选实施方案中，本发明涉及用于制造含人VH3结构域的抗体的方法，其包括：
a)在宿主细胞中表达该抗体，
b)回收含有抗体、宿主细胞和其它污染物的混合物，
c)使用至少蛋白A色谱步骤纯化抗体，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，和
d)回收含人VH3结构域的抗体，
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
在第三可选实施方案中，本发明涉及将单体形式的含人VH3结构域的抗体与多聚体形式的该抗体分离的方法，包括：
a)将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，
b)允许所述抗体与蛋白A结合，
c)施加选择性破坏单体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液，
d)回收所得的洗脱液，并任选地
e)施加第二洗脱缓冲液，其破坏多聚体形式的抗体的结合并回收该第二洗脱液，
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
在第四可选实施方案中，本发明涉及将单体形式的含人VH3结构域的抗体与多聚体形式的该抗体分离的方法，包括：
a)将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，
b)允许多聚体形式的抗体的结合，
c)回收流通物(或流出物(flow-through))中的单体形式的抗体，和任选地
d)施加选择性破坏多聚体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液，
e)回收从d)获得的洗脱液；
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
在另一个实施方案中，本发明的方法将另外包括另外的一个或多个色谱步骤以去除剩余的杂质。通常，这样的步骤将采用使用用于凝胶过滤色谱、阳离子色谱、阴离子色谱、混合模式色谱、疏水色谱和疏水电荷诱导色谱的具有适当功能性的固相的非亲和色谱步骤。这些可以以结合和洗脱模式或以流通模式操作。在流通模式中，杂质在固相中结合或具有降低的流动性，而目标蛋白质在洗脱液或流通级分中回收。本领域技术人员容易获得用于色谱的适合固相，例如具有适当功能性的膜或珠状树脂。在根据本发明的方法的具体实施方案中，该方法另外包括以流通模式操作的阴离子交换色谱的步骤。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法包括蛋白A色谱步骤，随后是第一色谱步骤(其是阴离子交换色谱，产生含有蛋白质的流通物)和第二色谱步骤(其是阳离子交换色谱，从其回收含有蛋白质的洗脱液)。
或者，本发明的方法包括蛋白A色谱法，随后是第一色谱步骤和第二色谱步骤，第一色谱步骤是阳离子交换色谱，从其回收含有蛋白质的洗脱液，第二色谱步骤是阴离子交换色谱以产生含有蛋白质的流通物。
通常，以结合和洗脱模式进行蛋白A色谱，其中感兴趣的蛋白质与固相的结合允许杂质诸如污染蛋白质流动通过色谱介质，而感兴趣的蛋白质保持与固相结合。然后用洗脱缓冲液从固相中回收结合的感兴趣的蛋白质，所述洗脱缓冲液破坏感兴趣的蛋白质与所述固相结合的机制。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括在施加包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物之后，将第一溶液加入到蛋白A色谱材料中，使得未结合的材料被去除在溶液中。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中，将洗脱缓冲液施加至蛋白A色谱材料，使得结合的抗体被释放。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中，相对于所施加的混合物，从蛋白A色谱回收的洗脱液相对于多聚体抗体富含单体抗体。
如本领域技术人员将理解的，在本文中，从蛋白A色谱回收的洗脱液具有的蛋白质内容物相对于在蛋白A色谱步骤之前的混合物含有更高百分比的单体形式的抗体。
在一个具体的实施方案中，从蛋白A色谱回收的洗脱液包含至少50％，至少60％，至少70％，75％，80％，85％或至少90％的单体形式的含人VH3结构域的抗体。
在进一步的可选择的实施方案中，当要回收多聚体形式的抗体时，来自蛋白A色谱的洗脱液具有的蛋白质内容物相对于蛋白A色谱步骤之前的混合物含有更高百分比的多聚体形式的抗体。在具体的实施方案中，从蛋白A色谱回收的洗脱液包含至少50％，至少60％，至少70％，75％，80％，85％或至少90％的多聚体形式的含人VH3结构域的抗体。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中，所述蛋白A是天然重组蛋白A。
本领域技术人员可获得含有所述天然重组蛋白A的许多色谱材料，例如(GE Healthcare),(Novasep),Captiv(Repligen),或(JSR)。
在本发明方法的一个具体实施方案中，通过施加具有适于破坏抗体结合的pH的洗脱缓冲液，从蛋白A色谱材料释放结合的抗体。所述pH取决于特定的分子，通常由技术人员根据经验确定，并被调节以达到所需的终点，即可能期望从施加的混合物中回收尽可能最大量的单体，或者可能期望获得尽可能最高纯度的单体。在本发明方法的具体实施方案中，洗脱缓冲液具有pH 3.0至pH 4.5，优选pH 3.2至pH 4.3，pH 3.5至pH 4，优选pH 3.6至pH3.9或pH 3.8。
适合用作蛋白A色谱中的洗涤和洗脱缓冲液的缓冲液在本领域中是容易获得的，并且可以选自以下非限制实例：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris、组氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液或MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸咪唑)、BES(N，N-(双-2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)-丙磺酸)或HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲剂。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物在允许所述抗体与蛋白A结合的条件下施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，施加第一溶液或洗涤缓冲液，使得未结合的材料被去除在溶液中，将洗脱缓冲液施加至蛋白A色谱材料，使得结合的抗体被释放，并且回收单体形式的含人VH3结构域的抗体，其中所回收的溶液相对于所施加的混合物富含单体形式的含VH3结构域的抗体，并且其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法包括将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物在允许所述抗体与蛋白A结合的条件下施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，施加第一溶液或洗涤缓冲液，使得未结合的材料被去除在溶液中，将洗脱缓冲液施加至蛋白A色谱材料，使得单体形式的结合抗体被释放，并且回收单体形式的含人VH3结构域的抗体，其中所回收的溶液相对于所施加的混合物富含单体形式的含VH3结构域的抗体，并且其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
在根据本发明的另一个实施方案中，含有VH3结构域的抗体选自Fab’，F(ab’)2，scFv，Fab-Fv，Fab-scFv，Fab-(scFv)2，Fab-(Fv)2，双链抗体(diabody)，三链抗体(triabody)和四链抗体(tetrabody)。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中，含VH3结构域的抗体包含至少2个人VH3结构域。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中，含人VH3结构域的抗体特异性结合OX40。
在本发明方法的一个实施方案中，抗体是PCT/EP2014/074409(在此引入作为参考)中公开的FabFv或其二硫键稳定的形式。
在一个实施方案中，抗体包含对人血清白蛋白特异的结合结构域，特别是具有如WO2013/068563(在此引入作为参考)中公开的CDR或可变区。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述含人VH3结构域的抗体包含：
-分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中定义的重链CDR1，CDR2和CDR3；和
-分别如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中定义的轻链CDR1，CDR2和CDR3。
在根据本发明的方法的另一个具体实施方案中，抗体是A26Fab-645dsFv，其包含特异性结合OX40的Fab部分和特异性结合血清白蛋白的Fv部分，该两个部分经由二硫键稳定，如WO2013/068563中定义的，在此引入作为参考。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法包括将包含单体和多聚体形式的A26Fab-645dsFv的混合物在允许所述抗体结合蛋白A的条件下施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，施加第一溶液或洗涤缓冲液，使得未结合的材料被去除在溶液中，将洗脱缓冲液施加至蛋白A色谱材料，使得单体形式的结合抗体被释放，并且回收单体形式的A26Fab-645dsFv，其中所回收的溶液相对于施加的混合物富集单体形式的A26Fab-645dsFv，并且其中洗脱缓冲液具有pH 3.5至pH 4.2，优选pH 3.6至pH 4.1，pH 3.7至pH 4.0，优选pH 3.8至pH 3.9或pH 3.8。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法另外包括将第二洗脱缓冲液施加至蛋白A色谱材料以回收多聚体形式的结合的A26Fab-645dsFv，其中所述第二洗脱缓冲液的pH低于3.5，优选低于pH3.4，优选pH2.8至pH3.2，优选pH2.9至pH3.1，优选pH3.0。
因此，本公开内容提供了结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其包含：
重链，其从N-末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH#1)，CH1结构域和第二重链可变结构域(VH#2)，
轻链，其从N-末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL#1)，CL结构域和第二轻链可变结构域(VL#2)，
其中所述重链和轻链排列成使得VH#1和VL#1形成第一抗原结合位点并且VH#2和VL#2形成第二抗原结合位点，
其中由第一抗原结合位点结合的抗原是人OX40，由第二抗原结合位点结合的抗原是人血清白蛋白，特别是
其中所述重链的第一可变结构域(VH#1)包含针对CDR-H1的SEQ ID NO：1中给出的序列，针对CDR-H2的SEQ ID NO：2中给出的序列和针对CDR-H3的SEQ ID NO：3中给出的序列，轻链的第一可变结构域(VL#1)包含针对CDR-L1的SEQ ID NO：4中给出的序列，针对CDR-L2的SEQ ID NO：5中给出的序列和针对CDR-L3的SEQ ID NO：6中给出的序列，
其中所述第二重链可变结构域(VH#2)具有SEQ ID NO：11中给出的序列，并且所述第二轻链可变结构域(VL#2)具有SEQ ID NO：12中给出的序列，并且所述第二重链可变区结构域(VH#2)和第二轻链可变结构域(VL#2)通过二硫键连接。
在一个实施方案中，在CH1结构域和第二重链可变结构域(VH#2)之间存在肽接头。在一个实施方案中，在CL结构域和第二轻链可变结构域(VL#1)之间存在肽接头。在一个实施方案中，第一重链可变结构域(VH#1)包含SEQ ID NO：8中给出的序列。在一个实施方案中，第一轻链可变域(VL#1)包含SEQ ID NO：7中给出的序列。在一个实施方案中，重链包含SEQ ID NO：15中给出的序列或由其组成。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO：16中给出的序列或由其组成。
因此，在一个实施方案中，提供了结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其具有包含SEQ ID NO：15中给出的序列的重链和包含SEQ ID NO：16中给出的序列的轻链。
在一个实施方案中，抗体分子如Fab-dsFv形式是在PCT/EP2014/074409或WO2014/019727(在此引入作为参考)中公开的抗体分子。
在另一个实施方案中，抗体分子是WO2013/068571(在此引入作为参考)中公开的Fab-scFv融合蛋白形式。
在另一个实施方案中，抗体分子是包含以下或由以下组成的多特异性抗体分子：
a)式(I)的多肽链：
VH-CH1-X-V1；和
b)式(II)的多肽链：
VL-CL-Y-V2；
其中：
VH代表重链可变结构域；
CH1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；
X代表键或接头；
Y代表键或接头；
V1代表dsFv，sdAb，scFv或dsscFv；
VL代表轻链可变结构域；
CL代表来自轻链恒定区的结构域，例如Cκ；
V2代表dsFv，sdAb，scFv或dsscFv；
其中V1或V2中的至少一个是在WO2015/197772(在此引入作为参考)中描述的dsFv或dsscFv。
在一个具体实施方案中，抗体分子是WO2015/197772(在此引入作为参考)中所述的Fab-2x dsscFv形式的多特异性抗体分子。
在另一个具体的实施方案中，Fab-2x dsscFv形式的多特异性抗体分子是三价抗体，即每个Fv结合不同的表位。
在另一个具体实施方案中，多特异性抗体分子具有如WO2015/197772(在此引入作为参考)中所述的Fab-dsscFv-dsFv形式。
根据本发明的方法可以制备的抗体可以通过培养用一种或多种编码重组抗体的表达载体转染的真核宿主细胞来产生。真核宿主细胞优选是哺乳动物细胞，更优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
哺乳动物细胞可在支持其生长和表达抗体的任何培养基中培养，优选培养基为化学成分确定的培养基，其不含动物衍生产物如动物血清和蛋白胨。本领域技术人员可获得不同的细胞培养基，其包含以适当浓度存在的维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲剂、核苷、葡萄糖或等同能量来源的不同组合，以实现细胞生长和蛋白质生产。在本领域技术人员已知的细胞培养周期中的不同时间，可以在细胞培养基中以适当的浓度包含额外的细胞培养基组分。
哺乳动物细胞培养可以在任何合适的容器中进行，例如摇瓶或生物反应器，其可以根据所需生产规模以补料分批模式运行或可以不这样运行。这些生物反应器可以是搅拌罐式或气升式反应器。可获得的各种大规模生物反应器的容量可以超过1,000L至50,000L，优选5,000L至20,000L，或至10,000L。或者，也可以使用更小规模如2L至100L的生物反应器以根据本发明的方法制造抗体。
可根据本发明的方法制备的抗体或其抗原结合片段通常存在于哺乳动物宿主细胞培养物(典型地为CHO细胞培养物)的上清液中。对于其中感兴趣的蛋白质如抗体或其抗原结合片段被分泌在上清液中的CHO培养过程，所述上清液通过本领域已知的方法典型地通过离心来收集。
因此，在本发明的具体实施方案中，所述方法包括在蛋白质纯化之前进行离心和上清液回收的步骤。在另一个具体的实施方案中，所述离心是连续离心。为了避免疑问，上清液指位于由细胞培养物的离心产生的沉淀细胞上方的液体。
或者，可以使用本领域技术人员已知的澄清技术例如深度过滤来回收所述上清液。因此，在本发明的具体实施方案中，该方法包括在蛋白质纯化之前进行深度过滤和上清液回收的步骤。
或者，宿主细胞是原核细胞，优选革兰氏阴性细菌。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌细胞。用于蛋白质表达的原核宿主细胞是本领域所熟知的(Terpe,K.(2006).Overviewof bacterial expression systems for heterologous protein production:frommolecular and biochemical fundamentals to commercial systems.Appl MicrobiolBiotechnol 72,211-222.)。宿主细胞是经遗传工程改造以产生感兴趣的蛋白质(例如抗体片段)的重组细胞。重组大肠杆菌宿主细胞可以来源于任何合适的大肠杆菌菌株，包括MC4100，TG1，TG2，DHB4，DH5α，DH1，BL21，K12，XL1Blue和JM109。一个例子是用于重组蛋白质发酵的常用宿主菌株大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)。也可以通过培养修饰的大肠杆菌菌株(例如代谢突变体或蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株，例如WO2011/086136、WO2011/086138或WI2011/086139(其通过引用并入本文)中所述的那些)产生抗体片段。
可根据本发明的方法纯化的抗体通常存在于大肠杆菌宿主细胞的周质中或宿主细胞培养上清液中，这取决于蛋白质的性质、生产规模和使用的大肠杆菌菌株。将蛋白质靶向至这些区室的方法在本领域中是众所周知的(Makrides,S.C.(1996).Strategies forachieving high-level expression of genes in Escherichia coli.Microbiol Rev60,512-538.)。将蛋白导向至大肠杆菌周质的合适信号序列的实例包括大肠杆菌PhoA，OmpA，OmpT，LamB和OmpF信号序列。蛋白质可以通过依赖于天然分泌途径或通过诱导外膜的有限泄漏以引起蛋白质分泌来靶向至上清液，其实例是使用pelB前导序列、蛋白A前导序列，共表达细菌素释放蛋白、丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白以及向培养基中加入甘氨酸以及共表达kil基因用于膜透化。最优选地，在本发明的方法中，重组蛋白在宿主大肠杆菌的周质中表达。
重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以处于诱导型***的控制之下，由此重组抗体在大肠杆菌中的表达处于诱导型启动子的控制之下。适用于大肠杆菌的许多诱导型启动子是本领域众所周知的，并且取决于启动子，重组蛋白质的表达可以通过改变因素如温度或生长培养基中特定物质的浓度来诱导。诱导型启动子的实例包括可用乳糖或不可水解的乳糖类似物异丙基-b-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导的大肠杆菌lac、tac和trc启动子以及分别由磷酸盐、色氨酸和L-***糖诱导的phoA、trp和araBAD启动子。表达可以通过例如添加诱导剂或在诱导是温度依赖性时通过温度变化来诱导。在通过向培养物中加入诱导剂来实现诱导重组蛋白表达的情况下，可以通过取决于发酵***和诱导剂的任何合适的方法来添加诱导剂，例如通过单次或多次一次性加入(shot addition)或通过饲料逐步添加诱导剂。应该理解的是，在诱导剂的添加和蛋白质表达的实际诱导之间可能存在延迟，例如在诱导剂是乳糖的情况下，在乳糖之前利用任何预先存在的碳源时在诱导蛋白质表达之前可能存在延迟。
大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)可以在任何培养基中培养，所述培养基将支持大肠杆菌的生长和重组蛋白质的表达。培养基可以是任何化学成分确定的培养基，例如，Durany O,等人(2004).Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli.Process Biochem 39,1677-1684中描述的。
大肠杆菌宿主细胞的培养可根据所需生产规模在任何合适的容器如摇瓶或发酵罐中进行。可获得的各种大规模发酵罐的容量可超过1,000升至100,000升。优选使用1,000至50,000升的发酵罐，更优选1,000至25,000、20,000、15,000、12,000或10,000升。也可以使用0.5-1000升的容量的较小规模的发酵罐。
大肠杆菌的发酵可以在任何合适的***中进行，例如连续、分批或补料分批模式，这取决于蛋白质和所需的产率。分批模式可以在需要的时候使用营养物或诱导剂的一次性添加。或者，可以使用补料分批培养，并且培养物以最大比生长速率在诱导前以分批模式生长，所述最大比生长速率可以使用最初存在于发酵罐中的营养物和一种或多种用于控制生长速率的营养物补料方案维持直到发酵完成。补料分批模式也可用于诱导前控制大肠杆菌宿主细胞的代谢，并允许达到更高的细胞密度。
如果需要，宿主细胞可以从发酵培养基中收集，例如，可以通过离心、过滤或浓缩从样品收集宿主细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括在提取蛋白质之前进行离心和细胞回收的步骤。
对于在宿主细胞的周质空间中发现感兴趣的蛋白如抗体片段的大肠杆菌发酵过程，需要从宿主细胞释放蛋白质。释放可以通过任何合适的方法来实现，例如通过机械或压力处理、冻融处理、渗透压冲击、提取剂或热处理的细胞裂解。这种用于蛋白质释放的提取方法在本领域是公知的。因此在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括在蛋白质纯化之前的额外的蛋白质提取步骤。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法还包括从细胞培养基中回收宿主细胞，使用蛋白质提取步骤收获蛋白质，回收蛋白质提取步骤产生的含蛋白质的混合物，并从混合物中纯化所述蛋白质，其中所述纯化包含至少一个蛋白A色谱步骤。
在一个具体的实施方案中，提取步骤包括向样品中加入提取缓冲液并回收得到的蛋白质。优选地，提取步骤在合适的时间和合适的温度下进行，以允许回收处于其天然构象的蛋白质，并对每种特定的蛋白质根据经验进行优化。在本发明的具体实施方案中，所述提取步骤在25℃至35℃，27℃至33℃，优选29℃至31℃下进行。蛋白质提取步骤进行一段时间，并且根据所使用的特定蛋白质和温度根据经验优化该时间段。在一个具体的实施方案中，所述提取步骤进行4至20小时，6至18小时，优选8至12小时。在一个具体的实施方案中，蛋白质提取步骤在29℃至31℃下进行8至12小时，优选在30℃进行11小时。
在另一个实施方案中，将提取缓冲液加入到样品中，然后将样品进行热处理步骤。热处理步骤优选是如在US5,665,866(在此引入作为参考)中详细描述的。
在提取步骤之后，含有感兴趣的蛋白质如抗体的混合物可以进行离心和/或过滤步骤。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法可以包括在提取步骤之后和从所述混合物中纯化蛋白质之前调节含有感兴趣的蛋白质的混合物的pH的步骤。
如本文所用的术语“抗体”或“多种/个抗体”是指单克隆或多克隆抗体。本文使用的术语“抗体”或“多种/个抗体”包括但不限于由本领域已知的重组技术产生的重组抗体。“抗体”或“多种/个抗体”包括任何物种特别是哺乳动物物种的抗体，包括具有两条基本完整的重链和两条基本上完整的轻链的抗体，任何同种型的人抗体，包括IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgG4,IgE，和作为该基本结构的二聚体产生的抗体，包括IgA1,IgA2，或五聚体，如IgM及其修饰变体，非人灵长类抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴的抗体，啮齿动物抗体，例如来自小鼠或大鼠的抗体；兔抗体，山羊或马抗体和骆驼类动物抗体(例如来自骆驼或美洲驼(例如NanobodiesTM))及其衍生物，或鸟类物种的抗体如鸡抗体或鱼类物种的抗体如鲨鱼抗体。术语“抗体”或“多种/个抗体”也指“嵌合”抗体，其中至少一个重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，并且重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，如狒狒，恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类动物化”抗体。“人源化”抗体是含有衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是具有所需的特异性、亲和性和活性的人抗体(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(如小鼠，大鼠，兔，鸡或非人灵长类动物)的高变区(或互补决定区(CDR))(供体抗体)的残基取代。在大多数情况下，CDR外的人(受体)抗体残基(即在框架区(FR)中)另外被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化降低了人体中非人抗体的免疫原性，从而促进抗体在治疗人类疾病中的应用。人源化抗体和生成它们的几种不同的技术在本领域是众所周知的。术语“抗体”或“多种/个抗体”也指人抗体，其可以作为人源化的替代物产生。例如，有可能产生在不产生内源性鼠抗体的情况下能够在免疫后产生完整人抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。人类种系免疫球蛋白基因阵列在这种种系突变小鼠中的转移将导致在用所述抗原免疫携带人种系免疫球蛋白基因的转基因动物时产生对特定抗原具有特异性的人类抗体。用于生产这种转基因动物的技术和从这种转基因动物分离和生产人抗体的技术是本领域已知的。或者，在转基因动物例如小鼠中，只有编码小鼠抗体可变区的免疫球蛋白基因被相应的人可变免疫球蛋白基因序列置换。编码抗体恒定区的小鼠种系免疫球蛋白基因保持不变。以这种方式，转基因小鼠的免疫***中的抗体效应子功能以及因此B细胞发育基本上不变，这可能导致体内抗原攻击后抗体应答的改善。一旦从这样的转基因动物中分离出了编码感兴趣的特定抗体的基因，编码恒定区的基因就可以用人恒定区基因置换，以获得完全人抗体。体外获得人抗体的其它方法基于展示技术，例如噬菌体展示技术或核糖体展示技术，其中使用重组DNA文库，其至少部分由人工产生或从供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中产生。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术在本领域中是公知的。人抗体也可以从分离的人B细胞产生，所述分离的人B细胞用感兴趣的抗原体外免疫，随后融合以产生杂交瘤，然后对杂交瘤筛选最佳的人抗体。如本文所用，术语“抗体”或“多种/个抗体”也指非糖基化抗体。
待用于本发明任何实施方案中的抗体分子包括抗体片段，如Fab，Fab’，F(ab’)2和Fv和scFv片段；以及双链抗体，包括形式例如(双特异性T细胞衔接物)和DARTsTM(双重亲和重新靶向技术)，三链抗体，四链抗体，微抗体，结构域抗体(dAb)如sdAb，VHH和VNAR片段，由抗体片段或抗体形成的单链抗体、双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv，Fab-scFv，Fab(Fv)2或Fab-(scFv)2构建体。如上定义的抗体片段是本领域已知的。为了清楚起见，Fab-Fv应理解为指包含以任何顺序连接的一个Fv区和一个Fab区的构建体，即Fab-Fv或Fv-Fab，其中在一个区中的最后一个氨基酸之后是下一个区中的第一个氨基酸，反之亦然。类似地，Fab-scFv应被理解为指包含以任何顺序连接的一个scFv区和一个Fab区(在Fab的情况下连接至任一多肽链)的构建体，即Fab-scFv或scFv-Fab，其中一个区中的最后一个氨基酸之后是下一个区中的第一个氨基酸，反之亦然。以相同的方式，Fab(Fv)2应理解为指包含以任何顺序连接的两个Fv区和一个Fab区的构建体，即Fab-Fv-Fv，Fv-Fab-Fv或Fv-Fv-Fab，其中一个区中的最后一个氨基酸之后是下一个区中的第一个氨基酸，反之亦然。类似地，Fab-(scFv)2应被理解为指包含以任意顺序连接的两个scFv区和一个Fab区(在Fab的情况下连接至任一多肽链)的构建体，产生20种可能的排列。
通常，这些构建体在第一区(例如Fab)和第二区(例如Fv)之间包含肽接头。这样的接头在本领域中是众所周知的，并且可以是一种或多种氨基酸，通常由技术人员在长度和组成上优化。或者，所述区可以直接连接，即不含肽接头。
WO2013/068571和WO2014/096390(通过引用并入)中描述了用于将可变结构域连接至Fab或Fab’的合适接头区的实例，其包括但不限于柔性接头序列和刚性接头序列。柔性接头序列包括Huston等人,1988,10PNAS 85:5879-5883；Wright&Deonarain,Mol.Immunol.,2007,44(11):2860-2869；Alfthan等人,Prot.Eng.,1995,8(7):725-731；Luo等人,J.Biochem.,1995,118(4):825-831；Tang等人,1996,J.Biol.Chern.271(26):15682-15686；和Turner等人,1997,JIMM 205,42-54中公开的那些。
如本文所用，术语“VH3结构域”是指免疫球蛋白的人重链可变区的框架亚组3。基于DNA序列和蛋白质同源性，抗体的重链可变结构域被分类为不同的亚家族(VH1至VH6)(Walter等人Am.J.Hum.Genet.42:446-451,1988,Analysis for genetic variationreveals human immunoglobulin VH-region gene organization；Schroeder等人IntImmunol.1990；2(1):41-50,Structure and evolution of mammalian VH families)。
如本文所用，术语“Fc区”是指天然抗体的Fc区，其是缺乏恒定重链结构域1(CH1)的恒定区二聚体。如本领域已知的，抗体的Fc区是天然抗体用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化后回收的可结晶片段(Fc)。
如本文所用，“不含Fc区”的抗体是指不含天然恒定重链结构域2(CH 2)、天然恒定重链结构域3(CH 3)和天然恒定重链结构域4(CH 4)区的抗体。
先前已经在本领域中描述了负责结合蛋白A的Fc区中的残基(Nagaoka等人Singleamino acid substitution in the mouse IgG1 Fc region induces drasticenhancement of the affinity to protein A,PEDS Vol.16,Issue 4,pages 243-245)。因此，技术人员可以开发具有失去与蛋白A结合能力的Fc区的抗体，并且这样的抗体将适用于根据本发明的方法。
如本文所用，术语“多聚体”或“多聚体形式”是指由来自两个或更多个单体的结构域组成的抗体形式，其中所有结构域都被正确地折叠和配对。图12提供了多聚体的实例，其中不同的抗体分子被正确地折叠并且每个VH结构域与互补的VL结构域配对。为了清楚起见，应该理解，互补的VH-VL对协作地结合相同的抗原。
本文使用的术语“蛋白A”或“葡萄球菌蛋白A”是与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的大多数菌株的细胞壁共价连接的I型膜蛋白。它与来自各种物种的IgG(例如人，兔和豚鼠)具有高度亲和力，但与牛和小鼠只有弱相互作用。蛋白A通过两个不同的结合事件与抗体相互作用：人IgG1、IgG2和IgG4的Fc部分上的“经典”结合位点，以及含有VH3亚家族的重链的人IgG、IgM、IgA和IgE的Fab部分上发现的“替代”结合位点。报道最多的来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的分子量为约42,000Da。重组链球菌蛋白A由299个氨基酸组成，并且通过SDS-PAGE估计具有预测分子量33.8kDa。
蛋白A由三个区域组成：S，是在分泌过程中被处理的信号序列；五个同源IgG结合结构域E、D、A、B和C以及细胞壁锚定区XM。缺失区域X的截短蛋白质的分子量为约31kD。结构域独立地能够与IgG1、IgG2和IgG4的Fc部分结合，但仅显示与IgG3的弱相互作用。另外，所有的天然蛋白A结构域均显示可比较的Fab结合，其已被描述为由区域D和E介导。
如本文所用，术语“OX40”是指也被称为CD134、TNFRSF4、ACT35或TXGP1L的分子，其是TNF受体超家族的成员，其作为共刺激受体起作用，并且CD28和OX40的连续接合是最佳T细胞增殖和存活所需的。
当提及抗体时，术语“特异性结合”、“特异性结合至”给定的分子以及本文所用的等同物意指抗体将以足够的亲和力和特异性结合所述给定的分子以实现生物学有意义的效果。所选抗体通常对给定分子具有结合亲和力，例如，抗体可以以100nM至1pM的Kd值结合给定分子。抗体亲和力可以例如通过表面等离子体共振基础测定如BIAcore测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)和竞争测定(例如RIA)来确定。在本发明的含义内，与所述给定分子特异性结合的抗体也可以与另一分子结合；例如在双特异性抗体的情况下(作为非限制性实例)。
实施例
实施例1：A26Fab-645dsFv通过pH梯度洗脱的蛋白A纯化
A26Fab-645dsFv的大肠杆菌的表达、提取和澄清
在IPTG(异丙基-b-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导下，将A26Fab-645dsFv(与人OX40和血清白蛋白结合的抗体片段)在大肠杆菌W3110宿主细胞中表达为异源蛋白，将异源蛋白通过加入调节至pH 7.4的100mM Tris/10mM EDTA缓冲液和在30℃下的蛋白质提取步骤来从宿主细胞的周质空间释放。通过离心除去细胞材料，然后使用离心和0.22μm过滤的组合澄清含有异源蛋白质的细胞提取物。
通过pH梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白A纯化
将澄清的大肠杆菌提取物施加至天然蛋白A色谱柱-5ml HiTrap MabSelect(GEHealthcare)，在pH7.4的Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡。首先用PBS洗涤柱以去除未结合的材料，然后用pH 7.4至pH 2.1的pH梯度洗脱结合的材料。将洗脱物分馏，并使用TSK gel G3000SWXL SEC-HPLC(Tosoh Corporation)，通过SEC-HPLC(尺寸排阻色谱-高效液相色谱)进行分析。使用SEC-HPLC分析来确定每个级分中存在的％单体和多聚体。A26Fab-645dsFv单体的保留时间约为9分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构均显示低于9分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或高分子量物种(HMWS)。
在从蛋白A色谱柱洗脱期间，在整个pH梯度上观察到两个峰，见图1。与第二峰中多聚体物种的升高水平相比，在第一个峰中观察到单体的升高水平，参见表1和图2。
A26Fab-645dsFv缺少Fc，因此与蛋白A的结合是由于V区的人VH3可变框架亚类。提出多聚体物种的增加的结合是由于这些分子对蛋白A的亲合力增加所致。多聚体物种具有更多的VH3区，因此与蛋白-A树脂的结合更强，需要较低的pH进行洗脱。
表1：来自A26Fab-645dsFv通过pH梯度洗脱的蛋白A纯化的级分的SEC G3000分析
实施例2：通过pH梯度洗脱对Fc构建体进行蛋白A纯化
多聚体Fc的CHO表达和澄清
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达含有与人IgM尾部片段融合的来自人IgG1的Fc结构域(导致Fc装配成多聚体)的Fc构建体。使用Nuclefector(Lonza)按照制造商的说明用含有作为选择性标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。将培养物以分批模式保持在摇瓶培养中，14天后收获。
细胞培养上清液的澄清通过离心(4000x g，室温下60分钟)然后进行深度和无菌过滤来进行。
将澄清的细胞培养物上清液浓缩，并且使用蛋白A色谱柱(5ml HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)，在PBS pH 7.4中平衡)纯化所有含Fc的构建体。柱用PBS洗涤，并用pH 3.4的0.1M柠檬酸盐洗脱结合的材料。将洗脱的材料缓冲液交换到pH 7.4的PBS中。
将纯化的Fc构建体施加至天然蛋白A色谱柱-5ml HiTrap MabSelect(GEHealthcare)，其在PBS pH 7.4中平衡。首先用PBS洗涤柱以去除未结合的材料，然后用pH7.4至pH2.1的pH梯度洗脱结合的材料，参见图3。将洗脱的材料分馏并通过SEC-HPLC(G3000SEC-HPLC,Tosoh Corporation)分析。使用SEC-HPLC分析来确定每个级分中存在的％单体和多聚体Fc。Fc单体具有约9.3分钟的保留时间。三聚体、六聚体和更高阶的结构的保留时间都低于9.4分钟，并且其统称为多聚体物种或高分子量物种(HMWS)，见表2和图4。
表2：来自多聚Fc通过pH梯度洗脱的蛋白A纯化的级分的G3000 SEC分析
Fc构建体作为单峰洗脱，在向上和向下的拐折处具有微小的肩部。然而，通过SEC-HPLC分析级分显示分子的单体和多聚体形式被平行洗脱，参见表2和图4。在整个梯度洗脱中没有观察到不同物种之间的分离。
Fc构建体的多聚体含有多个Fc区，但缺少可变区，因此缺乏通过人VH3结构域结合蛋白-A的可能性。单体和多聚体Fc构建体在梯度洗脱中从蛋白质-A柱共洗脱，表明树脂的Fc区亲合力不是针对洗脱的因素。因此，通过该技术不能有效分离单体和多聚体的含Fc区分子。这与实施例1和2相反，其中使用pH梯度从不含Fc区的含VH3结构域的抗体的蛋白-A的洗脱能够将单体与多聚体分离。
实施例3：通过pH阶梯洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白A纯化
A26Fab-645dsFv的CHO表达和澄清
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达结合人OX40和血清白蛋白的构建体。使用Nuclefector(Lonza)按照制造商的说明书用含有作为选择性标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体通过电穿孔转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。将培养物以分批模式保持在摇瓶培养中，14天后收获。
细胞培养上清液的澄清通过离心(4000x g，室温下60分钟)然后进行深度和无菌过滤来进行。
通过pH阶梯洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白A纯化
将澄清的细胞培养上清液施加至天然蛋白A色谱柱(5ml HiTrap MabSelect(GEHealthcare))，其在pH7.4的Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡。首先用PBS洗涤柱以去除未结合的材料，然后首先在pH3.8洗脱结合的材料，然后在pH3.0下进行第二洗脱步骤，参见图5。将洗脱的材料分馏并通过SEC-HPLC(G3000SEC-HPLC，Tosoh Corporation)和在还原和非还原条件下进行的4-20％Tris/甘氨酸SDS-PAGE进行分析。
使用SEC-HPLC分析确定每个级分中存在的％单体和多聚体。A26Fab-645dsFv单体的保留时间约为9分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构均具有低于9分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或更高分子量物种(HMWS)，参见图6和表3。
表3：来自A26Fab-645dsFv通过pH阶梯洗脱的蛋白A纯化的级分的G3000SEC分析
非还原性SDS-PAGE证实了洗脱峰中的上述单体和多聚体水平。A26Fab-645dsFv单体在97-66kDa之间迁移并且是泳道4中的主要带，对应于在pH3.8的洗脱，A26Fab-645dsFv多聚体作为120kDa以上的多条泳带迁移并且是泳道5中的大部分条带，对应于从pH3.0的洗脱回收的级分，参见图7。
还原性SDS-PAGE证实非还原性SDS-PAGE上的所有条带均与A26Fab-645dsFv有关，参见图8。
在pH 3.8的洗脱在2.8个柱体积中洗脱出单个峰，在向下的拐折处具有微小尾部。SEC-HPLC分析表明该峰含有单体形式的79％的A26Fab-645dsFv，大量的单体也通过非还原性SDS-PAGE分析证实。在pH 3.0的洗脱洗脱出单个峰。HPLC-SEC分析表明该峰为97％的多聚体形式的A26Fab-645dsFv，大量的多聚体也通过非还原性SDS-PAGE分析证实。
上述结果表明，通过VH3与蛋白A结合来有效分离单体与多聚体物种是可能的。这与前面实施例中所示的Fc结合蛋白-A相反。
实施例4：通过梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白-A(Amsphere)纯化
A26Fab-645dsFv的CHO表达和澄清
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达结合人OX40和血清白蛋白的构建体。使用Nuclefector(Lonza)，按照制造商的说明，用含有作为选择标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体通过电穿孔转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。将培养物以分批模式保持在摇瓶培养中，14天后收获。
细胞培养上清液的澄清通过离心(4000x g，室温下60分钟)然后进行深度和无菌过滤来进行。
通过pH梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白A纯化(Amsphere)
将澄清的上清液施加至Amsphere蛋白A色谱柱(5ml柱体积，10cm床高)，并在pH7.4的Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡。然后用PBS洗涤柱以除去未结合的材料，然后用pH6.0至pH2.1的pH梯度洗脱结合的材料。将洗脱的材料分馏并使用Acquity UPLC BEH450SEC 2.5μm柱通过SEC-UPLC(尺寸排阻色谱-超高效液相色谱)进行分析。使用SEC-UPLC分析来确定每个级分中存在的％单体和多聚体。A26Fab-645dsFv单体的保留时间约为2.2分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构都显示低于2.2分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或更高分子量物种(HMWS)。
在从Amsphere蛋白A色谱柱洗脱期间，在整个pH梯度上观察到两个峰，参见图9。与第二峰中多聚体物种的升高水平相比，在第一峰中观察到单体的升高水平，参见表5和图9。
A26Fab-645dsFv缺乏Fc，因此与Amsphere蛋白-A的结合是由于V区的人VH3可变框架亚类。提出多聚体物种的增加的结合是由于这些分子对蛋白A的亲合力增加所致。多聚体物种具有更多的VH3区，因此与蛋白-A树脂结合更强，从而需要较低的pH值进行洗脱。
表5：来自A26Fab-645dsFv通过pH梯度洗脱的Amsphere蛋白A纯化的级分的SEC分析
实施例5：通过梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白-A(NovaSep Absolute)纯化
A26Fab-645dsFv的CHO表达和澄清
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达结合人OX40和血清白蛋白的构建体。使用Nuclefector(Lonza)，按照制造商的说明，用含有作为选择标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体通过电穿孔转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。将培养物以分批模式保持在摇瓶培养中，14天后收获。
细胞培养上清液的澄清通过离心(4000x g，室温下60分钟)然后进行深度和无菌过滤来进行。
通过pH梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白A纯化(NovaSep Absolute)
将澄清的上清液施加至NovaSep Absolute蛋白A色谱柱(5ml柱体积，10cm床高)，并在pH7.4的Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡。首先用PBS洗涤柱以除去未结合的材料，然后用pH6.0至pH3.0的pH梯度洗脱结合的材料。将洗脱的材料分馏并使用AcquityUPLC BEH450 SEC 2.5μm柱通过SEC-UPLC进行分析。使用SEC-UPLC分析来确定每个级分中存在的％单体和多聚体。A26Fab-645dsFv单体的保留时间约为2.2分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构都显示低于2.2分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或更高分子量物种(HMWS)。
在从NovaSep Absolute蛋白A色谱柱洗脱期间，在整个pH梯度上观察到两个峰，参见图10。与第二峰中多聚体物种的升高水平相比，在第一个峰中观察到单体的升高水平，参见表6和图10。
A26Fab-645dsFv缺少Fc，因此与NovaSep Absolute蛋白A的结合是由于V区的人VH3可变框架亚类。提出多聚体物种的增加的结合是由于这些分子对蛋白A的亲合力增加所致。多聚体物种具有更多的VH3区，因此与蛋白-A树脂结合更强，从而需要较低的pH进行洗脱。
表6：来自A26Fab-645dsFv通过pH梯度洗脱的NovaSep Absolute蛋白A纯化的级分的SEC分析
实施例6：通过梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白-A(AcroSep)纯化
A26Fab-645dsFv的CHO表达和澄清
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达结合人OX40和血清白蛋白的构建体。使用Nuclefector(Lonza)，按照制造商的说明，用含有作为选择标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体通过电穿孔转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。将培养物以分批模式保持在摇瓶培养中，14天后收获。
细胞培养上清液的澄清通过离心(4000x g，室温下60分钟)然后进行深度和无菌过滤来进行。
通过pH梯度洗脱对A26Fab-645dsFv进行蛋白A纯化(AcroSep)
将澄清的上清液施加至AcroSep蛋白A色谱柱(1ml柱体积1.5cm床高)，其在Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中平衡。首先用PBS洗涤柱以除去未结合的材料，然后用pH6.0至pH3.0的pH梯度洗脱结合的材料。将洗脱的材料分馏并使用Acquity UPLCBEH450SEC 2.5μm柱通过SEC-UPLC进行分析。使用SEC-HPLC分析确定每个级分中存在的％单体和多聚体。A26Fab-645dsFv单体的保留时间约为2.2分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构都显示低于2.2分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或更高分子量物种(HMWS)。
在从AcroSep蛋白A色谱柱洗脱期间，在整个pH梯度上观察到单个宽洗脱峰，参见图11。分辨率降低可能是由于床高度降低，然而相比于在洗脱峰的向下拐折期间的多聚体物种的升高水平，在峰的向上拐折期间仍然观察到单体的升高水平，参见表7和图11。
A26Fab-645dsFv缺少Fc，因此与AcroSep Absolute蛋白-A的结合是由于V区的人VH3可变框架亚类。提出多聚体物种的增加的结合是由于这些分子对蛋白A的亲合力增加所致。多聚体物种具有更多的VH3区，因此与蛋白-A树脂结合更强，从而需要较低的pH进行洗脱。
表7：来自A26Fab-645dsFv通过pH梯度洗脱的AcroSep Absolute蛋白A纯化的级分的SEC分析
实施例7：通过pH梯度洗脱进行的蛋白-A纯化
通过pH梯度洗脱对进行蛋白A纯化
的CHO表达和澄清
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达如WO2015/197772中所述的Fab-2x dsscFv形式的多特异性三价抗体分子使用Nuclefector(Lonza)按照制造商的说明用含有作为选择性标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。表达在产生高细胞数目的内部专有的补料分批工艺中进行。
细胞培养上清液的澄清通过离心(4000x g，室温下60分钟)然后进行深度和无菌过滤来进行。将澄清的细胞培养上清液施加至在pH7.4的Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的5ml HiTrap MabSelect(GE Healthcare)。柱用PBS洗涤，并用PH7.4至pH2.1的pH梯度洗脱结合的材料，见图21。将洗脱的材料分馏并通过G3000SEC-HPLC和4-20％Tris/甘氨酸SDS-PAGE(还原性和非还原性)分析。使用SEC-HPLC分析来确定％单体和多聚体。单体的保留时间约为9.4分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构均具有<9.4分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或HMWS。对于SEC-HPLC分析，级分的色谱图见图22。
在pH梯度洗脱过程中观察到两个峰，其在向下拐折上具有肩部，参见图21。这三个级分通过SDS-PAGE分析，参见图23。在洗脱谱上，通过非还原性SDS-PAGE观察到几条带。单体在116-200kDa分子量带之间迁移。所有在单体上方迁移的条带已被统称为多聚体或HMWS。缺乏链间二硫键种类的轻链相关杂质和非二硫键合的重链和轻链在37-55kDa分子量标记之间迁移。级分1(泳道2)主要由单体和轻链相关物种组成，可见的HMWS很少或没有。单体是级分2中的主要带(泳道3)。尽管HMWS条带可见，但是水平显著降低至级分3(泳道4)中所见的水平。在还原性凝胶中，所有产物相关物种被还原至重链和轻链，在泳道3和泳道4中可看到非可还原物质的小条带。泳道2确认级分1对于轻链相关物种是重度富集的。
第一个峰(1)通过还原性SDS-PAGE被鉴定为轻链相关杂质，并且通过SEC-HPLC分析为含有2％HMWS。第二个峰(2)被鉴定为并且含有72％单体和22％HMWS，参见表8和图24。在峰2、级分3上的向下拐折被鉴定为并且包含6％单体和92％HMWS。
缺乏Fc，因此与蛋白-A的结合是由于v区的人VH3可变框架亚类。提出多聚体物种的增加的结合是由于这些分子对蛋白A的亲合力增加所致。多聚体物种具有更多的VH3区，因此与蛋白-A树脂结合更强，从而需要较低的pH进行洗脱。
表8来自通过pH梯度洗脱的蛋白A纯化的级分的G3000SEC分析
级分 蛋白质(mg) HMWS(％) 单体(％)
1 3.9 2.0 97.3
2 33.9 22.1 72.0
3 0.4 91.5 6.4
实施例8：通过pH梯度洗脱对BYbe进行蛋白-A纯化
BYbe的CHO表达和澄清
基本上如WO2013/068571的实施例4所述，使用不同的可变区序列构建Fab-scFv融合蛋白(Bybe)。构建体在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHODG44)中表达。使用Nuclefector(Lonza)按照制造商的说明用含有作为选择性标记的DHFR基因和编码产物的基因的质粒载体转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，和在DHFR抑制剂甲氨蝶呤存在下选择转染的细胞。在培养至摇瓶期后，评估生长和生产力，选择24个最高表达克隆用于在补料分批摇瓶过程中进行评估。在3L的摇瓶中用1L的培养物以0.3×106活细胞/mL的起始密度接种，并在5％CO2气氛中控制在36.8℃。从第3天至第12天添加营养补料，并且当浓度低于5.8g/L时，添加葡萄糖作为快速注射添加(bolus addition)。在第14天通过4000xg离心60分钟随后0.2μm过滤来收获培养物。
通过pH梯度洗脱对BYbe进行蛋白A纯化
将澄清的细胞培养上清液施加至在pH7.4的Sigma磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的4.7ml HiScreen MabSelect(GE Healthcare)柱。用PBS洗涤柱，接着用pH7.4的90％0.2M磷酸钠/10％柠檬酸洗涤柱，用pH7.4至pH2.1的pH梯度洗脱结合的材料，见图25。将洗脱的材料分馏并通过G3000SEC-HPLC和4-20％Tris/甘氨酸SDS-PAGE(还原性和未还原性)进行分析。使用SEC-HPLC分析来确定％单体和多聚体。BYbe单体的保留时间约为9.6分钟。二聚体，三聚体，四聚体和更高级结构均具有<9.6分钟的保留时间，并被统称为多聚体物种或HMWS。对于SEC-HPLC分析，级分的色谱图见图26。
在pH梯度洗脱过程中观察到单个峰，见图25。通过SDS-PAGE分析洗脱峰级分，参见图27。在洗脱谱上，通过非还原性SDS-PAGE观察到几条条带。单体迁移靠近98kDa分子量标记。在单体上方迁移的所有条带(在250kDa和98kDa分子量标记之间)被统称为多聚体或HMWS。非二硫键合的重链和轻链分别在50-64kDa和30kDa分子量标记上迁移。级分B9-B6(泳道6-9)主要由单体组成，可见的HMWS很少或没有。随着pH梯度变得更酸性，HMWS条带在级分B5-B3(泳道10-12)中增加/变得更强烈。在还原性凝胶中，所有产物相关物种被还原至重链和轻链。
洗脱峰被鉴定为BYbe，并且总体含有84％单体和16％HMWS，参见表9和图28。
BYbe缺少Fc，因此与蛋白-A的结合是由于v区的人VH3可变框架亚类。提出多聚体物种的增加的结合是由于这些分子对蛋白A的亲合力增加所致。多聚体物种具有更多的VH3区，因此更强烈地结合到蛋白质-A树脂，从而需要较低pH进行洗脱。
表5：来自BYbe通过pH梯度洗脱的蛋白A纯化的级分的G3000SEC分析
序列表
<110> UCB BIOPHARMA SPRL
<120> 蛋白质纯化方法
<130> PF0017 WO
<150> GB1506868.7
<151> 2015-04-22
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 1
Asn Tyr Gly Ile His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 2
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 3
Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 4
Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 5
Asn Ala Asn Thr Leu His Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<400> 6
Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab A26的LV区
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab A26的HV
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab组分的LC
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab组分HC
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白Fv组分的HC
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白Fv组分的LC
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 13
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A26 H(g4s, g4t, g4s)-645ds Fv(Gh5)
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
225 230 235 240
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp
275 280 285
Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro
325 330 335
Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser
355
<210> 16
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A26 Fab 轻链-(3xG4S)-645dsFv(gL4)
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val
225 230 235 240
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro
245 250 255
Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val
275 280 285
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
290 295 300
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly
305 310 315 320
Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val
325 330 335
Glu Ile Lys Arg Thr
340
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645gH1重链可变结构域
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
85 90 95
Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645gL1 轻链可变结构域
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A26 Fab 重链-( 3xG4S)-645dsFv(gH1)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
225 230 235 240
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp
275 280 285
Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr
325 330 335
Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
340 345 350
Val Ser Ser
355
<210> 20
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A26 Fab 轻链-(3xG4S)-645dsFv(gL1)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser
245 250 255
Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
260 265 270
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly
275 280 285
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
290 295 300
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly
305 310 315 320
Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys
325 330 335
Val Glu Ile Lys
340
<210> 21
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大肠杆菌OmpA前导序列的重链A26-645(gH5)
<400> 21
atgaagaaga ctgctatagc gatcgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60
gctgaagttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt 120
ctctcttgtg cagcaagcgg tttcacgttc accaactacg gtatccactg gattcgtcag 180
gcaccaggta aaggtctgga atgggtagcc tctatctctc cgtctggtgg tctgacgtac 240
taccgtgact ctgtcaaagg tcgtttcacc atctctcgtg atgacgcgaa aaactctccg 300
tacctgcaaa tgaactctct gcgtgcagaa gataccgcag tgtactactg cgctactggt 360
ggtgaaggta tcttcgacta ctggggtcag ggtaccctgg taactgtctc gagcgcttct 420
acaaagggcc caagcgtttt cccactggct ccgtcctcta aatccacctc tggtggtacg 480
gctgcactgg gttgcctggt gaaagactac ttcccagaac cagttaccgt gtcttggaac 540
tctggtgcac tgacctctgg tgttcacacc tttccagcag ttctccagtc ttctggtctg 600
tactccctgt ctagcgtggt taccgttccg tcttcttctc tgggtactca gacctacatc 660
tgcaacgtca accacaaacc gtccaacacc aaggtcgaca aaaaagtcga gccgaaatcc 720
tgtagtggag gtgggggctc aggtggaggc gggaccggtg gaggtggcag cgaggttcaa 780
ctgcttgagt ctggaggagg cctagtccag cctggaggga gcctgcgtct ctcttgtgca 840
gtaagcggca tcgacctgag caattacgcc atcaactggg tgagacaagc tccggggaag 900
tgtttagaat ggatcggtat aatatgggcc agtgggacga ccttttatgc tacatgggcg 960
aaaggaaggt ttacaattag ccgggacaat agcaaaaaca ccgtgtatct ccaaatgaac 1020
tccttgcgag cagaggacac ggcggtgtac tattgtgctc gcactgtccc aggttatagc 1080
actgcaccct acttcgatct gtggggacaa gggaccctgg tgactgtttc aagttaa 1137
<210> 22
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链A26-645(gH5)
<400> 22
gaagttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60
tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120
ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180
cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240
ctgcaaatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300
gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcgag cgcttctaca 360
aagggcccaa gcgttttccc actggctccg tcctctaaat ccacctctgg tggtacggct 420
gcactgggtt gcctggtgaa agactacttc ccagaaccag ttaccgtgtc ttggaactct 480
ggtgcactga cctctggtgt tcacaccttt ccagcagttc tccagtcttc tggtctgtac 540
tccctgtcta gcgtggttac cgttccgtct tcttctctgg gtactcagac ctacatctgc 600
aacgtcaacc acaaaccgtc caacaccaag gtcgacaaaa aagtcgagcc gaaatcctgt 660
agtggaggtg ggggctcagg tggaggcggg accggtggag gtggcagcga ggttcaactg 720
cttgagtctg gaggaggcct agtccagcct ggagggagcc tgcgtctctc ttgtgcagta 780
agcggcatcg acctgagcaa ttacgccatc aactgggtga gacaagctcc ggggaagtgt 840
ttagaatgga tcggtataat atgggccagt gggacgacct tttatgctac atgggcgaaa 900
ggaaggttta caattagccg ggacaatagc aaaaacaccg tgtatctcca aatgaactcc 960
ttgcgagcag aggacacggc ggtgtactat tgtgctcgca ctgtcccagg ttatagcact 1020
gcaccctact tcgatctgtg gggacaaggg accctggtga ctgtttcaag ttaa 1074
<210> 23
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大肠杆菌OmpA前导序列的轻链A26-645(gL4)
<400> 23
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gcgttggctg gtttcgcgac cgttgcgcaa 60
gctgatatcc agatgaccca gagcccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120
actattacct gtcgtgcaac ccagagcatc tacaacgctc tggcttggta tcagcagaaa 180
ccgggtaaag cgccaaaact cctgatctac aacgcgaaca ctctgcatac tggtgttccg 240
tctcgtttct ctgcgtctgg ttctggtacg gactctactc tgaccatctc ctctctccag 300
ccggaagatt tcgcgaccta ctactgccag cagtactacg attacccact gacgtttggt 360
ggtggtacca aagttgagat caaacgtacg gttgcagctc catccgtctt catctttcca 420
ccgtctgacg aacagctcaa atctggtact gcttctgtcg tttgcctcct gaacaacttc 480
tatccgcgtg aagcgaaagt ccagtggaaa gtcgacaacg cactccagtc tggtaactct 540
caggaatctg tgaccgaaca ggactccaaa gactccacct actctctgtc tagcaccctg 600
actctgtcca aagcagacta cgagaaacac aaagtgtacg cttgcgaagt tacccatcag 660
ggtctgagct ctccggttac caaatccttt aatagagggg agtgtggtgg cggtggcagt 720
ggtggtggag gttccggagg tggcggttca gacatacaaa tgacccagag tccttcatcg 780
gtatccgcgt ccgttggcga tagggtgact attacatgtc aaagctctcc tagcgtctgg 840
agcaattttc tatcctggta tcaacagaaa ccggggaagg ctccaaaact tctgatttat 900
gaagcctcga aactcaccag tggagttccg tcaagattca gtggctctgg atcagggaca 960
gacttcacgt tgacaatcag ttcgctgcaa ccagaggact ttgcgaccta ctattgtggt 1020
ggaggttaca gtagcataag tgatacgaca tttgggtgcg gtactaaggt ggaaatcaaa 1080
cgtacctaa 1089
<210> 24
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链A26-645(gL4)
<400> 24
gatatccaga tgacccagag cccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60
attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120
ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcatactgg tgttccgtct 180
cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctccagccg 240
gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300
ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtt gcagctccat ccgtcttcat ctttccaccg 360
tctgacgaac agctcaaatc tggtactgct tctgtcgttt gcctcctgaa caacttctat 420
ccgcgtgaag cgaaagtcca gtggaaagtc gacaacgcac tccagtctgg taactctcag 480
gaatctgtga ccgaacagga ctccaaagac tccacctact ctctgtctag caccctgact 540
ctgtccaaag cagactacga gaaacacaaa gtgtacgctt gcgaagttac ccatcagggt 600
ctgagctctc cggttaccaa atcctttaat agaggggagt gtggtggcgg tggcagtggt 660
ggtggaggtt ccggaggtgg cggttcagac atacaaatga cccagagtcc ttcatcggta 720
tccgcgtccg ttggcgatag ggtgactatt acatgtcaaa gctctcctag cgtctggagc 780
aattttctat cctggtatca acagaaaccg gggaaggctc caaaacttct gatttatgaa 840
gcctcgaaac tcaccagtgg agttccgtca agattcagtg gctctggatc agggacagac 900
ttcacgttga caatcagttc gctgcaacca gaggactttg cgacctacta ttgtggtgga 960
ggttacagta gcataagtga tacgacattt gggtgcggta ctaaggtgga aatcaaacgt 1020
acctaa 1026
<210> 25
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含B72.3前导序列的重链A26-645(gH5)
<400> 25
atggaatggt cctgggtctt cctgtttttc ctttctgtca caaccggggt gcacagcgag 60
gtgcagctcg tcgagtctgg aggcgggctt gtccagcctg gagggagcct gcgtctctct 120
tgtgcagcaa gcggtttcac gttcaccaac tacggtatcc actggattcg tcaggcacca 180
ggtaaaggtc tggaatgggt agcctctatc tctccgtctg gtggtctgac gtactaccgt 240
gactctgtca aaggtcgttt caccatctct cgtgatgacg cgaaaaactc tccgtacctg 300
cagatgaact ctctgcgtgc agaagatacc gcagtgtact actgcgctac tggtggtgaa 360
ggtatcttcg actactgggg tcagggtacc ctggtaactg tctcaagcgc ttctacaaag 420
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctctgg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgttcc 720
ggaggtggcg gttccggagg tggcggtacc ggtggcggtg gatccgaagt ccagctgctt 780
gaatccggag gcggactcgt gcagcccgga ggcagtcttc gcttgtcctg cgctgtatct 840
ggaatcgacc tgagcaatta cgccatcaac tgggtgagac aggcacctgg gaaatgcctc 900
gaatggatcg gcattatatg ggctagtggg acgacctttt atgctacatg ggcgaagggt 960
agattcacaa tctcacggga taatagtaag aacacagtgt acctgcagat gaactccctg 1020
cgagcagagg ataccgccgt ttactattgt gctcgcactg tcccaggtta tagcactgca 1080
ccctactttg atctgtgggg gcagggcact ctggtcaccg tctcgagttg a 1131
<210> 26
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链A26-645(gH5)
<400> 26
gaggtgcagc tcgtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60
tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120
ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180
cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240
ctgcagatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300
gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcaag cgcttctaca 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc tggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
tccggaggtg gcggttccgg aggtggcggt accggtggcg gtggatccga agtccagctg 720
cttgaatccg gaggcggact cgtgcagccc ggaggcagtc ttcgcttgtc ctgcgctgta 780
tctggaatcg acctgagcaa ttacgccatc aactgggtga gacaggcacc tgggaaatgc 840
ctcgaatgga tcggcattat atgggctagt gggacgacct tttatgctac atgggcgaag 900
ggtagattca caatctcacg ggataatagt aagaacacag tgtacctgca gatgaactcc 960
ctgcgagcag aggataccgc cgtttactat tgtgctcgca ctgtcccagg ttatagcact 1020
gcaccctact ttgatctgtg ggggcagggc actctggtca ccgtctcgag ttga 1074
<210> 27
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含B72.3前导序列的轻链A26-645(gL4)
<400> 27
atgtcagttc ccacacaggt gctgggcctg cttctgttgt ggctcaccga tgctaggtgt 60
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 120
attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 180
ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 240
cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 300
gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 360
ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccccca 420
tctgatgagc agttgaagtc tggcactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cctagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc ttcaatccgg aaactcccag 540
gagagtgtca ctgagcagga ctcaaaggac tccacctata gccttagcag cacactgaca 600
ctgagcaagg ctgactacga gaaacacaag gtctacgcct gcgaagtgac acatcaaggc 660
ctgagctcac ccgtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc 720
ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta 780
agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc 840
aattttctat cctggtacca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa 900
gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac 960
tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga 1020
ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt 1080
acctga 1086
<210> 28
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链A26-645(gL4)
<400> 28
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60
attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120
ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 180
cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 240
gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300
ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccccca 360
tctgatgagc agttgaagtc tggcactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 420
cctagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc ttcaatccgg aaactcccag 480
gagagtgtca ctgagcagga ctcaaaggac tccacctata gccttagcag cacactgaca 540
ctgagcaagg ctgactacga gaaacacaag gtctacgcct gcgaagtgac acatcaaggc 600
ctgagctcac ccgtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc 660
ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta 720
agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc 780
aattttctat cctggtacca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa 840
gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac 900
tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga 960
ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt 1020
acctga 1026
<210> 29
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域 (无ds)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>抗白蛋白抗体的重链可变结构域 (ds)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域 (无ds)
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域 (ds)
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 33
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 789
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于白蛋白的645 gH5gL4
<400> 35
Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Thr
20 25 30
Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr
65 70 75 80
Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys
85 90 95
Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Cys
100 105 110
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Cys
130 135 140
Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Thr
145 150 155 160
Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala
165 170 175
Cys Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Ala
180 185 190
Gly Gly Thr Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr
195 200 205
Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly
225 230 235 240
Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys
245 250 255
Gly Thr Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys
260 265 270
Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Gly
275 280 285
Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr
290 295 300
Ala Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala
340 345 350
Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly
355 360 365
Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr
370 375 380
Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly
385 390 395 400
Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly
405 410 415
Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly
420 425 430
Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala
435 440 445
Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly
450 455 460
Cys Gly Thr Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly
465 470 475 480
Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr
485 490 495
Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Thr Thr Thr Gly
500 505 510
Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys
515 520 525
Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys
530 535 540
Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala
545 550 555 560
Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly
565 570 575
Gly Cys Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr
580 585 590
Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly
595 600 605
Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys
610 615 620
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala
625 630 635 640
Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys
645 650 655
Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys
660 665 670
Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr
675 680 685
Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys
690 695 700
Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Cys
705 710 715 720
Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala
725 730 735
Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala
740 745 750
Ala Cys Gly Thr Ala Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr
755 760 765
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys
770 775 780
Ala Thr Cys Ala Cys
785
<210> 36
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于白蛋白的645 gH5gL4
<400> 36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr His His His
245 250 255
His His His His His His His
260
<210> 37
<211> 789
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于白蛋白的645 gH5gL4ds
<400> 37
Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Thr
20 25 30
Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr
65 70 75 80
Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys
85 90 95
Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Cys
100 105 110
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala
115 120 125
Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Cys
130 135 140
Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Thr
145 150 155 160
Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala
165 170 175
Cys Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Ala
180 185 190
Gly Gly Thr Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr
195 200 205
Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly
225 230 235 240
Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys
245 250 255
Gly Thr Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys
260 265 270
Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Gly
275 280 285
Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr
290 295 300
Ala Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala
340 345 350
Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly
355 360 365
Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr
370 375 380
Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly
385 390 395 400
Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly
405 410 415
Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly
420 425 430
Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala
435 440 445
Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly
450 455 460
Cys Gly Thr Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly
465 470 475 480
Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr
485 490 495
Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Thr Thr Thr Gly
500 505 510
Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys
515 520 525
Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys
530 535 540
Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala
545 550 555 560
Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly
565 570 575
Gly Cys Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr
580 585 590
Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly
595 600 605
Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys
610 615 620
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala
625 630 635 640
Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys
645 650 655
Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys
660 665 670
Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr
675 680 685
Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys
690 695 700
Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Cys
705 710 715 720
Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala
725 730 735
Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala
740 745 750
Ala Cys Gly Thr Ala Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr
755 760 765
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys
770 775 780
Ala Thr Cys Ala Cys
785
<210> 38
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于白蛋白的645 gH5gL4ds
<400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr His His His
245 250 255
His His His His His His His
260

Claims (12)

1.一种获得单体形式的含人VH3结构域的抗体的方法，包括：
a)在允许所述抗体与蛋白A结合的条件下，将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，和
b)回收单体形式的含人VH3结构域的抗体，
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
2.一种制备含人VH3结构域的抗体的方法，包括：
a)在宿主细胞中表达所述抗体，
b)回收含有抗体、宿主细胞和其它污染物的混合物，
c)使用至少蛋白A色谱步骤纯化所述抗体，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，和
d)回收含人VH3的抗体，
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
3.一种将单体形式的含人VH3结构域的抗体与多聚体形式的该抗体分离的方法，包括：
a)将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，
b)允许所述抗体与蛋白A结合，
c)施加选择性破坏单体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液，
d)回收所得的洗脱液，和任选地
e)施加破坏多聚体形式的抗体的结合的第二洗脱缓冲液，并回收该第二洗脱液，
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
4.一种将单体形式的含人VH3结构域的抗体与多聚体形式的该抗体分离的方法，包括：
a)将包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物施加至蛋白A色谱材料，其中所述蛋白A包含结构域D和/或E，
b)允许多聚体形式的抗体的结合，
c)回收流通物中的单体形式的抗体，和任选地
d)施加选择性破坏多聚体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液，和
e)回收从d)获得的洗脱液；
其中所述含人VH3结构域的抗体不含有Fc区。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施加包含单体和多聚体形式的含人VH3结构域的抗体的混合物之后，将第一溶液添加至蛋白A色谱材料，使得未结合的材料被去除在溶液中。
6.根据权利要求1、2或5所述的方法，其中将洗脱缓冲液施加至蛋白A色谱材料，使得结合的抗体被释放。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于所施加的混合物，从蛋白A色谱回收的洗脱液相对于多聚体抗体富含单体抗体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白A是天然重组蛋白A。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中含VH3结构域的抗体选自Fab’，F(ab’)2，scFv，Fab-Fv，Fab-scFv，Fab-(scFv)2，Fab-(Fv)2，Fab-dsFv，双链抗体，三链抗体和四链抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含VH3结构域的抗体包含至少2个人VH3结构域。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含VH3结构域的抗体特异性结合OX40。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述含VH3结构域的抗体包含：
-分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中定义的重链CDR1，CDR2和CDR3；和
-分别如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所定义的轻链CDR1，CDR2和CDR3。
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