CN110337588B - 用于定量免疫组织化学的方法和*** - Google Patents

Abstract

提供了用于靶蛋白分子(包括分泌的靶蛋白分子)的定量免疫组织化学(IHC)的方法和***。该方法包含对样品引入:对该靶蛋白分子特异性的一级抗体；与二级抗体酶缀合的二级抗体,该二级抗体是对该一级抗体特异性的；与酪胺半抗原缀合的酪胺,其中该二级抗体酶催化该酪胺半抗原沉积至该样品上；与三级抗体酶缀合的三级抗体,该三级抗体是对该酪胺半抗原特异性的；和生色团,其中该三级抗体酶催化与该生色团的反应以使得该生色团可见。该生色团是使用显微术作为点状点可见的。

Description

用于定量免疫组织化学的方法和***

发明领域

本发明涉及免疫组织化学技术,更加具体地,用于定量免疫组织化学的方法和***。

发明背景

预后性和/或预测性蛋白质生物标志物的自动化检测中使用的当前技术依赖于阈数目的生物标志物分子(例如大于1个,1,000个,10,000个,等)来产生可见信号。因而,产生可见信号需要的蛋白质生物标志物分子的数目取决于所使用的检测技术的特征,主要是灵敏度和特异性。如此,当前技术不能检测或量化独个蛋白质分子。结果是,几乎所有已建立的预后性和/或预测性蛋白质生物标志物的临床评估限于使用二元分析:加与减,反映信号的存在或缺失。

本发明特征在于放大信号的方法。本发明有助于降低产生可见信号需要的分子的阈数目。令人惊讶地,如预期的,本发明的方法具有足够的特异性以产生点状点,与弥漫的信号或团迹形成对比。可以对点状点计数。在某些实施方案中,本发明的方法可应用于分泌的蛋白质。

在某些实施方案中,本发明可用于定量免疫组织化学的方法,其中点状点可代表独个靶分子且可计数。在某些实施方案中,本发明能够检测和分析分泌的蛋白质因子(或其它适宜的分泌因子,不限于蛋白质),而当前的技术并不对自细胞分泌的蛋白质产生可解读的信号。这些量化是经由产生点状点信号的放大***和生色团的增加而实现的。

不希望将本发明限于任何理论或机制,认为靶分子的信号和表达水平的量化可帮助为患者提供与产生二元(加或减)结果的传统方法相比另外的预后价值和/或预测价值。

本发明还容许多种靶分子的多路化信号,例如使用具有窄吸收光谱的可分解染料。

发明概述

本发明特征在于用于定量免疫组织化学的方法和***。例如,本发明利用能够产生点状点信号的一种高灵敏度放大***(例如酪胺-DIG,酪胺-NP)和特定生色团。

在某些实施方案中,本发明提供一种用于检测结合至独个靶蛋白生物标志物的独个分子(例如抗体)的技术。点状点信号的产生帮助实现靶蛋白生物标志物(例如蛋白质或其它靶分子,包括分泌的靶蛋白生物标志物)的检测,分析,和量化。

本发明提供用于放大样品中的靶分子的信号的方法(例如用于放大***固定,石蜡包埋(FFPE)组织样品中的靶分子的信号的方法)。方法可包含用去石蜡化试剂处理组织样品并用抗原修复试剂处理组织样品。方法可进一步包含用蛋白酶处理样品,例如在应用对靶蛋白生物标志物特异性的生物标志物特异性药剂之前。

在一些实施方案中,方法包含对样品应用:对靶蛋白生物标志物特异性的生物标志物特异性药剂；对生物标志物特异性药剂特异性的第二结合剂,其中第二结合剂是与二级酶缀合的；包含与酪胺半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中二级酶催化酪胺半抗原沉积至样品上(例如在第二结合剂的位置处)；对酪胺半抗原特异性的第三结合剂,其中第三结合剂是与三级酶缀合的；和可检测模块(例如生色团),其中三级酶催化与可检测模块(例如生色团)的反应以使得可检测模块(例如生色团)可见。可检测模块(例如生色团)可以是使用显微术(例如明视野显微术)作为点状点可见的。点状点可指示独个靶分子。

本发明还提供用于检测样品中的靶蛋白生物标志物的定量免疫组织化学(IHC)的方法。在某些实施方案中,本发明还提供用于检测独个靶分子的方法。在某些实施方案中,本发明还提供用于检测分泌的靶蛋白生物标志物的方法,等。在一些实施方案中,方法包含对样品应用:对靶蛋白生物标志物特异性的生物标志物特异性药剂；对生物标志物特异性药剂特异性的第二结合剂,其中第二结合剂是与二级酶缀合的；包含与酪胺半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中二级酶催化酪胺半抗原沉积至样品上(例如在第二结合剂的位置处)；对酪胺半抗原特异性的第三结合剂,其中第三结合剂是与三级酶缀合的；和可检测模块(例如生色团),其中三级酶催化与可检测模块(例如生色团)的反应以使得可检测模块(例如生色团)可见。可检测模块(例如生色团)可以是使用显微术作为点状点可见的。在一些实施方案中,显微术是明视野显微术。在某些实施方案中,点状点可指示独个靶分子。

在某些实施方案中,本发明还特征在于计算样品中的(或视野,感兴趣区域,等中的)独个靶分子的数目的方法。在某些实施方案中,点状点指示独个靶分子。如此,计算点状点的数目可代表样品中的(或样品的视野或感兴趣区域中的)独个靶分子的数目。

在一些实施方案中,样品是组织样品,例如***固定,石蜡包埋(FFPE)组织样品；然而,样品不限于FFPE组织样品。本文中描述了备选的样品组合物。

在一些实施方案中,靶生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,脂质,核酸,翻译后修饰(例如磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,其组合,等),等等,或其组合。

生物标志物特异性药剂可以是抗体或其片段,例如一级抗体。在一些实施方案中,一级抗体是天然的,未修饰的抗体。在一些实施方案中,一级抗体是单克隆的或多克隆的。第二结合剂可以是抗体或其片段,例如二级抗体。在一些实施方案中,二级抗体包含抗物种抗体,抗修饰抗体,或其组合。在一些实施方案中,二级抗体酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))。

本文中描述了酪胺半抗原的例子。在一些实施方案中,酪胺半抗原包含生物素,洋地黄毒苷(DIG),硝基吡唑(NP),苯并呋咱(BF),苯并二氮卓(BD),硝基肉桂酰胺(NCA),荧光素,二硝基苯基(DNP),等等,等。

第三结合剂可以是抗体或其片段。在一些实施方案中,第三结合剂包含三级抗体,例如单克隆抗体。

在一些实施方案中,可检测模块包含银或酪胺-罗丹明染料(例如罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明(TAMRA),磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101(德克萨斯红),或其组合,等),DAB,4-硝基苯基磷酸酯(pNPP),坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP),硝基蓝四唑(NBT),BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺(TMB),2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS),邻联茴香胺,4-氯萘酚(4-CN),硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),邻苯二胺(OPD),5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal),甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal),对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP),5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc),3-氨基-9-乙基咔唑(AEC),品红,碘硝基四唑

(INT),四唑

蓝,或四唑

紫。

在某些实施方案中,点状点可代表或指示独个靶生物标志物。可以对点状点(例如靶分子)计数以帮助确定样品中靶生物标志物的量。

本发明的方法可应用于其中能检测和区分两种或更多种靶分子(例如一种或多种靶生物标志物,一种或多种靶生物标志物和一种或多种分泌的靶生物标志物,等)的多路免疫组织化学(IHC)测定法。

在一些实施方案中,本发明的方法是自动化的,例如在自动化染色仪器或载片染色仪上实施。在一些实施方案中,本发明的方法是手动的。

本发明还特征在于一种自动化染色仪器,其包含调适成实施本发明的方法的***。自动化染色仪器可包含与处理器偶联的存储器,其中存储器保存在由处理器执行时引起自动化染色仪器实施本发明的方法的操作的计算机可读指令。本发明还特征在于一种自动化***,其包含载片固定器,免疫组织化学试剂,和分配器,用于实施本发明的方法。例如,分配器可调适成将免疫组织化学试剂分配至载片固定器中的载片上。

本发明还提供工作流方法,例如用于自患者的肿瘤加工和制备组织切片和应用本文中的定量IHC方法的方法。例如,方法可包含自患者的肿瘤制备组织切片,例如使用切片机对患者的肿瘤的FFPE组织样品切片并在载片上封固组织切片；依照本文中描述的方法(定量IHC)将组织切片针对靶生物标志物组织化学染色,其中靶生物标志物表现为点状点。例如,可将组织切片放置在自动化染色仪器中,自动化染色仪器出于将靶生物标志物染色为独个点状点的目的,自动将多种试剂分配至组织切片。或者,可将组织切片手动染色,使得靶生物标志物表现为独个点状点。在某些实施方案中,表现为点状点的靶生物标志物可代表独个靶生物标志物分子。

工作流方法可进一步包含采集染色后的组织切片的数字图像并鉴定染色后的组织切片中的感兴趣区域(ROI)。在某些实施方案中,量化ROI中的点状点。在某些实施方案中,对经量化的点状点(生物标志物)将预先确定的评分函数应用于经量化的点状点,例如在临床应用的情况中。

方法还可包含针对第二靶生物标志物染色,量化ROI中与靶生物标志物和第二靶生物标志物对应的点状点,并将预先确定的评分函数应用于经量化的点状点。

本文中描述的任何特征或特征组合包括在本发明的范围内,前提是任何此类组合中包括的特征并不互相矛盾,这自上下文,此说明书,和本领域普通技术人员的知识会是显而易见的。本发明的另外的优点和方面在下面的详述和所附权利要求中是显而易见的。

附图简述

图1(现有技术)显示例行检测技术的一个例子的示意图。(1)一级抗体(天然的,未修饰的抗体)结合组织中的蛋白质靶。(2)添加二级抗体(与HRP酶缀合的山羊抗小鼠和山羊抗家兔多克隆抗体的混合物)。(3)添加DAB生色团。

图2(现有技术)显示检测方法的一个例子的示意图。(1)一级抗体(天然的,未修饰的抗体)结合组织中的蛋白质靶。(2)添加二级抗体(与HQ半抗原缀合的山羊抗小鼠和山羊抗家兔多克隆抗体的混合物)。(3)添加三级抗体(与HRP酶缀合的抗HQ单克隆抗体)。(4)添加DAB生色团。

图3(现有技术)显示检测方法的一个例子的示意图。(1)一级抗体(天然的,未修饰的抗体)结合组织中的蛋白质靶。(2)添加二级抗体(与HQ半抗原缀合的山羊抗小鼠和山羊抗家兔多克隆抗体的混合物)。(3)添加三级抗体(与HRP酶缀合的抗HQ单克隆抗体)。(4)添加酪胺-HQ半抗原缀合物(半抗原放大步骤)。(5)添加四级抗体(与HRP酶缀合的抗HQ单克隆抗体)。(6)添加DAB生色团。

图4A显示本发明的检测方法的一个例子的示意图。(1)一级抗体(天然的,未修饰的抗体)结合组织中的蛋白质靶。(2)添加二级抗体(与HRP酶缀合的抗物种多克隆抗体,或抗修饰抗体,等)。(3)添加酪胺(DIG,NP,BF,NCA,BD,或DNP,等半抗原缀合物)(半抗原放大步骤)。(4)添加三级抗体(与HRP酶缀合的抗半抗原单克隆抗体)。(5)添加银或酪胺-罗丹明染料生色团。注意,本发明不限于上述步骤或试剂。

图4B显示本文中描述的方法的示意图。天然的或经修饰的(例如半抗原化的,带标签的)抗体(例如单克隆抗体)结合靶生物标志物。使用单克隆或多克隆二级抗体缀合物(例如HRP)来结合靶特异性结合剂(例如一级抗体)。添加酪胺缀合物。然后,抗体(例如单克隆抗体(例如单克隆HRP抗体))结合酪胺缀合物。不希望将本发明限于任何理论或机制,认为结合至一级抗体的一级HRP缀合物(例如二级抗体)越少需要的半抗原放大越高(例如与RNA探针检测相比)使得足够的二级HRP沉积驱动可见的生色团信号。

图5显示自来源(例如细胞)分泌的分泌蛋白的梯度的示意图。

图6显示使用IHC的传统方法(顶部小图)和本发明的方法,qIHC(底部小图),ZR75.1异种移植物中的HER2的免疫组织化学(IHC)的一个例子。注意与使用传统方法的弥漫染色相比,使用本发明的方法(qIHC)在低至中等表达水平的HER2观察到的点状点信号。

图7显示使用IHC的传统方法(顶部小图)和本发明的方法,qIHC(底部小图),反应性扁桃体中的干扰素γ(IFNγ)(一种分泌的蛋白质因子)的免疫组织化学(IHC)的一个例子。注意与使用传统方法的弥漫染色相比,使用本发明的方法(qIHC)观察到的IFNγ的点状点信号。这提示本发明的方法可用于分泌的靶分子。

图8显示用在本发明的方法中使用的酪胺-生色团实现的点状IHC信号的例子。

图9显示扁桃体组织中的Her2蛋白的多路检测,显示蛋白质分子(例如单个蛋白质分子)的检测。

图10显示扁桃体组织中的Her2蛋白的检测,证明测定法的特异性。左边小图显示对照样品而右边小图显示针对Her2染色的样品。

术语

除非另有解释,本文中使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的普通技术人员的普遍理解相同的含义。单数术语“一个”,“一种”,和“该”包括复数所指物,除非上下文另外清楚指明。类似地,词语“或”意图包括“和”,除非上下文另外清楚指明。“包含”意味着“包括”。这里“包含A或B”意味着“包括A”或“包括B”或“包括A和B”。

下文描述了对于实践和/或测试本公开的实施方案合适的方法和材料。此类方法和材料仅仅是例示性的而并非意图是限制性的。可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的其它方法和材料。例如,各种一般的和更加具体的参考书中描述了本公开所属领域公知的常规方法,包括例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(和到2000年的增刊)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley&Sons,1999；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1990；和Harlow and Lane,Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999,通过援引在本文中完整收录其公开内容。

出于所有目的通过援引完整收录本文中提到的所有出版物,专利申请,专利,和其它参考书。在抵触的情况中,会以本说明书(包括术语的解释)为准。

虽然可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实践或测试所公开的技术,但是下文描述了合适的方法和材料。材料,方法,和实例仅仅是例示性的而并非意图是限制性的。

为了便于查阅本公开的各种实施方案,提供了下面的具体术语的解释:

抗体:一种多肽,其至少包括轻链或重链免疫球蛋白可变区且特异性结合抗原(诸如HER2蛋白或ER蛋白)的表位。抗体包括单克隆抗体,多克隆抗体,或抗体的片段。可将抗体与可检测标记物(诸如酶,半抗原,等)缀合或以其它方式用其标记。

抗体片段:一种不同于完整抗体的分子,其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。

生物学样品:如本文中使用的,术语“生物学样品”指自能够接受测试生物标志物或靶分子的存在或缺失的受试者获得的任何材料。

生物标志物或靶分子:如本文中使用的,术语“生物标志物”或“靶分子”指在生物学样品中找到的可用于表征生物学样品或自其获得生物学样品的受试者的任何分子或分子组。例如,生物标志物可以是其存在,缺失,或相对丰度:是特定疾病状态特征性的；指示疾病的严重程度或疾病进展或消退的可能性；和/或预测病理学状况会响应特定治疗的分子或分子组。又例如,生物标志物可以是传染因子(诸如细菌,真菌,病毒,或其它微生物),或取代基分子或其分子组。

生物标志物特异性药剂:任何化合物或组合物,其以允许特异性检测样品中的生物标志物的方式结合生物标志物或生物标志物内的特定结构。例子包括:抗体和其抗原结合片段；和工程化特异性结合结构,包括ADNECTIN(基于第十FN3纤连蛋白的支架；Bristol-Myers-Squibb Co.),AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z域的支架；AffibodyAB,Solna,Sweden),AVIMER(基于域A/LDL受体的支架；Amgen,Thousand Oaks,CA),dAb(基于VH或VL抗体域的支架；GlaxoSmithKline PLC,Cambridge,UK),DARPin(基于锚蛋白重复蛋白的支架；Molecular Partners AG,Zürich,CH),ANTICALIN(基于脂笼蛋白的支架；Pieris AG,Freising,DE),NANOBODY(基于VHH(骆驼科动物Ig)的支架；Ablynx N/V,Ghent,BE),TRANS-BODY(基于运铁蛋白的支架；Pfizer Inc.,New York,NY),SMIP(EmergentBiosolutions,Inc.,Rockville,MD),和TETRANECTIN(基于C型凝集素域(CTLD)的支架,四连接素；Borean Pharma A/S,Aarhus,DK)(此类工程化特异性结合结构的描述的综述见Wurch et al.,Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to WholeAntibodies for Imaging and Therapy:Status on Discovery Research and ClinicalValidation,Current Pharmaceutical Biotechnology,Vol.9,pp.502-509(2008),通过援引收录其内容)；和如下融合蛋白,其至少包括能够特异性结合生物标志物的第一域(例如抗体的抗原结合片段或结合生物标志物的蛋白的靶结合部分)和调适成推动检测试剂结合融合蛋白的第二部分(例如生物素标记物,表位标签,Ig片段,等)。

细胞样品:如本文中使用的,术语“细胞样品”指为病理学,组织学,或细胞学解读取得的含有完整细胞的任何样品,诸如细胞培养物,体液样品或手术标本。

缀合物:指共价连接成更大构建物的两个或更多个分子。在一些实施方案中,缀合物包括与一个或多个其它分子(诸如一个或多个其它生物分子)共价连接的一个或多个生物分子(诸如肽,核酸,蛋白质,酶,糖,多糖,脂质,糖蛋白,和脂蛋白)。在其它实施方案中,缀合物包括与一个或多个可检测标记物(半抗原,酶和其组合)共价连接的一个或多个特异性结合分子(诸如抗体和核酸序列)。在其它实施方案中,缀合物包括与可检测标记物(半抗原,生色团模块)共价连接的一个或多个潜伏的反应性模块。

接触:容许两个或更多个模块之间的联合(特别是直接物理联合)的放置,例如以固体形式和/或以液体形式二者(例如放置生物学样品(诸如附着于载片的生物学样品)与组合物(诸如含有本文中公开的探针的溶液)接触)。

可检测标记物或可检测模块:一种分子或材料,其能产生指示在样品上沉积的可检测模块或标记物的存在和/或浓度(或样品中靶(诸如蛋白质或核酸)的存在和/或量)的可检测信号(诸如视觉,电,或其它信号)。可检测标记物是本领域普通技术人员公知的。

可通过任何已知的或仍有待发现的机制(包括光子(包括无线电频率/射频,微波频率,红外频率,可见频率和紫外频率光子)的吸收,发射和/或散射)来产生可检测信号。

当与特异性结合分子(例如抗体或核酸探针)缀合时,可使用可检测标记物来定位和/或量化特异性结合分子针对的靶。可直接或间接检测可检测标记物,而且可组合使用数种不同可检测标记物来检测一种或多种靶。例如,第一可检测标记物(诸如与对靶特异性的抗体缀合的半抗原)可通过使用与特异性结合第一可检测标记物的分子缀合的第二可检测标记物来间接检测。另外,可将可分开检测的多种可检测标记物与特异性结合不同靶的不同特异性结合分子缀合以提供能提供单份样品中的多种靶的检测的多路测定法。

可检测标记物或可检测模块包括但不限于显色的,发磷光的和/或发光的分子,将一种物质转变成另一种物质以提供可检测信号(诸如通过将无色物质转变成有色物质或反之,或通过产生沉淀物或提高样品浊度)的催化剂(诸如酶),可使用另外的可检测标记的抗体缀合物经由抗体-半抗原结合相互作用来检测的半抗原,和顺磁性和磁性分子或材料。可检测标记物的具体例子包括:酶,诸如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,酸性磷酸酶,葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸酶；纳米颗粒,诸如量子点(美国专利No.6,815,064,6,682,596和6,649,138,通过援引将其公开内容完整收入本文)；金属螯合物,诸如放射性或顺磁性金属离子(像Gd³⁺)的DOTA和DPTA螯合物；和脂质体,例如含有被捕获的分子的脂质体。在可检测标记物包括酶的情况中,与酶组合使用可检测底物(诸如生色团,或发光化合物)以产生可检测信号(广泛的此类化合物是可商购的,例如购自Life Technologies,Carlsbad,CA)。

在其它实施方案中,可检测模块是经由明视野显微术可检测的分子,诸如染料,包括二氨基联苯胺(DAB),4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL),四甲基罗丹明(DISCOVERY紫),N,N’-双羧基戊基-5,5’-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5),和罗丹明110(罗丹明)。

或者,可在金相检测方案中使用酶。在一些例子中,金相检测方法包括与水溶性金属离子和酶的无氧还活性底物组合使用酶,诸如碱性磷酸酶。酶将底物转变成有氧还活性的药剂,而且有氧还活性的药剂还原金属离子,使得它形成可检测沉淀物(参见例如美国专利No.7,642,064,7,632,652,通过援引将其公开内容完整收入本文)。在其它例子中,金相检测方法包括连同水溶性金属离子,氧化剂和还原剂一起使用酶氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶),再次形成可检测沉淀物(参见例如美国专利No.6,670,113,通过援引将其公开内容完整收入本文)。半抗原是可受到抗体结合的小分子。例示性半抗原包括二硝基苯基(DNP),生物素,洋地黄毒苷(DIG),和荧光素。另外的半抗原包括噁唑,吡唑,噻唑,硝基芳基,苯并呋喃,三萜,脲,硫脲,鱼藤酮类化合物,香豆素和环木脂体半抗原,诸如美国专利No.7,695,929中公开的那些,通过援引将其公开内容完整收入本文。

检测试剂:当与组织化学测定法(包括免疫组织化学和亲和组织化学)联合使用时,用于靠近结合至细胞样品中的生物标志物的生物标志物特异性药剂沉积染色剂的任何试剂。非限制性例子包括能够结合生物标志物特异性抗体的二级抗体；与此类二级抗体连接的酶；和能与此类酶反应以实现显色染色剂沉积的化学药品；等等。

半抗原:半抗原是一种分子,典型地是小分子,其能与抗体特异性结合,但是典型地实质性没有免疫原性,除了在与载体分子组合时。许多半抗原是已知的且频繁用于分析规程,诸如二硝基苯基,生物素,洋地黄毒苷,荧光素,罗丹明,或美国专利No.7,695,929中公开的那些,通过援引将其公开内容完整收入本文。本申请的受让人Ventana MedicalSystems,Inc.已经专门开发了其它半抗原,包括选自噁唑,吡唑,噻唑,硝基芳基,苯并呋喃,三萜,脲,硫脲,鱼藤酮类化合物,香豆素,环木脂体,和其组合的半抗原,半抗原的具体半抗原例子包括苯并呋咱,硝基苯基,4-(2-羟基苯基)-1H-苯并[b][1,4]二氮卓-2(3H)-酮,和3-羟基-2-喹喔啉脲。可将多个不同半抗原与聚合载体偶联的。此外,可使用接头(诸如NHS-PEG接头)将化合物(诸如半抗原)与另一分子偶联。

组织化学检测:一种过程,其牵涉以允许在组织样品的各结构之间的横截面相互关系的背景中显微术检测生物标志物或其它结构的方式用检测试剂标记组织样品中的生物标志物或其它结构。例子包括但不限于***固定,石蜡包埋组织切片的亲和组织化学(AHC),免疫组织化学(IHC),显色原位杂交(CISH),银原位杂交(SISH),和苏木精和伊红(H&E)染色。

组织化学(例如还见免疫组织化学(IHC)):一种方法,其通过检测靶分子与能检测的特异性结合剂(诸如抗体)的相互作用来确定样品中靶分子的存在或分布。例如,在允许抗体-抗原结合的条件下将样品与抗体(或其它结合剂,诸如抗体片段,等)接触。可借助与抗体缀合的可检测标记物(直接检测)或借助与特异性结合一级抗体的二级抗体缀合的可检测标记物(例如间接检测)来检测抗体-抗原结合。

免疫组织化学(IHC):一种技术,其利用抗体或其衍生物或其它蛋白质性质结合剂在显微镜下分析组织学组织。由于构成身体的不同类型的组织学组织的内在性质以及组织抗原的复杂性,IHC没有通用的“一码普适”染色方案。一般地,IHC染色的工作流可以是如下的:a.疏水性组织保护:在组织切片周围使用疏水性屏障线以防止在温育期间试剂自载片渗漏；b.封闭:用试剂处理组织切片以封闭非特异性染色的内源来源,诸如(i)酶,(ii)内源过氧化物酶,(iii)游离醛基团,(iv)免疫球蛋白,和能模拟特异性染色的其它无关分子；c.透化(这个步骤可根据需要来使用):将组织切片与透化缓冲液一起温育以推动抗体和其它染色试剂渗透入组织；d.与一级抗体(常常描述为一抗)一起温育:此温育可进行数小时(例如1-24小时),或是于室温或是在冷室中(例如于6-8℃),取决于抗体的亲和力和组织靶的丰度；e.用清洗缓冲液漂洗:此步骤可使用新鲜清洗缓冲液作为短,重复循环(例如3-5个循环的5-15分钟)进行；f.与二级抗体(可描述为二抗)一起温育:这可于室温进行数小时(例如1-2小时)；g.用清洗缓冲液漂洗:这是步骤“e”的重复；和h.与检测试剂一起温育,与用清洗缓冲液漂洗交错:这可以在适用时(例如在显色检测中)进行。本发明不限于这种IHC方案。

复染色是用容许看到组织切片的整个“景观”且充当用于检测组织靶的主要颜色的参照的染料将组织切片染色。此类染料能将细胞核,细胞膜,或整个细胞染色。染料的例子包括DAPI,其结合核DNA且发出强烈的蓝光；Hoechst蓝染色剂,其结合核DNA且发出强烈的蓝光；和碘化丙啶,其结合核DNA且发出强烈的红光。细胞内细胞骨架网络的复染色可使用与染料缀合的鬼笔环肽来进行。鬼笔环肽是一种毒素,其紧密结合细胞的细胞质中的肌动蛋白丝,然后变成在显微镜下清楚可见。

大多数显色IHC方案基于使用亲合素和生物素分子,因为简单抗原-抗体反应在许多情况中的检测灵敏度相当低。亲合素-生物素结合用来桥接抗原结合的抗体与检测试剂,容许放大染色信号。最频繁使用的基于生物素的技术包括经标记的SA-生物素(LSAB)和亲合素-生物素复合物(ABC)检测。还有不基于生物素的检测技术,其利用或是与酶标记物或是与含有多个拷贝的酶标记物的长聚合物直接缀合的一级抗体。

LSAB检测利用与生物素缀合的二级抗体,其连接抗原结合的一级抗体与与酶缀合的SA。LSAB检测中的第一步是将组织切片与一级抗体一起温育,继以与生物素化的二级抗体一起温育。之后,将与选定的酶(例如AP,HRP,等)缀合的SA添加至组织切片,继以添加适宜的酶底物。酶将底物转变成有色颗粒,在抗原定位位点处沉淀,然后可以在显微镜下观察到。LSAB技术可使用生物素化的一级抗体来缩短,消除对与生物素化的二级抗体一起温育的需要。

ABC检测中的初始步骤(与一级抗体和生物素化的二级抗体一起温育)与LSAB中的相同,但是接下来的步骤和试剂相当不同。首先混合亲合素和生物素化的酶并于室温一起温育约30分钟,然后添加至组织切片。在此温育期间,亲合素与生物素化的酶相互作用,形成与酶分子一起密集堆叠的大复合物—远远超出在LSAB检测技术中发现的浓度—这加强抗原检测的灵敏度。

非生物素检测技术已经获得普及,因为它们没有亲合素-生物素检测的限制,诸如不同类型的动物组织(包括肾,脑,和胎盘)中丰富的内源生物素所致非特异性背景染色。

在显色IHC中,组织复染色用来显现组织切片的整个布局和标记相同类型的细胞器。通常,进行复染色以标记细胞核,颜色不应与描绘感兴趣抗原的主要颜色相同。例如,如果主要颜色是红色(AEC生色团)或褐色(DAB生色团),那么可使用产生蓝色的苏木精或产生绿色的甲基绿将核染色。如果主要颜色是蓝色(BCIP/NBT生色团),那么可使用核坚固红染料将核复染色。在组织抗原定位在细胞核中的情况中,可缩短它们的复染色的持续时间以使它们勉强可见或甚至跳过以避免掩盖主要的IHC颜色。

AHC指亲和组织化学,其中生物标志物的检测牵涉使用对生物标志物具有亲和力的结合剂。例如,可通过基于碱性蛋白亲合素和聚阴离子肝素之间的静电吸引的AHC将肥大细胞染色。

多路,多路化:在期望时,本发明的实施方案容许检测同一样品中的多种靶,例如实质性同时地,或顺序地。

点状点:如本文中使用的,术语“点状点”指染色的点样外观,其中点与弥漫的染色可区分。弥漫的信号样式(例如典型的DAB信号样式)一般不产生能独个解析的信号。点状点还能彼此解析(例如计数)。例如,图6显示使用本发明的方法(qIHC)在低至中等表达水平的HER2时观察到的点状点信号(底部小图),与使用传统方法的弥漫染色(顶部小图)比较。点状点与弥漫的染色不同,因为弥漫的染色覆盖更大面积的组织样品。而且,点状点能独个计数。

样品和生物学样品:任何含有或假定含有生物标志物的组合物或正在测试特定生物标志物的存在或缺失的组合物。样品可包括纯化的或分开的细胞,组织,或血液的成分,例如DNA,RNA,蛋白质,无细胞部分,或细胞裂解物。样品可以是***固定,石蜡包埋(FFPE)组织样品,例如来自肿瘤或转移性损害,例如原发性肿瘤或转移性肿瘤。样品还可以来自先前冷冻的或新鲜的组织,或来自液体样品,例如血液或血液成分(血浆或血清),尿液,***,唾液,痰液,粘液,***,泪液,淋巴液,脑脊液,自拭子洗下的材料,等。样品还可以包括自个体获得的细胞的体外培养物的组分和成分,包括细胞系。还可以自直接自个体获得的样品部分加工样品,例如细胞裂解物或消减了红血球的血液。

切片:当作为名词使用时,适合于显微术分析的组织样品的薄片,典型地使用切片机切割。当作为动词使用时,生成组织样品的切片,典型地使用切片机。

连续切片:自组织样品依序切割的一系列切片任一。两张切片要认为是彼此的“连续切片”,它们并不必然需要是来自组织的相连切片,但是它们应当一般含有处于相同横截面关系的相同组织结构,使得能在组织学染色之后彼此匹配结构。

特异性结合:如本文中使用的,短语“特异性结合,”“与……特异性结合”,或“对……特异性的”指可测量和可再现的靶和特异性结合剂之间的相互作用,诸如结合,其在分子(包括生物学分子)的异质群体存在下确定靶的存在。例如,特异性结合靶的结合实体是比它结合其它靶以更大的亲和力,亲合力,更加容易,和/或以更长持续时间结合这种靶的抗体。在一个实施方案中,结合实体对无关靶的结合的程度小于抗体对靶的结合的约10％,如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,特异性结合靶的结合实体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在另一个实施方案中,特异性结合可包括但不要求专一结合。

特异性结合剂:如本文中使用的,术语“特异性结合剂”指能够特异性结合生物标志物或生物标志物内的特定结构的任何化合物或组合物。例子包括但不限于对特定核苷酸序列特异性的核酸探针；抗体和其抗原结合片段；和工程化特异性结合结构,包括ADNECTIN(基于第十FN3纤连蛋白的支架；Bristol-Myers-Squibb Co.),AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z域的支架；Affibody AB,Solna,Sweden),AVIMER(基于域A/LDL受体的支架；Amgen,Thousand Oaks,CA),dAb(基于VH或VL抗体域的支架；GlaxoSmithKline PLC,Cambridge,UK),DARPin(基于锚蛋白重复蛋白的支架；Molecular Partners AG,Zürich,CH),ANTICALIN(基于脂笼蛋白的支架；Pieris AG,Freising,DE),NANOBODY(基于VHH(骆驼科动物Ig)的支架；Ablynx N/V,Ghent,BE),TRANS-BODY(基于运铁蛋白的支架；PfizerInc.,New York,NY),SMIP(Emergent Biosolutions,Inc.,Rockville,MD),和TETRANECTIN(基于C型凝集素域(CTLD)的支架,四连接素；Borean Pharma A/S,Aarhus,DK)。此类工程化特异性结合结构的描述的综述见Wurch et al.,Development of Novel ProteinScaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy:Statuson Discovery Research and Clinical Validation,Current PharmaceuticalBiotechnology,Vol.9,pp.502-509(2008),通过援引收录其内容。

染色剂/染色:当作为名词使用时,术语“染色剂”指可用于显现细胞样品中的特定分子或结构进行显微术分析(包括明视野显微术,电子显微术,等等)的任何物质。当作为动词使用时,术语“染色”指导致染色剂在细胞样品上沉积的任何过程。

受试者:任何多细胞脊椎动物生物,诸如人或非人哺乳动物(例如兽医受试者)。

组织样品:如本文中使用的,术语“组织样品”指保留细胞之间在它们在自其获得样品的受试者内存在时的横截面空间关系的细胞样品。“组织样品”涵盖原代组织样品(即由受试者产生的细胞和组织)和异种移植物(即植入受试者中的外来细胞样品)二者。

发明详述

当前的IHC技术的例子在图1,图2,和图3中显示。图1中显示的例示性方法特征在于结合靶的一级抗体和结合一级抗体的带有HRP的二级抗体。使用DAB生色团。图2中显示的例示性方法特征在于结合靶的一级抗体和结合一级抗体的带有HQ半抗原的二级抗体。带有HRP的三级抗体结合二级抗体。使用DAB生色团。图3中显示的例示性方法特征在于结合靶的一级抗体和结合一级抗体的带有HQ半抗原的二级抗体。带有HRP的三级抗体结合二级抗体。添加酪胺-HQ半抗原缀合物,并添加带有HRP酶的四级抗体。使用DAB生色团。这些当前技术牵涉一般产生弥漫的染色的检测方案,如用DAB的例子。

在某些实施方案中,本发明特征在于用于定量免疫组织化学(qIHC)的方法和***,其容许量化一种或多种靶分子。例如,本文中的方法产生可见的点状点(其在某些实施方案中容许对独个分子(例如靶分子)计数),例如通过降低产生可见信号需要的分子的阈数目。例如,本发明利用产生点状点信号的高灵敏度放大***和生色团。在某些实施方案中,本发明提供用于检测结合至独个靶分子的独个抗体的技术。例如,图4A中显示的例示性方法特征在于结合靶的一级抗体和结合一级抗体的带有HRP的二级抗体。添加酪胺-半抗原缀合物(例如DIG,NP,BF,NCA,BD,或DNP,等半抗原缀合物)以及带有HRP的三级抗体。最后,添加银或酪胺-罗丹明染料生色团(或添加其它适宜的生色团)。图4B显示天然的或经修饰的(例如半抗原化的,带标签的)结合靶生物标志物的抗体(例如单克隆抗体)。使用单克隆或多克隆二级抗体缀合物(例如HRP)来结合靶特异性结合剂(例如一级抗体)。添加酪胺缀合物。然后抗体(例如单克隆抗体(例如HRP单克隆抗体))结合酪胺缀合物。不希望将本发明限于任何理论或机制,认为结合至一级抗体的一级HRP缀合物(例如二级抗体)越少需要的半抗原放大越高(例如与RNA探针检测相比)使得足够的二级HRP沉积驱动可见的生色团信号。本发明不限于上述步骤或试剂。本发明不限于单分子检测。

本发明还包括分泌的靶分子(例如分泌的蛋白质,等)的定量免疫组织化学(qIHC)和用于检测多种靶分子的定量免疫组织化学(qIHC),例如使用可分解的染料。图5显示自来源(例如细胞)分泌的分泌因子的一个例子。当前的技术并不对自细胞分泌的蛋白质产生可解读的信号。在一些实施方案中,本文中的方法提高信号的放大(导致靶表现为可见的点状点),而且这种信号放大容许检测分泌的因子。在某些实施方案中,本发明的方法检测分泌的因子,诸如分泌的蛋白质(或其它适宜的分泌的因子,不限于蛋白质)(还见图7)。在某些实施方案中,本发明的方法检测分泌的因子的扩散样式和/或梯度(例如自来源(例如细胞)而去的扩散样式和/或梯度)。

本发明的方法可应用于样品,诸如但不限于组织样品(例如来自患者或其他受试者的组织样品,诸如FFPE组织样品)。

所检测的靶分子可以是任何适宜的靶分子,诸如蛋白质,脂质,碳水化合物,翻译后修饰(包括但不限于磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,等等,等),等等,其组合,等,包括分泌的靶分子。

样品和样品制备

本发明的方法在本文中在粘附于载片的组织切片上模拟。组织切片可包含健康组织,患病组织,或其组合。组织切片可衍生自任何适宜的组织,例如皮肤,乳腺,头和/或颈,肺,上胃肠道(例如食道和胃),女性生殖***(例如子宫,输卵管,和卵巢),男性生殖***(例如***,睾丸,等),下胃肠道(例如结肠,直肠,和***),泌尿生殖道,外分泌,内分泌,肾,神经,淋巴细胞起源,血管组织,心脏组织,神经***组织,血液,骨,等等,或其组合。

在一些实施方案中,组织切片包含肿瘤或转移性损害。肿瘤可以是实体瘤,诸如癌瘤,淋巴瘤,或肉瘤。在一些实施方案中,肿瘤是皮肤,乳腺,头和/或颈,肺,上胃肠道(包括食道和胃),女性生殖***(包括子宫,输卵管,和卵巢肿瘤),下胃肠道(包括结肠,直肠,和***肿瘤),泌尿生殖道,外分泌,内分泌,肾,神经,或淋巴细胞起源的肿瘤。在一些实施方案中,组织切片衍生自具有黑素瘤,乳腺癌,卵巢癌,胰腺癌,头和颈癌,肺癌,食道癌,胃癌,结肠直肠癌(包括结肠,直肠,和***的癌症),***,尿路上皮癌,或淋巴瘤的受试者。

样品可来自先前冷冻的或新鲜的组织,或来自液体样品,例如血液或血液成分(血浆或血清),尿液,***,唾液,痰液,粘液,***,泪液,淋巴液,脑脊液,自拭子洗下的材料,等。在一些实施方案中,样品包含细胞(例如自个体获得的细胞)的体外培养物,包括细胞系。本发明不限于包含/构成组织切片的样品。在一些实施方案中,样品包含核酸,蛋白质,细菌,病毒,或任何其它测试因素。

可以以与组织化学染色相容的方式加工样品(例如组织切片),包括例如如下文描述的固定,在蜡基质(诸如石蜡)中包埋,和切片(诸如用切片机)。本公开不需要特定加工步骤,只要所获得的样品与本发明的方法相容,例如将样品针对感兴趣生物标志物组织化学染色。

一般地,通过固定和在介质中包埋组织来制备组织样品。在其它例子中,样品包括细胞悬浮液,它是作为固体支持物(诸如玻璃载片)上的单层制备的,例如通过将细胞涂抹或离心至固体支持物上。在别的例子中,可以在本文中公开的方法中使用新鲜的冷冻的(例如未固定的)组织切片。

固定样品的过程可以变化。固定组织样品将细胞和组织组分保存成尽可能接近活样状态且容许它们经历制备规程而没有显著变化。固定阻滞在细胞死亡时开始的自溶和细菌分解过程,而且稳定细胞和组织组分,因此它们经得起组织加工的后续阶段。

可通过任何合适的过程来固定组织,包括灌注或通过在固定剂中浸泡。固定剂可分类为交联剂(诸如醛,例如甲醛,多聚甲醛,和戊二醛,以及非醛交联剂),氧化剂(例如金属离子和复合物,诸如四氧化锇和铬酸),蛋白质变性剂(例如乙酸,甲醇,和乙醇),机制未知的固定剂(例如氯化汞,丙酮,和苦味酸),组合试剂(例如Carnoy氏固定剂,methacarn,Bouin氏液,B5固定剂,Rossman氏液,和Gendre氏液),微波,和混杂固定剂(例如排除体积固定和蒸气固定)。防腐剂中还可包括添加剂,诸如缓冲剂,洗涤剂,鞣酸,酚,金属盐(诸如氯化锌,硫酸锌,和锂盐),和镧。

在制备样品中最常用的固定剂是甲醛,一般以***溶液的形式(缓冲剂溶液中的4％甲醛,称作10％缓冲***)。在一个例子中,固定剂是10％中性缓冲***。

在一些例子中,使用包埋介质。包埋介质是组织和/或细胞在其中包埋以帮助保存它们用于将来分析的惰性材料。包埋还使得组织样品能够切成薄切片。包埋介质包括石蜡,火棉,OCTTM化合物,琼脂,塑料,或丙烯酸树脂。许多包埋介质是疏水性的；因此,可能需要在利用主要是亲水性的试剂的组织学或细胞学分析前去除惰性材料。术语去石蜡化或脱蜡在本文中广泛用于指自生物学样品部分或完全去除任何类型的包埋介质。例如,通过通行穿过有机溶剂(诸如甲苯,二甲苯,柠檬烯,或其它合适的溶剂)将石蜡包埋的组织切片脱蜡。

作为一个例子,组织样品可以是用于在自动化染色仪器上进行组织学检查的FFPE组织样品。在这种情况中,可将样品去石蜡化,例如用自动化IHC/ISH载片染色仪,使用适宜的去石蜡化液。随后,可将任何数目的物质连续应用于样品。物质可以是用于预处理,细胞裂解,变性,清洗,染色,等等。

抗原修复

在诱导蛋白质中的分子交联以外,延长的固定时间可能对许多抗原是有损害的。这可改变天然蛋白质构象,由此改变表位的正常结构。结果是感兴趣生物标志物可能被掩蔽,或在免疫组织化学期间对抗体不可及。在一些情况中,可使用揭露或抗原修复技术来克服固定的影响。可通过物理办法,化学办法,或二者的组合来实现抗原修复。修复抗原的方法的例子在Shi et al.(J Histochemistry&Cytochemistry,2011,59:13-32),D’Amico etal.(J Immunological Methods,2009,341:1-18),和McNicoll and Richmond(Histopathology,1998,32:97-103),以及美国专利No.9,506,928和美国专利No.6,544,798中讨论。例如,抗原修复技术包括蛋白酶消化(例如胰蛋白酶,DNA酶,蛋白酶K,胃蛋白酶,链霉蛋白酶,无花果蛋白酶,等),其帮助切割分子交联和容许表位恢复成它的正常构象)；超声诱导的表位修复(SIER)；和热诱导的表位修复(HIER),其牵涉将载片放置在各种组合物的加热溶液中,之后应用一级抗体(或之后将其它组合物应用于样品)。微波炉,高压锅,热水浴,高压灭菌器,自动化染色仪器是实现热的可能手段。HIER溶液可包括0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 6),0.1M EDTA(pH 9)(或其它钙螯合剂溶液),0.5M Tris碱缓冲液(pH10),0.05M甘氨酸-HCl缓冲液,1％高碘酸,各种浓度的脲,硫氰酸铅溶液,等。可通过改变加热时间,加热温度,和pH来获得各种程度的表位修复。

酪胺-生色团检测

酪胺信号放大(TSA)是一种已知的基于受到催化的报告物沉积(CARD)的方法。据此通过援引完整收录其公开内容,美国专利No.5,583,001公开一种用于检测或量化分析物的方法,其使用分析物依赖性酶活化***,依赖于受到催化的报告物沉积来放大报告物信号,通过使经标记的酚分子与酶反应来增强酶在CARD或TSA方法中的催化作用。虽然已知酪胺信号放大放大靶的可见性,但是它也与升高的背景染色(例如非特异性识别事件的放大)有关。

例如,围绕一个或多个靶的蛋白质的量可能不足。在检测以高水平存在的生物标志物时,或在检测多种生物标志物的共定位时,样品中基于酪胺的检测试剂可附着的蛋白质的量可能是限制性试剂。酪胺结合位点的不足可引起降低的反应速率,容许酪胺反应性分子自靶扩散开去,而且一般导致更弱的响应,原因在于更低数量的发信号缀合物靠近靶反应。

酪胺-生色团缀合物已经用于miRNA检测(参见美国专利申请No.2013/0260379和WO 2015/124738,据此通过援引将其公开内容完整收入本文)。例如,可通过用半抗原标记的探针来检测靶。然后使与酶缀合的抗半抗原抗体接触样品,使得抗体结合探针并连接酶与靶。酶催化酪胺-半抗原缀合物沉积。多个酪胺-半抗原缀合物靠近靶结合样品,如此实质性放大与靶有关的信号。然后使第二酶缀合的抗半抗原抗体接触样品并容许结合酪胺-半抗原缀合物。然后可使用第二酶催化酪胺-生色团缀合物沉积,例如银沉积(VentanaMedical Systems,Inc.,目录#:780-001),或期望的任何其它生色团。

令人惊讶的是酪胺放大方法(诸如那些用于检测mRNA的)可用于样品中的靶的组织化学检测。组织化学应用需要更多的靶(检测抗体代替mRNA的情况中的探针),其在正常情况下会与高水平的背景有关。先前关于基于酪胺的信号放大***的报告描述丰富的背景信号。令人惊讶地发现在本发明的方法中使用的基于酪胺的缀合物并不产生太多的背景。实际上,本发明的方法提供灵敏度(例如精确标记靶生物标志物的能力),均匀性(例如在样品上均匀分布信号,从而避免弥漫染色袋的能力),而且可提供数量的测量(例如经由使用点状点信号)。

在某些实施方案中,反应中酪胺缀合物的浓度(终浓度)是1至10μM(例如3μM)。在某些实施方案中,酪胺缀合物的终浓度是5至10μM(例如7μM)。在某些实施方案中,酪胺缀合物的终浓度是5至20μM(例如7μM)。在某些实施方案中,酪胺缀合物的终浓度是0.1至1.0μm。在某些实施方案中,酪胺缀合物的终浓度是10至25μm。在某些实施方案中,酪胺缀合物的终浓度大于10μM。在某些实施方案中,酪胺缀合物的终浓度大于20μM。

不希望将本发明限于任何理论或机制,认为多克隆抗体会产生脱靶结合且导致背景信号(由于它们内在的升高的结合除了预定抗原以外的物质的能力)。例如,RNA方法需要使用单克隆抗体检测经标记的探针。令人惊讶地发现对在本文中的方法中使用的多克隆抗体没有观察到这一点(多克隆抗体并不产生可检测的背景信号)。如此,在某些实施方案中,可使用多克隆抗体进行本文中的qIHC方法(用于检测靶特异性结合剂,例如一级抗体)。在某些实施方案中,使用单克隆抗体进行本文中的qIHC方法(用于检测靶特异性结合剂,例如一级抗体)。

组织化学标记,生物标志物特异性药剂,和检测***

一般地,生物标志物(靶)标记可通过使样品与生物标志物特异性试剂(例如抗体)在推动靶生物标志物和生物标志物特异性试剂之间的特异性结合的条件下接触来实现。然后使样品与一组与生物标志物特异性试剂相互作用的检测试剂接触以推动可检测模块密切靠近靶生物标志物沉积,由此产生定位于靶生物标志物的可检测信号。多种不同的用于检测的方案对于典型的免疫组织化学应用是可能的。

可商购的检测试剂或包含检测试剂的试剂盒的非限制性例子包括:VENTANAultraView检测***(与酶(包括HRP和AP)缀合的二级抗体)；Ventana iVIEW检测***(生物素化的抗物种二级抗体和链霉亲合素缀合的酶)；VENTANA OptiView检测***(OptiView)(与半抗原缀合的抗物种二级抗体和与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体)；VENTANA放大试剂盒(未缀合的二级抗体,其可以与任何前述VENTANA检测***一起使用以放大在一级抗体结合位点处沉积的酶的数目)；VENTANA OptiView放大***(与半抗原缀合的抗物种二级抗体,与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体,和与相同半抗原缀合的酪胺。

生物标志物染色的切片可任选另外用对比剂(诸如苏木精染色剂)染色以显现大分子结构,鉴定形态特征或形态相关区域,或是手动的或是自动的。复染色剂的非限制性例子包括显色核复染色剂,诸如苏木精(染色成蓝色至紫色),亚甲基蓝(染色成蓝色),甲苯胺蓝(将核染色成深蓝色且将多糖染色成粉色至红色),核坚固红(也称作Kernechtrot染料,染色成红色),和甲基绿(染色成绿色)；非核显色染色剂,诸如伊红(染色成粉色),等。

在本发明的方法中,将生物标志物特异性药剂应用于样品,其中生物标志物特异性药剂是对样品中的靶特异性的且结合样品中的靶。在一些实施方案中,生物标志物特异性药剂是包含抗体或抗体片段的一级抗体。一级抗体可以是天然的,未修饰的或其它适宜的抗体。在一些实施方案中,一级抗体是单克隆的。在一些实施方案中,一级抗体是多克隆的。

随后,将第二结合剂应用于样品,其中第二结合剂是对结合靶的生物标志物特异性药剂特异性的且结合结合至靶的生物标志物特异性药剂。在一些实施方案中,第二结合剂是包含抗体或其片段的二级抗体。第二结合剂(例如二级抗体)是与二级酶(例如二级抗体酶)缀合的。第二结合剂(例如二级抗体)是对生物标志物特异性药剂的特征特异性的:第二结合剂(例如二级抗体)可以是抗物种抗体,抗修饰抗体,等,或其组合。合适的酶是公知的且包括但不限于氧化还原酶,水解酶,和过氧化物酶。明确包括的具体的酶是辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP),酸性磷酸酶,葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶,β-葡糖醛酸糖苷酶,和β-内酰胺酶。

随后,将酪胺剂(例如与酪胺半抗原缀合的酪胺分子)应用于样品。二级酶催化酪胺半抗原沉积至样品上。酪胺半抗原可包括但不限于生物素,洋地黄毒苷(DIG),NP,BF,NCA,BD,二硝基苯基(DNP),噁唑,吡唑,噻唑,硝基芳基,苯并呋喃,三萜,脲,硫脲,鱼藤酮类化合物,香豆素和环木脂体半抗原,诸如美国专利No.7,695,929中公开的那些,通过援引将其完整收入本文。

随后,将第三结合剂应用于样品。第三结合剂是对酪胺半抗原特异性的且结合酪胺半抗原。在一些实施方案中,第三结合剂是包含抗体或其片段的三级抗体。第三结合剂(例如三级抗体)是与三级酶(例如三级抗体酶)缀合的。合适的酶是公知的且包括但不限于氧化还原酶,水解酶,和过氧化物酶。明确包括的具体的酶是辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP),酸性磷酸酶,葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶,β-葡糖醛酸糖苷酶,和β-内酰胺酶。

在应用对酪胺半抗原特异性的第三结合剂(例如三级抗体)后,将可检测模块(例如生色团)应用于样品。三级酶催化与可检测模块(例如生色团)的反应以使得可检测模块(例如生色团)可见。可检测模块(例如生色团)可以是使用显微术(例如使用明视野显微术)作为点状点可见的。在某些实施方案中,点状点可代表独个靶分子。可以对所述点状点(例如靶分子)计数,例如用以量化样品中靶分子的量。

在一些实施方案中,可检测模块(例如生色团)包含银或酪胺-罗丹明染料。例如,在一些实施方案中,酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明(TAMRA),罗丹明6G,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101(德克萨斯红),等等,或其组合。本发明不限于可检测模块(例如生色团)的这些例子。例如,不希望将本发明限于任何理论或机制,有可能的是弥漫的生色团(例如DAB)能在这种技术中运转,例如如果有较低水平的靶分子(生物标志物)表达的话(当表达水平高时解析单个点的能力对于弥漫的生色团不太好)。

因此,可检测模块(显色化合物/底物)的其它非限制性例子包括4-硝基苯基磷酸酯(pNPP),坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP),硝基蓝四唑(NBT),BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺(TMB),2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS),邻联茴香胺,4-氯萘酚(4-CN),硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),邻苯二胺(OPD),5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal),甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal),对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP),5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc),3-氨基-9-乙基咔唑(AEC),品红,碘硝基四唑

(INT),四唑

蓝,或四唑

紫。

在一些实施方案中,本发明的方法特征在于一种金相检测方案,其中三级酶包含碱性磷酸酶(或合适的备选)且可检测模块(生色团)包含水溶性金属离子和三级酶的无氧化还原活性的底物。在一些实施方案中,酶将底物转变成氧化还原活性剂,而且氧化还原活性剂还原金属离子,引起它形成可检测沉淀物(参见例如美国专利No.7,642,064,PCT公开文本No.2005/003777和美国专利No.7,632,652；通过援引将其每一篇完整收入本文)。金相检测方法包括连同水溶性金属离子,氧化剂和还原剂使用酶氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶),再次用于形成可检测沉淀物(参见例如美国专利No.6,670,113,通过援引将其完整收入本文)。

在还有其它实施方案中,可检测模块包含潜伏的反应性模块,其配置成与三级酶反应以形成能结合样品或其它检测成分的反应性种类。这些反应性种类能够与靠近它们的产生(即接近酶)的样品反应,但是快速转变成非反应性种类,使得发信号缀合物并不在远离酶沉积位点的位点处沉积。潜伏的反应性模块的例子包括:醌甲基化物(QM)类似物,诸如WO2015124703A1中描述的那些,和酪胺缀合物,诸如WO2012003476A2中描述的那些,据此通过援引将其每一篇完整收入本文。在一些例子中,潜伏的反应性模块是与染料直接缀合的,诸如N,N’-双羧基戊基-5,5’-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5),4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL),四甲基罗丹明(DISCO紫),和罗丹明110(罗丹明)。

注意,在一些实施方案中,本发明的方法在用于检测多种靶生物标志物的多路染色方法中应用。在多路方法中,以容许不同生物标志物差异标记的方式应用生物标志物特异性试剂和检测试剂。

实现不同生物标志物的差异标记的一种方式是选择不会导致不同抗体或检测试剂之间的脱靶交叉反应性的生物标志物特异性试剂,检测试剂,和酶组合的组合(称作“组合染色”)。例如,在使用二级检测试剂的情况中,每种二级检测试剂仅仅能够结合在切片上使用的一级抗体之一。例如,可选择自不同动物物种衍生的一级抗体(诸如小鼠,家兔,大鼠,和山羊抗体),在该情况中可使用物种特异性二级抗体。又例如,每种一级抗体可包括不同半抗原或表位标签,而且选择二级抗体以特异性结合半抗原或表位标签。另外,应当将每组检测试剂调适成在切片上沉积不同可检测实体,诸如通过靠近每种生物标志物特异性试剂沉积不同酶。此类安排的一个例子显示于US 8,603,765。此类安排具有潜在优点,即能够在样品上同时存在每组生物标志物特异性试剂和相关特异性结合试剂和/或用生物标志物特异性试剂和检测试剂的混合物实施染色,由此减少染色步骤的数目。然而,此类安排可能并不总是可行的,因为试剂可能与不同酶交叉反应,而且各种抗体可能彼此交叉反应,导致异常染色。

实现不同生物标志物的差异标记的另一种方式是将样品针对每种生物标志物顺序染色。在这样一个实施方案中,使第一生物标志物特异性试剂与切片反应,接着使二级检测试剂与第一生物标志物特异性试剂和其它检测试剂反应,导致第一可检测实体沉积。然后处理切片以自切片去除生物标志物特异性试剂和相关检测试剂同时将沉积的染色剂留在原位。为后续生物标志物特异性试剂重复过程。用于去除生物标志物特异性试剂和相关检测试剂的方法的例子包括在自样品洗脱抗体的缓冲液存在下加热样品(称作“热杀灭方法”),诸如由Stack et al.,Multiplexed immunohistochemistry,imaging,andquantitation:A review,with an assessment of Tyramide signal amplification,multispectral imaging and multiplex analysis,Methods,Vol.70,Issue 1,pp 46-58(Nov.2014),和PCT/EP2016/057955公开的那些,通过援引收录其内容。

正如熟练技术人员会领会的,可组合组合染色和顺序染色方法。例如,在只有一个子集的一级抗体与组合染色相容的情况中,可修改顺序染色方法,其中使用组合染色方法将与组合染色相容的抗体应用于样品,并使用顺序染色方法应用剩余抗体。

在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的两种靶分子。在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的三种靶分子。在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的四种靶分子。在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的五种靶分子。在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的六种靶分子。在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的七种靶分子。在一些实施方案中,使用本发明的方法检测同一样品中的八种或更多种靶分子。

自动化***

可以在自动化染色仪器(载片染色仪)或其它适宜的自动化载片加工仪器上实施本发明的方法。自动化染色仪器(例如IHC/ISH载片染色仪)的具体例子包括:itelliPATH(Biocare Medical),WAVE(Celerus Diagnostics),DAKO OMNIS和DAKO自动染色仪LINK 48(Agilent Technologies),BENCHMARK(Ventana Medical Systems,Inc.),Leica BOND,和Lab Vision自动染色仪(Thermo Scientific)。自动化染色仪器(自动化载片染色仪)还描述于Prichard,Overview of Automated Immunohistochemistry,Arch Pathol Lab Med.,Vol.138,pp.1578-1582(2014),通过援引完整收入本文。另外,Ventana Medical Systems,Inc.是许多公开用于实施自动化分析的***和方法的美国专利的受让人,包括美国专利No.5,650,327,5,654,200,6,296,809,6,352,861,6,827,901和6,943,029,和已公布的美国专利申请No.20030211630和20040052685,通过援引将其每一篇完整收入本文。可以将本发明的方法调适成在任何适宜的自动化染色仪器(或自动化载片加工仪器)上实施。

自动化IHC/ISH载片染色仪典型地至少包括染色仪单元,用于将执行染色方案的试剂分配至载片上。可商购的染色单元典型地以下面的原理之一操作:(1)打开独个载片染色,其中水平放置载片并在含有组织样品的载片的表面上作为水洼分配试剂(诸如在DAKO自动染色仪Link 48(Agilent Technologies)和intelliPATH染色仪(Biocare Medical)上执行)；(2)液体覆盖技术,其中或是用在样品上沉积的惰性流体层覆盖试剂或是穿过在样品上沉积的惰性流体层分配试剂(诸如在BenchMark和VENTANA DISCOVERY染色仪上执行)；(3)毛细间隙染色,其中与另一表面(其可以是另一载片或盖片)平行靠近放置载片表面以产生窄间隙,穿过其毛细力吸取液体试剂并保持液体试剂与样品接触(诸如DAKOTECHMATE,Leica BOND,和DAKO OMNIS染色仪使用的染色原理)。毛细间隙染色的一些迭代并不在间隙中混合流体(诸如在DAKO TECHMATE和Leica BOND上)。在毛细间隙染色的一些变型中,在间隙中混合试剂,诸如平移间隙技术,其中在载片和弯曲的表面之间产生间隙且表面相对于彼此的移动实现混合(参见US 7,820,381)；和动态间隙染色,其与毛细间隙染色类似地使用毛细力将样品应用于载片,然后在温育期间相对于彼此平移平行表面以搅动试剂来实现试剂混合(诸如在DAKO OMNIS载片染色仪(Agilent)上执行的染色原理)。最近已经提议使用喷墨技术在载片上沉积试剂。参见WO 2016-170008A1。这个染色原理列表并非意图是穷尽的,而且本方法和***意图包括可用于将适宜的试剂应用于样品的任何染色技术(已知的和未来开发的二者)。

本发明不限于在自动化***中应用的方法。在一些实施方案中,手动应用本发明的方法。

不希望将本发明限于任何理论或机制,认为与产生二元(加或减)结果的传统方法相比,提供靶分子的信号和表达水平的量化的本发明方法可帮助为患者提供另外的预后价值和/或预测价值。而且,本发明的方法可提供IHC测定法的标准化。本发明的方法可用于多种靶分子。

图像加工和分析

在将组织切片染色后,样品经历图像采集,图像加工,和分析。

数字图像采集***可包含扫描平台,诸如能以20倍,40倍,或其它放大倍数扫描染色后的载片以生成高分辨率全载片数字图像的载片扫描仪,包括例如载片扫描仪。在基本水平上,典型的载片扫描仪至少包括:(1)带有物镜的显微镜,(2)光源(诸如卤素,发光二极管,白光,和/或多光谱光源,取决于染料),(3)用于到处移动玻璃载片(或用于围绕载片移动光学器件)的机器人,(4)一个或多个用于图像捕捉的数码相机,(5)用于控制机器人和用于操作,管理,和查看数字载片的计算机和相关软件。通过相机的电荷耦合器件(CCD)捕捉载片上的多个不同X-Y位置处的(和在一些情况中,在多个Z平面处的)数字数据,并将图像接合到一起以形成整个扫描表面的复合图像。用于实现这一点的常用方法包括:(1)基于瓦的扫描,其中以很小的增量移动载片台或光学器件以捕捉方形图像帧,其以轻微程度交叠相邻方形。然后将捕捉到的方形彼此自动匹配以构建复合图像；和(2)基于线的扫描,其中在采集期间以单一轴移动载片台以捕捉多个复合图像“条”。然后可以将图像条彼此匹配以形成更大的复合图像。

在一些实施方案中,成像装置是明视野成像仪载片扫描仪。一种明视野成像仪是由Ventana Medical Systems,Inc.出售的iScan Coreo明视野扫描仪。在自动化的实施方案中,成像装置是题为IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES的国际专利申请No.:PCT/US2010/002772(专利公开文本No.:WO/2011/049608)中公开的或2011年9月9日提交的题为IMAGINGSYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME的美国专利申请No.61/533,114中公开的数字病理学装置。通过援引完整收录国际专利申请No.PCT/US2010/002772和美国专利申请No.61/533,114。

各种扫描仪(例如明视野)的详细概览可参见Farahani et al.,Whole slideimaging in pathology:advantages,limitations,and emerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int’l,Vol.7,p.23-33(June 2015),通过援引完整收录其内容。可商购的载片扫描仪的例子包括:3DHistech PANNORAMIC SCAN II；DigiPathPATHSCOPE；Hamamatsu NANOZOOMER RS,HT,和XR；Huron TISSUESCOPE 4000,4000XT,和HS；Leica SCANSCOPE AT,AT2,CS,FL,和SCN400；Mikroscan D2；Olympus VS120-SL；OmnyxVL4,和VL120；PerkinElmer LAMINA；Philips ULTRA-FAST扫描仪；Sakura FinetekVISIONTEK；Unic PRECICE 500,和PRECICE 600x；VENTANA ISCAN COREO和ISCAN HT；和Zeiss AXIO SCAN.Z1。其它例示性***和特征可参见例如WO2011-049608或2011年9月9日提交的题为IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME的美国专利申请No.61/533,114,通过援引完整收录其内容。

可将由扫描平台产生的图像转移至图像分析***或图像分析***可访问的服务器或数据库。在一些实施方案中,可经由一个或多个局域网和/或广域网自动转移图像。在一些实施方案中,图像分析***可以是与扫描平台和/或图像采集***的其它模块集成的或包括在扫描平台和/或图像采集***的其它模块中的,在该情况中可将图像转移至图像分析***。在一些实施方案中,图像采集***可以不是与图像分析***通讯偶联的,在该情况中可将图像保存在任何类型的非易失性存储介质(例如闪存驱动器)上并自介质下载至图像分析***或与其通讯偶联的服务器或数据库。

图像采集***还可以是集成入自动化载片染色仪器或自动化载片加工***和/或自动化H&E染色平台(如上文描述的)的。

在单路染色方法中,对独个连续切片实施IHC,然后对其独个成像。一旦成像,就实施特征提取以比对切片进行后续分析。用于比对组织切片的软件是本领域普通技术人员公知的。

在多路染色方法中,对单一切片实施IHC和图像采集。因为组织切片特征在于多种生物标志物(例如多种生色团,等),所以加工图像以分离出不同信号。例如,多路化染色后的组织切片图像的加工可特征在于将数字图像分解(也称作光谱分解,颜色分离,颜色解卷积,等)成它关于每一种生物标志物的独个组成染料并获得颜色混合物中每一种染料的比例。例如,过程可包含将数字图像分解成关于第一生色团(第一生物标志物)的第一解构图像,关于第二生色团(第二生物标志物)的第二解构图像,等。典型地,图像采集获得RGB彩色图像,其是根本的共定位的生物标志物表达的混合物。已经提议数种技术将RGB图像的每个像素分解成组分染色剂的集合和来自它们中每一种的贡献的分数。Ruifrok et al.,(Anal.Quant.Cytol.Histol.,2001,23:291-299)开发了一种分解方法(称作颜色解卷积)来分解具有多至三种染色剂的RGM图像。用于分解多光谱图像的其它方法包括Chen andSrinivas(Comput Med Imaging Graph,2015,46(1):30-39),Kesheva(LincolnLaboratory Journal,2003,14:55-78),Greer(IEEE Trans Image Proc.,2012,221:219-228),和Yang et al.(IEEE Trans.Image Proc.,2011,20:1112-1125)中公开的那些。

分解过程使用关于标准类型的组织和染色剂组合公知的颜色参照矢量或参照光谱提取染色剂特异性通道以测定独个染色剂的局部浓度。以图像值的一个矢量或一个颜色矢量代表扫描图像的每一个像素,而且每一种染色剂对应于一个颜色参照矢量。染色剂的局部浓度由颜色参照矢量的比例因子代表。因此,含有共定位的不同浓度的多种染色剂的像素的颜色矢量是所有存在的染色剂的参照光谱的线性组合。在明视野(透射)成像中,将由染色后的组织发射的光强度转换成光密度空间,不同染色剂的混合由做出贡献的参照光谱的线性加权组合代表。

在某些实施方案中,染色后的组织切片可包含浓度依赖性染色剂(例如在不同浓度具有不同显色特性的染色剂)。如此,分解组织切片的数字图像的方法可说明光散射的影响和在不同染色剂浓度,光散射可如何改变在检测到的光中RGB通道信号的比例。这可以特征在于自关于浓度依赖性染色剂的一组颜色参照矢量(其中组中的每一个颜色参照矢量描述或表征处于不同浓度水平的浓度依赖性染色剂)为浓度依赖性染色剂选择最佳颜色参照矢量,并使用选定的最佳颜色参照矢量分解图像。

在某些实施方案中,在数字图像中手动鉴定感兴趣区域(ROI)。例如,训练有素的专家可在样品的数字图像上手动描绘一个或多个形态学区域。在其它实施方案中,计算机执行的***可帮助用户注解ROI(称作“半自动化ROI注解”)。例如,用户可在数字图像上描绘一个或多个区域,然后***将其自动转换成完整ROI。例如,如果期望的ROI是侵入性边缘(IM)区的话,用户可描绘(例如通过描轮廓(outlining),描踪迹(tracing))IM区或整个肿瘤(WT)区,而且***应用使用计算机视觉和机器学习的样式识别功能来鉴定具有与IM区相似的形态特征的区域。还可使用许多其它安排。在ROI产生是半自动化的情况中,用户可以得到修改由计算机***注解的ROI的选项,诸如通过扩充ROI,将ROI的区域或ROI内的对象注解为排除在分析之外,等。在其它实施方案中,计算机***可在没有来自用户的任何直接输入的情况下自动建议ROI(称作“自动化ROI注解”)。例如,可将先前经过训练的组织分区功能或其它样式识别功能应用于未注解的图像以鉴定作为ROI使用的期望的形态学区域。用户可以得到修改由计算机***注解的ROI的选项,诸如通过扩充ROI,将ROI的区域或ROI内的对象注解为排除在分析之外,等。对于H&E载片的单路连续切片,可鉴定(注解)肿瘤区并在称作图像的“注册”的过程中将注解转移至其它连续图像。也可用多路测定法进行注册。

图像分析***可特征在于一种或多种计算装置,诸如台式计算机,膝上型计算机,平板,智能电话,服务器,特定应用计算装置,或能够实施本文中描述的技术和操作的任何其它类型的电子装置。在一些实施方案中,图像分析***可以是作为单一装置执行的。在其它实施方案中,图像分析***可以是作为两个或更多个装置在一起的组合执行的。例如,图像分析***可包括经由一个或多个局域网和/或广域网(诸如因特网)彼此通讯偶联的一个或多个服务器计算机和一个或多个客户计算机。

图像分析***可包括存储器,处理器,和显示器。存储器可包括任何类型的易失性或非易失性存储器(诸如随机存取存储器(RAM),只读存储器(诸如电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)),闪存,硬驱动器,固态驱动器,光盘,等等)的任何组合。处理器可包括一个或多个任何类型的处理器,诸如中央处理单元(CPU),图形处理单元(GPU),特殊目的信号或图像处理器,现场可编程门阵列(FPGA),张量处理单元(TPU),等等。

可使用任何合适的技术来执行显示器,诸如LCD,LED,OLED,TFT,等离子体,等。在一些执行中,显示器可以是触敏显示器(触摸屏)。

图像分析***还可包括对象鉴定器,感兴趣区域(ROI)生成器,用户界面模块,和评分引擎。本领域普通技术人员可领会每个模块可作为多个子模块来执行,而且任何两个或更多个模块可组合成单个模块。而且,在一些实施方案中,***可包括另外的引擎和模块(例如输入装置,连网和通讯模块,等)。在执行本文中公开的模块中有用的例示性的可商购的软件包包括VENTANA VIRTUOSO；Definiens TISSUE STUDIO,DEVELOPER XD,和IMAGEMINER；和Visopharm BIOTOPIX,ONCOTOPIX,和STEREOTOPIX软件包。

在采集图像之后,图像分析***可将图像传递至对象鉴定器,其发挥功能来鉴定和标记图像内的有关对象和其它特征,稍后会用于评分。在本发明中,生物标志物表现为可量化的点状点。如此,在图像分析中鉴定的对象是ROI(例如整个肿瘤,侵入性边缘,肿瘤核心,肿瘤周围区域,等)内的点状点。

可以任何次序执行对象鉴定器和ROI的注解(ROI生成器)。例如,可首先将对象鉴定器应用于整个图像。然后可保存所鉴定的对象的位置和特征并在执行ROI生成器时调用。可在产生ROI时由评分引擎产生得分。或者,可首先执行ROI生成器。在这种情况中,可仅仅对ROI执行对象鉴定器,或者仍然可以对整个图像执行它。还可能的是同时执行对象鉴定器和ROI生成器。

在执行对象鉴定器和ROI生成器二者之后,执行评分引擎。

图6显示与使用传统方法的弥漫染色(顶部小图)相比,使用本发明的方法(qIHC)在低至中等表达水平的HER2观察到的点状点信号(底部小图)。点状点不同于弥漫的染色,因为弥漫的染色覆盖更大面积的组织样品。本文中的方法使用在组织切片中标记的一种或多种生物标志物的点状点信号提供组织切片的评分。例如,图像分析软件可将经量化的生物标志物(对象度量)输入预先确定的评分函数以获得组织切片的得分。

本发明还提供供与本文中描述的自动化***一起使用的计算***和计算机算法。

实施例1

实施例1描述一系列使用本发明的方法的实验。本发明不限于本文中描述的方法,***,和组合物。

实验1:组装了一种高灵敏度检测***(本发明的一种方法),包括带V5表位标签的4B5抗Her2家兔单克隆抗体+小鼠抗V5-HRP缀合物+酪胺-DIG+小鼠抗DIG-HRP缀合物+银生色团。使用滴定实验实现了能够特异性(背景少或无)且灵敏检测结合至每份组织样品中的Her2表达性细胞的抗Her2抗体的抗V5-HRP缀合物浓度的确定。使用带V5表位标签的4B5抗Her2家兔单克隆抗体或阴性对照(抗体稀释剂)和一定范围的抗V5-HRP缀合物浓度将扁桃体和Her2三合一异种移植物载片染色。执行了类似的实验以证明酪胺-DIG+小鼠抗DIG-HRP缀合物+银生色团试剂(省略小鼠抗V5-HRP缀合物)的特异性(背景信号少或无)。

实验2:使用最佳试剂浓度和五张扁桃体和五张Her2三合一异种移植物载片重复了实验1。结果证明高灵敏度检测***(本发明的方法)的灵敏度与RTD OptiView amp DAB检测***相比升高。

实验3:执行了实验评估用酪胺-罗丹明染料替换银生色团以产生点状点信号的效用。利用高灵敏度检测***(本发明的方法),包括带V5表位标签的4B5抗Her2家兔单克隆抗体+小鼠抗V5-HRP缀合物+酪胺-DIG+小鼠抗DIG-HRP缀合物+酪胺-罗丹明染料生色团,将扁桃体和Her2三合一异种移植物载片染色。无一级抗体载片充当阴性对照载片。对三种不同酪胺-罗丹明染料生色团(酪胺-罗丹明6G,酪胺-四甲基罗丹明(TAMRA),和酪胺-磺酰罗丹明101(德克萨斯红))观察到点状点信号。产生点状点信号的效用提示使高灵敏度蛋白质检测***适应使用具有窄吸收光谱,使用计算机算法可分解的生色团染料的多路***的能力。

实验4:执行了实验评估高灵敏度蛋白质检测***(本发明的方法)用于检测分泌的蛋白质因子的效用。选择干扰素γ(IFNg)作为模式分泌因子,因为它具有充分证明的在白细胞(T细胞)生物学和炎性过程中的生物学作用(很可能由反应性扁桃体组织中的T和NKT细胞表达)。购买了一种多克隆天然(未修饰)家兔抗人IFNg(Abcam)并用于将人三份人扁桃体组织(假定的阳性样品)和Her2三合一异种移植物组织(假定的阴性对照组织,因为异种移植物组织由在缺乏T和NKT细胞的免疫缺陷,SCID,小鼠中生长的人癌细胞系构成)染色。先前执行了滴定实验以确定RTD OmniMap多克隆山羊抗家兔-HRP缀合物用于使用高灵敏度检测***(本发明的方法)(酪胺-DIG+小鼠抗DIG-HRP缀合物+银生色团)灵敏且特异性检测家兔抗体的适宜浓度；0.25倍商业销售试剂产生的背景信号少至无。作为很少细胞周围的强烈信号和自其它细胞发出的更加弥漫的信号观察到高灵敏度***用于检测自免疫细胞分泌的IFNg的效用；该技术用于检测分泌因子的特异性得到大多数扁桃体细胞缺乏信号和Her2三合一异种移植物组织上缺乏信号的支持。图7显示使用IHC的传统方法(顶部小图)和本发明的方法,qIHC(底部小图),反应性扁桃体中IFNg的免疫组织化学的结果。与使用传统方法的弥漫染色相比,注意使用本发明的方法(qIHC)观察到的IFNγ的点状点信号。这提示本发明的方法可用于分泌的靶分子。

实验5:执行了实验检验高灵敏度蛋白质检测技术(本发明的方法)能够检测结合至单个蛋白质分子的独个抗体的假说。组装了一种双色检测***以包括下面的试剂:带V5表位标签的4B5抗Her2家兔单克隆抗体+小鼠抗V5-HRP缀合物+酪胺-DIG+小鼠抗DIG-HRP缀合物+酪胺-TAMRA生色团(红色信号)和带E2表位标签的4B5抗Her2家兔单克隆抗体+家兔抗E2-HRP缀合物+酪胺-NP+小鼠抗NP-HRP缀合物+银生色团(黑色信号)。使用与用于优化V5和DIG检测试剂配置的那些类似的模型,先前进行的实验已经确定了E2-HRP和基于NP的检测试剂用于产生灵敏且特异性信号的适宜浓度。高灵敏度检测技术(本发明的方法)自结合至单个蛋白质分子的独个抗体产生信号的效用得到扁桃体或Her2三合一异种移植物组织(ZR75.1异种移植物)中的Her2表达性细胞产生独个黑色或红色信号的支持。

实施例2

见图9,使用多路染色测定法将扁桃体组织针对Her2染色。使用小鼠抗V5-HRP+酪胺-DIG+小鼠抗DIG-HRP+酪胺-TAMRA生色团(粉色)检测带V5表位标签的抗Her2单克隆抗体4B5。使用小鼠抗E2-HRP+酪胺-NP+小鼠抗NP-HRP+银生色团(黑色)检测带E2表位标签的抗Her2单克隆抗体4B5。注意,带V5和E2标签的4B5抗Her2单克隆抗体竞争靶Her2蛋白中的相同氨基酸序列且在执行检测之前在一起共温育。单个粉色点状点发信号,很可能衍生自结合至靶的独个单个V5标记的4B5单抗；每个抗体很可能只结合单个Her2蛋白。图9与结合至独个表位的独个抗体的检测(例如单个蛋白质分子检测)一致。图10显示扁桃体组织中的Her2蛋白的检测,证明测定法的特异性。左边小图显示对照样品而右边小图显示针对Her2染色的样品。所使用的检测***是OmniMap xRBT-HRP(0.25x),tyr-DIG,xDIG-HRP,和银(Ag)。

在本文中描述的那些以外,对本发明的各种修饰根据前面的描述对于本领域技术人员会是显而易见的。此类修饰还意图落在所附权利要求书的范围内。通过援引将本申请中引用的每一篇参考文献完整收入本文。

尽管已经显示和描述本发明的优选实施方案,但是对于本领域技术人员会是显而易见的是可以对其进行不超出所附权利要求书的范围的修饰。因此,本发明的范围只受所附权利要求书的限制。权利要求中记载的附图标记(reference number)是例示性的且仅仅为了便于专利局审查,而且不是任何方式限制性的。在一些实施方案中,本专利申请中呈现的图是按比例绘制的,包括角,尺寸的比率,等。在一些实施方案中,图仅仅是代表性的且权利要求不受图的尺寸限制。在一些实施方案中,使用短语“包含”对本文中描述的发明的描述包括可以描述为“由……组成”的实施方案,而且因此满足请求保护本发明使用短语“由……组成”的一种或多种实施方案的书面描述要求。

Claims (186)

1.一种放大样品中的靶蛋白生物标志物的信号的非诊断方法,所述方法包含:

a.对该样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

2.权利要求1的方法,其中该样品是组织样品。

3.权利要求2的方法,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

4.权利要求1-3任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

5.权利要求4的方法,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

6.权利要求1-5任一项的方法,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

7.权利要求6的方法,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

8.权利要求6或权利要求7的方法,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

9.权利要求1-8任一项的方法,其中该第二结合剂包含二级抗体。

10.权利要求1-9任一项的方法,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

11.权利要求10的方法,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

12.权利要求1-11任一项的方法,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

13.权利要求1-12任一项的方法,其中该第三结合剂包含三级抗体。

14.权利要求13的方法,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

15.权利要求1-14任一项的方法,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

16.权利要求1-15任一项的方法,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

17.权利要求1-16任一项的方法,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

18.权利要求1-17任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

19.一种放大样品中的靶蛋白生物标志物的信号的非诊断方法,所述方法包含:

a.对该样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的多克隆第二结合剂,该多克隆第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

20.权利要求19的方法,其中该样品是组织样品。

21.权利要求20的方法,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

22.权利要求19-21任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

23.权利要求22的方法,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

24.权利要求19-23任一项的方法,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

25.权利要求24的方法,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

26.权利要求24或权利要求25的方法,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

27.权利要求19-26任一项的方法,其中该第二结合剂包含二级抗体。

28.权利要求19-27任一项的方法,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

29.权利要求28的方法,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

30.权利要求19-29任一项的方法,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

31.权利要求19-30任一项的方法,其中该第三结合剂包含三级抗体。

32.权利要求31的方法,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

33.权利要求19-32任一项的方法,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

34.权利要求19-33任一项的方法,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

35.权利要求19-34任一项的方法,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

36.权利要求19-35任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

37.一种放大***固定,石蜡包埋组织样品中的靶蛋白生物标志物的信号的非诊断方法,所述方法包含:

a.用去石蜡化试剂处理该组织样品；

b.用抗原修复试剂处理该组织样品；

c.对该组织样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

d.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

e.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

f.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

g.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

38.权利要求37的方法,其进一步包含在应用对该靶蛋白生物标志物特异性的该生物标志物特异性药剂之前用蛋白酶处理该组织样品。

39.权利要求37或权利要求38的方法,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

40.权利要求39的方法,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

41.权利要求37-40任一项的方法,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

42.权利要求41的方法,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

43.权利要求41或权利要求42的方法,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

44.权利要求37-43任一项的方法,其中该第二结合剂包含二级抗体。

45.权利要求37-44任一项的方法,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

46.权利要求45的方法,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

47.权利要求37-46任一项的方法,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

48.权利要求37-47任一项的方法,其中该第三结合剂包含三级抗体。

49.权利要求48的方法,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

50.权利要求37-49任一项的方法,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

51.权利要求37-50任一项的方法,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

52.权利要求37-51任一项的方法,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

53.权利要求37-52任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

54.一种用于检测样品中的靶蛋白生物标志物的定量免疫组织化学的非诊断方法,所述方法包含:

a.对该样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

55.权利要求54的方法,其中该样品是组织样品。

56.权利要求55的方法,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

57.权利要求54-56任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

58.权利要求57的方法,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

59.权利要求54-58任一项的方法,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

60.权利要求59的方法,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

61.权利要求59或权利要求60的方法,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

62.权利要求54-61任一项的方法,其中该第二结合剂包含二级抗体。

63.权利要求54-62任一项的方法,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

64.权利要求63的方法,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

65.权利要求54-64任一项的方法,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

66.权利要求54-65任一项的方法,其中该第三结合剂包含三级抗体。

67.权利要求66的方法,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

68.权利要求54-67任一项的方法,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

69.权利要求54-68任一项的方法,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

70.权利要求54-69任一项的方法,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

71.权利要求54-70任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

72.一种样品中的分泌的靶蛋白生物标志物的定量免疫组织化学的非诊断方法,所述方法包含:

a.对该样品应用对该分泌的靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该分泌的靶蛋白生物标志物；

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

73.权利要求72的方法,其中该样品是组织样品。

74.权利要求73的方法,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

75.权利要求72-74任一项的方法,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

76.权利要求75的方法,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

77.权利要求72-76任一项的方法,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

78.权利要求77的方法,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

79.权利要求77或权利要求78的方法,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

80.权利要求72-79任一项的方法,其中该第二结合剂包含二级抗体。

81.权利要求72-80任一项的方法,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

82.权利要求81的方法,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

83.权利要求72-82任一项的方法,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

84.权利要求72-83任一项的方法,其中该第三结合剂包含三级抗体。

85.权利要求84的方法,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

86.权利要求72-85任一项的方法,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

87.权利要求72-86任一项的方法,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

88.权利要求72-87任一项的方法,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种分泌的靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

89.权利要求72-88任一项的方法,其中该方法容许其中检测和区分一种分泌的靶蛋白生物标志物和一种或多种另外的靶蛋白生物标志物的多路IHC测定法。

90.权利要求1-89任一项的方法,其中该方法是自动化的。

91.权利要求1-90任一项的方法,其中在自动化染色仪器上实施该方法。

92.权利要求1-89任一项的方法,其中该方法是手动的。

93.自动化染色仪器用于实施依照权利要求1-89任一项的方法的用途。

94.权利要求93的用途,其中该自动化染色仪器包含与处理器偶联的存储器,其中该存储器保存在由该处理器执行时引起该自动化染色仪器实施依照权利要求1-89任一项的方法的操作的计算机可读指令。

95.包含载片固定器,试剂,和分配器的自动化***用于实施依照权利要求1-89任一项的方法的用途。

96.权利要求95的用途,其中该自动化***进一步包含包含与处理器偶联的存储器的***,其中该存储器保存在由该处理器执行时引起该自动化***实施依照权利要求1-89任一项的方法的操作的计算机可读指令。

97.权利要求95或权利要求96的用途,其中该分配器调适成将试剂分配至该载片固定器中的载片上。

98.对靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂,对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,对该半抗原特异性的第三结合剂,和可检测模块制备供一种放大样品中的该靶蛋白生物标志物的信号的方法使用的试剂或试剂盒的用途,所述方法包含:

a.对该样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

99.权利要求98的用途,其中该样品是组织样品。

100.权利要求99的用途,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

101.权利要求98-100任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

102.权利要求101的用途,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

103.权利要求98-102任一项的用途,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

104.权利要求103的用途,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

105.权利要求103或权利要求104的用途,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

106.权利要求98-105任一项的用途,其中该第二结合剂包含二级抗体。

107.权利要求98-106任一项的用途,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

108.权利要求107的用途,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

109.权利要求98-108任一项的用途,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

110.权利要求98-109任一项的用途,其中该第三结合剂包含三级抗体。

111.权利要求110的用途,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

112.权利要求98-111任一项的用途,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

113.权利要求98-112任一项的用途,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

114.权利要求98-113任一项的用途,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

115.权利要求98-114任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

116.对靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂,对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的多克隆第二结合剂,包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,对该半抗原特异性的第三结合剂,和可检测模块制备供一种放大样品中的该靶蛋白生物标志物的信号的方法使用的试剂或试剂盒的用途,所述方法包含:

a.对该样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的多克隆第二结合剂,该多克隆第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

117.权利要求116的用途,其中该样品是组织样品。

118.权利要求117的用途,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

119.权利要求116-118任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

120.权利要求119的用途,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

121.权利要求116-120任一项的用途,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

122.权利要求121的用途,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

123.权利要求121或权利要求122的用途,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

124.权利要求116-123任一项的用途,其中该第二结合剂包含二级抗体。

125.权利要求116-124任一项的用途,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

126.权利要求125的用途,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

127.权利要求116-126任一项的用途,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

128.权利要求116-127任一项的用途,其中该第三结合剂包含三级抗体。

129.权利要求128的用途,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

130.权利要求116-129任一项的用途,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

131.权利要求116-130任一项的用途,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

132.权利要求116-131任一项的用途,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

133.权利要求116-132任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

134.去石蜡化试剂,抗原修复试剂,对靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂,对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,对该半抗原特异性的第三结合剂,和可检测模块制备供一种放大***固定,石蜡包埋组织样品中的该靶蛋白生物标志物的信号的方法使用的试剂或试剂盒的用途,所述方法包含:

a.用去石蜡化试剂处理该组织样品；

b.用抗原修复试剂处理该组织样品；

c.对该组织样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

d.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

e.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

f.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

g.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

135.权利要求134的用途,其中该方法进一步包含在应用对该靶蛋白生物标志物特异性的该生物标志物特异性药剂之前用蛋白酶处理该组织样品。

136.权利要求134或权利要求135的用途,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

137.权利要求136的用途,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

138.权利要求134-137任一项的用途,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

139.权利要求138的用途,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

140.权利要求138或权利要求139的用途,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

141.权利要求134-140任一项的用途,其中该第二结合剂包含二级抗体。

142.权利要求134-141任一项的用途,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

143.权利要求142的用途,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

144.权利要求134-143任一项的用途,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

145.权利要求134-144任一项的用途,其中该第三结合剂包含三级抗体。

146.权利要求145的用途,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

147.权利要求134-146任一项的用途,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

148.权利要求134-147任一项的用途,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

149.权利要求134-148任一项的用途,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

150.权利要求134-149任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

151.对靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂,对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,对该半抗原特异性的第三结合剂,和可检测模块制备供一种用于检测样品中的该靶蛋白生物标志物的定量免疫组织化学的方法使用的试剂或试剂盒的用途,所述方法包含:

a.对该样品应用对该靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该靶蛋白生物标志物；且

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

152.权利要求151的用途,其中该样品是组织样品。

153.权利要求152的用途,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

154.权利要求151-153任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

155.权利要求154的用途,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

156.权利要求151-155任一项的用途,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

157.权利要求156的用途,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

158.权利要求156或权利要求157的用途,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

159.权利要求151-158任一项的用途,其中该第二结合剂包含二级抗体。

160.权利要求151-159任一项的用途,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

161.权利要求160的用途,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

162.权利要求151-161任一项的用途,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

163.权利要求151-162任一项的用途,其中该第三结合剂包含三级抗体。

164.权利要求163的用途,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

165.权利要求151-164任一项的用途,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

166.权利要求151-165任一项的用途,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

167.权利要求151-166任一项的用途,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

168.权利要求151-167任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物是分泌的分子。

169.对分泌的靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂,对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,对该半抗原特异性的第三结合剂,和可检测模块制备供一种样品中的该分泌的靶蛋白生物标志物的定量免疫组织化学的方法使用的试剂或试剂盒的用途,所述方法包含:

a.对该样品应用对该分泌的靶蛋白生物标志物特异性的第一生物标志物特异性结合剂；

b.对该样品应用对该第一生物标志物特异性结合剂特异性的第二结合剂,该第二结合剂是与二级酶缀合的；

c.对该样品应用包含与半抗原缀合的酪胺分子的酪胺剂,其中在该第二结合剂的位置处该二级酶催化该半抗原沉积至该样品上；

d.对该样品应用对该半抗原特异性的第三结合剂,该第三结合剂是与三级酶缀合的；并

e.对该样品应用可检测模块,其中该三级酶催化与该可检测模块的反应以使得该可检测模块可见；

由此该可检测模块是使用明视野显微术作为点状点可见的,其中该点状点指示该分泌的靶蛋白生物标志物；

其中该可检测模块包含酪胺-罗丹明染料。

170.权利要求169的用途,其中该样品是组织样品。

171.权利要求170的用途,其中该组织样品是***固定,石蜡包埋组织样品。

172.权利要求169-171任一项的用途,其中该靶蛋白生物标志物包含蛋白质,碳水化合物,核酸,脂质,翻译后修饰,或其组合。

173.权利要求172的用途,其中该翻译后修饰包含磷酸根修饰,香叶基修饰,乙酰基修饰,泛素修饰,碳水化合物修饰,氨甲酰基修饰,或其组合。

174.权利要求169-173任一项的用途,其中该第一生物标志物特异性结合剂包含一级抗体。

175.权利要求174的用途,其中该一级抗体是天然的,未修饰的抗体。

176.权利要求174或权利要求175的用途,其中该一级抗体是单克隆的或多克隆的。

177.权利要求169-176任一项的用途,其中该第二结合剂包含二级抗体。

178.权利要求169-177任一项的用途,其中该二级酶包含氧化还原酶,水解酶,或过氧化物酶。

179.权利要求178的用途,其中该过氧化物酶包含辣根过氧化物酶。

180.权利要求169-179任一项的用途,其中该半抗原包含生物素,洋地黄毒苷,硝基吡唑,苯并呋咱,苯并二氮卓,硝基肉桂酰胺,或二硝基苯基。

181.权利要求169-180任一项的用途,其中该第三结合剂包含三级抗体。

182.权利要求181的用途,其中该三级抗体包含单克隆抗体。

183.权利要求169-182任一项的用途,其中该酪胺-罗丹明染料包含罗丹明110,罗丹明6G,四甲基罗丹明,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,或其组合。

184.权利要求169-183任一项的用途,其中该可检测模块包含DAB,4-硝基苯基磷酸酯,坚固红,溴氯吲哚基磷酸酯,硝基蓝四唑,BCIP/NBT,坚固红,AP橙,AP蓝,四甲基联苯胺,2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐],邻联茴香胺,4-氯萘酚,硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷,邻苯二胺,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷,甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷,对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸,3-氨基-9-乙基咔唑,品红,碘硝基四唑

四唑

蓝,或四唑

紫。

185.权利要求169-184任一项的用途,其中将该方法应用于其中检测和区分两种或更多种分泌的靶蛋白生物标志物的多路免疫组织化学测定法。

186.权利要求169-185任一项的用途,其中该方法容许其中检测和区分一种分泌的靶蛋白生物标志物和一种或多种另外的靶蛋白生物标志物的多路IHC测定法。

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