CN112834736A - 一种检测多种抗原的病理检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种同时检测N种抗原的试剂盒，属于生物学检测技术领域及免疫学领域，所述试剂盒包括：能够特异性结合所述N种抗原的N种第一抗体组成的第一抗体组合物；抗所述N种第一抗体的N种第二抗体组成的第二抗体组合物，所述N种第二抗体分别与N种人工多肽偶联；分别抗所述N种人工多肽的N种第三抗体或其抗原结合部分组成的第三抗体组合物或抗原结合部分组合物，所述第三抗体或其抗原结合部分分别与多聚物偶联，与N种第三抗体偶联的多聚物上偶联N种显色剂。利用不同的显色剂，能够用于N种抗原的同时检测，特异性好，灵敏度高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域及免疫学领域，具体地，一种同时检测多种抗原的病理检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对病理组织中相应抗原进行定性、定位或定量测定的一项免疫学检测技术。免疫组织化学检测原理是：组织切片经抗原热修复处理后与一抗试剂进行孵育，在原位形成一抗与目标抗原的抗原-抗体复合物；抗原-抗体复合物中一抗分子再与酶标记的聚合物二抗通过孵育结合，在原位进一步形成抗原-抗体-二抗聚合物的复合物；最后通过酶催化的底物在抗原部位形成有颜色的沉积物。光学显微镜下通过观察棕色部位来确定是否有目标抗原及其表达情况。通过免疫组织化学染色可确定病理组织细胞类型和形态、辨认组织细胞产物的来源、确定组织细胞的分化程度；尤其在临床病理中的应用最为重要，如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后；辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。
目前国内市场上供应“抗体-酶标记-多聚物检测***”二抗产品的公司主要有：(1)Dako公司的Envision二抗，使用链状的葡聚糖为多聚物载体，在载体上连接多个酶分子与二抗分子，使检测信号放大，但是链状的葡聚糖分子量较大，整个酶-抗体聚合物与组织蛋白结合时产生较大的空间位阻，对于低丰度表达的蛋白检测灵敏度不高；(2)CN105566499A公开了的病理增强型二抗原理是使用葡萄串式多聚物为载体制备的酶标二抗，使多个酶紧密地连接到球状多分支载体体分子上，属于一步法二抗的制备。(3)德国SDTGmbH,Baesweiler发明的AmpliStainTMdetection systems使用蛇形链接物作物骨架制备酶-载体-二抗复合物。(4)罗氏诊断试剂公司开发的二抗，是以天然存在的小分子半抗原(如农药、兽药、抗生素、量子点等)与抗体偶联，以天然存在的小分子半抗原与对应酶多聚物抗小分子半抗原抗体结合，从而实现组织蛋白的免疫组化检测；但该方法需要天然半抗原小分子，交联过程需要较多有毒有害化学试剂，且偶联过程复杂，故生产费用较高。
目前，现有技术在聚合物结构设计、制备工艺上没有大的改进，具体体现在：单位体积内酶、抗体数量没有显著增加；聚合物空间位阻没有明显降低，导致灵敏度没有改善，故急需效果更好的病理检测增强型二抗。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供一种人工多肽组合物，其包括人工多肽PL、人工多肽HM和人工多肽LH中的至少一种，其中，
所述人工多肽PL的氨基酸序列包括AAP(AADAAD)nAAPAAA，其中n＝1～10，即具有SEQ ID NO.1-10所示氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，为了方便偶联蛋白，在该氨基酸的N端或C端添加1个半胱氨酸(C)。
所述人工多肽HM的氨基酸序列包括GQA(T)nAQQ，其中n＝1～10，即具有SEQ IDNO.11-20所示氨基酸序列序列。在本发明的一些实施方案中，为了方便偶联蛋白，在该氨基酸的N端或C端添加1个半胱氨酸(C)。
所述人工多肽LH的氨基酸序列包括TTT(PTT)n，其中n＝1～10，即具有SEQ IDNO.21-30所示氨基酸序列序列。在本发明的一些实施方案中，为了方便偶联蛋白，在该氨基酸的N端或C端添加1个半胱氨酸(C)。
在本发明中，所述人工多肽又称为非天然多肽、合成多肽或人工合成多肽。其在哺乳动物体内天然不存在，尤其在人体内不存在，由此可避免交叉反应。
本发明的第二方面提供一种单抗组合物，包括分别抗本发明第一方面所述的人工多肽PL、人工多肽HM和人工多肽LH的单抗中的至少一种。其中，所述单抗又称为单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，抗人工多肽PL的单抗的重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3分别具有SEQ ID NO:31-36所示的氨基酸序列。该抗体为兔源抗体，可特异性结合人工多肽PL，EC50为9.94ng/mL。
在本发明的一些实施方案中，抗人工多肽HM的单抗的重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3分别具有SEQ ID NO:37-42所示的氨基酸序列。该抗体为兔源抗体，可特异性结合人工多肽HM，EC50为11.6ng/mL。
在本发明的一些实施方案中，抗人工多肽LH的单抗的重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3分别具有SEQ ID NO:43-48所示的氨基酸序列。该抗体为兔源抗体，可特异性结合人工多肽LH，EC50为1.78ng/mL。
本发明第三方面提供一种人工多肽-抗体偶联物组合物，其包括本发明第一方面所述人工多肽PL与抗体形成的人工多肽PL-抗体偶联物、本发明第一方面所述人工多肽HM与抗体形成的人工多肽HM-抗体偶联物和本发明第一方面所述人工多肽LH与抗体形成的人工多肽LH-抗体偶联物中的至少一种，其中，所述抗体为多抗，即多克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述多抗为羊抗鼠多抗或羊抗兔多抗。
本发明第四方面提供一种多聚物组合物，其包括偶联有本发明第二方面所述抗人工多肽PL的单抗的抗原结合部分的多聚物、偶联有本发明第二方面所述抗人工多肽HM的单抗的抗原结合部分的多聚物和偶联有本发明第二方面所述抗人工多肽LH的单抗的抗原结合部分的多聚物中的至少一种，其中，所述多聚物还偶联有显色剂。由此形成抗人工多肽PL单抗-显色剂标记-多聚物、抗人工多肽HM单抗-显色剂标记-多聚物或抗人工多肽LH单抗-显色剂标记-多聚物。
在本发明的一些实施方案中，所述显色剂为荧光素、酶、金属离子、量子点或同位素。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-糖苷酶。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分为Fab'片段。
本发明的第五方面提供本发明第一方面所述的人工多肽组合物或其与本发明第二方面所述的单抗组合物在制备用于病理检测的试剂盒中的应用。
本发明的第六方面提供一种用于病理检测的试剂盒，包括本发明第三方面所述的人工多肽-抗体偶联物组合物和本发明第四方面所述的多聚物组合物。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于一抗。所述人工多肽-抗体偶联物中的多抗可以结合所述单抗。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括染色剂和复染剂。进一步地，所述试剂盒还包括样本处理试剂。
在本发明的一些实施方案中，所述复合物包括含有两种抗原的生物样本，结合第一抗原的第一一抗和结合第二抗原的第二一抗，所述的人工多肽-抗体偶联物组合物中的两种；所述的多聚物组合物中的两种，所述多聚物上的单抗的抗原结合部分与相应的人工多肽结合，所述人工多肽-抗体偶联物上的多抗分别与第一一抗和第二一抗结合，所述第一一抗和第二一抗分别与生物样本上的第一抗原和第二抗原结合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述复合物包括含有两种抗原的生物样本，结合第一抗原的第一一抗和结合第二抗原的第二一抗，人工多肽PL-抗体偶联物和人工多肽HM-抗体偶联物；抗人工多肽PL单抗-显色剂标记-多聚物和抗人工多肽HM单抗-显色剂标记-多聚物。所述第一一抗是兔单抗，所述第二一抗是鼠单抗，所述人工多肽PL-抗体偶联物为人工多肽PL-羊抗兔多抗偶联物，所述人工多肽HM-抗体偶联物为人工多肽HM-羊抗鼠多抗偶联物。其中，所述抗人工多肽PL单抗与所述人工多肽PL结合，所述抗人工多肽HM单抗与所述人工多肽HM结合；所述羊抗兔多抗与所述兔单抗结合，所述羊抗鼠多抗与所述鼠单抗结合；所述兔单抗与所述第一抗原结合，所述鼠单抗与所述第二抗原结合。由此形成所述复合物。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述复合物包括含有两种抗原的生物样本，结合第一抗原的第一一抗和结合第二抗原的第二一抗，人工多肽PL-抗体偶联物和人工多肽LH-抗体偶联物；抗人工多肽PL单抗-显色剂标记-多聚物和抗人工多肽LH单抗-显色剂标记-多聚物。所述第一一抗是兔单抗，所述第二一抗是鼠单抗，所述人工多肽PL-抗体偶联物为人工多肽PL-羊抗兔多抗偶联物，所述人工多肽LH-抗体偶联物为人工多肽LH-羊抗鼠多抗偶联物。其中，所述抗人工多肽PL单抗与所述人工多肽PL结合，所述抗人工多肽LH单抗与所述人工多肽LH结合；所述羊抗兔多抗与所述兔单抗结合，所述羊抗鼠多抗与所述鼠单抗结合；所述兔单抗与所述第一抗原结合，所述鼠单抗与所述第二抗原结合。由此形成所述复合物。
在本发明的又一些具体实施方案中，所述复合物包括含有两种抗原的生物样本，结合第一抗原的第一一抗和结合第二抗原的第二一抗，人工多肽HM-抗体偶联物和人工多肽LH-抗体偶联物；抗人工多肽HM单抗-显色剂标记-多聚物和抗人工多肽LH单抗-显色剂标记-多聚物。所述第一一抗是兔单抗，所述第二一抗是鼠单抗，所述人工多肽HM-抗体偶联物为人工多肽HM-羊抗兔多抗偶联物，所述人工多肽LH-抗体偶联物为人工多肽LH-羊抗鼠多抗偶联物。其中，所述抗人工多肽HM单抗与所述人工多肽HM结合，所述抗人工多肽LH单抗与所述人工多肽LH结合；所述羊抗兔多抗与所述兔单抗结合，所述羊抗鼠多抗与所述鼠单抗结合；所述兔单抗与所述第一抗原结合，所述鼠单抗与所述第二抗原结合。由此形成所述复合物。
在本发明的一些实施方案中，所述复合物包括含有三种抗原的生物样本，结合第一抗原的第一一抗、结合第二抗原的第二一抗和结合第三抗原的第三一抗，人工多肽PL-抗体偶联物、人工多肽HM-抗体偶联物和人工多肽LH-抗体偶联物；抗人工多肽LH单抗-显色剂标记-多聚物、抗人工多肽HM单抗-显色剂标记-多聚物和抗人工多肽LH单抗-显色剂标记-多聚物，所述第一一抗是第一兔单抗，所述第二一抗是第二兔单抗、所述第三一抗是鼠单抗，所述人工多肽PL-抗体偶联物为人工多肽PL-羊抗兔多抗偶联物，所述人工多肽HM-抗体偶联物为人工多肽HM-羊抗兔多抗偶联物，所述人工多肽LH-抗体偶联物为人工多肽LH-羊抗鼠多抗偶联物。其中，所述抗人工多肽PL单抗与所述人工多肽PL结合，所述抗人工多肽HM单抗与所述人工多肽HM结合，所述抗人工多肽LH单抗与所述人工多肽LH结合；所述人工多肽PL-羊抗兔多抗偶联物上的羊抗兔多抗与所述第一兔单抗结合，所述人工多肽HM-羊抗兔多抗偶联物上的羊抗兔多抗与所述第二兔单抗结合，所述羊抗鼠多抗与所述鼠单抗结合；所述第一兔单抗与所述第一抗原结合，所述第二兔单抗与所述第二抗原结合，所述鼠单抗与所述第三抗原结合。由此形成所述复合物。
进一步地，由于第一一抗和第二一抗均为兔单抗，为了避免交叉反应，在制备复合物时，需要先利用第一一抗和第三一抗、人工多肽PL-羊抗兔偶联物和人工多肽LH-羊抗鼠多抗偶联物、抗人工多肽PL单抗-显色剂标记-多聚物和抗人工多肽LH单抗-显色剂标记-多聚物分别进行一抗孵育、一抗后孵育和二抗孵育，然后再利用第二一抗、人工多肽HM-羊抗兔偶联物、抗人工多肽HM单抗-显色剂标记再次进行一抗孵育、一抗后孵育和二抗孵育。其中人工多肽PL-羊抗兔偶联物的使用量需过量，避免有第一一抗未与多抗结合而造成交叉反应。
基于上述原理，
本发明第八方面提供一种同时检测N种抗原的试剂盒，包括：能够特异性结合所述N种抗原的N种第一抗体组成的第一抗体组合物；抗所述N种第一抗体的N种第二抗体组成的第二抗体组合物，所述N种第二抗体分别与N种人工多肽偶联；分别抗所述N种人工多肽的N种第三抗体或其抗原结合部分组成的第三抗体组合物或抗原结合部分组合物，所述第三抗体或其抗原结合部分分别与多聚物偶联，与N种第三抗体偶联的多聚物上偶联N种显色剂。
在本发明的一些实施方案中，所述显色剂为荧光素、酶、金属离子、量子点或同位素。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-糖苷酶。
在本发明的一些实施方案中，所述N为2-5。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分为Fab'片段。
在本发明的一些实施方案中，所述第一抗体和第三抗体为单抗，优选地为兔单抗或鼠单抗。所述第二抗体为多抗，优选地为羊抗兔多抗或羊抗鼠多抗。
本发明第九方面提供一种同时检测N种抗原的方法，包括以下步骤：
S1，将能够特异性结合所述N种抗原的N种第一抗体与所述N种抗原结合；
S2，将抗所述N种第一抗体的N种第二抗体与所述N种第一抗体结合，其中，所述N种第二抗体分别与N种人工多肽偶联；
S3，将抗所述N种人工多肽的N种第三抗体或其抗原结合部分与所述N种组成的第三抗体组合物或抗原结合部分组合物，所述第三抗体或其抗原结合部分分别与多聚物偶联，与N种第三抗体偶联的多聚物上偶联N种显色剂，
由于N种显色剂各不相同，从而完成N种抗原的同时检测。
在本发明的一些实施方案中，所述N为2-5。
在本发明的一些实施方案中，所述显色剂为荧光素、酶、金属离子、量子点或同位素。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-糖苷酶。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分为Fab'片段。
在本发明的一些实施方案中，所述第一抗体和第三抗体为单抗，优选地为兔单抗或鼠单抗。所述第二抗体为多抗，优选地为羊抗兔多抗或羊抗鼠多抗。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的人工多肽序列完全为人工设计，是哺乳动物体内天然不存在的序列，利用化学合成方法生产，稳定性好，成本低。
利用本发明人工多肽免疫产生的抗体不会与哺乳动物来源的样本，如组织发生非特异反应信号，而只会与该人工多肽发生反应产生信号，所以用于二抗检测***可避免产生非特异性信号，特异性更好。
基于抗原、一抗、一抗后和多聚物二抗特异性结合建立病理增强型二抗检测方法，稳定性与重复性好，特别适合于免疫组化中表达丰度低的蛋白的检测，有效提高检测的灵敏度与特异性。
使用不同人工多肽标记不同单抗-酶标记-多聚物后配以不同的底物显色液，不同的人工多肽及其特异性抗体组合使用，可以实现双重染色或多重染色，可在同一实验中提供多项指标检测结果，判断更加准确。
本发明还可应用于ELISA、Westernblot、免疫细胞化学等方面的检测，特异性好，灵敏度高，应用前景广阔。
本发明制备的人工多肽及其抗体在病理诊断中可实现放大信号，制备过程避免较多有毒有害化学试剂，且偶联过程简单，易于大批量生产。
附图说明
图1示出了利用人工多肽增强型二抗进行检测的示意图。A：单个抗原检测，B：两个抗原同时检测。
图2示出了人工多肽PL及其抗体ELISA结合曲线。
图3示出了人工多肽HM及其抗体ELISA结合曲线。
图4示出了人工多肽LH及其抗体ELISA结合曲线。
图5示出了羊抗鼠、羊抗兔多抗血清滴度ELISA结果。
图6示出了还原SDS-PAGE鉴定纯化的羊抗鼠、羊抗兔结果图。蛋白上样量为10μg，泳道1为羊抗兔IgG。泳道2为羊抗鼠Ig。
图7示出了羊抗鼠多抗识别小鼠免疫球蛋白亚型Western blot鉴定结果。
图8示出了羊抗兔多抗识别兔IgG亚类。
图9示出了人工多肽PL-羊抗鼠抗体偶联物与抗PL单抗ELISA结合曲线。
图10示出了人工多肽PL-羊抗兔抗体偶联物与抗PL单抗ELISA结合曲线。
图11示出了人工多肽HM-羊抗鼠抗体偶联物与抗HM单抗ELISA结合曲线。
图12示出了人工多肽HM-羊抗兔抗体偶联物与抗HM单抗ELISA结合曲线。
图13示出了人工多肽LH-羊抗鼠抗体偶联物与抗LH单抗ELISA结合曲线。
图14示出了人工多肽LH-羊抗兔抗体偶联物与抗LH单抗ELISA结合曲线。
图15示出了抗人工多肽PL抗体-酶标记-多聚物的鉴定结果。
图16示出了抗人工多肽HM抗体-酶标记-多聚物的鉴定结果。
图17示出了抗人工多肽LH抗体-酶标记-多聚物的鉴定结果。
图18示出了宫颈细胞涂片双染结果。A：p16/Ki-67双染阳性结果；B：p16/Ki-67双染阴性结果。
图19示出了使用HM、LH人工多肽及其抗体酶标多聚物对***组织进行p63/CK5双重染色鉴定结果图。
图20示出了使用PL、LH、HM人工多肽及其抗体荧光标记的多聚物对肾组织进行三重染色。
图21示出了使用人工多肽及其抗体组成的病理增强型二抗在免疫细胞化学应用。A：利用人工多肽HM及其抗体检测Raji细胞；B：利用人工多肽PL及其抗体检测Daudi细胞；C：利用人工多肽LH及其抗体检测Hela细胞。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1利用人工多肽制备增强型二抗体系
本实施例提供一种利用人工多肽制备增强型二抗的方法及其在病理检测中的应用。
首先，制备人工多肽，人工多肽序列完全为人工设计合成，其设计原则是：哺乳动物体内天然不存在的序列，其产生的抗体与哺乳动物，尤其是与人体组织上的蛋白无特异***叉反应。
其次，制备针对一抗的多抗，并与人工多肽偶联，形成人工多肽-抗体偶联物，即一抗后试剂。一种多抗可与多个人工多肽偶联，从而起到放大检测信号的作用。
然后，制备抗人工多肽的单抗或其抗原结合部分，并与多聚物和显色剂偶联，形成抗人工多肽抗体-显色剂标记-多聚物，由于多聚物上可以结合多个显色剂分子，从而起到再次放大检测信号的作用。同时，由于多聚物上可以结合多个抗人工多肽抗体或其抗原结合部分，从而可以提供灵敏度。
在使用过程中，如图1A所示，首先利用一抗与抗原结合，然后将人工多肽-抗体偶联物与一抗结合，再利用“抗人工多肽抗体-显色剂标记-多聚物”识别人工多肽，通过显色反应，完成检测。通过人工多肽及多聚物多重放大，可以提高检测灵敏度，尤其适用于低丰度待测抗原的检测。
针对两种或多种抗原检测，可以利用不同的多肽制备不同的人工多肽-抗体偶联物，并制备相应的抗人工多肽抗体-显色剂标记-多聚物，通过改变显色剂的种类，可以实现两种甚至多种抗原同时检测。
例如，如图1B所示，针对两种不同的抗原：第一抗原和第二抗原，可以采用两种不同的显然剂完成双重染色，从而达到同时检测的目的。具体地，包括以下步骤：
一抗孵育：首先分别或同时将能够特异性结合第一抗原的第一一抗和能够特异性结合第二抗原的第二一抗滴加到组织样本上。
一抗后孵育：分别或同时加入第一人工多肽-第一多抗偶联物(第一一抗后试剂)和第二人工多肽-第二多抗偶联物(第二一抗后试剂)。
二抗孵育：分别或同时加入抗第一人工多肽抗体-第一显色剂标记-多聚物(第一二抗)和抗第二人工多肽抗体-第二显色剂标记-多聚物(第二二抗)。
由于第一显色剂和第二显色剂的颜色或其他检测显示结果不同，可以完成两种抗原的同时检测。
第一一抗和第二一抗均为单抗，第一一抗仅能结合第一抗原，不能结合第二抗原；同样，第二一抗仅能结合第二抗原，不能结合第一抗原。
第一多抗仅能结合第一一抗，不能结合第二一抗；同样，第二多抗仅能结合第二一抗，不能结合第一一抗。当然，第一多抗和第二多抗也可以相同，但不能同时加入，即加入过量的第一一抗，去除多余的第一一抗后，加入过量第一多抗，去除多余的第一多抗后，再加入第二一抗，接着再加入第二多抗，可以达到相同的目的。
抗第一人工多肽抗体仅能结合第一人工多肽，不能结合第二人工多肽；同样，抗第二人工多肽抗体仅能结合第二人工多肽，不能结合第一人工多肽。
利用同样的原理和方法，可以制备针对三种甚至更多种抗原同时检测的一抗后试剂和二抗试剂，从而完成三种甚至更多种抗原的同时检测。
实施例2人工多肽
本实施例中涉及到的人工多肽是指在哺乳动物体内天然不存在，尤其在人体组织中不存在多肽。
人工多肽PL：氨基酸序列为TTT(PTT)n，n＝1～10，即为：
TTTPTT(SEQ ID NO:1)，
TTTPTTPTT(SEQ ID NO:2)，
TTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:3)，
TTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:4)，
TTTPTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:5)，
TTTPTTPTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:6)，
TTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:7)，
TTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:8)，
TTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:9)，或
TTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTTPTT(SEQ ID NO:10)，
为了方便偶联蛋白，可在该氨基酸的N端或C端添加1个半胱氨酸(C)。
人工多肽HM：氨基酸序列为AAP(AADAAD)nAAPAAA，n＝1～10，即为：
AAPAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:11)，
AAPAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:12)，
AAPAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:13)，
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:14)，
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:15)，
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:16)，
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:17)，
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:18)，
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQID NO:19)，或
AAPAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAADAAPAAA(SEQ ID NO:20)。
为了方便偶联蛋白，同样可在该氨基酸的N端或C端添加1个半胱氨酸(C)。
人工多肽LH：氨基酸序列为GQA(T)nAQQ，n＝1～10，即为：
GQATAQQ(SEQ ID NO:21)，
GQATTAQQ(SEQ ID NO:22)，
GQATTTAQQ(SEQ ID NO:23)，
GQATTTTAQQ(SEQ ID NO:24)，
GQATTTTTAQQ(SEQ ID NO:25)，
GQATTTTTTAQQ(SEQ ID NO:26)，
GQATTTTTTTAQQ(SEQ ID NO:27)，
GQATTTTTTTTAQQ(SEQ ID NO:28)，
GQATTTTTTTTTAQQ(SEQ ID NO:29)，或
GQATTTTTTTTTTAQQ(SEQ ID NO:30)。
为了方便偶联蛋白，同样可在该氨基酸的N端或C端添加1个半胱氨酸(C)。
实施例3抗人工多肽抗体的制备
将实施例2中人工多肽PL(TTTPTTPTT)免疫兔，进一步制备兔源单抗。该抗体可特异性结合人工多肽PL，ELISA结合曲线见图2，EC50为9.94ng/mL。
该抗人工多肽PL抗体运用Kabat在线软件分析，结果显示，该抗体的可变区序列具有以下信息：
(1)CDR-H1氨基酸序列包括：TNAMS(SEQ ID NO:31)。
(2)CDR-H2氨基酸序列包括：IISSSGSTYYARWAKG(SEQ ID NO:32)。
(3)CDR-H3氨基酸序列包括；GNI(SEQ ID NO:33)。
(4)CDR-L1氨基酸序列包括：QSSQSVYNNNLA(SEQ ID NO:34)。
(5)CDR-L2氨基酸序列包括：RASKLAS(SEQ ID NO:35)。
(6)CDR-L3氨基酸序列包括：LGGYDCSSADCGA(SEQ ID NO:36)。
利用同样的的方法，将实施例2中人工多肽HM(AAPAADAADAAPAAA)免疫兔，进一步制备兔源单抗。该抗体可特异性结合人工多肽HM，ELISA结合曲线见图3，EC50为11.6ng/mL。
该抗人工多肽HM抗体运用Kabat在线软件分析，结果显示，该抗体的可变区序列具有以下信息：
(1)CDR-H1氨基酸序列包括：SYAMG(SEQ ID NO:37)。
(2)CDR-H2氨基酸序列包括：IATTGSSTYHASWAKG(SEQ ID NO:38)。
(3)CDR-H3氨基酸序列包括；DGDWTGWYFSI(SEQ ID NO:39)。
(4)CDR-L1氨基酸序列包括：QASQSISNRLA(SEQ ID NO:40)。
(5)CDR-L2氨基酸序列包括：DASDLAS(SEQ ID NO:41)。
(6)CDR-L3氨基酸序列包括：QQGYGGDNIENL(SEQ ID NO:42)。
利用同样的的方法，将实施例2中人工多肽LH(GQATAQQ)免疫兔，进一步制备兔源单抗。该抗体可特异性结合人工多肽LH，ELISA结合曲线见图4，EC50为1.78ng/mL。
该抗人工多肽LH抗体运用Kabat在线软件分析，结果显示，该抗体的可变区序列具有以下信息：
(1)CDR-H1氨基酸序列包括：RYAMC(SEQ ID NO:43)。
(2)CDR-H2氨基酸序列包括：IIGVSGTTYYTSWAKG(SEQ ID NO:44)。
(3)CDR-H3氨基酸序列包括；VMPGYDDYGDDGFDP(SEQ ID NO:45)。
(4)CDR-L1氨基酸序列包括：QASEDIYSNLA(SEQ ID NO:46)。
(5)CDR-L2氨基酸序列包括：AASYLAS(SEQ ID NO:47)。
(6)CDR-L3氨基酸序列包括：QCTYYSGSYELFT(SEQ ID NO:48)。
值得说明的是，虽然上述单抗为其中一条人工多肽序列产生，但产生的表位集中在几个相同的氨基酸上，对所有具有相同表位的氨基酸均可识别，并且亲和力没有显著区别。
可知，本实施例制备的人工多肽抗体与对应的人工多肽氨基酸序列发生高灵敏度、高特异性的结合，可应用于各种病理检测中，如利用ELISA、Western blot、免疫细胞化学等进行病理检测。
实施例4羊抗鼠Ig、羊抗兔IgG的纯化及鉴定
分别利用小鼠免疫球蛋白(Ig)复合物和兔IgG免疫山羊，得到羊抗鼠或羊抗兔多抗血清。经ELISA鉴定，羊抗鼠IgG的血清滴度(EC50)为1：1950000，羊抗兔IgG的血清滴度(EC50)为1：3550000。ELISA曲线结果如图5所示。
对2个多抗分别进行Protein A纯化，纯化步骤如下：
(1)在需要纯化的羊抗鼠或羊抗兔多抗血清中加入等体积2×Binding Buffer，混匀备用。
(2)将新的Protein A柱竖直固定，根据所需柱体积加入等体积的BindingBuffer。重悬Protein A填料，吸取所需柱体积的填料悬浊液至柱中，盖上垫片后加入30CV去离子水冲洗主子，加入30CV Binding Buffer平衡柱子并调节自流柱的流速为1mL/min。
(3)从4℃取出Protein A柱，固定在自流塑料架上，恢复至室温后开始使用。
(4)在柱内酒精下降至上垫片表面时，加入30CV去离子水冲洗柱子，再加入30CVBinding Buffer平衡柱子，再加入30CV Binding Buffer平衡柱子并调节自流柱的流速为1mL/min。多抗血清样品室温上样，上样速度为1mL/min，收集流穿样品。
(5)流穿液经超滤浓缩并置换为PBS buffer，检测浓度后置于4℃备用。
对纯化的羊抗鼠、羊抗兔多抗分别进行还原型SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见图6，从图6可以看出羊抗鼠Ig多抗、羊抗兔IgG多抗使用还原的SDS-PAGE重链为50kD、轻链为25kD左右，目的条带正确无误。
对羊抗鼠纯化多抗分别使用IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM共5种亚型的单抗进行还原的SDS-PAGE跑胶，并转膜，进行Western blot检测。其中一抗为羊抗鼠纯化多抗，二抗为驴抗羊标记的HRP，使用显色液显色后，用凝胶成像仪进行拍照，鉴定结果见图7，从图7可知羊抗鼠多抗可识别小鼠免疫球蛋白分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM，共5种亚型。
对羊抗兔纯化多抗使用免疫原(纯化的兔IgG)进行包被酶标板，5％脱脂奶粉封闭后，羊抗兔纯化多抗从1μg/mL开始，进行4倍倍比稀释，共7个梯度，作为一抗加入酶标板，HRP标记的驴抗羊IgG作为二抗，TMB进行显色反应后，1M H2SO4进行终止反应后读板。ELISA实验结果见图8，从图8可知羊抗兔IgG可识别兔IgG亚类，且ELISA四参数拟合曲线EC50为9.63ng/mL。
实施例5人工多肽标记抗体或抗体片段
以人工多肽PL、HM或LH作为多抗的结合物，与羊抗鼠Ig、羊抗兔IgG进行偶联，其中羊抗鼠Ig包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM等免疫球蛋白亚类的混合物。多抗包括抗体全长或其抗原结合部分，其中抗原结合部分包括F(ab’)2、Fab’、ScFv等。
以人工多肽PL与羊抗兔IgG偶联为例：
(1)采用protein A初步纯化羊抗兔IgG后，分别过Mouse IgG、Rat IgG和HumanIgG亲和层析柱，收集洗脱液，使用OD280检测浓度后溶于一定体积的5mM EDTA。
(2)将Sulf-SPDP先溶于一定量的DMSO，再加入1×PBS溶液混匀。
(3)将Sulf-SPDP溶液缓慢加入羊抗兔IgG溶液中，一边加一边搅拌，混匀后室温放置1h进行活化。
(4)1h后，将活化的羊抗兔IgG溶液装入冷却的透析袋，放入2L预冷的1×PBS溶液中，再磁力搅拌器上4℃透析1h。
(5)1h后更换2L新鲜的1×PBS透析液，4℃透析2h；2h后更换2L新鲜1×PBS透析液，4℃透析2h。
(6)取与羊抗兔IgG等质量的人工多肽PL溶于适量DMSO中，再加入1×PBS快速混匀，立即加入1mL活化并透析完成的羊抗兔IgG溶液，混匀后4℃交联反应过夜。
(7)次日，4℃透析6h，期间换液2-3次。结束后，小管分装-20℃保存。
实施例6偶联物的鉴定
采用ELISA方法鉴定对偶联物进行鉴定：
使用实施例5制备的人工多肽PL/人工多肽HM/人工多肽LH-羊抗鼠或羊抗兔抗体偶联物包被酶标板，1μg/mL，50μL/well，4℃包被过夜。次日，洗板后，使用5％脱脂奶粉进行封闭，100μL/well，30℃封闭1h。以不同浓度梯度的抗人工多肽PL的兔单抗作为一抗，50μL/well，30℃孵育1h。羊抗兔IgG标记的HRP作为二抗，50μL/well，30℃孵育40min。使用TMB显色液进行显色后，1M硫酸终止反应后于酶标仪处读取OD450的值。
人工多肽PL-羊抗鼠或羊抗兔抗体偶联物间接ELISA检测结果见图9、图10。图9结果显示：人工多肽PL-羊抗鼠抗体偶联物与抗人工多肽PL单抗有免疫显色反应，且人工多肽PL偶联的羊抗鼠与抗人工多肽PL单抗ELISA结合曲线EC50为12ng/mL，偶联前的二者ELISA结合曲线EC50为9.94ng/mL，偶联后EC50是偶联前EC50的83％，结合活性损失较少。结果也表明羊抗鼠抗体上成功偶联了人工多肽PL。图10结果显示：人工多肽PL-羊抗抗兔抗体偶联物与抗人工多肽PL单抗有免疫显色反应，且人工多肽PL偶联的羊抗鼠与抗人工多肽PL单抗ELISA结合曲线EC50为11.5ng/mL，偶联前的二者ELISA结合曲线EC50为9.94ng/mL，偶联后EC50是偶联前EC50的86％，结合活性损失较少。结果也表明羊抗兔抗体上成功偶联了人工多肽PL。得到的人工多肽PL-羊抗鼠抗体偶联物和人工多肽PL-羊抗兔抗体偶联物，可制备得到一抗后试剂。
人工多肽HM-羊抗鼠或羊抗兔抗体偶联物间接ELISA检测结果见图11、图12。图11结果显示：人工多肽HM-羊抗抗鼠抗体偶联物与抗人工多肽HM单抗有免疫显色反应，且人工多肽HM偶联的羊抗鼠与抗人工多肽HM单抗ELISA结合曲线EC50为13.8ng/mL，偶联前的二者ELISA结合曲线EC50为11.6ng/mL，偶联后EC50是偶联前EC50的84％，结合活性损失较少。结果也表明羊抗鼠抗体上成功偶联了人工多肽HM。图12结果显示：人工多肽HM-羊抗兔抗体偶联物有免疫显色反应，且EC50为12.6ng/mL，偶联前的二者ELISA结合曲线EC50为11.6ng/mL，偶联后EC50是偶联前EC50的92％，结合活性损失较少。结果也表明羊抗兔抗体上成功偶联了人工多肽HM。得到的人工多肽HM-羊抗鼠抗体偶联物和人工多肽HM-羊抗兔抗体偶联物，可制备得到一抗后试剂。
人工多肽LH-羊抗鼠或羊抗兔抗体偶联物间接ELISA检测结果见图13、图14。图13结果显示：人工多肽LH-羊抗抗鼠抗体偶联物与抗人工多肽LH单抗有免疫显色反应，且人工多肽LH偶联的羊抗鼠与抗人工多肽LH单抗ELISA结合曲线EC50为4.81ng/mL，偶联前的二者ELISA结合曲线EC50为1.78ng/mL，偶联后的抗原抗体结合EC50仍然比较灵敏。结果也表明羊抗兔抗体上成功偶联了人工多肽LH。图14结果显示：人工多肽LH-羊抗鼠或羊抗兔抗体偶联物有免疫显色反应，且EC50为3.23ng/mL，偶联前的二者ELISA结合曲线EC50为1.78ng/mL，虽然偶联后EC50是偶联前EC50的55％，但偶联后的抗原抗体结合EC50也比较灵敏。结果也表明羊抗兔抗体上成功偶联了人工多肽LH。得到的人工多肽LH-羊抗鼠抗体偶联物和人工多肽LH-羊抗兔抗体偶联物，可制备得到一抗后试剂。
实施例7抗人工多肽抗体-显色剂标记-多聚物的制备
本实施例显色剂以辣根过氧化物酶(HRP)为例。
(1)使用Sulf-SMCC活化50mg辣根过氧化物酶(溶于0.01M pH7.4 PBS，含5mMEDTA，浓度为25mg/mL)室温活化30min，二者摩尔比为20-40:1，10kD超滤浓缩后待用。
(2)使用S-乙酰巯基丁二酸酐活化多聚物载体(分子量7W-12W)(多聚物载体溶于0.01M pH6.5 PBS溶液中。反应混合液用50kD超滤管超滤浓缩，并置换缓冲液为0.01MpH7.4 PBS。收集液超滤浓缩，4℃保存备用。
(3)将(1)与(2)制得的产物混合后置于4℃反应16-20h。添加1/10体积的0.1M巯基乙醇至上述反应液中，30℃反应20min。此步制得多聚物载体-酶复合物。
(4)使用Sephadex G-200柱子纯化步骤(3)中反应产物，收集403nm处高分子量处的溶液，超滤浓缩约3mL。此步制得多聚物载体-酶复合物。
(5)使用胃蛋白酶酶切抗人工多肽PL抗体/抗人工多肽HM抗体/抗人工多肽LH抗体，酶切缓冲液为pH3.2的柠檬酸缓冲液。37℃酶切2-3h，制备F(ab’)2。在制得的F(ab’)2添加适量0.1M的半胱胺盐酸盐，pH6.0，37℃反应1.5h，其中半胱胺盐酸盐与抗体F(ab’)2的摩尔质量比为100:1-150:1，制备带有巯基的Fab’。
(6)取适量Sulf-SMCC活化制得的多聚物载体-酶复合物，室温反应30min。使用50kD的超滤管进行超滤浓缩并置换缓冲液为0.01M pH7.4PBS后；收集403nm处的组分。
(7)将步骤(6)获得的复合物与抗人工多肽PL单抗/抗人工多肽HM抗体/抗人工多肽LH抗体的Fab’混合，4℃反应16-20h。反应结束后，加入适量体积的0.1M巯基乙醇，30℃反应20min；然后，在Sephadex G-200分子筛上对合成的反应混合物进行纯化。
分别在280nm和403nm处测定吸光度，结果如图15、图16和图17所示。
图15-17分别示出了抗人工多肽PL抗体-酶标记-多聚物、抗人工多肽HM抗体-酶标记-多聚物和了抗人工多肽LH抗体-酶标记-多聚物的鉴定结果，其中具有两个峰的高分子量滤液组分是相应的多聚物，可以制作二抗试剂。
实施例8双重染色放大信号鉴定组织或细胞类型
检测方法如下：
(1)取宫颈细胞薄片(用于同时检测p16与Ki-67)置于95％乙醇中，浸泡固定30min后风干备用。取石蜡包埋的***增生组织切片(用于同时检测p63与CK5)进行脱蜡、水化。
(2)使用Tris-EDTA，pH9.0抗原修复缓冲液，在高温常压下对组织抗原进行煮沸15-20min修复。待15-20min后关火，并将组织切片一直放在抗原修复缓冲液中冷却至室温。
(3)将冷却至室温的切片使用自来水涮洗3次，每次10-30秒。
(4)使用3％H2O2封闭组织切片上的内源性过氧化物酶，室温孵育10min。
(5)拿出染色架，倒掉塑料染色缸中的H2O2，加入自来水后放入染色架涮洗切片，涮洗3次，每次涮10下。
(6)画圈：使用无尘纸将切片上组织周围的水擦干，免疫组化笔在组织周围画圈，画圈位置距离组织2-3mm，画好圈的片子浸泡在PBST中。
(7)一抗孵育：将切片排列在湿盒中，在切片上滴加第一一抗和第二一一抗试剂，3滴/张(视切片大小以完全覆盖切片组织为宜)。室温孵育30min后，收集切片，在PBST中涮洗3次，每次涮10下。
(8)一抗后孵育：将切片排列在湿盒中，其中实验组切片上滴加第一一抗后试剂和第二一抗后试剂2滴/张(视切片大小以完全覆盖切片组织为宜)，另一组切片上滴加对照一抗后试剂(ImmunoHistoProbe，Cat#1981-07，Advanced-Biosystems)，室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗。
(9)二抗孵育：将切片排列在湿盒中，实验组切片上滴加第一二抗试剂和第二二抗试剂2滴/张(视切片大小以完全覆盖切片组织为宜)，对照组切片上滴加酶标多聚物二抗。室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗。
(10)DAB显色：根据所需的用量配置新鲜的DAB显色液。将切片排列在湿盒中，在切片上滴加DAB显色液100μL/张(视切片大小以完全覆盖切片组织为宜)，显色1-5min(镜检控制染色)，自来水冲洗终止显色。收集切片，在自来水中涮洗。
(11)AP显色：根据所需的用量配置新鲜的AP显色液。将切片排列在湿盒中，在切片上滴加AP显色液100μL/张(视切片大小以完全覆盖切片细胞为宜)，显色5-10分钟(镜检控制染色)，自来水冲洗终止显色。收集切片，在自来水中涮洗。
(12)苏木素复染：将切片放入苏木素染液中4min。用自来水涮洗除去多余的染料，后在PBST溶液中返蓝约1min。
(13)梯度酒精脱水、透明、封片。
(14)显微镜下观察染色结果。
利用上述方法，分别利用实施例6制备的一抗后试剂和实施例7制备的二抗试剂，结合特定的一抗，分别对石蜡包埋的不同类型的人体组织切片进行双重染色，具体实验方案如表1所示：
表1双重染色放大信号鉴定组织或细胞类型
宫颈细胞涂片双染结果见图18。图中p16染宫颈细胞质/胞核为红色染色，且Ki-67染宫颈细胞核为棕色染色判为阳性，只有p16或Ki-67染色或无染色的情况均判为阴性结果。***组织双染结果见图19。图中p63染***上皮细胞胞核，为棕色染色，且CK5染***上皮胞浆，为红色染色。
以上结果显示该检测体系可应用于病理组织的双染，为临床诊断提供参考依据。
实施例9三重染色鉴定组织或细胞类型
本实施例以COL4A1、PAX-8及WT1对人肾组织切片进行三重染色，实验方案如表2所示。
表2三重染色鉴定组织或细胞类型
选择人体石蜡包埋组织切片肾组织1张进行脱蜡、水化。利用实施例8描述的方法进行抗原修复等操作。并首先利用第1组别的试剂和第2组别的试剂进行一抗孵育、一抗后孵育和二抗孵育；接着再利用第3组别的试剂利用一抗孵育、一抗后孵育和二抗孵育，其中人工多肽PL-羊抗兔抗体偶联物的添加量需要过量，由此可避免部分与COL4A1抗原结合兔源COL4A1单抗，由于未与人工多肽PL-羊抗兔抗体偶联物，而与后加入的人工多肽HM-羊抗兔抗体偶联物结合，造成检测的非特异性。
在第二次二抗孵育后，在切片上滴加1滴抗荧光淬灭剂(含DAPI)，置于荧光显微镜下观察，并拍照。三重荧光染色结果见图20，图中COL4A1染肾组织基底膜，为绿色荧光；PAX-8染肾组织肾小管上皮细胞，细胞核为黄色荧光；WT1染肾组织肾小球上皮细胞胞核为红色染色。
实施例10免疫细胞化学应用
利用免疫细胞化学检测方法对不同细胞进行检测，实验方案如表3所示：
表3增强型二抗免疫细胞化学检测
分别取相应的细胞制备的细胞蜡块切片，进行脱蜡、水化，之后按照实施例8描述的方法进行染色。
染色结果如图21所示，Raji细胞(A)使用CD20兔单抗进行免疫细胞染色后，细胞膜呈棕色染色。Daudi细胞(B)和Hela细胞(C)分别使用FoxP1兔单抗和Ki-67兔单抗使用进行免疫细胞染色后，细胞核呈棕色染色。
以上结果表明，使用人工多肽PL、HM和LH及其抗体组成的病理增强型二抗可实现细胞蜡块的免疫学染色。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 杭州百凌生物科技有限公司
<120> 一种检测多种抗原的病理检测试剂盒及其制备方法和应用
<130> AJ2010229
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1 5 10
Claims (10)
1.一种同时检测N种抗原的试剂盒，其特征在于，包括：
能够特异性结合所述N种抗原的N种第一抗体组成的第一抗体组合物；抗所述N种第一抗体的N种第二抗体组成的第二抗体组合物，所述N种第二抗体分别与N种人工多肽偶联；
分别抗所述N种人工多肽的N种第三抗体或其抗原结合部分组成的第三抗体组合物或抗原结合部分组合物，所述第三抗体或其抗原结合部分分别与多聚物偶联，与N种第三抗体偶联的多聚物上偶联N种显色剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为荧光素、酶、金属离子、量子点或同位素。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-糖苷酶。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述N为2-5。
5.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体和第三抗体为单抗，所述第二抗体为多抗。
6.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原结合部分为Fab'片段。
8.一种同时检测N种抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将能够特异性结合所述N种抗原的N种第一抗体与所述N种抗原结合；
S2，将抗所述N种第一抗体的N种第二抗体与所述N种第一抗体结合，其中，所述N种第二抗体分别与N种人工多肽偶联；
S3，将抗所述N种人工多肽的N种第三抗体或其抗原结合部分与所述N种组成的第三抗体组合物或抗原结合部分组合物，所述第三抗体或其抗原结合部分分别与多聚物偶联，与N种第三抗体偶联的多聚物上偶联N种显色剂，
由于N种显色剂各不相同，从而完成N种抗原的同时检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述N为2-5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一抗体和第三抗体为单抗，所述第二抗体为多抗。
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