CN109884303B - 一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用，涉及多重免疫组化技术领域，本发明所述多重免疫组化分析试剂盒，其中限定了单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组(panel 1)和第二单克隆抗体组(panel 2)；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体。本发明所述多重免疫组化分析试剂盒以人离体肝组织石蜡切片为样本进行检测，进而预测免疫检查点抑制剂对肝癌的作用有效性。

Description

一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用

技术领域

本发明涉及多重免疫组化技术领域，尤其涉及一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

肝癌是全球第二大癌症相关的死亡原因。据估算，2012年全球新发肝癌例数达78.2万，肝癌死亡病例74.5万，其中大约50％发生在中国。肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的90％，可由乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染、酗酒以及与糖尿病和肥胖相关的代谢综合征引起。在过去的十年中，HCC的分子发病机制取得了重大的研究进展，但目前的治疗方法仍然非常有限。只有少数肝癌患者在早期被诊断出来，此时的治疗方法如手术切除、移植或局部消融对早期肝癌患者尚有效。在晚期患者中，唯一能够提高生存率的***性治疗是多酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib，一线)和瑞格拉非尼(Regorafenib，二线)，尽管如此，患者的平均预期寿命也不到2年。

近年来，免疫检查点抑制剂通过靶向T细胞的调控通路，释放机体自身的免疫反应来攻击肿瘤，在不同实体肿瘤中显示出显著的疗效。Ipilimumab(anti-CTLA-4)、Nivolumab(anti-PD1)、Pembrolizumab(anti-PD1)等8种免疫检查点抑制剂已经获得监管机构的批准，改变了癌症治疗的前景。肝癌患者预后一般较差，有症状性的肝癌患者5年生存率<5％。此外，这些肿瘤已被证明对放疗和化疗具有相当的耐药性，在肝细胞癌中，免疫治疗是一种很有吸引力的选择。基于CheckMate-040研究，2017年FDA加速批准了抗程序性死亡受体1(PD1)单抗Nivolumab用于既往曾接受索拉非尼治疗的晚期HCC患者的治疗。接受Nivolumab治疗的患者的客观缓解率为20％，疾病控制率64％，缓解持续时间达到17个月，无进展生存为4个月，中位总生存尚未达到，剂量递增组的中位总生存为15个月，同时安全性良好。新的实验数据表明，瘤内T细胞浸润、干扰素(IFN)信号、检查点分子(PD1、PDL1表达)或高肿瘤突变负担的存在可能有利于临床缓解。不幸的是，对于肝癌肿瘤的免疫学特征以及如何利用这些信息最大限度地提高对免疫疗法的反应率，我们知之甚少。所以，检测肝癌肿瘤微环境中免疫细胞亚群及免疫检查点分子的情况，对于预测患者应用免疫检查点抑制剂药物是否有效是非常有利的。

现有的免疫组化常用二氨基联苯胺(即3,3，-diaminobenzidine，DAB)显色，其原理是因为二氨基联苯胺是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累，形成棕褐色不溶性产物。DAB主要和蛋白质的NH2或SH基团结合，形成稳定的nn键或ns键，然后DAB中的显色基团就能显示出颜色，标记到已经暴露的蛋白质上，从而显示目标细胞的蛋白质分布及种类等。现有技术在一张切片上一般标记一个分子。虽然目前有一些多重标记的免疫组化染色方法，但是这些多重组化染色方法在洗脱时会对前一轮形成的染色造成影响，往往需要添加染色增强剂等，检测结果不够精确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用，该试剂盒可以有效地预测免疫检查点抑制剂的有效性，具有灵敏度高、特异性好的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、核染色剂和荧光基团标记的酪氨盐，所述荧光基团标记的酪氨盐中荧光基团的种类数量与单克隆抗体组中单克隆抗体种类的数量一致；

所述单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组和第二单克隆抗体组；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体。

优选的，所述试剂盒还包括防猝灭剂、洗涤剂和封闭液。

优选的，所述洗涤液为TBST缓冲液。

优选的，所述核染色剂为DAPI染色剂。

优选的，所述荧光基团包括520-FITC、570-Cy3、620-Cy3.5、650-Cy5和690-Cy5.5。

本发明还提供了一种上述方案所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与所述单克隆抗体组中的任意一种单克隆抗体混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗复合物；

(2)将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物；

(3)将抗原-一抗-二抗复合物、任意一种荧光基团标记的酪氨盐以及过氧化氢混合进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物；

(4)将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，微波处理，洗涤，得到第二荧光标记复合物；

所述微波处理的条件包括：750～850w处理1～3min，再以200～300w处理12～20min；

(5)以第二荧光标记复合物作为待测样品重复步骤(1)～(4)，重复至所述单克隆抗体组中的各单克隆抗体全部与待测样品结合过一次为止，得到多重标记复合物；

其中，步骤(1)中第一次和每次重复采用的单克隆抗体互不相同，步骤(3)中第一次和每次重复采用的荧光基团标记的酪氨盐互不相同；

(6)向步骤(5)所得的多重标记复合物中添加核染色剂，孵育，洗涤，封片，以连续光谱成像、检测。

优选的，步骤(1)中，当孵育的单克隆抗体为CD66B单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、CD163单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体或CD68单克隆抗体时，孵育温度为35～42℃；当孵育的单克隆抗体为PDL1单克隆抗体时，孵育温度为2～6℃；所述第一单克隆抗体组中抗体的孵育顺序依次为：CD66B单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD163单克隆抗体、CD8单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组中抗体的孵育顺序依次为：PD-1单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD68单克隆抗体。

优选的，所述步骤(1)中单克隆抗体使用时稀释倍数为50～500倍；所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶标记的二抗的用量为50～200μL/样品。

本发明还提供了上述方案所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒在预测免疫检查点抑制剂对肝癌治疗有效性中的应用，其特征在于，所述应用包括：

S1、利用上述方案所述试剂盒检测待测样品中CD8⁺PDL1^-，CD8⁺PD1^-，CD68⁺PD1^-，CD68⁺PDL1^-，CD68⁺和CD8⁺的数量；

S2、根据S1的测定结果计算CD68⁺/CD8⁺的比值；

S3、根据S1和S2的测定和计算结果，当待测样品中CD8⁺PDL1^-＞2.14、CD8⁺PD1^-＞2.83时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高；

或者当待测样品中CD68⁺/CD8⁺＜5.49、CD68⁺PD1^-＜8.15和CD68⁺PDL1^-＜8.15时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，其中限定了单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组和第二单克隆抗体组；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体。本发明提供的多重免疫组化分析试剂盒以以人离体肝组织石蜡切片作为样本进行检测，可在同一组织样品中同时标记多个免疫细胞标志物、肿瘤细胞标志物以及免疫相关分子，利用试剂盒的检测待测样品中CD8⁺PDL1^-，CD8⁺PD1^-，CD68⁺PD1^-，CD68⁺PDL1^-以及CD68⁺，CD8⁺的数量，并计算CD68⁺/CD8⁺的比值；根据各指标高于或低于阈值来判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者获得良好治疗效果的几率更高。

本发明还提供了上述技术方案所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒的使用方法，首先以单克隆抗体组中的其中一种单克隆抗体标记待测样品，形成抗原-一抗复合物；再以辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗结合一抗，形成抗原-一抗-二抗复合物；添加过氧化氢和其中一种荧光基团标记的酪氨盐后，在过氧化氢存在的情况下，荧光基团标记的酪氨盐在HRP催化下形成含有共价键键合位点的酶促产物(带有荧光基团)，与周围(包括抗原、一抗和二抗上)的蛋白残基(色氨酸、组氨酸和酪氨盐残基等)结合，这样在抗原-一抗结合部位将聚集大量的含有荧光基团标记的酶促产物，因而抗原(一抗所识别的免疫检查点)数量越多则其结合的酶促产物越多，带有的荧光基团也就越多，进而其检测信号越强。

将酶促反应得到的荧光标记进行微波处理可分离抗原与一抗(单克隆抗体组中的单克隆抗体)的结合，洗脱后即可去除单克隆抗体；由于酶促产物与抗原为共价键结合，微波处理对酶促产物和抗原结合的影响较小，不会影响标记在抗原上的荧光信号强度，从而实现了在确保上一轮荧光标记信号不丢失的情况下彻底去除上一轮抗体，不会对下一轮单克隆抗体标记造成干扰。采用不同的单克隆抗体和不同的荧光基团标记的酪氨盐，按照上述方法重复进行，即可实现在同一待测样品上标记多个分子，无需担心交叉反应，检测结果准确，最多可以同时标记六种不同的免疫标志物。将多重标记后的待测样品进行染色、封片，利用多光谱成像检测待测样品中的免疫标志物浓度即可。

可见，采用本发明提供的使用方法能够实现在同一待测样品上标记多个分子，并且消除了前一轮多克隆抗体的干扰，检测的准确度高、检测效率高。

附图说明

图1为实施例1中panel 1组免疫治疗效果好坏的病例展示图；其中图1A为panel 1组免疫治疗疗效差的病例谱图，图1B为panel 1组免疫治疗疗效好的病例谱图；

图2为实施例1中panel 2组免疫治疗效果好坏的病例展示图；其中图2A为panel 2组免疫治疗疗效差的病例谱图，图2B为panel 2组免疫治疗疗效好的病例谱图；

图3为A-Factorimportance森林图；

图4为ROC曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、核染色剂和荧光基团标记的酪氨盐，所述荧光基团标记的酪氨盐中荧光基团的种类数量与单克隆抗体组中单克隆抗体种类的数量一致；

所述单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组和第二单克隆抗体组；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体。

在本发明中，所述试剂盒还包括防猝灭剂、洗涤剂和封闭液。

在本发明中，所述单克隆抗体组中的各个单克隆抗体用于分别识别待检测的免疫检查点。在本发明中，所述多重免疫组化分析试剂盒具有特异性强、灵敏度高的优点。

在本发明中，所述单克隆抗体组中的各种单克隆抗体优选的为鼠源单克隆抗体和/或兔源单克隆抗体；在本发明的具体实施例中，PanCK、CD163、PD-1、CD68使用的二抗为中杉金桥生产的PV-6002(酶标山羊抗小鼠IgG聚合物)；CD66B、PDL1、CD8使用的二抗为中杉金桥生产的PV-6001(酶标山羊抗兔IgG聚合物。本发明对所述单克隆抗体组中的各种单克隆抗体的制备方法无特殊限定，采用市售商品或常规方法自行制备均可。

在本发明中，所述抗原修复液用于修复抗原，防止免疫组化染色时不能完全标记。本发明对所述抗原修复液的来源无特殊限定，采用本领域市售商品或已知配方均可，本发明的具体实施例中采用Perkin Elmer生产的Opal7-colorManual IHC Kit作为抗原修复液。

在本发明中，辣根过氧化物酶标记的二抗用于与所述单克隆抗体组中的单克隆抗体结合，其中的辣根过氧化物酶在有过氧化氢存在的情况下，催化荧光基团标记的酪氨盐生成带有共价结合位点的酶促产物，该酶促产物能够与待测样品中的蛋白残基结合，从而使荧光基团标记在待测样品上。本发明对所述辣根过氧化物酶标记的二抗来源无特殊限定，采用市售商品即可。

在本发明中，所述过氧化氢为辣根过氧化物酶的酶促反应提供条件。本发明对所述过氧化氢的来源无特殊限定。

在本发明中，所述荧光基团标记的酪氨盐作为反应底物，从而生成酶促反应，利用酶促产物与抗原中的蛋白残基结合，进而将酶促产物带有的荧光基团标记在待测样品上，并且荧光基团标记数量与采用的一抗所识别的标志物数量成正比，进而实现对待识别的抗原定量检测。本发明优选的，所述荧光基团包括520-FITC、570-Cy3、620-Cy3.5、650-Cy5和690-Cy5.5。

在本发明中，所述核染色剂优选为DAPI染色剂。在本发明中，所述的核染色剂用于标记细胞核。

在本发明中，所述试剂盒还包括防猝灭剂，所述防淬灭剂起到抗荧光衰减以及防止荧光猝灭的作用。本发明对所述防猝灭剂的种类无特殊限定，采用本领域市售商品即可。在本发明的具体实施例中，所述防猝灭剂优选为Boble Ryder抗荧光衰减封片剂。

在本发明中，所述封闭液用于封闭抗原，提高检测精确度。本发明对所述封闭液的种类无特殊限定，本发明的具体实施例中采用Perkin Elmer生成的Antibody Diluen/Block作为封闭液。

在本发明中，所述洗涤剂用于在检测过程中的洗涤步骤，本发明对所述洗涤剂优选为TBST缓冲液。

本发明提供的肝癌的多重免疫组化分析试剂盒针对肝癌的免疫检查点抑制情况进行设计，提供了对应的单克隆抗体组进行识别，特异性强，灵敏度高。

本发明还提供了一种上述方案所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与所述单克隆抗体组中的任意一种单克隆抗体混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗复合物；

(2)将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物；

(3)将抗原-一抗-二抗复合物、任意一种荧光基团标记的酪氨盐以及过氧化氢混合进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物；

(4)将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，微波处理，洗涤，得到第二荧光标记复合物；

所述微波处理的条件包括：750～850w处理1～3min，再以200～300w处理12～20min；

(5)以第二荧光标记复合物作为待测样品重复步骤(1)～(4)，重复至所述单克隆抗体组中的各单克隆抗体全部与待测样品结合过一次为止，得到多重标记复合物；

其中，步骤(1)中第一次和每次重复采用的单克隆抗体互不相同，步骤(3)中第一次和每次重复采用的荧光基团标记的酪氨盐互不相同；

(6)向步骤(5)所得的多重标记复合物中添加核染色剂，孵育，洗涤，封片，以连续光谱成像、检测。

在本发明中，所述待测样品优选为肝癌的组织切片，更优选的，所述组织切片为石蜡切片。在本发明中，当所述待测样品为肝癌组织石蜡切片时，本发明在待测样品与单克隆抗体混合前还进行脱蜡和水化，具体包括以下步骤：

A、将肝癌组织石蜡切片在50～70℃下烘烤100～150min，得到烘烤切片；

B、烘烤切片依次以二甲苯萃取两次，无水乙醇萃取两次，质量分数95％乙醇溶液萃取一次，质量分数90％乙醇溶液萃取一次，质量分数85％乙醇溶液萃取一次，质量分数80％乙醇溶液萃取一次，质量分数75％乙醇溶液萃取一次，得到脱蜡水化后的肝癌组织作为待测样品。

本发明优选的，所述步骤B中二甲苯的每次萃取时间优选为8～12min；无水乙醇的每次萃取时间优选为3～8min；质量分数95％乙醇溶液、质量分数90％乙醇溶液、质量分数85％乙醇溶液、质量分数80％乙醇溶液和质量分数75％乙醇溶液独立地萃取时间优选为3～8min。

在本发明中，若本发明所述的多重免疫组化分析试剂盒还包括封闭液，则先将待测样品以封闭液进行封闭后再与单克隆抗体混合，所述封闭液的用量优选为50～150μL/样品，更优选为100μL/样品。在本发明中，所述封闭液的封闭时间优选为8～15min，更优选为10min。

本发明将待测样品与所述单克隆抗体组中的任意一种单克隆抗体混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗复合物。本发明优选的，为了进一步提高试剂盒的预测准确度，本发明所述单克隆抗体组中的第一单克隆抗体组中抗体的孵育顺序依次为：CD66B单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD163单克隆抗体、CD8单克隆抗体；本发明所述单克隆抗体组中的第二单克隆抗体组中抗体的孵育顺序依次为：PD-1单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD68单克隆抗体。

在本发明中，当孵育的单克隆抗体为CD66B单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、CD163单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体或CD68单克隆抗体时，孵育温度优选为35～42℃，更优选为37℃。在本发明中，上述单克隆抗体的孵育时间优选为1h。

在本发明中，当孵育的单克隆抗体为PDL1单克隆抗体时，孵育温度优选为2～6℃，更有选为3～5℃。在本发明中，上述单克隆抗体的孵育时间优选为12～16h。

在本发明中，所述单克隆抗体为购买的市售单克隆抗体原液，使用时将所述单克隆抗体稀释50～500倍后使用；在本发明中，优选的采用抗体稀释/封闭液(opal^TM试剂盒)稀释单克隆抗体。在本发明中，所述单克隆抗体的用量为100～300μL/样品。

在本发明中，当所述多重组化免疫分析试剂盒中包括洗涤液时，所述洗涤优选的用洗涤液洗涤；在本发明中，所述洗涤优选的重复2～3次。在本发明中，所述洗涤时间每次优选为3～10min，更优选为5min。本发明下述步骤中的洗涤步骤操作均相同，不再赘述。

得到抗原-一抗复合物后，本发明将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物。

在本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的二抗优选为HRP标记的山羊抗兔IgG聚合物或酶标山羊抗小鼠IgG聚合物。在本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的二抗为购买的市售商品。在本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的二抗使用量优选为50～200μL/样品，更优选为100μL/样品。

在本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的二抗的孵育时间优选为8～15min，更优选为10min。在本发明中，所述孵育的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。

得到抗原-一抗-二抗复合物后，本发明将抗原-一抗-二抗复合物、任意一种荧光基团标记的酪氨盐以及过氧化氢混合进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物。

在本发明中，所述过氧化氢优选的以信号放大液形式提供，所述信号放大液为市售商品，其中混合有过氧化氢。本发明优选的将市售信号放大液稀释80～120倍后使用，更优选为稀释100倍。在本发明中，所述荧光基团标记的酪氨盐优选的购自市售商品，在本发明的具体实施例中采用市售的OpalTM 7-色荧光染色试剂盒内的荧光基团标记的酪氨盐；本发明优选的，使用时将各荧光基团标记的酪氨盐稀释50～150倍后使用，更优选的稀释100倍。本发明优选的，所述荧光基团标记的酪氨盐使用量优选为稀释后溶液80～150μL/样品，更优选为100μL/样品。

在本发明中，所述孵育时间优选为8～15min，更优选为10min。在本发明中，所述孵育的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。

得到第一荧光标记复合物后，本发明将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，微波处理，洗涤，得到第二荧光标记复合物；所述微波处理的条件包括：750～850w处理1～3min，再以200～300w处理12～20min。在本发明中，所述微波处理条件优选的包括：80w预热5min，再800w处理2min，最后240w处理15min。

在本发明中，所述抗原修复液来自市售商品，在本发明的具体实施例中采用Opal^TM7-色荧光染色试剂盒内的抗原修复液；所述抗原修复液的用量优选为150～300mL/样品，更优选为200mL/样品。

在本发明中，所述第一荧光标记复合物在微波处理下，与抗原结合的单克隆抗体被解离，通过洗涤即可去除脱离的单克隆抗体以及HRP标记的二抗，不会影响下一轮反应的进行，防止多重标记时相互干扰。

得到第二荧光标记复合物后，本发明以得到的第二荧光标记复合物作为待测样品，重复上述单克隆抗体识别至得到荧光标记复合物的步骤，重复至所述单克隆抗体组中的所有单克隆抗体均与待测样品结合过一次为止，得到多重标记复合物。

在本发明的重复过程中，每一轮重复时采用的单克隆抗体均与其他任意一轮采用的单克隆抗体种类不同；相应地，每一轮重复时采用的荧光基团标记的酪氨盐中的荧光基团也与其他任意一轮的种类不同。从而实现采用不同的荧光基团分别标记不同的单克隆抗体的目的。

得到多重标记复合物后，本发明向多重标记复合物中添加核染色剂进行孵育，洗涤，封固，连续光谱成像，图像处理和观察分析。

在本发明中，所述核染色剂的添加量优选为80～150μL/样品，更优选为100μL/样品。

在本发明中，所述孵育时间优选为5～10min，更优选为8min。

在本发明中，当所述多重组化免疫试剂盒还包括防猝灭剂时，在所述孵育、洗涤后添加防猝灭剂，再加盖盖玻片进行封片。

在本发明中，所述多重免疫组化分析试剂盒能满足现有组织学光谱成像仪器对多个分子同时成像，即多光谱成像。

多光谱成像依赖于光谱数据采集和光谱拆分计算两个过程：

光谱数据采集：多光谱数据采集的技术手段有很多种，比如光栅分光、棱镜分光、液晶可调谐滤波器分光等等。运用PerkinElmer公司的Vectra***(液晶可调滤波器，LCTF)过滤采集特定波段的光谱信号。LCTF由液晶材料组成，通过调整附加的电压改变光线在晶体中的光程，选择性输出特定波长的光信号，实现分光的目的。CCD曝光配合LCTF的连续滤波，就可以准确记录不同波长段的图像信号。

光谱拆分：光谱图像的每个像素点信号都是不同荧光染料和样本自发信号的叠加，以每种染料的光谱特征曲线为标准，通过数学方法对光谱图像中叠加的信号进行还原运算，从而获得单通道图像的过程称为光谱拆分计算。光谱拆分计算是整个光谱成像不可缺少的重要环节，直接影响数据结果的准确性。

使用“纯光谱拆分算法”可以拆分多达10色叠加的颜色信号，将光谱图像中隐藏的“纯”染料信号准确的解析出来，得到每种染料在图像中的特异分布。而且可以将"真实的目标信号"从自发荧光背景中抽提出来，得到超高信噪比的图像，让弱表达的荧光信号得以从背景中显现出来。

分析软件能在组织上的同一个坐标位置上共定位至少4个分子，检查是否有抗原分子同时表达在一个细胞上。

本发明还提供了上述方案所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒在预测免疫检查点抑制剂对肝癌治疗有效性中的应用，其特征在于，所述应用包括：

S1、利用上述方案所述试剂盒检测待测样品中CD8⁺PDL1^-，CD8⁺PD1^-，CD68⁺PD1^-，CD68⁺PDL1^-，CD68⁺和CD8⁺的数量；

S2、根据S1的测定结果计算CD68⁺/CD8⁺的比值；

S3、根据S1和S2的测定和计算结果，当待测样品中CD8⁺PDL1^-＞2.14和CD8⁺PD1^-＞2.83时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高；

或者当待测样品中CD68⁺/CD8⁺＜5.49、CD68⁺PD1-＜8.15和CD68⁺PDL1^-＜8.15时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高。

在本发明中，当所述多重组化免疫分析试剂盒用于预测免疫检查点抑制剂的有效性时，以人离体肝组织石蜡切片作为待测样本。

具体的，本发明以人离体肝组织石蜡切片作为样品，按照上述技术方案所示的方法以前述技术方案所述多重免疫组化分析试剂盒进行检测，检测得到待测样品中所含PanCK(Pan-cytokeratin，广谱细胞角蛋白)、PDL1(免疫检查点分子)、CD66B(中性粒细胞标志物)、CD163(M2型巨噬细胞标志物)和CD8(T细胞标志物)的含量，或者检测得到待测样品中所含PanCK、PDL1、PD-1(免疫检查点分子)、CD68(巨噬细胞标志物)和CD8的含量。

根据上述测定结果计算CD68⁺/CD8⁺的比值；

根据上述测定和计算结果，当待测样品中CD8⁺PDL1^-＞2.14、和CD8⁺PD1^-＞2.83时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高；

或者当待测样品中CD68⁺/CD8⁺＜5.49、CD68⁺PD1^-＜8.15和CD68⁺PDL1^-＜8.15时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高。未达到上述条件时，则判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性低。

利用本发明所述多重免疫组化分析试剂盒对免疫检查点抑制剂有效性预测的特异性强、灵敏度高，为实现精确用药提供条件。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

选取20例肝癌患者肿瘤组织免疫治疗疗效较差(总体生存期(Overall Survival，OS)较短(编号1～10))和免疫治疗疗效较好(OS较长(编号11～20))的各10例，具体生存期见表1。

表1 20例肝癌患者生存期

按如下步骤进行肿瘤微环境中各蛋白的多重免疫组化分析。每例患者2张切片(panel 1及panel 2)，每个切片标记5个分子。其染色顺序为：Panel1：CD66B、PanCK、PDL1、CD163、CD8；Panel 2:PD-1、PanCK、PDL1、CD8、CD68。实验过程中的一抗、二抗、荧光染料信息如表2：

表2一抗、二抗及荧光染料信息

实施例操作步骤：

1.将含有20例石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120min；

2.脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min×2)→90％乙醇(5min)→85％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)；

3.蒸馏水冲洗2次，5min/次；

4.抗原修复：用OpalTM 7-色荧光染色试剂盒(Opal 7-colorManual IHC Kit，PerkinElmer)内抗原修复液微波修复，80w预热5min，800w高火2min，240w中低火15min(美的微波炉M1-231A)；

5.室温自然冷却15min；

6.洗涤：TBST缓冲溶液洗3次,5min/次；

7.封闭：用封闭液(厂家Perkin Elmer；商品名Antibody Diluent/Block)，室温封闭10min；

8.一抗孵育：滴加一抗(一抗工作液100～300μL)，CD66B、PanCK、CD163、CD8、CD68、PD1的孵育条件为37℃孵育1h；PD-L1的孵育条件为4℃孵育过夜；一抗的染色分为两个panel，染色顺序为：Panel 1：CD66B、PanCK、PDL1、CD163、CD8；Panel 2:PD-1、PanCK、PDL1、CD8、CD68；

9.洗涤：TBST缓冲溶液洗3次,5min/次；

10.二抗孵育：滴加试剂盒内二抗，37℃孵育10min；PanCK、CD163、PD-1、CD68；使用的二抗为中杉金桥生产的PV-6002(酶标山羊抗小鼠IgG聚合物)；CD66B、PDL1、CD8使用的二抗为中杉金桥生产的PV-6001(酶标山羊抗兔IgG聚合物)；

11.洗涤：TBST缓冲溶液洗3次,5min/次；

12.荧光显色：滴加TSA稀释100倍后的opal荧光染色，室温10min；

13.洗涤：TBST缓冲溶液洗3次,5min/次；

14.抗体依次染色：第一个抗体染色结束，后续每个抗体均需重复步骤4到步骤13，依次标记所有抗体；抗体染色顺序为：panel1：CD66B、PanCK、PDL1、CD163、CD8；panel2:PD-1、PanCK、PDL1、CD8、CD68；

15.微波处理：重复步骤4)到步骤6)；

16.DAPI染色，室温5～10min；

17.洗涤：TBST洗3次,5min/次；

18.封固：防淬灭剂封片(Boble Ryder抗荧光衰减封片剂)；

19.连续光谱成像，图像处理和观察分析

根据以上操作步骤，完成对20例肝癌肿瘤组织切片的免疫细胞标志物及免疫相关分子的多重标记。运用PerkinElmer公司的Vectra***进行连续光谱采集，并做图像处理和观察分析。免疫治疗疗效差和免疫治疗疗效好的病例各展示1例，每例各展示1张图，如图1(A/B)和图2(A/B)所示，图1中不同颜色代表不同的标志物，具体如表3和表4所示。

表3图1所示的panel 1标志物颜色

标志物	PanCK	CD8	PDL1	CD66B	CD163
						颜色	绿色	***	橙色	水红色	蓝绿色

表4图2所示的panel 2标志物颜色

标志物	PanCK	CD8	PDL1	CD68	PD1
						颜色	绿色	***	橙色	蓝绿色	洋红色

对肿瘤区域的各分子统计分析，20例患者的免疫细胞及免疫检查点分子检测的的阳性百分比统计结果如表5～表8所示：

表5 panel 1治疗效果差的患者肿瘤区域中各分子的阳性表达百分比统计结果(％)

表6 panel 1治疗效果好的患者肿瘤区域中各分子的阳性表达百分比统计结果(％)

编号	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
											CD8<sup>+</sup>	0.47	2.69	2.32	7.05	3.88	14.85	2.14	0.34	0.14	0.22
PDL1<sup>+</sup>	0.05	0.01	0	0	0.01	3.14	0.07	0	0.01	0.17
											PanCK<sup>+</sup>	0.01	40.45	0	0	5.99	2.13	0.01	55.43	11.57	5.22
CD8<sup>+</sup>PDL1<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	0.75	0	0	0	0
											CD8<sup>+</sup>PDL1<sup>-</sup>	0.47	2.69	2.32	7.05	3.88	14.11	2.14	0.34	0.14	0.22
PDL1<sup>+</sup>PanCK<sup>+</sup>	0	0.01	0	0	0	0.12	0	0	0.01	0
											CD66B<sup>+</sup>	0.3	1.06	0	0.66	0	20.54	0.38	0.05	9.2	1.59
CD163<sup>+</sup>	6.05	3.83	2.56	2.6	6.28	21.2	0.13	2.87	11.82	1
											CD66B<sup>+</sup>/CD8<sup>+</sup>	0.85	0.59	0	0.1	0	1.48	0.26	0.21	51.7	93.24
CD163<sup>+</sup>/CD8<sup>+</sup>	17.01	2.13	2	0.39	4.11	1.53	0.09	12.1	66.4	58.76
											PDL1<sup>+</sup>CD163<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	0.58	0	0	0.03	0
PDL1<sup>-</sup>CD163<sup>+</sup>	6.05	3.83	2.56	2.6	6.28	20.62	0.13	2.87	11.8	1

表7 panel 2治疗效果较差的患者肿瘤区域中各分子的阳性表达百分比统计结果(％)

表8 panel 2治疗效果好的患者肿瘤区域中各分子的阳性表达百分比统计结果(％)

编号	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
											CD66B<sup>+</sup>PDL1<sup>-</sup>	0.3	1.06	0	0.66	0	20.13	0.38	0.05	9.18	1.59
CD66B<sup>+</sup>PDL1<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	0.41	0	0	0.03	0
											PD1<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	0.21	0	0	0	0
CD68<sup>+</sup>	1.44	6.74	4.7	5.97	0.92	14.82	0.08	3.65	4.52	0.39
											CD68<sup>+</sup>/CD8<sup>+</sup>	2.45	1.88	1.4	0.81	0.15	0.93	0.03	8.15	44.74	0.93
CD8<sup>+</sup>PD1<sup>-</sup>	0.59	3.58	3.36	7.35	6.23	15.84	2.84	0.45	0.1	0.42
											CD8<sup>+</sup>PD1<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	0.02	0	0	0	0
CD68<sup>+</sup>PDL1<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	2.8	0	0	0	0
											CD68<sup>+</sup>PDL1<sup>-</sup>	1.44	6.74	4.7	5.97	0.92	12.02	0.08	3.65	4.52	0.39
CD68<sup>+</sup>PD1<sup>+</sup>	0	0	0	0	0	0.08	0	0	0	0
											CD68<sup>+</sup>PD1<sup>-</sup>	1.44	6.74	4.7	5.97	0.92	14.73	0.08	3.65	4.52	0.39

采用随机森林算法对免疫治疗疗效较差组和免疫治疗疗效较好组进行多因素分析。对每一棵决策树，选择相应的袋外数据计算袋外数据误差，记为errOOB1。随机对袋外数据所有样本的特征X加入噪声干扰，再次计算袋外数据误差，记为errOOB2。特征X的重要性＝∑(errOOB2-errOOB1)/k。重要因子的确定方法为：计算每个特征的重要性并降序排序。重要因子为特征数的top 20％。

ROC曲线的绘制：对每一棵树，测定样本的真阳性率和假阳性率。以真阳性率(灵敏度％)为纵坐标，假阳性率(1-特异度％)为横坐标绘制ROC曲线。免疫治疗疗效较差组和免疫治疗疗效较好组的多因素分析结果：Factor importance森林图如图3所示、ROC曲线如图4所示。

从多因素分析结果来看，区分免疫治疗疗效较差组和免疫治疗疗效较好组的重要因子在肿瘤区域内有5个，分别为CD8⁺PDL1^-，CD8⁺PD1^-，CD68⁺PD1^-，CD68⁺PDL1^-以及CD68⁺/CD8⁺的比值。

ROC曲线中，橙色点表示该点的Youden指数最大(Youden指数＝灵敏度+特异度-1)，即灵敏度和特异度最好。AUC＝0.89,P＝0.002，表示具有统计学意义。当一位受试者检测了以上2个panel的指标，且相关指标及其比值符合或优于对应的阈值时，这位受试者将来从免疫治疗中临床获益的概率将会远高于其他不符合的受试者。

由此可见，采用多重免疫组化同时标记组织石蜡切片中多个免疫细胞标志物、肿瘤细胞标志物及免疫检查点分子，对于同时预测多个患者应用免疫检查点抑制剂药物是否有效是非常有利的。

采用Mann-Whitney试验对免疫治疗疗效较差组和免疫治疗疗效较好组进行单因素分析，得到特征因子的阈值。5个指标的阈值如下，见表9：

表9 5个指标的阈值

当待测样品中CD8⁺PDL1^-＞2.14、CD8⁺PD1^-＞2.83时，其从免疫治疗中临床获益的概率较高；当受试者CD68⁺/CD8⁺＜5.49、CD68⁺PD1^-＜8.15及CD68⁺PDL1^-＜8.15时，其从免疫治疗中临床获益的概率较高。

实施例2

一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、荧光基团标记的酪氨盐与核染色剂；

所述单克隆抗体组为：PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；

所述荧光基团为520-FITC、570-Cy3、620-Cy3.5、650-Cy5和690-Cy5.5；

所述试剂盒还包括防猝灭剂、洗涤剂和封闭液。

实施例3

一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、荧光基团标记的酪氨盐与核染色剂；

所述单克隆抗体组为：PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体；

所述荧光基团为520-FITC、570-Cy3、620-Cy3.5、650-Cy5和690-Cy5.5；

所述试剂盒还包括防猝灭剂、洗涤剂和封闭液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、核染色剂和荧光基团标记的酪氨盐，所述荧光基团标记的酪氨盐中荧光基团的种类数量与单克隆抗体组中单克隆抗体种类的数量一致；

所述单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组和第二单克隆抗体组；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体；

所述核染色剂为DAPI染色剂；

所述荧光基团包括520-FITC、570-Cy3、620-Cy3.5、650-Cy5和690-Cy5.5。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括防猝灭剂、洗涤剂和封闭液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤剂为TBST缓冲液。

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