JP7280339B2 - ペプチド核酸コンジュゲート - Google Patents
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Description
[式中、
『特異的結合体』は、抗体(例えば、一次抗体又は二次抗体)、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
Zは、PNA配列、非荷電性DNA配列、並びに荷電性及び非荷電性の塩基を含むDNA配列からなる群より選択され;
Xは標識であり;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。
[式中、
d及びeは、それぞれ独立して、2から20の範囲の整数であり;
Qは、結合、O、S、又はN(Rc)(Rd)であり;
Ra及びRbは、独立して、H、C1-C4アルキル基、F、Cl、又はN(Rc)(Rd)であり;
Rc及びRdは、独立して、CH3又はHであり;かつ
A及びBは、独立して、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基である]。
[式中、
Tは、1から4個の炭素原子を有し、かつ任意選択的にO、N、又はSで置換され、かつ、末端反応性部分を有する基であり;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;かつ
zは0又は1である]。
[式中、
d及びeは、それぞれ独立して、2から20の範囲の整数であり;
Qは、結合、O、S、又はN(Rc)(Rd)であり;
Ra及びRbは、独立して、H、C1-C4アルキル基、F、Cl、又はN(Rc)(Rd)であり;
Rc及びRdは、独立して、CH3又はHであり;かつ
A及びBは、独立して、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基である]。
(a)サンプルを第1のコンジュゲートと接触させることであって、該第1のコンジュゲートが式(I)の構造を有する、接触させること:
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
Zは、PNA配列、非荷電性DNA配列、並びに荷電性及び非荷電性の塩基を含むDNA配列からなる群より選択され;
Xは標識であり;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である];及び
(b)サンプルを第1の検出試薬と接触させて、PNAコンジュゲートの検出を容易にすること、を含む、サンプル中の標的を検出する方法である。
(a)サンプルを第1のコンジュゲートと接触させることであって、該第1のコンジュゲートが式(IC)の構造を有する、接触させること:
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である];及び
(b)サンプルを第1の検出試薬と接触させて、PNAコンジュゲートの検出を容易にすることを含む、サンプル中の標的を検出する方法である。
(a)サンプルを第1のコンジュゲートと接触させることであって、該第1のコンジュゲートが式(IC)の構造を有し:
[式中、
『特異的結合体』は、抗体(例えば、一次抗体又は二次抗体)、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;『リンカー』が切断可能基をさらに含み;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは0であり;
zは0であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である];及び
(b)サンプルを試薬(又は光源、選択される切断可能基に応じて決まる)と接触させて、『リンカー』上の切断可能基を切断させること;及び、(c)切断された『PNA』配列の量を定量すること
を含む、サンプル中の標的を検出する方法である。
本開示の一態様は、特異的結合体及びオリゴマーのコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様では、コンジュゲートは、PNAコンジュゲート、すなわち、特異的結合体と、PNA配列を含むオリゴマーとのコンジュゲートである。幾つかの実施態様では、特異的結合体とオリゴマーとは、切断可能な基を含むリンカーを含めたリンカーを介して結合している。幾つかの実施態様では、オリゴマーは、PNA配列、非荷電性DNA配列、又は荷電性及び非荷電性の塩基を含有するDNA配列を含む。幾つかの実施態様では、オリゴマーは、PNA配列を含む。幾つかの実施態様では、特異的結合体は抗体であり、オリゴマーはPNAを含む。
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
Zは、PNA配列、非荷電性DNA配列、並びに荷電性及び非荷電性の塩基を含むDNA配列からなる群より選択され;
Xは標識であり;
Yはスペーサーであり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。
特異的結合体-PNAオリゴマー (IA),
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;かつ
『PNAオリゴマー』は、少なくとも1つのPNA配列を含む]。
[式中、
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yはスペーサーであり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;かつ
zは0又は1である]。
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yはスペーサーであり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。
[式中、
『Ab』は、一次抗体又は二次抗体からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
『PNA』はPNA配列であり;
Xは標識であり;
Yはスペーサーであり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。
[式中、
『特異的結合体』は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
『リンカー』は、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
Zは、PNA配列、非荷電性DNA配列、並びに荷電性及び非荷電性の塩基を含むDNA配列からなる群より選択され;
Xは標識であり;
Yはスペーサーであり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。
[式中、d及びeは、それぞれ独立して、2から20の範囲の整数であり;Qは、結合、O、S、又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立して、H、C1-C4アルキル基、F、Cl、又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立して、CH3又はHであり;A及びBは、独立して、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基である]。幾つかの実施態様では、d及びeは、2から6の範囲の整数である。幾つかの実施態様では、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、A又はBの少なくとも一方は、切断可能な部分を含む。
[式中、
d及びeは、それぞれ独立して、2から20の範囲の整数であり;
Qは、結合、O、S、又はN(Rc)(Rd)であり;
Rc及びRdは、独立して、CH3又はHであり;かつ
A及びBは、独立して、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基である]。
[式中、
d及びeは、それぞれ独立して、2から20の範囲の整数であり;
A及びBは、独立して、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基である]。他の実施態様では、d及びeは、2から15の範囲の整数である。他の実施態様では、d及びeは、2から10の範囲の整数である。さらに他の実施態様では、d及びeは、2から6の範囲の整数である。
PNAコンジュゲートは、当業者に公知であることが知られている任意の手段によって合成することができる。幾つかの実施態様では、PNAオリゴマーは、図19に示すように、NHSエステル基を有する架橋剤(例えば、SPDP-PEG8-NHS)などのヘテロ二官能性架橋剤を介して特異的結合体に結合する。ヘテロ二官能性架橋剤の例には、図16に示されるDBCO-PEGn-マレイミド、DBCO-PEGn-NHS、N3-PEGn-NHS、又はN3-PEGn-マレイミド(nは0~20の範囲である)が含まれる。コンジュゲーションに適したPNA配列の非限定的な例には次のものが含まれる:
配列番号8: 5’-ビオチン-o-GTCAACCATCTTCAG-Lys(C6SH)-3’
配列番号9: 5’-ビオチン-o-TTAGTCCAACTGGCA-Lys(C6SH)-3’
配列番号10: 5’-ビオチン-o-CATTCAAATCCCCGA-PL-Lys(C6SH)-3’
配列番号11: 5’-ビオチン-o-CTGAAGATGGTTTAC-Lys(C6SH)-3’
配列番号12: 5’-Alexa488-o-CATCCTGCCGCTATG-Lys(C6SH)-3’
配列番号13: 5’-ビオチン-o-GTCAACCATCTTCAG-Arg-o-Cys-3’
配列番号14: 5’-ビオチン-O-GTCAACCATCTTCAG-Lys(eg3-N3)-3’
配列番号15: 5’-ビオチン-O-GTCAACCATCTTCAG-Lys(SMCC)-3’
幾つかの実施態様では、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のいずれかのコンジュゲートは、該コンジュゲートの直接検出を容易にする標識を含みうる。例えば、コンジュゲートの標識がフルオロフォア又は発色団を含む場合、該フルオロフォア又は発色団は、当業者に知られている方法に従って直接検出することができる。
幾つかの実施態様では、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のコンジュゲートは、PNA配列又はDNA配列の1つをコンジュゲートのヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって検出することができ、該PNA配列又はDNA配列は、コンジュゲートのヌクレオチド配列に対して相補的である。
幾つかの実施態様では、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のコンジュゲートは、分子「バーコード」として役立てることができるヌクレオチド配列を有するオリゴマーを含む。例えば、2つのPNAコンジュゲートは、同様のPNAオリゴマー部分を含みうるが、該PNAオリゴマー部分は、PNA配列内のある特定の塩基が異なっている。このようにして、異なるPNA配列を有するPNAコンジュゲートを、Nanostring nCounterプラットフォームを使用することなどによって検出及び/又は定量化することができる。幾つかの実施態様では、PNAコンジュゲートは、ビオチン標識などのレポーター部分を含む。
Gyrosは、並行処理及びレーザー誘起蛍光検出を用いるアフィニティーフロースルーフォーマットを使用したイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、液体の送達及び移動のための遠心力及び毛管作用を使用する、100ナノリットルを超えるスケールのチャネルを含む、コンパクトディスク(CD)中で行われる。
幾つかの実施態様では、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のコンジュゲートは、「検出キット」の一部として利用することができる。一般に、任意の検出キットは、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)の1つ以上のコンジュゲート、及び該1つ以上のコンジュゲートを検出するための検出試薬を含みうる。幾つかの実施態様では、キットは、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のいずれかの1つのコンジュゲートと、さらなる成分(例えば別の抗体コンジュゲート、検出試薬、洗浄試薬、緩衝液、対比染色等)とを含む。他の実施態様では、キットは、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のいずれかの少なくとも2つのコンジュゲートと、任意のさらなる成分(例えば別の抗体コンジュゲート、検出試薬、洗浄試薬、緩衝液、対比染色等)を含む。
本開示はまた、本明細書に記載される式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のコンジュゲートのいずれかを用いて組織サンプル内の1つ以上の標的を検出する方法を提供する。幾つかの実施態様では、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のいずれかのコンジュゲートをシンプレックスアッセイに使用して、組織サンプル内の特定の標的を直接的又は間接的に検出することができる(例えば、CD68、Ki67、CD20等)。
本開示の幾つかの態様では、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のいずれかのコンジュゲートは、組織サンプル中の標的の多重検出を達成するために、他の特異的結合体と組み合わせて使用される。当業者は、上記特定された方法及び手順のいずれも、式(I)、(IA)、(IC)、(ID)、及び(II)のいずれかと他の特異的結合体との両方のコンジュゲートを使用する任意のアッセイに応じて適合させることができることを認識するであろう。
多重アッセイ及び方法は自動化することができ、検体処理装置と組み合わせることもできる。例えば、検体処理装置又は自動化検体処理装置は、顕微鏡スライド上に配置したサンプルに対し、約100マイクロリットルから約500マイクロリットルの本開示のコンジュゲートを塗布することができる。幾つかの実施態様では、検体処理装置は、Ventana Medical Systems, Inc.から販売されているBENCHMARK XT装置、BenchMark Special Stains装置、NexES Special Stainer装置、SYMPHONY装置、又はBENCHMARK ULTRA装置などの自動装置である。Ventana Medical Systems,Inc.は、それらの各々の全体が、ここに参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第5,650,327号、同第5,654,200号、同第6,296,809号、同第6,352,861号、同第6,827,901号、及び同第6,943,029号、並びに、米国特許出願公開第2003/0211630号、及び同第2004/0052685号を含めた、自動分析を実行するためのシステム及び方法を開示している多数の米国特許の譲受人である。あるいは、検体は、手動で処理することもできる。抗酸染色組成物を適用することができる他の市販の検体処理システムの例としては、VENTANA SYMPHONY(個別のスライド染色剤)及びVENTANA HE 600(個別のスライド染色剤)系;Agilent TechnologiesのDako CoverStainer(バッチ染色剤);Leica ST4020 Small Linear Stainer(バッチ染色剤)、Leica ST5020 Multistainer(バッチ染色剤)、及びLeica ST5010 Autostainer XL系(バッチ染色剤);Leica Biosystems Nussloch GmbHのH&E染色剤が挙げられる。本明細書に開示されるコンジュゲートのいずれかを適用することに加えて、検体処理装置は、他の抗体、抗体コンジュゲート、対比染色等を検体に分配することができる。確かに、検体処理装置は、検体に広範囲の物質を適用することができる。物質としては、限定はしないが、染料、プローブ、試薬、リンス剤、及び/又は調整剤が挙げられる。物質は、流体(例えば、気体、液体、又は気体/液体混合物)などでありうる。流体は、溶媒(例えば、極性溶媒、非極性溶媒等)、溶液(例えば、水溶液又は他の種類の溶液)などでありうる。試薬としては、限定はしないが、染色剤、湿潤剤、抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等)、抗原回収液(例えば、水性又は非水性の抗原回収溶液、抗原回収緩衝液等)などを挙げることができる。プローブは、検出可能な標識又はレポーター分子に結合した、単離された核酸又は単離された合成オリゴヌクレオチドでありうる。標識としては、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素を挙げることができる。
対比染色は、顕微鏡下において、構造をより容易に視覚化できるように、1つ以上の標的を検出するために薬剤で既に染色された後に、サンプルを後処理する方法である。例えば、免疫組織化学的染色をより明確にするために、カバースリップをする前に、対比染色が任意選択的に用いられる。対比染色は、一次染色とは色が異なる。ヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、及びNuclear Fast Redなど、多くの対比染色がよく知られている。DAPI(4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)は、使用することができる蛍光染色剤である。
開示される実施態様のうちのある特定の態様、又は全ての態様は、自動化することができ、コンピュータ解析及び/又は画像解析システムによって促進することができる。幾つかの用途では、正確な色又は蛍光比が測定される。幾つかの実施態様では、光学顕微鏡が画像分析に利用される。ある特定の開示される実施態様は、デジタル画像の取得に関する。これはデジタルカメラを顕微鏡に接続することによって行うことができる。染色されたサンプルから得られたデジタル画像は、画像解析ソフトウェアを用いて解析される。色又は蛍光はいくつかの異なる方法で測定することができる。例えば、色は、赤、青、及び緑の値として;色相、彩度、明度の値として;及び/又は、分光撮像カメラを使用して、特定の波長又は波長範囲を測定することによって、測定することができる。サンプルはまた、定性的及び半定量的に評価することもできる。定性的評価には、染色強度の評価、陽性染色細胞及び染色に関与する細胞内コンパートメントの識別、及び全体的なサンプル又はスライドの品質の評価が含まれる。別々の評価が、試験サンプルに対して行われ、この分析には、サンプルが異常状態を表すかどうかを決定するために、既知の平均値と比較することが含まれうる。
サンプルは、生物学的成分を含み、かつ、概して1つ以上の目的とする標的分子を含むことが疑われる。標的分子は、細胞の表面上にあってもよく、細胞は懸濁液中又は組織切片中に存在しうる。標的分子はまた、細胞内に存在してもよく、細胞溶解又はプローブによる細胞の浸透の際に検出することができる。当業者は、サンプル中の標的分子を検出する方法が、用いられるサンプル及びプローブの種類に応じて変わることを理解するであろう。サンプルを収集及び調製する方法は当技術分野において知られている。
ヤギ抗マウス(GAM)、ヤギ抗ウサギ(GAR)、及びマウス抗DIGに対するPNAの例示的なコンジュゲーションが、以下に記載される:
PNAコンジュゲート抗体をUV-Vis吸光度で特徴付けた。抗体-PNAコンジュゲートにおける260nmでの吸光度の増加は、PNAの首尾よい取り込みを示唆した(図2参照)。A260対A280の比は、コンジュゲーションの効率を定性的に評価し、かつ、抗体あたりのPNAオリゴマーの数を潜在的に推定するために用いられうる。
短PNA(15塩基のPNA、10塩基のPNA)オリゴのコンジュゲーションが抗体の結合親和性及び特異性に影響を及ぼさないことを証明するために、PNA-コンジュゲート二次抗体を用いて、異なるマーカーについて扁桃組織に対するIHCアッセイを行った(一次及び二次)。IHCアッセイは全て、特定のアッセイに基づいて修正されたプロトコルを使用して、Benchmark XT(Ventana社)で行われた。PNA-コンジュゲート抗体を、滴定として100μLの体積で、手動で加えた。
幾つかの実施態様では、PNA-コンジュゲート抗体は、Gyros技術又はDNA計数に基づくNanoString nCounterプラットフォームなどの方法によるタンパク質発現の多重定量測定を可能にするように設計されている。したがって、PNA配列は、エクスサイチュPNA計数を可能にするために組織に結合した後にPNAコンジュゲート抗体から切断しなければならない。この特定の例では、PNA配列は、ジスルフィド結合を介して抗体に結合し、これは、(例えば、ジスルフィド結合の還元によって)化学的に切断されて、PNA配列の放出をもたらすことができる。
扁桃スライドを一次抗体(ウサギKi67)、二次抗体(GAR-PL-PNA、ビオチンを有する光切断可能なPNAを有するヤギ抗ウサギ抗体)で処理した。その後、スライドを、異なる時間の間、UV光(ハンドヘルドUVランプ、365nm)で照射した。対照スライドはUV処理せず、比較のために使用した。次いで、全てのスライドを検出用にSA-HRP及びDABで処理した。
発色検出の他に、コンジュゲート中のビオチンは、SA-フルオロフォアを用いて蛍光的にも検出されうる。図6は、一次抗体、その後、PNAをコンジュゲートした二次抗体を用いて、Ki67について染色し、SA-FITCで検出した扁桃スライドの蛍光画像を示している。SA-FITCは、PNA配列のビオチンに結合する。蛍光シグナルはKi67マーカーの局在と一致している。この実験によって、PNAコンジュゲート抗体がもたらす検出スキームの多様性が実証された。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、NanoString nCounterプラットフォームは、最大800種類の異なるDNA配列を潜在的に検出する能力を有しており、抗体PNAコンジュゲートを使用することで、IHCの非常に大きな多重化能力を可能にすることが報告されている。我々は、検出スキームがレポーター鎖の標的オリゴ(おそらくはDNA又はPNAでありうる)へのハイブリダイゼーションに基づいていることから、PNAはDNAと同様の方式で検出することができると仮定している。しかしながら、PNAの3’末端上のビオチンの存在は、捕捉鎖を使用する必要性を排除するため、PNAオリゴマーは、NanoString nCounterプラットフォームで典型的に用いられる、標準的なDNA標的(典型的には約100塩基の長さ)よりも著しく短くできると考えられる。さらには、DNA対DNAと比較して、DNAに対するPNAのより高い結合親和性は、比較的短いPNA/DNAレポーター二本鎖に対して十分な安定性をもたらすと考えられる。
先の実験では、PNAはビオチン標識に対する染色によって検出された。異なる標識(発色性、蛍光発生性等)を担持する相補的DNA又はPNA配列は、代替的な染色手法として使用することができる。この実験では、扁桃スライドを、ウサギ抗Ki67一次抗体、その後、PNAをコンジュゲートしたGARと共にインキュベートした。その後、スライドを蛍光標識を有するPNAに相補的なDNA配列(例えば、FITC又はローダミン)と共にインキュベートした。図8は、スライドがDNAハイブリダイゼーションによって首尾よく染色されたことを示している。蛍光染色はマーカーの局在と一致し、バックグラウンドシグナルは観察されなかった。DNA配列を、約185nMの濃度及び約100μLの容量の手動滴定として加えた。
1: 5’-CTGAAGATGGTTGAC/ローダミン-3’(配列番号16)
2: 5’-FAM/CTGAAGATGGTTGAC-3’(配列番号17)
この実験では、相補的DNAをハプテン(DIG)で標識した。2つの扁桃スライドを、ウサギ抗Ki67及びマウス抗CD45、その後、それぞれPNAコンジュゲートGAR及びPNAコンジュゲートGAMと共にインキュベートした。DIGで標識した相補的DNAを両方のスライドと共にインキュベートし、その後、HRPを抗DIG抗体とコンジュゲートし、DAB沈着を行った。DNAを、約185nMの濃度及び約100μLの容量で手動の滴定ステップとして加えた。
PNAオリゴマーを抗体にコンジュゲートするステップは以下の通りである:
PNAオリゴマーを抗体にコンジュゲートするステップは以下の通りである:
Gyros技術を使用したPNAの定量化を実証するため、約0.0274nMから約20nMの範囲の濃度のビオチン化PNAオリゴ(Bt-PNA)を試験した(表1)。各濃度について、1:2の比のBt-PNAとのジゴキシゲニンで標識した相補的一本鎖DNA(DNA-DIG)を、最初に室温でハイブリダイズさせた後、二連のGyrosによって分析した。検出は、Ms-抗DIG、その後にAlexaFluor647-GAMを使用して達成した。Gyrosプログラムを使用して四点曲線(表1参照)を当てはめ、0.998を超えるR2を有する標準曲線を生成した。特に、最低PNA濃度のシグナル対バックグラウンド比(S/B)は、約10であり、PNA又はssDNAによる非常に低いバックグラウンドシグナルが示唆された。
Claims (19)
- 式(I)又は(II)のいずれかの構造を有するコンジュゲート:
、
[式中、
特異的結合体は、抗体、抗体フラグメント、薬物/抗体複合体、及び核酸からなる群より選択され;
リンカーは、2から80個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的にO、N、又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり、かつリンカーは、少なくとも1つの切断可能な基を含み;
Zは、5から20個の塩基を含み、かつZは、PNA配列であり;
Xは、ビオチン、酵素、色原体、フルオロフォア、ハプテン、及び質量分析タグからなる群より選択され;
Yは、1から12個の炭素原子を有し、かつ、任意選択的に1つ以上のO、N、又はSヘテロ原子を有する、分岐又は非分岐、直鎖又は環状、置換又は非置換、飽和又は不飽和の基であり;
mは、0又は1から6の範囲の整数であり;
zは0又は1であり;かつ
nは1から12の範囲の整数である]。 - リンカーが、1g/molから3000g/molの範囲の分子量を有する、請求項1に記載のコンジュゲート。
- リンカーが、20g/molから200g/molの範囲の分子量を有する、請求項1に記載のコンジュゲート。
- Zが、5から15個の塩基を含む、請求項1に記載のコンジュゲート。
- Zが、8から12個の塩基を含む、請求項1に記載のコンジュゲート。
- Xが、ハプテンである、請求項1に記載のコンジュゲート。
- Xが、フルオロフォアである、請求項1に記載のコンジュゲート。
- nが、少なくとも2である、請求項1に記載のコンジュゲート。
- nが、2から6の範囲である、請求項1に記載のコンジュゲート。
- nが、2から4の範囲である、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 少なくとも1つの切断可能な基が、光切断可能基、化学的に切断可能な基、及び酵素的に切断可能な基からなる群から選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。
- サンプル中の標的を検出する方法であって、請求項1に記載のコンジュゲートである第1のコンジュゲートにサンプルを接触させること、及びサンプルを第1の検出試薬に接触させて、第1のコンジュゲートの検出を容易にすること、を含む、in vitroの方法。
- 請求項12に記載の方法であって、
特異的結合体が、一次抗体であり、かつ該一次抗体が、サンプル中の第1の標的に特異的である;又は
特異的結合体が、二次抗体であり、前記方法が、サンプルを第1のコンジュゲートに接触させることに先立って、サンプルを第1の標的に特異的な第1の一次抗体に接触させることをさらに含み、かつ該二次抗体が、第1の一次抗体に特異的である
方法。 - 第1の検出試薬が、第1のコンジュゲートの標識に特異的な、抗標識抗体であり、標識が、式(I)又は(II)におけるXであり、mが、1から6までの範囲の整数である、請求項12に記載の方法。
- 検出試薬が、第1のコンジュゲートのZ基に相補的なPNA又はDNA配列を含み、かつ相補的なPNA又はDNA配列が、レポーター部分にコンジュゲートされている、請求項12に記載の方法。
- レポーター部分が、フルオロフォアである;又は
レポーター部分がハプテンであり、方法が、相補的なPNA又はDNA配列のハプテンに特異的な抗ハプテン抗体にサンプルを接触させることをさらに含む
請求項15に記載の方法。 - mが、1から6までの範囲の整数である、請求項1に記載のコンジュゲート。
- mが、1である、請求項1に記載のコンジュゲート。
- zが、1である、請求項18に記載のコンジュゲート。
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