CN110243651B - 一种网织红细胞检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种网织红细胞检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种网织红细胞检测试剂盒，包括：染色液和足够量的稀释液，所述染色液包括特异性核酸染料和有机溶剂，所述特异性核酸染料为式3所示的化合物：所述稀释液包括缓冲剂、至少一种表面活性剂和水，所述检测试剂盒的pH值为7‑11；所述表面活性剂包括两性表面活性剂，所述两性表面活性剂为咪唑啉型式4所示的化合物；同时公开了该试剂盒用于制备网织红细胞含量的测定试剂的应用。本发明所用的染料很容易进入被稀释液处理过的细胞，与分子内部与核酸物质进行结合，染料安全毒性小，使用两性表面活性剂跟非离子表面活性剂处理细胞，经染料染色后，RET成熟程度区分界限明显，结果测定准确，同时还可以测定血小板的含量。
Description
技术领域
本发明属于血细胞分析领域，主要涉及一种网织红细胞检测试剂及其应用。所述网织红细胞检测试剂盒采用了新型的无毒、高敏感性、高稳定性的核酸染料以及稀释液，可以准确的对网织红细胞进行分类。
背景技术
网织红细胞是红细胞的一种，介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，其胞质中残存少量嗜碱性物质RNA，RNA含量越高，网织红细胞越幼稚。正常人的外周血中都是成熟的红细胞及少量网织红细胞(成年人：百分率，0.5％-1.5％，新生儿：百分率，3.0％-6.0％)，因此临床检验可以根据网织红细胞的成熟度及其含量判断病人的信息，主要用于判断贫血类型。
目前，网织红细胞的检测方法主要有二种：一种是手工法，一种是仪器法。手工法：由于网织红细胞胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后，胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚至网织状结构，从而进行区分。仪器法：主要利用荧光染料与网织红细胞中的RNA结合，当FCM发出的激光照射于细胞上时，细胞发射出特定颜色的荧光，根据荧光的强弱，测定RNA含量，从而精确测定Ret占成熟红细胞的百分比(RET％)。还可根据激光照射后发射出的荧光强度或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系对RET成熟程度进行分群，将其划分为低荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞(HFR)。荧光强度越高，网织红细胞越幼稚。手工法，费时较长，效率低，成本较高。因此，仪器法成为临床上的主要需求。
目前，已有多家厂家对仪器法进行了研究，取得了相应的进展，现有相关技术如下：
现有技术一：中国专利，公开号CN 1172953A，公开了一种用网织红细胞染色的花青素类型的染料如式1
及使白细胞染色的特异性染料。阳离子表面活性剂做促染剂，在一定缓冲体系下进行测定。此方法不足之处在于多种染料对环境及人体有伤害，同时对异常淋巴细胞血液中，白细胞跟网织红细胞区分度不是很明显。另外，RET成熟程度区分界限不是很明显。
现有技术二：中国专利，公开号CN 101344472A，公开了一种荧光染料如式2
及缓冲剂、促染剂和渗透压调节剂。此方法不足之处在于此染料对人体有一定的伤害，同时RET成熟程度区分界限不是很明显。
现有技术三：美国专利，US 5821127公开了一种用聚次甲基兰作为特异性染料，阳离子和两性表面活性剂做促染剂。此方法不足之处在于次染料对红细胞有非特异性染色，背景强度较大，且RET成熟程度区分界限不是很明显。
综上所述，现有的发明专利中还存在许多不足之处，比如染料的危害，稳定性，对红细胞有非特异性染色，RET成熟程度区分界限不是很明显，试剂成本高，制备复杂等，因此需要对现有技术进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于：鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种网织红细胞检测试剂盒，此试剂盒中的核酸染料具有无毒、高敏感性、高稳定性的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种网织红细胞检测试剂盒，包括染色液和足够量的稀释液，所述染色液包括特异性核酸染料和用于溶解所述特异性核酸染料的有机溶剂，所述特异性核酸染料为式3所示的化合物：
其中R1、R2、R3为小于四个碳的烷基，R4为磺酸基，X为卤素原子；
所述稀释液包括缓冲剂、至少一种表面活性剂和水，所述检测试剂盒的pH值为7-11；
所述表面活性剂包括两性表面活性剂，所述两性表面活性剂为咪唑啉型式4所示的化合物：
R代表烷基或含8～16个碳原子的烷基。
所述特异性核酸染料溶液的溶剂为乙二醇，甲醇，乙醇，丙醇中的一种或两种的混合物；
所述缓冲剂选自Tris(2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)，Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，磷酸盐缓冲液的一种或两种混合物；
上述网织红细胞检测试剂盒，包括：
染色液：特异性核酸染料 0.20-1.00mmol
有机溶剂 1L
稀释液：
进一步地，所述网织红细胞检测试剂盒，包括：
染色液：特异性核酸染料 0.50-0.80mmol
有机溶剂 1L
稀释液：
pH值调节使用的酸碱调节剂主要包括盐酸、甲酸、氢氧化钠、氢氧化钾。
渗透压浓度在180-280mOsm/kg之间，优选200-250mOsm/kg之间。
进一步地，所述网织红细胞检测试剂盒中稀释液还可以包括防腐剂及盐等。常用的防腐剂有苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐类、苯氧乙醇、甲醛和Proclin300等。防腐剂的用量通常为0.05-3g/L，不同的防腐剂可以选择不同浓度，保证试剂在有效期内功能正常即可，本发明中，在稀释液中添加防腐剂的浓度为0.2-4.0g/L。
优选地，在稀释液中添加所述防腐剂的浓度为0.2-1.0g/L。
此外，为了增强试剂的分散、增溶作用，可适当在稀释液中添加一种非离子表面活性剂；
所述非离子表面活性剂为聚乙二醇型的非离子表面活性剂，或者是吐温系列的比较温和的表面活性剂，所述非离子表面活性的浓度为0.3-0.5g/L。
最优地，一种网织红细胞检测试剂盒，包括：
染色液：特异性核酸染料 0.70mmol
稀释液：
一种网织红细胞检测试剂盒的应用，其中，将所述特异性核酸染料用于网织红细胞检测。
有益效果：由于本发明所用的染料为一种新型的小分子的染料，很容易进入被稀释液处理过的细胞，与分子内部与核酸物质进行结合。解决了之前大分子染料难以进入分子内部以致染色效果不佳的技术难点。同时，本发明所用染料安全毒性小，解决了常用核酸染料高毒性的缺点。使用两性表面活性剂跟非离子表面活性剂处理细胞，经染料染色后，RET成熟程度区分界限明显，结果测定准确。同时还可以测定血小板的含量。
本发明为血细胞分析仪配套试剂，处理后的细胞在激光的照射下，发射出特定波长的荧光，通过散射光和荧光强度的不同将细胞进行区分及计数，得出不同光强度的网织红细胞的比例。从而得出测试结果。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明一种网织红细胞检测试剂盒进行详细说明，其中：
图1利用本发明试剂盒在配套血细胞分析仪上的散点图示意图；
图2为实施例4试剂与手工法RET％对照结果1；
图3为实施例4试剂与手工法RET#对照结果1；
图4为实施例4试剂与手工法RET％对照结果2；
图5为实施例4试剂与手工法RET#对照结果2；
图6为实施例4试剂与手工法RET％对照结果3；
图7为实施例4试剂与手工法RET#对照结果3。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
实施例1：
一种网织红细胞检测试剂盒，按照下列方案配制溶液：
染色液：
式5染料 0.50mmol/L；
乙二醇 930mL；
乙醇 70mL；
稀释液：
将式5染料用乙二醇、乙醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将十二烷基咪唑啉、吐温20、Tris、Proclin300按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至8。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，并测定网织红细胞的相关参数结果见表1。
表1实施例1测定结果
表1中结果表明本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施例2
按照下列方案配制溶液：
染色液：
式6染料 0.80mmol/L；
乙二醇 930mL；
丙醇 70mL；
稀释液：
将式6染料用乙二醇、丙醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将十四烷基咪唑啉、吐温60、HEPES、乙二醇苯醚按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至10。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，并测定网织红细胞的相关参数结果见表2。
表2实施例2测定结果
表2中结果表明本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施例3：
按照下列方案配制溶液：
染色液：
式7染料 0.79mmol/L；
乙二醇 930mL；
甲醇 70mL；
稀释液：
将式7染料用乙二醇、甲醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将十四烷基咪唑啉、乙二醇400、MOPS、Proclin300按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至8.5。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，并测定网织红细胞的相关参数结果见表3。
表3实施例3测定结果
表3中结果表明本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施例4：
按照下列方案配制溶液：
染色液：
式8染料 0.70mmol/L；
乙二醇 930mL；
甲醇 70mL；
稀释液：
将式8染料用乙二醇、甲醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将十二烷基咪唑啉、吐温20、HEPES、Proclin300按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至8.5。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，并测定网织红细胞的相关参数结果见表4。
表4实施例4测定结果
表4中结果表明本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施例5：
按照下列方案配制溶液：
染色液：
式8染料 0.60mmol/L；
乙二醇 900mL；
甲醇 100mL；
稀释液：
将式8染料用乙二醇、甲醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将十烷基咪唑啉、吐温80、磷酸氢二钠、山梨酸按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至8.5。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，并测定网织红细胞的相关参数结果见表5。
表5实施例5测定结果
表5中结果表明本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施例6：
按照下列方案配制溶液：
染色液：
式8染料 0.20mmol/L；
乙二醇 900mL；
甲醇 100mL；
稀释液：
将式8染料用乙二醇、甲醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将八烷基咪唑啉、吐温80、Tricine、甲醛按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至7。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施例7：
按照下列方案配制溶液：
染色液：
式8染料 1.00mmol/L；
乙二醇 900mL；
丙醇 100mL；
稀释液：
将式8染料用乙二醇、丙醇按上述比例混合，室温下搅拌至溶解完全，用0.2μm滤膜进行过滤，密封避光保存。
将十二烷基咪唑啉、HEPES、苯甲酸按上述比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用酸或者碱调节pH值调至11。用0.2μm滤膜进行过滤，保存。
将本实施例的两种试剂在配套血细胞分析仪上进行测试，空白值满足要求，本实施例中的试剂在配套的血细胞分析仪上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)的测定结果跟XN-1000仪器测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
与手工法对比实验：
本发明的实施案例4中的试剂盒在配套仪器上RET％(网织红细胞百分比)、RET#(网织红细胞总数)测定结果与手工法(网织红细胞计数的参考方法WS/T346-2011)检测结果有高度的相关性，其中每次测试样本量在100份以上(一半以上样本为RET#在0.02×106/μL)。具体对照结果见图2-7所示，计算结果如表6所示。
表6实施例4试剂盒与手工法测定结果对比相关性
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，包括：染色液和稀释液，所述染色液包括特异性核酸染料和用于溶解所述特异性核酸染料的有机溶剂，所述特异性核酸染料为式3所示的化合物：
其中R1、R2、R3为小于四个碳的烷基，R4为磺酸基，X为卤素原子；
所述稀释液包括缓冲剂、至少一种表面活性剂和水，所述检测试剂盒的pH值为7-11；
所述表面活性剂包括两性表面活性剂，所述两性表面活性剂为咪唑啉型式4所示的化合物：
R代表烷基或含8～16个碳原子的烷基。
2.根据权利要求1所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于：所述有机溶剂为乙二醇、甲醇、乙醇、丙醇中的一种或两种的混合物。
3.根据权利要求1所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲剂选自Tris、HEPES、MOPS、Tricine、磷酸盐缓冲液的一种或两种混合物。
4.根据权利要求1所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，所述染色液：其中，所述特异性核酸染料的浓度为0.20-1.00mmol/L；所述稀释液：其中，每1L水中含有两性表面活性剂0.2-1.5g、缓冲剂0.5-8.0g。
5.根据权利要求1所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，所述染色液：其中，所述特异性核酸染料的浓度为0.50-0.80mmol/L；所述稀释液：其中，每1L水中含有的两性表面活性剂0.3-1.0g、缓冲剂4.0-6.0g；所述pH值为8-10。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液中还包括防腐剂，所述防腐剂包括苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐类、苯氧乙醇、甲醛和Proclin300中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液中每1L水中含有的所述防腐剂0.2-4.0g。
8.根据权利要求1～5任一所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂还包括非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂为乙二醇型的非离子表面活性剂，或者是吐温系列的表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的网织红细胞检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液中每1L水中含有非离子表面活性0.3-0.5g。
10.一种网织红细胞检测试剂盒的应用，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述网织红细胞检测试剂盒用于制备网织红细胞含量的测定试剂。
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