CN1172953A - 网织红细胞测定用试剂和测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供由至少一种能使网织红细胞特异染色的色素和至少一种能使白细胞特异染色的色素组成的网织红细胞测定用试剂和测定方法。利用该试剂,使用配备便宜且小型的光源的流式细胞仪对既使有异常淋巴细胞等出现的特殊检测样品也可正确而迅速地测定网织红细胞。

Description

网织红细胞测定用试剂和测定方法

本发明涉及网织红细胞测定用试剂和测定方法，更详细地是涉及在临床检验方面为了测定血液中网织红细胞以及网织红细胞成熟指数而采用的试剂和测定方法。

网织红细胞是骨髓中的幼红细胞脱核后刚刚被释放到外周血液中的未成熟红细胞。网织红细胞作为细胞成熟过程中的遗迹具有以下特征：即细胞内含有少量的成熟红细胞中不含的RNA或核糖体、线粒体等细胞亚器官。

在临床检验方面，对网织红细胞进行分类计数在掌握患者骨髓内造血状态方面非常重要。骨髓造血正常的健康人其网织红细胞占红细胞总量的0.5～3.0％，可是当骨髓造血处于异常状态例如在骨髓造血被抑制的状态下，网织红细胞数量减少，而在骨髓造血亢进的状态下，网织红细胞数量增加。具体讲就是网织红细胞数量在再生不良性贫血、恶性肿瘤化疗时减少，而在溶血性贫血时增加。

以前的网织红细胞计数方法是通过将血液样品与含有新美蓝(NMB)、或煌焦油蓝(BCB)等碱性色素的染色液混合，使网织红细胞中含有的上述残存物质析出，染色，在显微镜下观察每个细胞，辨别成熟的红细胞和网织红细胞。这是一个手工操作方法。

然而，手工操作法的问题在于样品制作繁琐，而且检验技师间会产生细胞辨别的个人误差和细胞计数数量少等原因造成的统计学上的误差增大。

为了解决上述问题，可按下面方法(流式细胞仪法)进行，用荧光碱性色素代替上面的碱性色素对网织红细胞进行荧光染色，用流式细胞仪测定细胞的前方散射光强度和荧光强度，主要用荧光强度的差别辨别成熟红细胞和网织红细胞并进行分类计数。用于这一方法的色素有人们熟知的吖啶橙、噻唑橙、金(色)胺O等色素。

这个方法是根据网织红细胞的荧光强度，按其成熟程度对网织红细胞分类计数，有可能算出网织红细胞的成熟指数，人们已经知道，荧光强度高的网织红细胞的比率，即，***织红细胞的比率作为骨髓造血功能的恢复指标是有用的，人们期待着这一方法的利用。

但另有一问题：作为激发荧光色素的光源需要价格高而且体积大的氩激光器，所以装置本身价格高且体积大。另外，除了在流式细胞仪法可使用的金(色)胺O以外的上述色素对网织红细胞染色需5分多钟时间。特别是噻唑橙需60分钟以上的染色时间，这已在Lee.L.G.etal：Cytometry；7：508-517(1986)报告了，所以使样品制备全自动化是困难的，从省力的观点看是有问题的。由于通过人工进行样品制备，所以因其手工技术或操作者不同而使数据有偏差，尤其是在网织红细胞成熟指数上存在着很大的数据偏差这一缺点。

美国第5360739号专利公布了一种流式细胞仪测定方法，即采用比较便宜的He/Ne激光源，噁嗪750作为色素，通过测定散射光强度和吸光度或荧光强度测定网织红细胞。但该专利未涉及下面讲的异常淋巴细胞的问题。

本申请人也专心致力于研究用于正确而迅速测定网织红细胞以及网织红细胞成熟指数的试剂和测定方法，该试剂和测定方法可在配置了便宜的小型光源的流式细胞仪法中使用。但由于在出现异常淋巴细胞的特殊患者的样品中，淋巴细胞荧光强度与网织红细胞的荧光强度差不多，所以它们的分辨变得困难了。因此，就白细胞和网织红细胞的辨别困难问题，目前还未确立正确而迅速地测定的试剂以及测定方法。这一情况也在目前市售的以氩激光为光源的流式细胞仪用网织红细胞测定用试剂盒(Retic-COUNT^TM)的使用说明书中给了提示：即在测定白细胞数异常增加的患者的样品时需要通过另外的方法确认。

根据本发明可以提供由至少一种可使网织红细胞特异染色的色素和至少一种可使白细胞特异染色的色素组成的网织红细胞测定用试剂。

同时可提供使用上述试剂测定网织红细胞的方法。

本发明的试剂和测定方法对于象上述那样患者的检测样品，即对于出现很多异常淋巴细胞的患者样品也可正确而迅速地测定网织红细胞。本发明的试剂尤其适合于流式细胞仪法中使用。就是说，对于出现很多异常淋巴细胞的患者样品，通过使用本发明的试剂，可以不让成熟的红细胞和网织红细胞的荧光强度变化，而只使白细胞的荧光强度增大，所以可以精度更高地分类计数网织红细胞。

本发明的试剂是由使网织红细胞特异染色的色素和使白细胞特异染色的色素组成的。所谓使网织红细胞特异染色的色素是指用这种色素染色可使网织红细胞与其它血细胞区别开来。例如：式(I)化合物

式中，R₁为氢原子或低级烷基；R₂和R₃可相同或不同，为氢原子、低级烷基或低级烷氧基；R₄为氢原子、酰基或低级烷基；R₅为氢原子，可被取代的低级烷基；Z为硫原子、氧原子或被低级烷基取代的碳原子；n为1或2；X^-是阴离子。

式(I)的R₁中的低级烷基是指碳数为1～6的直链或支链的烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。其中理想的是甲基和乙基。

R₂和R₃中的低级烷基与上述相同，而作为低级烷氧基是指碳数为1～6的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、或丙氧基，其中理想的是甲氧基和乙氧基，而R₂和R₃是氢原子时更理想。

R₄中的酰基理想的是从脂肪族羧酸衍生的酰基，例如乙酰基和丙酰基，其中理想的是乙酰基。而低级烷基与上述的一样。

R₅中的低级烷基与上述的一样，所谓可被取代的低级烷基是指可以被1～3个羟基或卤原子(如氟、氯、溴、磺)等取代的低级烷基，其中，理想的是羟甲基和羟乙基。

Z中的低级烷基与上述的一样，作为Z理想的是硫原子。

X^-中的阴离子有卤素离子(氟、氧、溴或碘离子、卤化硼离子(BF₄ ^-、BCl₄ ^-、BBr₄ ^-等)、磷化合物离子、卤氧酸离子、氟硫酸离子、甲硫酸离子、苯环上有卤原子或卤代烷基取代基的四苯基硼化合物离子等，其中，理想的是溴离子和BF₄ ^-。

下面给出了式(I)的具体化合物。

上面式(I)中n＝1的化合物，可经过下面途径合成。例如用下式表示的化合物与N，N-二取代甲脒反应，其生成物再与以下式表示的喹啉衍生物反应，然后经氟硼酸钠处理，即可合成。

而式(I)中n＝2的化合物，是在上述反应中用丙二醛双(苯亚氨)盐代替N，N-二取代甲脒进行反应合成的。

其它可能使用的色素的例子，其结构式如下：和 [这里的B为

或是

C’为

X’是O，S，Se或是＞C(CH₃)₂；

Y’是Cl，Br或I，

R₁’、R₂’、R₃’、R₄’、R₅’、R₆’或R₇’相同或不相同，表示低级烷基、低级链烯基或卤化低级烷基]例如：

(1)1，1’，3，3，3’，3’-六甲基吲哚二喹啉蓝色素碘化物(HIDCI，可从LAMBDA PHYSIK社购买到)

(2)1，1’-二乙基-2，4’-醌喹啉蓝色素碘化物(NK-138，可从日本感光色素研究所买到)

(3)频哪氰醇氯化物

(4)1，3’-二乙基-2，2’-醌硫杂喹啉蓝色素碘化物。

用作网织红细胞检测用的色素也可使用众所周知的噁嗪750。为使网织红细胞染色，本发明试剂中的上述色素用量要充足，可根据色素的种类、试剂组成进行适当调整。例如，大约为0.1～100mg/升，更理想的量大约是0.3～30mg/升，最理想的是0.3～3mg/升。

而作为使白细胞特异染色的色素例如有式(II)和式(III)代表的色素

式中R₆和R₇可相同也可不同，表示氢原子、低级烷基、低级烷氧基或苯基；R₈～R₁₁可相同或不同，表示氢原子或低级烷基；X^-是阴离子。

式中R₁₂和R₁₃可相同也可不同，表示氢原子、低级烷基，低级烷氧基或用低级烷基取代的氨基，R₁₄和R₁₅相同或不同，表示氢原子或低级烷基；X^-是阴离子。

而上述式(II)和式(III)中的低级烷基以及低级烷氧基与前面所述一样。

为使白细胞染色，本发明试剂中色素的浓度要充足而且这一浓度不妨碍网织红细胞测定用色素对网织红细胞的染色。浓度可以根据色素的种类以及试剂组成进行适当调整。例如为0.001～200mg/升，更理想的大约是0.003～3mg/升，最理想的是0.003～0.03mg/升。

在本发明试剂组成中使网织红细胞特异染色的色素可以迅速地向红细胞内渗透，将细胞内的RNA染色。因此，即使只使用使网织红细胞特异染色的色素，对网织红细胞进行分类计数也是可能的。然而，在因急性淋巴性白血病等使淋巴细胞系的异常细胞增多等特别的情况下，淋巴细胞和未成熟的网织红细胞的荧光强度变得大致相等，所以辨别这两种细胞就变得困难了。

另一方面，本发明的试剂中含有能使白细胞特异染色的色素，用上述浓度只使白细胞染色是可能的。使白细胞特异染色的色素因色素的种类不同染色也不一样，大概都可以使白细胞中的不包含在网织红细胞中的颗粒成分或核等特异染色，我们认为由此会使白细胞的荧光强度增强。其结果，网织红细胞和白细胞的荧光强度会产生明显的差别，即，白细胞的荧光强度比网织红细胞的荧光强度强，由于网织红细胞的荧光强度没有变化，所以即使在上述那样的情况下辨别这两种细胞也是可能的。

这里虽然例举了用红色波长的光可激发的色素，但本发明中不限于这些色素，也可将被蓝色波长光那样的其它波长的光激发的色素组合使用，即使在这种情况下，也可提高网织红细胞和白细胞的辨别率。

另外还可使本发明试剂中含有抑制红细胞的非特异染色的多价阴离子、缓冲液、渗透压补偿液和/或促染液。

本发明人在研究试剂组成时发现，当通常使用的染液中的渗透压补偿液的主要成分是NaCl(主要是Cl^-)时，红细胞的非特异荧光变大，而网织红细胞的特异荧光变小，其结果使得红细胞和网织红细胞的辨别变得困难了。另外也发现将染色液中的Cl^-换成多价阴离子时，成熟红细胞的非特异荧光显著地被抑制，红细胞和网织红细胞的辨别也变得容易了。因此理想的是使本发明试剂中含有多价阴离子。作为多价阴离子，硫酸根离子、磷酸根离子、碳酸根离子以及多价羧酸根离子特别适合。供给这些离子的化合物例如有柠檬酸、硫酸、磷酸、EDTA及它们的碱金属盐等。多价阴离子的浓度为在试剂的总离子成分中所占比例在50％以上，理想的是占70％以上。

另外，本发明的试剂中可含有使pH保持一定的缓冲液。使用缓冲液使pH保持一定由此可保持稳定的网织红细胞的染色结果，使用的浓度是数mM～100mM左右。缓冲液的种类，只要是通常使用的，并不特别限定，例如按所希望的pH适当使用羧酸盐类、磷酸盐类、古德缓冲液、牛磺酸、三乙醇胺等。本发明中试剂的合适pH因所用色素不同而有所不同，但一般是在6.0～11.0范围，理想的pH是处于7.0～10.0范围，更理想的是在8.0～9.5范围内。若pH比上述范围过低时，由于红细胞易脆化，变得易溶血，所以使得网织红细胞的正确测定变得困难了。若pH过高，由于红细胞膜上的酸性官能团解离，使它易与阳离子色素结合，增加红细胞的非特异荧光。由于这一原因有使成熟红细胞与网织红细胞的辨别变得困难的倾向，这是不希望的。若上述多价阴离子具有将pH调节到合适的pH范围内的缓冲能力，也可兼用作缓冲剂。

本发明的试剂中也含有渗透压补偿液，为了防止红细胞的低渗溶血，希望将渗透压调整到生理学上的渗透压。通常调整到150～600mOsm/kg的范围内。渗透压补偿液并不被特别限定。例如，合适的有丙酸等酸的碱金属盐、葡萄糖、甘露糖等糖类。若未达到所占试剂中总阴离子的比例的50％，也可使用象NaCl那样的碱金属卤化物、碱土金属卤化物等。若是用上述的多价阴离子以及缓冲液可以将渗透压调节到适当的范围内时，就不需含有渗透压补偿液了。

本发明的试剂中还可含有作为促染液的以式(IV)表示的阳离子表面活性剂。

式中，R₁₆为碳数是8-12的烷基；R₁₇、R₁₈、R₁₉相同或不同，表示低级烷基；Y^-为卤素离子。

其中，碳数8-12的烷基包括直链或支链的烷基，例如辛基、癸基或十二烷基，基中理想的是辛基和癸基。

而低级烷基与上述的相同。

作为阳离子表面活性剂的具体例子有溴化辛基三甲基铵(OTAB)、溴化癸基三甲基铵(DTAB)或氯化十二烷基三甲基铵(LTAC)。

作为促染液的阳离子表面活性剂的浓度，总碳数愈增加，少量即可有效。例如：OTAB为300～20000mg/升，DTAB为500～300mg/升，而LTAC为50～250mg/升即可。阳离子表面活性剂的作用机制虽然不明确，但由于它会引起与红细胞膜的某些相互作用，人们认为它可促进色素的通透性。因此样品中若促染液量多就会伤害红细胞，有时会引起溶血，这是所不希望的。

另外由于阳离子表面活性剂有使红细胞球状化的作用，所以使红细胞团的前方散射光强度分布聚束。其结果，使血小板和红细胞系细胞的辨别变得容易了。还有在小球红细胞病、例如在缺铁性贫血等病的治疗中，血液中因疾病而产生的小球形红细胞和正球形红细胞混在一起，但若用本发明的试剂通过前方散射光强度辨别这两种细胞也成了可能。同时也可同样辨别少量出现的椭圆形红细胞。这样一来利用阳离子表面活性剂的红细胞球形化作用在测定网织红细胞的同时也可检测小球形红细胞和椭圆形红细胞等红细胞的异常形态。

本发明的试剂中除含有上述组成成分之外，也可含有例如2-吡啶基硫代-1-氧化钠或β-苯乙醇等防腐剂。

还有在本发明的试剂中使用的色素在水溶液中不稳定时可将色素溶解在适当的可与水互溶的非水溶剂中保存，如乙醇、二甲基亚砜、乙二醇等。使用时与含有别的成分的水溶液混合后就可使用。各个色素溶解在同一非水溶剂中也是可能的，而也可能溶解在别的非水溶剂中。

本发明的试剂在使用流式细胞仪测定网织红细胞时特别有效。

工序(1)，将本发明的网织红细胞测定试剂与血液学样品混合后制备测定用样品。所谓血液学样品是指含有成为测定对象的血液成分的任何样品。例如，进行过抗凝剂处理的外周血液或骨髓液。测定样品的制备理想的是将网织红细胞测定用试剂与血液学样品按100∶1～1000∶1的比例混合后使其反应，此时的反应温度在25～50℃范围内合适，更优选在35～45℃。而合适的反应时间因试剂中所含色素而不同，但理想的是10秒～5分钟左右，更理想的是20秒～2分钟左右，最理想的是20～60秒左右。

工序(2)，将在工序(1)中得到的测定用样品导入装有红色波长光源的流式细胞仪的流动***中。作为红色波长光源，只要是可产生使用色素(荧光色素)的激发波长附近的光，例如600～680nm左右的波长的光的光源即可，并不被特别限定。例如He/Ne激光器、红色波长范围的半导体激光器等光源。图1给出了使用的含有红色波长光源的流式细胞仪的光学部分。在半导体激光器1的前方通过会聚透镜组2装了一个流动池3，在流动池的前方通过光束限制器4装了前方散射光用受光透镜5和光电二极管6。而在流动池3的侧面通过侧面荧光用的受光透镜7装了带通滤波器8和光电倍增管9。而流动部分、数据处理部分等其它构件，将众所周知的结构等改进后即可使用。

工序(3)，用上述的红色波长的光照射流过鞘流(Sheath-flow)中的细胞。

工序(4)是测定由细胞发出的散射光和荧光。此时的散射光无论是前方散射光或侧面散射光都可以。作为前方散射光无论是前方低角散射光(1～5°)或是前方高角散射光(6～20°)都可以。散射光是反映细胞大小信息的参数，其它测定细胞大小信息的方法还有电阻法等。根据情况不同可利用电阻法代替散射光的测定来测定电阻信号。

工序(5)，根据散射光强度或散射光强度和荧光强度的散射图辨别血小板和其它的细胞。

工序(6)，根据荧光强度或者荧光强度和散射光强度的散射图辨别红细胞、网织红细胞以及白细胞。

工序(7)，对红细胞和网织红细胞分类计数，算出它们的细胞数和细胞比率。

将网织红细胞按其成熟程度的差别分类计数，具体讲是根据荧光强度的不同进行的，可以算出它们占总网织红细胞的比例。

实施例1：首先按下列组成配制网织红细胞测定用试剂。

使红细胞特异染色的色素A          3mg

使白细胞特异染色的色素B          0.03mg

麦黄酮(缓冲剂)                   1.79g

柠檬酸3钠二水和物(多价阴离子)    29.4gLTAC(阳离子表面活性剂、促染剂)  150mg精制水                          1升(用氢氧化钠将pH调到9.0)

                       噁嗪170

将经过抗凝剂处理的健康人血液10μl加到2ml的试剂中，40℃温育120秒后，将得到的测定用样品用图1所示的光学部分测定前方散射光强度和荧光强度。在图2所示的散射图中，网织红细胞比率是2.0％。而作为对照方法用东亚医用电子制R-2000测定的也是2.0％。

同样测定淋巴***的异常细胞出现的血液时得到图3的散射图。根据这个散射图可以清楚地辨别网织红细胞团和白细胞团。

实施例2：首先按下列组成配制网织红细胞测定用试剂。

使网织红细胞特异染色的色素A    3mg

使白细胞特异染色的色素C        30mg

麦黄酮                         1.79g

柠檬酸3钠二水和物              29.4g

LTAC                           150mg

精制水                         1升

(用氢氧化钠将pH调到9.0)

将10μl经抗凝剂处理的健康人血加到2ml的试剂中，40℃温育120秒后，将得到的测定用样品用图1所示的光学部分测定前方散射光强度和荧光强度。图4给出的散射图中网织红细胞比率是1.8％，而作为对照方法用东亚医用电子制R-2000测定时是1.7％。

比较例1：首先按下列组成配制网织红细胞测定用试剂。

使网织红细胞特异染色的色素A    3mg

麦黄酮                         1.79g

柠檬酸3钠二水和物              29.4g

LTAC                           150mg

精制水                         1升

(用氢氧化钠将pH调到9.0)

将10μl进行过抗凝剂处理的健康人血加到2ml试剂中，40℃温育120秒后，将得到的测定用样品用图1所示的光学部分测定前方散射光强度和荧光强度。图5给出的散射图中网织红细胞的比率为2.1％，而作为对照方法用东亚医用电子制R-2000测定时是2.0％。

同样测定出现淋巴***的异常淋巴细胞的血液时得到图6的散射图。根据这个散射图不能清楚地辨别网织红细胞团和白细胞团。

采用本发明的试剂和测定方法，使用配置了便宜、小型的光源的流式细胞仪法，既使在异常淋巴细胞出现的特殊检测样品中也可正确、迅速地测定网织红细胞。即，利用本发明的试剂和测定方法对于出现异常淋巴细胞的患者样品，可以不使成熟红细胞和网织红细胞的荧光强度变化，而只使白细胞的荧光强度变大，因此可以更精确地对网织红细胞分类计数。

附图的简单说明：

图1：在本发明的测定方法中使用的带有红色波长光源的流式细胞仪的光学部分的简图。

图2：使用含有本发明的使网织红细胞特异染色的色素A和使白细胞特异染色的色素B的网织红细胞测定用试剂，测定健康人外周血液样品的前方散射光强度以及荧光强度时得到的散射图。

图3：使用含有本发明的使网织红细胞特异染色的色素A和使白细胞特异染色的色素B的网织红细胞测定用试剂，测定出现异常淋巴细胞的患者的外周血液样品的前方散射光强度以及荧光强度时得到的散射图。

图4：使用含有本发明的使网织红细胞特异染色的色素A和使白细胞特异染色的色素C的网织红细胞测定用试剂，测定健康人的外周血液样品的前方散射光强度以及荧光强度时得到的散射图。

图5：使用本发明的只含有使网织红细胞特异染色的色素A的网织红细胞测定用试剂，测定健康人外周血液样品的前方散射光强度以及荧光强度时得到的散射图。

图6：使用只含有使网织红细胞特异染色的色素A的网织红细胞测定用试剂，测定有异常淋巴细胞出现的患者的外周血液样品的前方散射光强度以及荧光强度时得到的散射图。

符号说明：

1.半导体激光器

2.会聚透镜组

3.流动池

4.光束限制器

5.前方散射光用受光透镜

6.光电二极管

7.侧面荧光用受光透镜

8.带通滤波片

9.光电倍增管

Claims (12)

1.网织红细胞测定用试剂，由至少一种能使网织红细胞特异染色的色素和至少一种能使白细胞特异染色的色素组成。

2.权利要求1中记载的网织红细胞测定用试剂，其中使网织红细胞特异染色的色素如式(I)所示，

(式中，R₁为氢原子或低级烷基；R₂和R₃相同或不同，表示氢原子、低级烷基或低级烷氧基；R₄为氢原子、酰基或低级烷基；R₅为氢原子、可以被取代的低级烷基；Z为硫原子、氧原子或被低级烷基取代的碳原子；n为1或2，X^-为阴离子)。

3.权利要求1或权利要求2中任一项记载的网织红细胞测定用试剂，其中使白细胞特异染色的色素如式(II)或式(III)所示，

(式中，R₆以及R₇相同或不同，表示氢原子、低级烷基、低级烷氧基或苯基；R₈～R₁₁相同或不同，表示氢原子或低级烷基；X^-为阴离子)

(式中，R₁₂及R₁₃相同或不同，表示氢原子、低级烷基、烷氧基以及可被低级烷基取代的氨基；R₁₄和R₁₅相同或不同，表示氢原子或低级烷基；X^-是阴离子)。

4.权利要求1～3中任一项记载的网织红细胞测定用试剂，其中含有抑制红细胞的非特异荧光的多价阴离子。

5.权利要求1～4中任一项记载的网织红细胞测定用试剂，其中含有使pH保持一定的缓冲液。

6.权利要求1～5中任一项记载的网织红细胞测定用试剂，其中含有使渗透压维持在生理学渗透压的渗透压补偿液。

7.权利要求1～6中任一项记载的网织红细胞测定用试剂，其中含有促染液。

8.权利要求7中记载的网织红细胞测定用试剂，其中的促染液是阳离子表面活性剂。

9.权利要求8中记载的网织红细胞测定用试剂，其中的阳离子表面活性剂如式(IV)所示，

(式中，R₁₆为碳数8～12的烷基；R₁₇、R₁₈、R₁₉相同或不同，表示低级烷基；Y^-为卤素离子)。

10.权利要求9中记载的网织红细胞测定用试剂，其中的阳离子表面活性剂是下列的至少一种：氯化十二烷基三甲基铵、溴化癸基三甲基铵、溴化辛基三甲基铵。

11.使用权利要求1～10中任一项记载的试剂测定网织红细胞的方法。

12.权利要求11中记载的方法，该方法使用流式细胞仪。

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