CN1189185A

CN1189185A - 降解鼠李半乳糖醛酸聚糖ⅱ的酶和微生物

Info

Publication number: CN1189185A
Application number: CN96195086A
Authority: CN
Inventors: P·皮尔里恩; J－M·布里洛特; T·道科; P·威利姆斯; S·维代尔; M·莫托尼特
Original assignee: National Institute Of Agronomique
Current assignee: National Institute Of Agronomique
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-21
Publication date: 1998-07-29

Abstract

公开了降解鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG－Ⅱ),具有内切－β－L－吡喃鼠李糖基－(1→3′)－D－呋喃芹菜糖基水解酶活性和/或内切－α－L－吡喃岩藻糖－(1→4)－L－吡喃鼠李糖基水解酶活性的酶。该酶可通过微生物,尤其是青霉属菌株,例如保藏在CNCM,保藏号为1—1577和1—1578菌株来产生。可通过包括层析步骤的方法从植物提取物中获得RG－Ⅱ。

Description

降解鼠李半乳糖醛酸聚糖II的酶和微生物

本发明涉及一种降解鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RG-II)及其衍生物的酶以及获得该酶的方法。

本发明进一步涉及一种获得RG-II的方法。

本发明还涉及该酶的应用。

鼠李半乳糖醛酸聚糖II是植物细胞壁的一种普遍且高度复杂的成分(ONeil等，植物生物化学方法(1990)2：415-439))。它属于果胶多糖且主要存在于正常的片层和初生壁中。

由于它由12种不同单糖构成，聚合度(dp)接近30，因此它的结构极其复杂(图1)。由于在它的组成中存在稀有糖类而增加了这种复杂性，它的组成中包含芹菜糖或3-C-(羟基甲基)-D-甘油丁糖，KDO或2-ceto-3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸，DHA或3-脱氧-D-来苏糖-2-庚酮糖酸，2-O-甲基-岩藻糖，2-O-甲基-木糖以及乙酸或3-C-羧基-5-脱氧-L-木糖。后一单糖构成了RG-II特有的标志。膜壁多糖中较常见的单糖：鼠李糖、岩藻糖、***糖、半乳糖和半乳糖醛酸和葡糖醛酸也存在于RG-II的组成中，但通常带有端基异构体和增强分子结构特异性和复杂性的特定类型的多种连接。

RG-II的超微结构(图1)进一步增加了这种复杂性(Puvane-sarjah等，碳水化合物研究(1991)218：211-222))。由在α-(1→4)键合的7至14个半乳糖醛酸残基组成的同型链在仍未确定的位置上带有4个不同的支链：两个二糖和两个更为复杂的非糖链。从同型半乳糖链的长度和支链B的端部观察到结构的可变性，并且似乎是由用来获得它的酶活性所造成的。第二，在A5残基上已检测到未确定的取代基的存在。此外，RG-II分子包含2-3个酯化半乳糖醛酸羧基的甲基和2个位于R3(槭汁酸)和B4(2-O-甲基-岩藻糖)残基上的乙酰基。

因此，RG-II的通式结构已被确定，虽然一些取代基的性质仍未能鉴定出。

在植物的细胞壁中，RG-II与天然果胶有关，但原果胶和RG-II之间的确切键合类型仍然未知。同样，对其在植物细胞壁中的作用也了解不多。然而，已知它存在于整个植物界(A1bersheim等，生物化学协会学报(1994)22：374-378)：蕨类植物和孢子植物，裸子植物和被子植物，单子叶植物和双子叶植物(图2)中，并以显著的量存在于细胞壁的正常的片层中。还已知它的结构在所研究的不同的植物中保持一致(Albersheim等生物化学协会学报(1994)22：374-378))。

最近研究表明它可起信号多糖的作用并诱导植物的特定反应(引发活性)(Aldington和Fry，实验植物学(1994)45：287-293)。然而，它结构的多样性，普通存在及复杂性使人设想在植物细胞壁的粘合、并从而在组织***的细胞结构中起着根本的作用。

如图1所示，在具有果胶酶活性(果胶酯酶，内切或外切多聚半乳糖醛酸酶)的酶的作用下，RG-II从细胞壁上释放出来，其中具有果胶酶活性的酶降解天然果胶的光滑链并以非降解形式释放RG-II(Darvill等，植物生理学(1978)62：418-422)。同型半乳糖醛酸链长度的可变性是使它能从天然果胶中释放的酶促降解的原因(Whit-combe等，碳水化合物研究(1995)271：15-29)。

RG-II结构的复杂性和独特性使它特别对存在于商业真菌及细菌酶制剂中的以及植物提取物中的酶的降解有抗性。

事实上在用于降解植物细胞壁，富含各种活性的商业酶制剂中不可能证明任何降解活性。观察到的唯一的降解是有关位于侧链非还原端的呋喃***糖、吡喃鼠李糖或呋喃半乳糖残基。促使这些残基释放的外切酶实际上广泛存在于酶制剂中，并且根据作者，从而毫无疑问地解释了所报道的各种RG-II制剂中观察到的可变性。

当压榨或捣碎水果和蔬菜时，释放出确保天然果胶的同型半乳糖醛酸链降解的果胶溶解活性。当使用酒或发酵产物时，通过加入商业果胶溶解酶和发酵植物区系增强这些活性。在果汁和花蜜、蔬菜和其衍生物(尤其是酒)中，RG-II以完整的形式且以通常显著的量被释放。

在酒中，RG-II代表一种主要的多糖(Doco和Brillouet，碳水化合物研究(1993)243：333-343)，它的浓度可达到100mg/L。它参与大量不希望出现的现象中，例如阻塞滤膜(Belleville等EnoL.Vitic.Sci(1991)46：100-107)，形成不稳定的带有其它胶体大分子的复合物以及诱导沉淀现象。不得不通过使用能降解它的特定的酶来消除它。

到目前为止，已报道了几种从酒中获得RG-II的方法：

-借助于从悬浮植物细胞培养物中分离的细胞壁的真菌内切聚半乳糖醛酸酶，进行酶水解(Darvill等，植物生理学(1978)62：418-422)，

-来自一种黑曲霉的商业酶制剂AC果胶醇(Stevenson等，碳水化合物研究(1988)179：269-288)。这里RG-II以低浓度存在，并且它的纯化涉及大量用于除去蛋白质和着色物质的步骤，

-从酒中来(Doco和Brillouet，碳水化合物研究(1993)243：333-343)，并且描述的纯化过程使用了4个连续的空间排阻色谱和离子交换色谱步骤。

应该注意虽然鼠李半乳糖醛酸聚糖I或RG-I具有极其相似的名称，但就其结构(它的结构以鼠李糖和半乳糖醛酸的交替为基础)和它的酶促降解而言，它是一个完全不同于RG-II的植物细胞壁的组分。鼠李半乳糖醛酸酶(Schols等，碳水化合物研究(1990)206：105-115)或原果胶酶(Sakamoto和Sakal，碳水化合物研究(1994)259：77-91)活性已被描述。

对现有技术状况的上述分析表明没有拥有满意的降解RG-II活性的酶或酶制剂。然而，这种多糖的存在是不希望产生的现象的根源，例如阻塞滤膜、形成不稳定的带有其它胶体大分子的复合物以及诱导沉淀现象。

由于涉及广泛的经济活动，需要寻找一种解决这个问题的办法。

申请人表明可以从微生物中分离负责降解RG-II和其衍生物的酶活性。

首先，他提出了一种新的获得RG-II的方法，使得有可能从各种植物来源中大量地获得它。

本发明涉及一种酶，其特征在于它降解RG-II和其它的衍生物。

根据本发明，RG-II指包含图1所示结构的任何多糖，不论其为单体或二聚体形式，以及从其部分降解产生、并且包含链A、B、C或D的至少一个片段的任何分子，它的特征在于它的组成和它的序列。

在下文，当提到RG-II时，相同的含义也应用于该分子的任何衍生物。

该酶有利地显示出内切水解酶类型的活性。

该酶尤其可显示出内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖水解酶和/或内切-α-L-吡喃岩藻糖基-(1→4)-L-吡喃鼠李糖水解酶活性。如图1所示，这些活性可通过它们释放链A的能力而被确定。

该酶可通过微生物，尤其是青霉属的真菌来制备。

具有降解RG-II活性的这些微生物组成了本发明的另一个目的。尤其是，它们可为于1995年5月19日保藏在National Collec-tion of Cultures of Microorganisms of the Pasteur Institute(CNCM)的下列青霉属的种：

-以n°1-1577保藏在CNCM的简青霉(P.Simplicissimum)菌株(IPV1)，

-以n°1-1578保藏在CNCM的齿孢青霉(P.daleae)菌株(LaV2)。

这两个青霉菌株显示出被迅速形成(从培养的第6天开始)的蓝绿孢子分隔的丝状蕈这一特征形态。

齿孢青霉是一种仍从森林土壤中分离的稀少真菌，并已知它能降解淀粉和果胶多糖。这一种类描述在《土壤真菌简编》H.K.Dom-sch，W.Gams和T.H.Anderson(1980)Academic Press，London，P.560中。

简青霉是较常见的一种，通常从腐烂植物中分离。这一种类描述在《土壤真菌简编》H.K.Domsch，W.Gams和T.H.Anderson(1980)Academic Press，London，P.597-598中。

本发明还涉及包含上述降解RG-II的酶和其衍生物的酶制剂。

具有促使RG-II降解的活性的这些制剂的富集为需要部分或完全降解细胞壁和植物多糖的所有那些应用提供了一种完全崭新的可能性。

能特异性降解RG-II和其衍生物的酶可被尤其用于下列应用中：

-从果汁、蔬菜和它们的衍生物中除去RG-II，以改善过滤性，易于产生果汁和浓缩的芳香香基，促进澄清现象和确保终产品的良好稳定性，

-清洗用于澄清果汁、蔬菜和它们衍生物的微孔过滤膜和超滤膜，

-获得浸渍类型的制剂，即使得幼嫩植物的细胞组织以膜壁结构的最少降解而被分离(生产果汁，果浆，胶状物和植物及果实的浓缩液)。

-获得液化类型的制剂，即用于提供对植物细胞壁的多糖的完全水解(生产汁和水果芳香香基，植物和发酵饮料，啤酒)，

-从植物残渣中(甜菜根浆，挤压果实之后的固体残渣…)生产果胶和动物食物。

-从植物中生产纤维素；其它多糖成分的酶解使得有可能提高产率(纺织工业和造纸)。

根据所需的应用类型促使植物细胞壁降解的商业酶制剂需要具有最为特异和尽可能确定的生化作用方式。用于降解RG-II并具有特异的被很好确定的作用方式的酶的特殊贡献将改进真菌酶的工艺潜能的利用。

本发明的上述酶和酶制剂可优选通过包括下面步骤的方法获得：

-在适宜于产生酶的合适培养环境中培养显示出降解RG-II或其衍生物活性的微生物，

-在培养物上清或微生物的压碎物的上清中收集酶或酶制剂。

优选地，该方法包括下列步骤：

-在适宜于这些微生物并包含RG-II的合适培养基中培养显示出降解RG-II活性的微生物，

-回收微生物，

-压碎微生物，

-尤其是通过过滤或离心被压碎的微生物来去除不溶物，和

-回收包含酶或酶制剂的上清。

也可在条件允许时，通过选择条件或青霉的种类，使酶被释放到培养基中，在不压碎微生物的情况下直接从培养物上清中获得酶。

该方法可有利地通过使用以N°1-1577和N°1-1578保藏在CNCM的青霉菌株来完成。

还可通过克隆负责它们合成的基因后进行遗传改造或通过本领域技术人员已知的任何其它适宜的方法，尤其通过在已确定它们序列后，从单独的氨基酸合成来获得这些酶。

本发明还涉及从植物提取物中获得RG-II和它的代谢物或衍生物的方法，其中它包括提取物的层析步骤。

显然，该方法涉及获得RG-II，而且还有已知为当完成该方法时可形成的该分子的降解代谢物，以及RG-II衍生物。

根据本发明，“植物提取物”指包含尤其是溶解的植物多糖的任何制备物。多糖已通过超滤或沉淀而浓缩，例如用乙醇，甲醇或任何其它适宜溶剂进行沉淀。

该方法还可至少包括在RG-II保留载体上的RG-II吸附层析。该吸附层析可在活性碳、聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂或任何其它适宜载体上进行。

还可在层析步骤之前和/或之后加上通过超滤或通过空间排阻层析的多糖分离步骤。为了完成分级沉淀，有利地使用乙醇或甲醇。为了完成空间排阻层析，有利地使用Sephacryl柱或任何其它适宜载体。

本发明还涉及可通过这些方法中的一种获得的制备物：

-第一种，主要包含(至少95％)RG-II单体的制备物，和

-第二种，包含至少80％，优选大于95％RG-II二聚体的制备物。

每次层析后，根据它们的组成确定包含RG-II的那些级分。本领域技术人员可以进行这一操作。

这些方法使人容易从来自除禾本科植物外的任何植物产品获得相当量(约1千克)的RG-II制备物，例如从果汁、蔬菜和它们的衍生物，尤其是可能经浓缩的酒、酒糟和葡萄汁，以及以约10克的规模进行。RG-II优选从植物初生壁中获得，但它也可在常规改变过程(挤压，发酵)中或通过用液化酶从需要溶解细胞壁的任何植物衍生物中获得。

本发明的另一个目的是针对降解RG-II能力筛选微生物(尤其是真菌)的方法，所述方法特征在于微生物被培养在包含RG-II的适宜的培养基中。

本发明还涉及包含RG-II的这些微生物的培养基。

本领域技术人员可仅通过阅读本发明的描述和一般知识来完成本发明的方法，尤其是根据本发明的制备和分离酶的方法以及制备RG-II的方法。尽管如此，仍可参考下述手册：微生物学方法，卷1-6，J.R.Morris和D.W.Ribbons(1969-1972)，Academic Press，伦敦，纽约。

现通过下列实施例来说明本发明，但本发明不受其限制。

本说明书和实施例中所指的附图如下。

图1图解表示包括其侧链A-D的RG-II的结构。在该图中，R¹代表氢或α-L-吡喃鼠李糖，R²和R³代表氢或其它取代基。

图2说明RG-II在植物界中的分布。

图3说明在DEAE柱(Macroprep)上对酒中多糖、酸性糖和中性糖的分级分离。

图4A和4B为从红酒分离的两个RG-II级分的高效空间排阻层析图谱。

图5表示在Superdex-75HR柱上，从酒浓缩液中纯化的两个RG-II级分的高效空间排阻层析图谱：a：级分III，RG-II二聚体(分子量9500Da，在18.5分时洗脱)；b：级分II，RG-II单体(分子量4750Da，在20.5分时洗脱)。

图6为实验工厂规模RG-II纯化图。

图7为在Superdex-75HR柱上，对红酒总多糖(a)，在Relite^DIAION^树脂上不保留的级分(b)，和被保留并用20％乙醇洗脱的级分(c)进行CES-HP所确定的图谱比较。

图8说明简青霉(1-1577)的可溶细胞提取物对RG-II的降解图谱a，b和c分别对应于天然RG-II和24小时和48小时降解后的RG-II。

图9说明LaV2菌株(1-1578)的可溶细胞提取物对RG-II的降解(a：天然RG-II，b：96小时后；c：168小时后，d：190小时后)。

图10说明简青霉(1-1577)培养物降解RG-II后，接着进行的CES-HP层析。曲线a-f分别表示天然RG-II图谱和真菌生长96小时、132小时、168小时、192小时和400小时后的RG-II图谱。

图11说明齿孢青霉(1-1578)培养物降解RG-II后，接着在不同时间进行的CES-HP层析(a：天然RG-II；b：72小时；c：120小时；d：240小时；e：264小时；f：336小时；g：384小时)。

图12表示简化的图1的结构。指示了根据本发明的可能的酶切位点(箭头1和2)。

图13表示通过简青霉和齿孢青霉降解后，RG-II残余部分的结构。

图14说明齿孢青霉(1-1578)对二聚体RG-II的降解。图谱a-c分别表示二聚体天然RG-II和降解168小时和300小时后的二聚RG-II图谱。

图15说明被简青霉(1-1577)的全部可溶性细胞提取物降解后接着进行的CES-HP层析纯化。图谱a-d分别对应于起始RG-II和保温72小时，120小时和148小时后的RG-II图谱。

图16为红酒(图谱a)与存在IPV1酶提取物下保温48小时后(图谱b)所测得的CES-HP多糖分布图的比较。

图17为红酒(图谱a)与仅存在Pectinex^Ultra Sp L(图谱b)或与IPV1菌株的酶提取物结合(图谱c)保温48小时后的多糖分布图的CES-HP比较。

图18为在不存在(图谱a)和存在(图谱b)IPV1菌株的酶提取物下，保温48小时后，通过Rapidase^ Liq酶制剂全液化苹果而获得的苹果汁的多糖分布图的CES-HP比较。

图19A和19B说明与对照(图19B)比较，IPV1菌株的酶提取物对甜菜根组织(图19A)的降解。

图19C，20A和20C分别表示与各自对照(图19D，20B和20D)比较，IPV1菌株的酶提取物对胡萝卜、苹果和马铃薯组织的降解。

实施例1：通过阴离子交换层析和分子筛选从酒中纯化鼠李半乳糖醛酸聚糖II

RG-II以非降解形式存在于尤其是果汁、蔬菜汁和它们的衍生物，特别是发酵衍生物中。

可通过进行下面的纯化步骤从来自植物的任何产品中均一地纯化RG-II：

1.通过用80％乙醇沉淀或通过超滤一步获得大分子。

2.酸性PH阴离子交换制备性层析。

3.分子筛选层析(如果寻求80％的纯度比例的RG-II制备物，则可省略使得有可能达到高纯度百分比的这一步骤)。

1.酒样品和胶体的获得

采用的酒是从Pech-Rouge/Narbonne试验园中于1991年9月成熟收获的黑Carigan得到。在截留限为10000的Carbo Sep M5(Tech Sep，法国)超滤膜上浓缩了600升酒。接着将被浓缩的酒的全部胶体(最终体积为25L)通过加入4体积60mM HCl酸化的乙醇来沉淀，用80-90％乙醇连续洗涤，放回到水中并对40mM，PH4.6柠檬酸钠缓冲液透析。全部胶体的干重(脱盐和冷冻干燥一等分试样级分后测定)为296g，即每升酒中为约0.5g。

2.阴离子交换层析

连续10次通过在40mM，PH4.6的柠檬酸钠缓冲液中以20.5ml/min平衡的DEAE-Macroprep(Bio Rad，USA)柱(5×80cm)，进行PH4.6的胶体溶液的阴离子交换层析分级分离。中性或略带电荷的多糖在注射缓冲液中洗脱(级分I)。首先借助于浓度50mM的柠檬酸钠缓冲液洗脱(级分II)，接着将50(级分III)和150mM(级分IV)NaCl加入到洗脱缓冲液中来洗脱包含RG-II的级分(图3)。这三种级分分别代表以干重表示的总胶体的7.9％，6.6％和4.1％。

3.通过空间排阻层析均一纯化RG-II

通过在包含50mM Nacl的50mM，PH5乙酸钠缓冲液中以7ml/分平衡的Sephacryl S-400 HR柱(5×75cm)上的空间排阻层析均一地纯化存在于级分II和III中的RG-II。

在冷冻干燥前，将包含RG-II的级分对水进行透析。

获得的两个RG-II样品具有理想均一的高效空间排阻层析分布图(CES-HP，在两个Shodex OHPak KB-803和KB805柱上依次分析，以0.1M LiNO₃ 1ml/分洗脱，折射计检测)(图4)，并且分别代表酒样品总胶体的4.4和4.6％。由于必需加上包含在级分IV中的未被均一纯化的RG-II，所以所用酒样品的RG-II的总的百分比大于50mg/l。

4.从酒纯化的RG-II级分的组成

两个纯化的RG-II级分均具有特征性的RG-II组成(表1)。就它们的组成分析而言，它们相互没有明显的不同。

将DEAE-Macroprep上获得的级分II和III在Superdex-7511R柱(1×30cm，14分钟时洗脱)分子筛载体上进行分析。此分析表明级分II主要包括RG-II单体(在20.5分钟洗脱，分子量为4750Da)，而级分III包含大于95％的RG-II二聚体(在18.5分钟洗脱，分子量9500Da)。

因此级分II的RG-II制备物被用于筛选和诱导特异性降解的酶活性。实施例2：从酒糟通过吸附层析获得的RG-II

通过真空蒸馏和浓缩300hl红酒(来自不同葡萄的酒的混合物)获得所使用的酒糟：

通过在落浮标***中真空蒸发浓缩通过蒸馏获得的酒糟。在该浓缩物中倾析后，去除酒石酸氢盐，并接着在相同***中重新浓缩酒糟。最终，酒被浓缩30倍，并通过加入4体积90％乙醇沉淀所获得的1000升浓缩酒糟的全部胶体。将沉淀放回300升水中以形成用作RG-II来源的酒糟溶液。吸附层析

下面的层析分离通过与折射检测***相连的Shodex柱(见实施例1或Superdex-HR 75柱(Pharmacia；流速0.6ml/分钟))上的HPIC来确定。

(a)在活性炭上

活性炭对于大量分子具有高度的吸附活性。在本发明中选择活性炭是因为它从各种种类的果胶多糖中分离RG-II的能力。事实上，所有多糖被吸附在活性炭上，但RG-II仅在小于40％的乙醇浓度时被吸附。试验了两种类型的炭。

粉状活性炭

将被稀释1/15的1升酒糟溶液放置与100g粉状活性炭(Norit^SA⁺)接触30分钟。接着将溶液烧结过滤以除去炭粒。将保留在滤器上的炭悬浮于1升40％乙醇中，定期搅拌混合物30分钟，接着真空过滤。随后用HPLC分析洗脱的RG-II。该级分的组成分析(表2)表明RG-II的纯度接近50％。

挤压活性炭

这类炭需要与酒糟溶液接触更长的时间(48小时)以吸附RG-II，但确实具有易化过滤步骤的优点。第二，所需炭的量为粉状炭的两倍。

将被稀释1/15的1升酒糟溶液放置与200g挤压活性炭(Norit^RO-08Supra)接触48小时。除去未被吸附的级分后，通过将它溶解在40％乙醇24小时解吸包含RG-II的级分。获得的RG-II显示出与使用粉状炭的情况相同程度的纯度。

(b)在混合聚苯乙烯-二乙烯苯树脂上(Resin Relite^DI-AION^SP411)

Relite^DIAION^SP411树脂为由聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物组成的非极性合成树脂。它不吸附存在于植物提取物中的其它多糖而保留RG-II。从而通过Relite^DIAION^SP411树脂上的吸附层析，这些提取物将被分为两个级分：一个包含不同于RG-II的多糖的非保留级分和一个包含RG-II的保留级分。

试验工厂规模上的RG-II纯化

从酒糟纯化RG-II的试验工厂规模图示于图6中。将稀释1/15的250升酒糟溶液(2.5倍柱体积)在Norit^RO-08 Supra活性炭上迅速脱色，并接着移至流速为40升/小时的90升Relite^DI-AION^SP411柱上(RG-II吸附在该层析载体上的接触时间为2小时)。用100升水洗柱。未保留级分因而由注射和洗涤体积组成。借助于用100升20％乙醇，接着是200升水洗柱而达到RG-II的洗脱。

如上获得的RG-II(从全部酒糟制备物得1kg)显示出近60％的纯度(表2)。通过加入乙醇(乙醇的最终浓度为约40％)沉淀RG-II。获得的沉淀包含纯度为90％的RG-II。实施例3：通过吸附层析从酒中获得RG-II

除去酒(红酒，葡萄种Merlot 94，Chardonnay 94白酒)的醇并通过在旋转蒸发仪中真空蒸发两次。

将15ml的级分以25ml/小时的流速上样到50ml Relite^ DI-AION^SP411中。接着将柱用50ml水洗涤。用50ml 20％乙醇洗脱RG-II，并将柱用100ml水洗涤。HPLC分析表明(图7)由于RG-II不存在于树脂的未保留级分中，所以它被定量吸附在树脂上并通过20％乙醇洗脱而被定量回收。对于红酒(表2)，RG-II溶液的纯度接近50％，对于白酒接近35％。实施例4：从葡萄汁获得RG-II

Amberlite^XAD为非极性聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂。将通过压碎Grenache种浆果获得的100ml白葡萄汁注射到用水平衡的100ml XAD2树脂柱中。用60％体积的甲醇洗脱RG-II，纯度为约40％。洗脱物的分析结果示于表2中。实施例5：从水果和蔬菜汁中获得RG-II

从0.6kg削皮并切割成小块放在200ml抗坏血酸(最终浓度为3mM)的苹果、蕃茄和胡萝卜中获得可溶提取物。借助于商业液化酶制剂(Pectinex^Ultra SPL；Novo Ferment和Rapidase^Liq；Gist-Brocades)的共同作用，45℃下，通过酶液化作用24小时获得所使用的水果和蔬菜汁。通过在热作用下使酶变性来终止液化反应。通过离心消除固体残余物，上清液用作RG-II来源。

酶液化作用后水果和蔬菜的RG-II的纯化

在被以25ml/小时的速率移至包含50ml Relite^DIAION^SP411用水平衡的柱(2.5×30cm)之前，将通过酶液化作用获得的水果和蔬菜汁用滤纸过滤。然后用50ml水洗涤柱，用50ml 20％乙醇洗脱RG-II，再用100ml水洗涤。

获得的RG-II制备物显示出纯度水平超过80％。

它们的分析结果示于表2中。实施例6：筛选将RG-II降解为单体形式的微生物

RG-II为植物细胞壁的普遍成分，通过自然生态***的微生物确保它降解至生物圈中：土壤，混合肥料，来自污水植物的污泥。

从天然样品中分离了青霉属的两个真菌株，它们使用RG-II作为唯一碳源和能量来源种。

1.培养基：

如表3所示，制备了用于筛选使用RG-II作为碳源和能源的微生物的培养基。这是一种其中加入了单体RG-II溶液的无机培养基，并具有2-10mg/ml的最终浓度。通过加入三种抗生素到培养基中除去含真菌培养物中的污染细菌：青霉素G，链霉素和四环素。

样品取自不同的自然生态***(农业或森林土壤，泥土，混合肥料，来自污水植物的污泥，腐烂的果实)，并在25-37℃之间培养在单体RG-II浓度调至10mg/ml的无机培养基中。每一次观察到微生物生长，在相同培养基上，培养物被挑出数次。这一步骤最初使得有可能分离几种保证能在RG-II培养基上生长的培养物。通过高效空间排阻层析平行对照培养基中的RG-II的降解，并仅保留了其中这种降解与微生物的生长同时被观察到的那些培养物。

在将培养物铺在培养皿中通过加入2％琼脂糖(表3)而获得包含2.5mg/ml单体RG-II的琼脂培养基上之后，分离了确保降解RG-II的微生物。25℃下，保温1周后，取菌落样品并接种至液体培养基中以检查它们降解RG-II的能力。

3.选择降解RG-II的菌株

由于它们拥有所需特性，最终保留了两个丝状真菌株。

1.迅速生长并与培养基中的RG-II的减少完全相关。

2.平行观察到RG-II量的减少和指示内切水解酶型降解酶活性存在的HP-SEC洗脱体积的位移。

3.25℃培养一周，RG-II降解的最终水平达到70％。

这两个被编号为E和K的培养物因此被用于制备降解RG-II的酶及研究酶的作用方式。在25℃，不进行搅拌，与空气接触的条件下，在存在下述三种抗生素时，将它们培养在包含5mg/ml RG-II的液体培养基中：青霉素G，链霉素和四环素。实施例7：制备降解RG-II的酶

已知青霉属的各个种能产生并在培养基中盐析出降解多糖的酶，已鉴定了两个分离的菌株产生降解RG-II的酶的能力。

1.在培养上清液寻找能降解RG-II的酶

25℃下，将齿孢青霉株LaV2(保藏号CNCM1-1578)和简青霉株IPV1(保藏号CNCM1-1577)培养在含2.5mg/ml单体RG-II的培养基中。培养96小时后，取出1ml含生长菌丝体的培养基，0.22μm滤器中灭菌过滤，接着加入2mg/ml天然RG-II。将包含降解酶和RG-II的培养基放置25℃下保温，25μl级分被保温0、20和45小时并进行CES-HP分析。在不同保温时间的RG-II的洗脱分布图之间的比较清楚地揭示出在培养基中不存在任何RG-II降解活性。从而在真菌的细胞质和周质中寻找这些活性。

2.在真菌的总细胞提取物中制备降解RG-II的酶

25℃下，将前述的齿孢青霉株LaV2和简青霉株IPV1培养在4ml含6mg/ml单体RG-II的培养基中。培养140小时后，离心收集菌丝体，4℃下在50mM MES/KOH缓冲液中压碎(使用玻璃球)4分钟，其中50mM MES KOH缓冲液(吗啉代-乙烷-磺酸)被调节为pH6，并加入了1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)和1mM DTT(二硫苏糖醇)。通过以10,000g离心5分钟回收细胞上清。

通过在压碎、离心之后，向上清加入2.5mg/ml天然RG-II，25℃保温，接着对RG-II的降解进行CES-HP分析，检测了在可溶性细胞提取物中的降解RG-II的酶的存在，与天然RG-II比较，分析24和48小时处的分布图(图8和9)，显示从24小时开始RG-II高度降解(50％)，并持续到48小时给出40％的残余分子。

因此，确保降解RG-II的酶活性存在于可溶性细胞提取物中，并因而可在压碎真菌之后获得。因此青霉属的这两个独立的菌株是能降解鼠李半乳糖醛酸聚糖的酶的良好生产菌。实施例8：

青霉属的这两个独立菌株产生降解培养基中的RG-II的酶。最初通过跟踪真菌生长的培养基中多糖的降解来研究这些酶的作用方式。这一方法具有仅能跟踪未被真菌同化的RG-II级分的缺点，但仍确实解释了所使用的活性及它们的作用方式。

1.用简青霉实现RG-II降解动力学

25℃下，将简青霉IPV1源放置在锥形瓶中含有5mg/ml单体RG-II的10ml培养基中。在0、96、132、168和192小时时取出1ml级分。接着通过加入20μl 1M HCl将培养基的pH重新调至5。在360小时时进行下一次取样，在保温400小时后最后终止培养。对每次取样进行CES-HP分析(图10)，它使得可以在让真菌生长的同时来跟踪降解。将各种取样级分在以100mM，pH4的乙酸钠缓冲液平衡的Bio-Gel P-6柱(1×50cm)脱盐。

对每一保温时间，对降解中的级分进行全面结构分析。这一分析包括：

-定量RG-II的降解比例。

确定中性糖和糖醛酸组成。

-确定组成分子的残基之间的键类型。

-确定同型半乳糖醛酸链的长度。

所有这些分析能表明每次取样的RG-II分子的状态并因此跟踪它随时间的降解。这些结果说明了在某一段时间分子降解的酶作用方式细节。

2.用齿孢青霉实现RG-II降解的动力学

为了跟踪齿孢青霉LaV2对RG-II的降解，预先皂化500mgRG-II单体制备物(4℃，在50mM NaOH中2小时)，并接着还原(4℃，在存在2.5g NaBH₄下6小时)以标记分子的还原末端。25℃下，将齿孢青霉LaV2株放置在锥形瓶中含5mg/ml皂化RG-II的6ml培养基中并将其还原。在0、72、120、168、240、264、336和384小时时取出0.6ml级分。对每次取样进行CES-HP分析(图11)以在让真菌生长的同时跟踪降解。将取样的各级分在pH5.2 30mM，甲酸铵缓冲液中以0.6ml/分钟平衡的Superdex-75HR柱(1×30cm)上脱盐。

对于每一保温时间，在对降解期间RG-II级分进行全面结构分析。这一分析包括：

-定量RG-II的降解比例。

-确定甲醇解后，中性糖和三甲基甲硅烷基化衍生物形式的糖醛酸的组成。

-通过甲基化分析，包括将糖醛酸还原为三乙基硼氘化锂，确定组成分子的残基之间的键的类型(Pellerin等，1995碳水化合物研究277：135-143)。

-确定同型半乳糖醛酸链的长度。

所有这些分析能表明每次取样的RG-II分子的状态并因此跟踪它随时间的降解。这些结果说明了在某一段时间分子降解的酶作用方式详情。

3.RG-II的降解机理

对分子中的各残基的组成(表4和5)及键类型的分析使得有可能跟踪某一段时间的RG-II残余分子的状态，并且说明了RG-II被青霉属这两个菌株的一系列依次作用的酶所降解：

a)第一降解步骤是断裂三取代的β-L-鼠李糖与α-L-岩藻糖和β-D-芹菜糖残基之间的键，它导致失去被真菌同化的链A(图12)。这一步骤与同型半乳糖醛酸链略为变短同时发生在培养开始的几天中，其中同型半乳糖醛酸链变短平均去掉了8-9至7个残基，并伴有呋喃***糖(B7和D2)和吡喃鼠李糖(C2)末端残基的部分丢失。

b)α-D-芹菜糖残基携带的链A的残基A2至A5的全部消除看来引起了RG-II分子对酶降解的抗性，因为接着观察到第二个降解状态，这一状态的特征在于：

-转变为平均大小为4个半乳糖醛酸残基的同型半乳糖醛酸链的明显变短，

-丢失残基A1，

-仍借助于β-D-芹菜糖与同型半乳糖醛酸链相连的链B在其非还原末端进行了改变，即定量丢失末端呋喃***糖残基及丢失α-L-鼠李糖残基(残基B6和B7)。

-Kdo和Dha残基看来受酶降解的部分影响。

在第二阶段观察到的所有降解可借助于已知酶获得：β-D-芹菜糖苷酶，β-L-***糖苷酶，α-L-鼠李糖苷糖，内切或外切-聚半乳糖醛酸酶。

在真菌生长期末的残余分子定量地对应于链B(残基B1至B5)，对应于平均聚合度水平为4的寡糖携带的残基Kdo(C1)和Dha(D1)，并相当于初始RG-II分子的20-30％(图13)。

因此使用两种内切类型的酶活性的第一阶段是促使RG-II分子降解的阶段。链A的定量释放事实上使该分子对以已知作用方式起作用并通常在商业酶制剂中遇到的酶敏感。

从而由齿孢青霉LaV2和简青霉IPV1产生具有内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖基水解酶(1)和内切-α-L-吡喃岩藻糖基-(1→4)-L-吡喃鼠李糖基水解酶(2)类型活性的酶是使得这些真菌能利用RG-II生长的决定阶段。因此是利用这些具有内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖基水解酶(1)和内切-α-L-吡喃岩藻糖基-(1→4)-L-吡喃鼠李糖基水解酶(2)类型活性的酶，才使得RG-II完全酶降解。活性(1)的特异性高，因为链B不受其水解活性的影响，尽管它通过相同类型的鼠李糖基芹菜糖苷键与同型半乳糖醛酸链相连。可如下解释与链A和B相关的活性(1)的行为差异：

-鼠李糖取代基之间的不同：在链B中C3处连有一条链，在链A中C4处连有一条链和在C2和C3处连有两个单糖。

-或在RG-II分子中这两条链的位置不同。

酶制剂中存在这两种活性任一种就能从RG-II中释放链A，这产生了果胶糖水解制剂的常规酶不能降解RG-II的问题。实际上，在所述酶的作用下链A离去之后，其它使RG-II更完全降解的酶开始参与。第二降解阶段中有下列活性酶参与：

-β-D-芹菜糖苷酶

-β-L-***糖苷酶

-α-L-鼠李糖苷酶

-内切-聚半乳糖醛酸酶

-外切-聚半乳糖醛酸酶。实施例9：二聚体RG-II制备物的获得和齿孢青霉的降解

将齿孢青霉菌株放在包含将酒糟浓缩物通过Relite^DIAION^(实施例2)而获得的5mg/ml RG-II制备物的培养基上。该制备物包含60％二聚体形式的RG-II，在Superdex-75 HR柱上分析证明了这一点。通过HPLC对真菌培养基的跟踪显示高的RG-II降解。高分子量污染物(主要是存在于酒糟浓缩物中的聚甘露糖)没有被降解。

根据降解单体RG-II而分离的齿孢青霉菌株具有降解二聚体形式的RG-II的能力。由此，本专利申请的酶对两种形式的分子均具有活性。实施例10：获得降解RG-II的酶制剂

从如下得到的简青霉IPV1培养物中获得包含降解RG-II活性，尤其是内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖基水解酶或内切-α-L-吡喃岩藻糖基-(1→4)-L-吡喃鼠李糖基水解酶(2)类型活性的酶制剂：

将包含6mg/ml纯化的RG-II的120ml培养基分至8个培养皿中。25℃下，将简青霉IPV1放在培养物中培养6天，如上所述(实施例3)离心收集菌丝体(1.2g湿度)，在pH调至6，包含1mMPMSF和二硫苏糖醇的50mM MES/KOH缓冲液中压碎。通过离心最终获得全部酶提取物(6ml)并用于下列实施例。实施例11：通过简青霉的酶提取物降解纯化的RG-II

25℃下，将下述混合物与0.02％NaN₃一起保温：

-500μl 50mM乙酸钠缓冲液。实施例12：简青霉的酶提取物对酒多糖的降解

检测包含降解RG-II的酶、尤其是内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖基水解酶或内切-α-L-吡喃岩藻糖-(1→4)-L-吡喃鼠李糖基水解酶类型活性的总酶提取物降解酒中RG-II的能力。

通过在Centricon 30膜(Amicon，USA)上超滤酒，获得红酒(黑Carignan种)的全部多糖。用1.9ml PH4.8，50mM乙酸盐缓冲液回收透析残余物(100μl)。在25℃，0.02％NaN₃存在下进行下述保温试验。

a：200μl含酒总多糖的透析残余物

5μl H₂O

20μl MES压碎缓中液

b：200μl含酒总多糖的透析残余物

5μl H₂O

20μl根据实施例9获得的简青霉IPV1总酶提取物。

c：200μl含酒总多糖的透析残余物

5μl Pectinex^Ultra Sp-L

20μl根据实施例9获得的简青霉IPV1的总酶提取物。

48小时后，从各试验中取样25μl并进行CES-HP分析。分析结果(图16和17)表明：

-简青霉IPV1的酶提取物对酒RG-II的降解(在18.2分洗脱出特征峰)(图16)。

-商业Pectinex^Ultra Sp-L酶制剂对酒的其它多糖(甘露糖蛋白，***聚糖和***半乳聚糖)的降解，而RG-II的特征峰保持不动(图17)。

-通过降解试验c中酒的所有多糖证实了两种酶制剂的互补作用。

因此，包含内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖基水解酶或内切-α-L-比喃岩藻糖-(1→4)-L-吡喃鼠李糖基水解酶的简青霉IPV1的总酶提取物清楚地包含在从棒曲霉制备的商业酶制剂中不存在的酶活性，并富含溶纤维素、溶半纤维素和溶果胶的活性，并尤其富含鼠李糖半乳糖醛酸酶活性(Schols等，1990，碳水化合物研究，206，105-115)。

加入本发明的酶并结合其它溶果胶活性的酶导致酒中多糖的更完全的降解，并从而能改善过滤能力及防止胶体的形成和沉淀干扰。实施例13：简青霉IPV1的酶提取物对苹果汁多糖的降解

从1kg苹果(Starking种)中制备苹果汁：将所有苹果削成1cm厚的薄片，并加入1g抗坏血酸和500μl Rapidase^Liq(Gist Bro-cades，法国)酶制剂，搅拌下，在50℃放置2小时。在商业酶制剂的作用下液化苹果，接着通过离心获得苹果汁。Rapidase^Liq制剂包含高水平的果胶酶(果胶裂解酶，内切和外切聚半乳糖醛酸酶，鼠李糖半乳糖醛酸酶，***聚糖酶)、半纤维素酶(半乳聚糖酶，木聚糖酶)和纤维素酶活性。

将1.5ml清澈的苹果汁在Centricon30膜(Amicon，USA)上超滤。用1.4ml PH4.8 50mM的乙酸盐缓冲液吸收透析残余物(100ml)，在25℃，0.02％NaN₃存在下进行下面的保温试验：

a：200μl含苹果汁总多糖的透析残余物，50μl H₂O

b：200μl含苹果汁总多糖的透析残余物，50μl简青霉IPV1的总酶提取物。

48小时后，从各试验中取样25μl并进行CES-HP分析。

由于简青霉IPV1酶提取物的加入使得在用Rapidase^Liq制剂处理苹果后完全降解所有残余的多糖，结果分析(图18)表明了降解RG-II的酶的互补作用。尤其是，RG-II的特征峰(在18.2分钟被洗脱)经历了明显的降解。此外，具有更高分子量，抗Rapidase^Liq中酶作用的结构的降解提示这些级分也包含RG-II片段。

已清楚地显示出内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖基水解酶或内切-α-L-比喃岩藻糖基-(1→4)-L-吡喃鼠李糖基水解酶类型活性的简青霉IPV1的总酶提取物因而包含不存在于从黑曲霉制备的并被描述为具有所有已知的溶纤维素、溶半纤维素、溶果胶(包括鼠李糖半乳糖醛酸酶类型)活性的商业酶制剂中的酶活性，因而通过本试验证实了降解RG-II的酶的互补和附加作用。实施例14：简青霉的酶提取物对水果和蔬菜的浸渍作用

对下面的水果和蔬菜证实了简青霉IPV1总酶提取物对植物组织的解离活性：

-红甜菜根

-胡萝卜

-“Bintge”土豆

-金黄色苹果

将158×4×2mm的各种水果或蔬菜的片放在加入了下述成分的2ml PH4.8，50mM乙酸盐缓冲液中：

-200μl用作参照的压碎MES缓冲液。

-200μl用于酶试验的简青霉IPV1的总酶提取物。

在25℃，0.02％NaN₃存在下，将各试验进行保温72小时，然后在涡旋搅拌器中剧烈搅拌(2×10秒)并照相。分析结果表明：

-甜菜根和胡萝卜组织几乎完全分解(图19)。

-有浸渍效果，并伴随有细胞出现在土豆和苹果的悬浮液中(图20)。

因此，包含内切-β-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖水解酶或内切-α-吡喃岩藻糖-(1→4)-L-吡喃鼠李糖水解酶类型活性的简青霉IPV1总酶提取物具有解离植物组织的效果。结论

降解RG-II的酶活性可因此在液相或在固体载体上单独使用或与其它酶结合使用，并且允许：

-对水果和蔬菜汁和它们的衍生物中的RG-II高水平的降解，例如70％，从而改善过滤能力，易化浓缩汁的制备，促进澄清现象并确保最终产品的良好的稳定性。

-清洗用于过滤水果和蔬菜汁和它们的衍生物的微孔载体和超滤载体。

这些酶活性促进植物细胞壁的降解，并从而可在需要浸渍、液化或全部或部分水解植物组织的所有应用中单独使用或与其它酶结合使用，尤其：

-在用于生产水果汁、果泥、果冻或水果和蔬菜的浓缩液及它们的衍生物(包括酒)的浸渍制剂中；

-在用于生产水果、蔬菜汁和芳香香基及它们的衍生物(包括酒)和生产啤酒的液化制剂中；

-用于从植物残渣，例如甜菜根浆，水果压榨后的固体残渣中生产果胶；

-用于从植物材料中生产动物饲料；

-用于从纺织工业中所用的植物(尤其从棉花)中生产纤维素及用于造纸；

-用于从植物残渣中生产能引发保护植物的活性反应且能被用作植物保护产品的寡糖。

表1从酒中分离的两种RG-II级分的组成

级分II 级分III分子类型单体二聚体蛋白质^a O.6 0.6糖醛酸^a 36.9 39中性糖^a 27.3 24.9甲醇^a 1.4 1.3乙酸^a 1.6 1.8鼠李糖 31.8 35.42-O-CH³-岩藻糖^b 6.3 6.5岩藻糖^b 3.7 5.22-O-CH³-木糖^b 4.8 4.8芹菜糖^b 7.4 7.5***糖^b 25 23.7半乳糖^b 19.1 15.8械汁酸^b 1.2 2.2半乳糖醛酸^b 38.2 37.2葡糖醛酸^b 3.3 3.4Kdo^b 4.4 5.Dha^b 2.6 2.5a：干物质的百分数b：摩尔％

表2从各种植物提取物和不同层析载体上获得的RG-II制备物的组成

(摩尔百分数)和纯度样品浓缩酒苹果胡萝卜蕃茄酒葡萄汁浓缩酒糟采用的载体 DEAE-Macroprep Relite Relite Relite Relite Amberlite Relite 碳

阴离子交换 Diaion SP411 Diaion SP411 Diaion SP411 Diaion SP411 XAD2 Diaion SP411 SA+2-O-甲基-岩藻糖 63 5.0 6.2 6.1 1.1 2.0 1.8 2.0鼠李糖 31.8 29.9 31.2 20.8 13.6 22.3 14.6 22.5岩藻糖 3.7 10.8 7.9 14.7 1.7 6.0 1.7 1.72-O-甲基-木糖 4.8 3.9 4.9 4.7 0.9 3.8 1.5 1.6***糖 25.0 20.1 23.7 20.9 52.3 22.6 29.3 13.0木糖 - - - - 0.9 14.9 0.8 1.1芹菜糖 7.3 7.2 2.5 8.0 1.5 9.1 2.4 2.9甘露糖 0.9 8.8 4.8 10.8 8.1 2.2 16.7 42.6半乳糖 19.1 12.0 17.2 14.2 15.0 3.0 27.7 11.8葡萄糖 1.1 2.3 1.6 - 4.9 3.4 0.9纯度百分数 97 95 96 82 45 40 57 52

表3

丝状真菌培养基-无机培养基

NH₄NO₃ 2g/l

K₂HPO₄ 1g/l

MgSO₄，7H₂O 0.5g/l

KCl 0.5g/l

硫酸铁 10g/l-Heller溶液

ZnSO₄ 1g/l

MnSO₄，H₂O 0.1g/l

CuSO₄，5H₂O 0.03g/l

AlCl₂ 0.03g/l

NiCl₂，6H₂O 0.03g/l

K1 0.01g/l

硼酸 1g/l-维生素溶液

维生素B1 0.08g/l

维生素H 0.08g/l培养基组成-无机培养基 1ml-Heller溶液 1μl-维生素溶液 1μl-链霉素(5mg/ml) 2μl-四环素(5mg/ml) 2μl-青霉素(10,000U/ml) 10μl多糖5mg/ml在室温(25℃)，光下配制培养基表4：简青霉降解动力学期间RG-II的组成(以起始干物质的百分数表示)

起始 96小时 132小时 168小时 192小时 400小时中性糖 28.2 28.5 23.1 19.1 18.5 10.3糖醛酸 40.4 35.3 25.9 18.1 16.4 9.9中性糖+糖醛酸 68.8 63.8 49.0 37.2 34.9 20.2单糖残基号2-O-甲基-岩藻糖 B4′ 2.1 2.4 2.1 2.0 2.1 2.0鼠李糖 A2，B2，B6，D2 9.4 9.1 7.2 6.4 5.4 2.9岩藻糖 A3 1.1 1.1 0.6 0.1 0.1 0.02-O 甲基-木糖 A3′ 1.4 1.6 1.2 0.1 0.0 0.0***糖 B5，B7，C2 6.2 6.0 5.5 5.0 4.5 1.5芹菜糖 A1，B1 2.2 2.7 2.5 2.4 2.2 1.4半乳糖 A5，B4 5.5 5.0 3.5 2.7 2.4 2.5半乳糖醛酸 A2′，A2”，聚-GalA 23.3 24.2 19.5 18.9 15.2 8.5葡糖醛酸 A4 3.2 3.0 1.8 0.3 0.2 0.0同型半乳糖醛酸链的 8-9 7-8 7 6-7 6 4平均聚合度残余分子％ 100 93 71 54 51 29

表5齿孢青霉降解动力学期间RG-II残余物的组成

起始 120小时 168小时 240小时 264小时 366小时 384小时鼠李糖 4.0 3.2 3.0 2.6 2.1 0.7 0.22-O-CH₃-岩藻糖 1.0 1.0 1.0 0.8 0.8 0.2 0.1岩藻糖 1.0 1.0 1.0 0.7 1.0 0.5 0.62-O-CH₃-木糖 1.0 1.0 1.0 0.5 0.3芹菜糖 2.0 2.0 1.9 1.7 1.5 0.4 0.2***糖 3.0 2.6 2.2 1.8 1.4 0.4 0.2半乳糖 2.0 1.8 1.3 1.1 0.9 0.2 0.2半乳糖醛酸 10.5 10.5 7.9 7.5 7.7 4.1 4.0葡糖醛酸 1.0 1.4 0.8 0.3 0.3乙酸 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.3 0.2Kdo 0.9 1.9 0.9 0.5 0.9 0.7 0.6Dha 0.7 0.1.1 0.3 0.3 0.6 0.6 0.5总计 27.7 27.0 21.9 18.3 18.1 8.1 6.8同型半乳糖醛酸的平均聚合度 8.5 8.0 8.0 7.5 6.0 4.5 3.5残余分子％ 100 97 79 79 66 29 25表6：在简青霉降解时组成RG-II分子的残基的甲基化和键分析甲基醚键类型残基起始 96小时 132小时 160小时 192小时 400小时2，3，4-Rha^* Rhap(1→^b D2B6 1.3 1.45 1.0 1.1 0.7 0.23，4 Rha →2)-Rhap-(1→ B6 0.8 0.5 0.5 0.8 0.8 0.152，4 Rha →3)-Rhap-(1→ B2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0Rha →2，3，4)Rhap(1→ A2 1.0 0.85 0.7 0 1 0 02，3，4-Fuc 2-0-Me-Fucp-(1→ B4′ 0.7 0.7 0.7 0.7 0.6 0.62 Fuc →3，4)→Fucp-(1→ A3 0.6 0.6 0.4 0.1 0 02，3 Api →3′)-Api-(1→ B1A1 2.0 2.0 2.0 1.95 1.7 0.82 3，5Ara Araf-(1→^b C2B7 1.2 1.4 1.0 1.0 0.8 02，3，4-Ara Arap(1→ B5 0.1 0.2 0.2 0.1 0.15 0.33，4Ara →2)Arap(1→ B5 0.2 0.4 0.55 0.7 0.7 0.44-Ara →2，3)-Arap(1→ B5 0.7 0.5 0.3 0.1 0 02，3，4xil 2-0-Me-xilp-(1→ A3′ 0.6 0.6 0.4 0.1 0 02，3，4，6-Gal Galp-(1→ A5 0.5 0.45 0.1 0.05 0 03，6Gal →2，4)-Galp-1(→ B4 1.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.952，6-Gal →3，4)-Galp-(1→ A5 0.45 0.4 0.3 0.08结果以在降解期间保持恒定的RG-II分子中的→3)吡喃鼠李糖-(1→残基，残基N°B2为基础计算的摩尔比表示。

^a2，3，4-Me3-Rha＝1.5-二-氧-乙酰基-2，3，4-三-氧-鼠李糖醇，等

^bp＝吡喃糖，f＝呋喃糖表7在齿孢青霉降解动力学期间组成RG-II残基的甲基化作用和键分析甲基醚键起始 72小时 120小时 168小时 240小时 264小时2，3，4-Rha Rhap→ 1.4 1.2 1 1.2 1.2 1.23，4-Rha →2-Rhap→ 1.1 0.7 0.5 0.4 0.3 0.42，4-Rha →3-Rhap→ 1 1 1 1 1 13-Rhap →2，4-Rhap→ 0.4 0.1 0.3Rha →2，3，4-Rhap→ 1.2 1.2 1.2 1.1 0.8 0.32，3，4-Fuc 2-O-CH₃-Fuc→ 0.8 0.7 0.7 0.8 0.7 0.82-Fuc →3，4-Fuc→ 0.6 0.7 0.7 0.6 0.3 0.22，3，4-Xil 2-O-CH₃-Xil→ 0.6 0.6 0.5 0.5 0.3 0.12，3-Api →3′-Api→ 2.2 2.2 2.3 2.2 2.2 1.82，3，5-Ara Araf→ 1.6 1.4 1.1 1.3 0.8 0.83，4-Ara →2-Arap→ 0.3 0.3 0.3 0.3 0.54 Ara →2，3-Arap→ 0.6 0.7 0.6 0.6 0.4 0.22，3，4，6-Gal Galp→ 0.5 0.5 0.5 0.4 0.3 0.22，6-Gal →3，4-Galp→ 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.33，6-Gal →2，4-Galp→ 1.0 1.2 1.1 1.1 1.0 0.93-Acer →2-AcerA→ 0.5 0.5 0.3 0.5 0.6 0.62，3，4-GalA GalpA→ 2.6 3.0 3.0 2.6 1.9 1.42，3-GalA →4-GalpA→ 2.0 2.3 2.1 1.8 1.7 1.52-GalA →3，4-GalpA→ 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.33-GalA →2，4-GalpA→ 1.1 1.2 1.3 1.3 1.8 1.6GalA →2，3，4-GalpA→ 0.8 0.9 0.8 0.7 0.3 0.21，2，3，5-GalA →4-GalpA还原 1.0 0.9 0.8 0.7 0.7 0.82，3，4-G1cA GlcpA→ 0.23，4GlcA →2-GlcpA→ 1.1 1.4 1.3 1.1 0.6 0.4结果以在降解期间保持恒定的RG-II分子中的→3)吡喃鼠李糖-(1→残基，残基N°B2为基础表示。

2，3，4-Rhm＝1.5-二-氧-乙酰基-2，3，4-三-氧-甲基-鼠李糖醇等。

Claims

1.一种酶，其特征在于它具有降解鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG-II)和其衍生物的活性。

2.根据权利要求1的酶，其特征在于它具有内切水解酶类型的活性。

3.根据权利要求1和2任一项的酶，特征在于它具有内切-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→3′)-D-呋喃芹菜糖水解酶活性。

4.根据权利要求1或2任一项的酶，特征在于它具有内切-α-L-比喃岩藻糖基-(1→4)-L-比喃鼠李糖水解酶活性。

5.具有降解RG-II和其衍生物的活性的微生物，尤其是真菌。

6.根据权利要求5的真菌，特征在于它是青霉属的种。

7.根据权利要求5或6的真菌株，特征在于它保藏在CNCM，保藏号为1-1578(LAV2)。

8.根据权利要求5或6的真菌株，特征在于它保藏在CNCM，保藏号为1-1577(IPV1)。

9.根据权利要求1-4任一项的酶，特征在于它适宜于由权利要求5-8任一项的菌株所产生。

10.一种酶制剂，其特征在于它包含权利要求1至4和9任一项的酶。

11.获得权利要求1-4和9和10任一项的酶或制剂的方法，其包括下述步骤：

-将根据权利要求5-8任一项的微生物培养在适于产生权利要求1-4任一项的酶的培养基中；

-从培养物上清中或来自被压碎的微生物的上清中回收酶或酶制剂。

12.根据权利要求11的方法，特征在于它包括下述步骤：

-将权利要求5-8任一项的微生物培养在适于所述微生物生长并包含RG-II或其一种衍生物的培养基中；

-回收微生物，

-压碎微生物，

-除去不溶物，和

-回收包含酶或酶制剂的上清。

13.从植物提取物中获得RG-II的方法，其包括下述步骤：

-分离包含在所述提取物中的大分子，和

-在PH大于4时进行阴离子交换层析。

14.根据权利要求11的方法，其特征在于通过沉淀或超滤进行分离。

15.根据权利要求13或14的方法，其特征在于阴离子交换层析后接着进行空间排阻层析。

16.从植物提取物中获得RG-II的方法，其包括至少一个在RG-II保留载体上的吸附层析步骤。

17.根据权利要求16的方法，其特征在于吸附层析在活性炭或聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂上进行。

18.适于通过权利要求13-17任一项的方法获得的RG-II制备物，其特征在于它包含至少95％的RG-II单体。

19.适于通过权利要求13-17任一项的方法获得的RG-II制备物，特征在于它包含至少80％，并且优选大于95％的RG-II二聚体。

20.用于筛选微生物、尤其是真菌以确定它们降解RG-II能力的方法，其特征在于所述微生物在适当的含RG-II的培养基上生长，所述RG-II适于通过权利要求13-17任一项的方法获得。

21.一种微生物培养基，其特征在于它包含通过权利要求13-17任一项的方法而获得的RG-II。

22.根据权利要求11或12的方法，其特征在于RG-II通过权利要求13-17任一项的方法而获得。

23.权利要求1-4，9和10任一项的或通过权利要求11和12任一项的方法而获得的酶或酶制剂在降解或改性RG-II或其衍生物中的应用。

24.权利要求1-4，9和10任一项的或通过权利要求11和12任一项的方法而获得的酶或酶制剂在改善过滤能力和易化浓缩果汁的制备或促进澄清中的应用。

25.权利要求1-4，9和10任一项或通过权利要求11和12任一项的方法而获得的酶或酶制剂在清洗用于过滤水果汁、蔬菜汁和它们的衍生物的过滤载体中的应用。

26.权利要求1-4，9和10任一项的或通过权利要求11和12任一项的方法获得的酶或酶制剂在浸渍、液化或全部或部分水解植物组织中的应用。

27.根据权利要求26的应用，在用于生产果汁、果泥、果冻和水果及蔬菜浓缩液及其包括酒的衍生物的浸渍制剂中。

28.根据权利要求26的应用，在用于从水果、蔬菜生产果汁和芳香香基和其包括酒的衍生物以及用于生产啤酒的液化制剂中。

29.根据权利要求26的应用，用于从植物残渣如甜菜根浆和来自压碎水果的固体残渣生产果胶。

30.根据权利要求26的应用，用于从植物材料生产动物饲料。

31.根据权利要求26的应用，用于从纺织工业的植物尤其棉花中生产纤维素，及用于造纸。

32.根据权利要求26的应用，用于从植物残余物中生产具有增强植物防御反应活性并可被用作植物保护产品的寡糖。