CN110192524B

CN110192524B - 一种以叶茎及花序梗隐芽为外植体的姜科植物离体快速繁育的方法

Info

Publication number: CN110192524B
Application number: CN201910513095.XA
Authority: CN
Inventors: 胡秀; 谭嘉川; 黄嘉琦; 李晓泳; 邓莎
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2039-06-13
Also published as: CN110192524A

Abstract

本发明公开一种以叶茎及花序梗隐芽为外植体的姜科植物离体快速繁育的方法，取健壮、带花序的姜科植物叶茎，逐层剥去叶鞘，保留最内一层紧贴叶茎的叶鞘，将消毒、处理后得到的带隐芽的外植体，逐步移植于促隐芽萌发的诱导培养基、促薄片诱导不定芽的培养基、丛生芽增殖的培养基、生根培养基中培养，诱导其萌发、增殖、生根，并最终移栽至自然环境中。本发明方法首次确立了部分姜科植物存在隐芽，并建立了以隐芽作为外植体进行离体培养的技术；本发明方法操作简单，大大降低了姜科植物体外培育的污染率，提高了姜科植物离体快速繁殖的效率。

Description

一种以叶茎及花序梗隐芽为外植体的姜科植物离体快速繁育的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种植物的组织培养方法，具体涉及一种以叶茎及花序梗隐芽为外植体的姜科植物离体快速繁育的方法。

背景技术

姜科是单子叶植物中的一个大科，全世界姜科植物有约50个属，1300多种，中国有约20个属，220个种，包含有重要的食用、药用和观赏用植物，如生姜、姜黄、姜花、草果、沙姜、高良姜、益智等，具有非常重要的经济价值。

姜科植物多为异花授粉，种子繁殖的后代不能保持母株的优良性状，且从播种至开花需要两年以上的时间，因此在生产中主要依靠块茎进行繁殖。但这种方式效率低，且容易受到自然灾害和虫害的影响，不足以为产业化应用提供足够的、优质的种苗。

组织培养技术由于能够保持母本的优良特性，且在人工控制的条件下培养，不会被天气、季节等因素限制，能够快速地生长、繁殖，因此在植物种苗繁育上有普遍的应用。

在姜科植物的离体快速繁殖体系建立中，常以根茎上的芽眼以及根茎萌发出的嫩茎为外植体。然而，采用这些部位为外植体存在着来源少、污染率高、诱导成活率低的问题；即便是采用操作繁复的多种无菌处理手段结合，无菌诱导成活率也常常在50％以下。无菌处理问题长期困扰着该科植物以营养器官作为外植体时的无菌体系建立，因此亟需开发一种新的无菌体系建立的方法。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种便于操作、有效降低污染率，实现姜科植物离体快速、高效繁育的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种以叶茎及花序梗隐芽为外植体的姜科植物离体快速繁育的方法，包括如下步骤：

1)选取健壮、带花序的姜科植物叶茎，逐层剥去叶鞘，保留最内一层紧贴叶茎的叶鞘，以一个隐芽为中心将叶茎切成每段长为4～6厘米的茎段；

2)在无菌条件下，用75％酒精浸泡60～120秒后，无菌水冲洗3～4次，再用0.10％升汞溶液消毒10～20分钟，无菌水冲洗6～8次，将茎段两端切去，保留以隐芽为节位、上下长度约为0.4～0.6厘米的叶茎，拨开最后的叶鞘使隐芽显露，接种到促隐芽萌发的诱导培养基上；

3)将步骤2)中隐芽萌发成的小根茎，切为薄片，接种于促薄片诱导不定芽的培养基上，诱导出不定芽；

4)将步骤3)中获得的不定芽切分，接种于促丛生芽增殖的培养基，进行快速繁殖；

5)重复步骤4)3～4次，获取足够数量的增殖苗丛；

6)将步骤5)中获得的增殖苗丛切分为单个，接种于生根培养基；

7)将步骤6)中获得的装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至泥炭：园土：粗砂＝1：1：1的土壤环境中继续种植。

发明人在姜科植物的分类学研究中发现，姜花属、山姜属、舞花姜的部分种类花序基部的苞片着生位置带有芽点，且这些芽点在母体上萌发成了新的小根茎。故而猜测这几个属中在权威志书(Flora of China)中被称为假茎的地上部分应该是真正的茎，并且在被叶鞘层层包裹的节的位置应该有芽点存在。经过全面而细致的解剖，最终发现了在姜科植物中，其成熟的叶茎及花序梗由3～15个带隐芽的节组成，隐芽大小仅为1～2毫米，肉眼几乎不可见，因而长期以来被忽视。由于这些茎段被叶鞘层层包裹，无菌处理非常简单，是优良的外植体来源。本方法即基于这一发现而建立。

通常，无菌处理往往受制于消毒剂的强度、作用时间与对材料的伤害之间的平衡，无法达到一个理想的水平。但由于本发明消毒处理时保留了最里面一层叶鞘，因此可以通过提高升汞溶液处理的浓度且适当延长消毒处理时间以达到理想的无菌处理效果。由于隐芽受叶鞘的层层保护，天然无菌，因此，在消毒结束后剥去最后一层叶鞘后可以直接接种，无需再消毒，在保护隐芽的同时获得了理想的灭菌效果。

由于叶茎及花序梗隐芽非常小，萌发十分困难。需要取开花后的植物的叶茎隐芽进行培养，因为未开花植物的叶茎隐芽不够成熟而容易死亡从而不能萌发。

另外，本发明通过反复试验，采用以下浓度的BA、TDZ、NAA进行组配，隐芽诱导率为90％以上。

具体地，所述促隐芽萌发的诱导培养基为：在MS培养基的基础上添加3.0～5.0mg/L的BA、1.0～3.0mg/L的TDZ、0.01～0.02mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂。

优选地，所述促隐芽萌发的诱导培养基为：在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、2.0mg/L的TDZ、0.01mg/L的NAA、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

其中，MS培养基组成如下：1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L二水氯化钙、370mg/L硫酸镁(以MgSO₄·7H₂O计)、170mg/L磷酸二氢钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰(以MnSO₄·4H₂O计)、8.6mg/L硫酸锌(以ZnSO₄·7H₂O计)、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L五水硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L七水合硫酸亚铁、37.3mg/L乙二胺四乙酸二钠、100mg/L肌醇、0.55mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.1mg/L盐酸硫胺素、2mg/L甘氨酸，下同。

其中，BA是6-苄基氨基嘌呤、TDZ为苯基噻二唑脲，NAA为萘乙酸，下同。

本发明通过反复试验，采用以下浓度的BA、TDZ进行组配，每30天的增殖率为4～6倍。

具体地，所述促薄片诱导不定芽的培养基为：在MS培养基的基础上添加3.0～5.0mg/L的BA、0.1～0.3mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂。

优选地，所述促薄片诱导不定芽的培养基为：在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、0.2mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

具体地，所述促丛生芽增殖的培养基为：在MS培养基的基础上添加3.0～5.0mg/L的BA、0.01～0.03mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂。

优选地，所述促丛生芽增殖的培养基为在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、0.02mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

本发明通过反复试验，采用以下浓度的BA、NAA进行组配，生根率为100％。

具体地，所述生根培养基为：在MS培养基的基础上添加0.3～0.5mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂。

优选地，所述生根培养基为：在MS培养基的基础上添加0.4mg/L的BA、1.0mg/L的NAA、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

作为对上述快速增殖方法的进一步改进，优选地，步骤2)～6)中的培养条件均为：24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx。

作为对上述快速增殖方法的进一步改进，优选地，步骤7)中的培养条件为：温度24～26℃、湿度90-95％、光照10～14h/d、光照强度2000～3000lx。

本发明为以叶茎及花序梗隐芽为外植体对姜科植物进行离体快速繁育的方法，首次确立了隐芽在部分姜科植物中存在；本发明方法适用于姜科植物中姜花属、山姜属、姜属、豆蔻属、距药姜属等具有叶茎、花序顶生且隐芽被叶鞘紧密包裹的种类；还适用于具有叶茎、花序侧生的种类，这一类姜科植物除了带隐芽的叶茎可作为外植体，带隐芽且节部被紧密包裹的花序梗也可作外植体，如姜属的生姜(Zingiber officinale Roscoe)的花序梗，Etlingera属的瓷玫瑰(Etlingera elatior(Jack)R.M.Sm.)的花序梗。

采用叶茎及花序梗的隐芽为外植体，由于隐芽所在的部位相对封闭，来源洁净度相对更高；另外，可通过延长消毒时间获得更理想的消毒效果，进一步降低离体培养的污染率，大大提高了姜科植物离体体系建立的无菌处理效率及有效性，为后续的离体快速增殖打下了有利的基础。

在以隐芽为外植体的基础上，通过反复试验，在不同培养阶段采用不同的激素种类及组合，并优化各培养基的配方，进一步提高了外植体诱导成活率、离体条件下的增殖率，且无菌苗均能顺利生根，移栽成活率达到90％以上，实现了姜科植物的离体快速繁殖。

另外，由于植物的每一节根茎仅可萌发出1个新的嫩茎作为外植体，而每枝叶茎及花序梗带有3-18个节不等(不同属有差异，但均大于1)。因此，经由叶茎及花序梗隐芽可获得的外植体数量远多于根茎，这极大的拓宽了姜科植物外植体的来源，增大了离体快速繁殖时的基数，对姜科植物的离体培养快速繁殖具有重要意义。

本发明方法可操作性强，步骤便捷，效率高，对姜科植物离体无菌体系的建立、离体种苗的快速繁殖具有重要意义，在姜科植物的产业化过程中具有重要的应用前景。

附图说明

图1以叶茎隐芽为外植体的‘寒月’姜花离体快速繁殖的流程图。

图2以叶茎隐芽为外植体的操作方法。

图3四种类型的‘寒月’姜花外植体示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1MS培养基的配制方法

MS培养基的组分如表1，配制1L MS培养基：准确称取表1中所述的各种化合物，加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，用NaOH调pH至6.0，最后定容到1L。

表1 MS培养基组分

实施例2各培养基的制备方法

1)促隐芽萌发的诱导培养基：取600毫升的纯水，依次按比例加入一定体积的MS母液，25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，3.0～5.0mg/L的BA、1.0～3.0mg/L的TDZ、0.01～0.02mg/L的NAA(BA、TDZ、NAA原液在无菌条件下经滤膜过滤)，定容至1升后调整pH值为6.0，分装后高压灭菌，冷却至常温后存放备用；

2)促薄片诱导不定芽的培养基：取600毫升的纯水，依次按比例加入一定体积的MS母液，25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，3.0～5.0mg/L的BA、0.1～0.3mg/L的TDZ(BA、TDZ原液在无菌条件下经滤膜过滤)，定容至1升后调整pH值为6.0，分装后高压灭菌，冷却至常温后存放备用；

3)促丛生芽增殖的培养基：取600毫升的纯水，依次按比例加入一定体积的MS母液，25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，3.0～5.0mg/L的BA、0.01～0.03mg/L的TDZ(BA、TDZ原液在无菌条件下经滤膜过滤)，定容至1升后调整pH值为6.0，分装后高压灭菌，冷却至常温后存放备用；

4)生根培养基：取600毫升的纯水，依次按比例加入一定体积的MS母液，25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，0.3～0.5mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的NAA(BA、NAA原液在无菌条件下经滤膜过滤)，定容至1升后调整pH值为6.0，分装后高压灭菌，冷却至常温后存放备用；

实施例3以叶茎隐芽为外植体的‘寒月’姜花离体快速繁殖。

(一)试验步骤：

1)外植体准备：选取健壮的、顶端带花序的‘寒月’姜花的叶茎，逐层剥去叶鞘，保留最内一层紧贴叶茎的叶鞘。以一个隐芽为中心将叶茎切成每段长为4～6厘米的茎段。

2)外植体的无菌处理及隐芽的萌发诱导：在无菌条件下，用75％酒精浸泡60秒后，无菌水冲洗3次，再用0.10％升汞溶液消毒20分钟，无菌水冲洗8次。将茎段两端切去，保留以隐芽为节位、上下长度约为0.5厘米的叶茎，用刀片和镊子拨开最后的叶鞘使隐芽显露，接种到促隐芽萌发的诱导培养基(在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、2.0mg/L的TDZ、0.01mg/L的NAA、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx的条件下培养至长出小根茎。

3)薄片的不定芽诱导：为提高繁殖效率，将小根茎按照其着生的芽眼的位置切为5个薄片，接种于促薄片诱导不定芽的培养基(在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、0.2mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx的条件下培养至长出不定芽。

4)将步骤3)中获得的不定芽切分，接种于促丛生芽增殖培养基(在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、0.02mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂)，温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx条件下培养至得到增殖苗丛。

5)将步骤4)中获得的增殖苗丛切分为单个，接种于丛生芽增殖培养基反复继代3～4次获得足够数量的增殖苗丛；

6)将步骤5)获得的具有2～3片叶的增殖苗丛切分为单个，接种于生根培养基(在MS培养基的基础上添加0.4mg/L的BA、1.0mg/L的NAA、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx条件下培养培养至得到带根的无菌苗。

7)将步骤6)中获得的装有生根苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至泥炭：园土：粗砂＝1：1：1的花盆。温室的培养条件为：温度24～26℃、湿度90-95％、光照10～14h/d、光照强度2000～3000lx。

(二)试验结果：

‘寒月’姜花是从野生白姜花群体中筛选出的新品种。与白姜花相比，喉部多了艳丽的黄斑，香气淡雅，花期从半年提高到整年，具有很高的市场价值，对种苗的需求量很大，急需开展快速繁殖。

采用本发明的方案对‘寒月’姜花进行培育，培育过程如图1所示；以叶茎隐芽为外植体的具体操作过程如图2，A：选取顶端带花序的叶茎；B：剥去叶鞘至最里面一层，剪为带一个芽的长节段，对节段进行消毒处理；C：将节段两端切去，剥去最里面一层叶鞘，将带隐芽的节段接种于培养基；D：接种后3周膨大为小根茎。

以叶茎隐芽为外植体接种于促隐芽萌发的诱导培养基后，3天后隐芽开始萌动，1周时开始迅速增大，30天时膨大为顶端带2-3片叶的小根茎；将小根茎切为薄片，接种于促薄片诱导不定芽的培养基后，30天后平均每个薄片诱导出2个芽，整个小根茎的增殖率为10；将不定芽切分后接种于促丛生芽增殖培养基培养30天后增殖率为6倍；增殖苗的生根率为100％；生根后的无菌苗移栽后成活率为90％；本发明方案成功通过组织培养的方法对‘寒月’姜花进行培育，育苗时效快，成功率高。

实施例4以叶茎隐芽为外植体的宽唇山姜的离体快速繁殖。

(一)试验步骤：

1)外植体准备：选取健壮的、顶端带花序的宽唇山姜的叶茎，逐层剥去叶鞘，保留最内一层紧贴叶茎的叶鞘。以一个隐芽为中心将叶茎切成每段长为4～6厘米的茎段。

2)外植体的无菌处理及隐芽的萌发诱导：在无菌条件下，用75％酒精浸泡120秒后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液消毒15分钟，无菌水冲洗7次。将茎段两端切去，保留以隐芽为节位、上下长度约为0.6厘米的叶茎，用刀片和镊子拨开最后的叶鞘使隐芽显露，接种到促隐芽萌发的诱导培养基(在MS培养基的基础上添加5.0mg/L的BA、1.0mg/L的TDZ、0.02mg/L的NAA、25g/L的蔗糖，以及6.5g/L的琼脂)。在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx的培养条件下培养至长出小根茎。

3)薄片的不定芽诱导：为提高繁殖效率，将小根茎按照其着生的芽眼的位置切为5个薄片，接种于促薄片诱导不定芽的培养基(在MS培养基的基础上添加5.0mg/L的BA、0.1mg/L的TDZ、25g/L的蔗糖，以及6.5g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx的培养条件下培养至长出不定芽。

4)将步骤3)中获得的不定芽切分，接种于促丛生芽增殖的培养基(在MS培养基的基础上添加5.0mg/L的BA、0.01mg/L的TDZ、25g/L的蔗糖，以及6.5g/L的琼脂)，温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx条件下培养至获得增殖苗丛。

5)将步骤4)中获得的增殖苗丛切分为单个，接种与丛生芽增殖培养基反复继代3～4次获得足够数量的增殖苗丛；

6)将步骤5)获得的具有2～3片叶的增殖苗丛切分为单个，接种于生根培养基(在MS培养基的基础上添加0.5mg/L的BA、1.0mg/L的NAA、25g/L的蔗糖，以及6.5g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx条件下培养得到带根的无菌苗。

(二)试验结果

宽唇山姜花蕾纯白、带有瓷质的光泽，花序大而饱满，是山姜属中极富观赏价值的种类，但尚处于野生状态，未曾被开发，其种苗繁育具有非常重要的意义。

采用本发明的方案对宽唇山姜进行离体快速繁殖。以叶茎隐芽为外植体接种于促隐芽萌发的诱导培养基后，3天后隐芽开始萌动，1周时开始迅速增大，30天时膨大为顶端带2-3片叶的小根茎；将小根茎切为薄片后接种于促薄片诱导不定芽的培养基后，30天后平均每个薄片诱导出2个芽，整个小根茎的增殖率为10；将不定芽切分后接种于促丛生芽增殖培养基培养30天后增殖率为6.5倍；增殖苗的生根率为100％；生根后的无菌苗移栽后成活率为90％；本发明方案成功通过组织培养的方法对宽唇山姜花蕾进行人工培育，育苗时效快，成功率高。

实施例5以生姜花序梗隐芽作外植体的离体快速繁殖

(一)试验步骤：

1)外植体准备：培育两年生以上的健壮植株，选取健壮的花序，将花序梗切成每段长为4～6厘米的茎段。

2)外植体的无菌处理及隐芽的萌发诱导：在无菌条件下，用75％酒精浸泡60秒后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗6次。将花序梗节段两端切去，保留以隐芽为节位、上下长度约为0.4厘米的花序梗，用刀片和镊子拨开花序梗苞叶使隐芽显露，接种到促隐芽萌发的诱导培养基(在MS培养基的基础上添加3.0mg/L的BA、3.0mg/L的TDZ、0.01mg/L的NAA、35g/L的蔗糖，以及7.5g/L的琼脂)。在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx的培养条件下培养至长出小根茎。

3)薄片的不定芽诱导：为提高繁殖效率，将小根茎按照其着生的芽眼的位置切为5个薄片，接种于促薄片诱导不定芽的培养基(在MS培养基的基础上添加3.0mg/L的BA、0.3mg/L的TDZ、35g/L的蔗糖，以及7.5g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx的培养条件下培养至长出不定芽。

4)将步骤3)中获得的不定芽切分，接种于促丛生芽增殖培养基(在MS培养基的基础上添加3.0mg/L的BA、0.03mg/L的TDZ、35g/L的蔗糖，以及7.5g/L的琼脂)，温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx条件下培养30天获得增殖苗丛。

5)将步骤4)中获得的增殖苗丛切分为单个，接种与丛生芽增殖培养基反复继代3～4次获得足够数量的增殖苗从；

6)将步骤5)获得的具有2～3片叶的增殖苗丛切分为单个，接种于生根培养基(在MS培养基的基础上添加0.3mg/L的BA、2.0mg/L的NAA、35g/L的蔗糖，以及7.5g/L的琼脂)，在温度24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx条件下培养得到带根的无菌苗。

7)将步骤6)中获得的装有生根苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至泥炭：园土：粗砂＝1：1：1的花盆，成活率为90％。温室的培养条件为：温度24～26℃、湿度90-95％、光照10～14h/d、光照强度2000～3000lx。

(二)试验结果：

生姜Zingiber officinale Roscoe是日常生活中不可或缺的调料，具有多种保健功能。多代分株繁殖后的生姜容易感染细菌和病毒造成减产，采用离体培养繁殖种苗具有非常重要的意义。我国在常规栽培条件下花序较为少见，主要原因是这种多年生的经济植物通常是作为一年生来栽培的，在花序还未出现以前就将作为食用部分的根茎挖起。然而，生姜的花序梗因为有花序梗苞片的紧密覆盖，非常适合用作外植体，能迅速建立无菌体系。

采用本发明的方案对生姜进行培育。以花梗序隐芽为外植体接种于促隐芽萌发的诱导培养基后，3天后隐芽开始萌动，1周时开始迅速增大，30天时膨大为顶端带2-3片叶的小根茎；将小根茎处理后接种于促薄片诱导不定芽的培养基后，30天后平均每个薄片诱导出2个芽，整个小根茎的增殖率为10；将不定芽切分后接种于促丛生芽增殖培养基培养30天后增殖率为6倍；增殖苗的生根率为100％；生根后的无菌苗移栽后成活率为90％；本发明方案首次通过花序梗隐芽对培养的方法对生姜进行人工培育，育苗时效快，成功率高。

实施例6不同外植体和消毒时间对‘寒月’姜花的处理结果

(一)试验设计及步骤：

本试验使用了四种类型的外植体(如图3)：开花后的叶茎隐芽(A)，未开花的叶茎隐芽(B)，根茎基部萌发的嫩芽(C)，成熟根茎上的芽眼(D)。

将四种类型的外植体用75％乙醇消毒1min，然后分别用0.10％HgCl₂消毒5、10、15min。将消毒完的外植体置于培养室中培养，培养30天后观察并记录污染率、死亡率和诱导成活率。

不同类型外植体的消毒操作步骤：

A型和B型：从温室收集叶茎。首先，剥去叶鞘，小心保存最内层叶鞘，以保护隐芽免受消毒剂的污染和伤害；其次，将叶茎切成每段上有一个芽的茎段，对茎段进行消毒，切除茎段的两端，剥去茎段的最内侧叶鞘，并接种在培养基(MS培养基添加4.0mg/L BA，0.01mg/L NAA，1.0mg/L TDZ)。

C型：将根茎基部萌发的嫩芽依次消毒。消毒后，切掉根茎的末端，剥去新鲜枝条的外鞘，并将它们接种在培养基上。

D型：依次对含有芽眼根茎进行消毒。消毒后，切成8×8mm大小的带芽眼的根茎，并将其接种在培养基上。

(二)试验结果：

从图3可以清楚地发现，在‘寒月’姜花中有根茎和叶茎两种类型的茎。根茎是肉质的，并具有节和短的节间，芽常有鳞状叶鞘覆盖。然而，在成熟根茎上的鳞状叶鞘已经掉落，在嫩芽上的这些鳞状叶鞘是松散排列而且容易被微生物侵入。

另外，以常用的C型外植体作为对照，A、B、D型外植体的数量、污染率、死亡率及诱导成活率见表2。

表2不同外植体类型及消毒时间的诱导结果

由表2可得，以开花后的叶茎隐芽为外植体来源丰富度最高。这是因为对于整株植物，随着栽培时间的增加，B型、C型和D型都可以发展成A型，大大增加了A型数量的倍数；B型的数量很少是因为叶茎隐芽的数量由叶茎上的叶片数决定，只有叶片完全发育的叶茎才能拥有最多的隐芽。根据栽培条件不同，‘寒月’姜花的每个成熟的叶茎上有12-18个隐芽不等，无菌处理后每个隐芽在离体条件下都能萌发成新的根茎，从而建立无菌体系，为后续的继代培养提供足够大的增殖基数。

由表2还可得，以隐芽为外植体进行培育时，A型具有最低的污染率，最佳的萌发率。其中，A型、B型污染率远低于C型、D型(以根茎嫩芽、根茎芽眼为外植体)；且在试验范围内，随着HgCl₂(升汞)溶液处理时间的增加，C型、D型污染率虽然有所下降，但死亡率却在增加；而消毒时间的增长对A、B型外植体的隐芽的存活率并没有造成影响。就A型和B型相比较，虽然B型(以未开花的叶茎隐芽为外植体)的污染率低，但不管消毒时间长短死亡率都很高。这是因为B型的隐芽不够成熟而容易死亡，另一个原因可能是因为B型的叶茎不够强壮，无法为隐芽的萌发提供营养。

总的来说，A型因为有紧贴的一层叶鞘保护，不必担心消毒时间过长会杀死外植体，消毒率稳定且有保证，有利于降低对操作人员的要求，便于推广本发明的技术。另外，由于A型拥有强壮的茎节和成熟的隐芽，从而能够健康萌芽，便于姜科植物的高效离体培育。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种以叶茎及花序梗隐芽为外植体的姜科植物离体快速繁育的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)在无菌条件下，用75％酒精浸泡60～120秒后，无菌水冲洗3～4次，再用0.10％升汞溶液消毒10～20分钟，无菌水冲洗6～8次，将茎段两端切去，保留以隐芽为节位、上下长度为0.4～0.6厘米的叶茎，拨开最后的叶鞘使隐芽显露，接种到促隐芽萌发的诱导培养基上；

5)重复步骤4)3～4次，获取足够数量的增殖苗丛；

7)将步骤6)中获得的装有生根苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至泥炭：园土：粗砂＝1：1：1的土壤环境中继续种植；

所述促隐芽萌发的诱导培养基为：在MS培养基的基础上添加3.0～5.0mg/L的BA、1.0～3.0mg/L的TDZ、0.01～0.02mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂；

所述促薄片诱导不定芽的培养基为：在MS培养基的基础上添加3.0～5.0mg/L的BA、0.1～0.3mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂；

所述促丛生芽增殖的培养基为：在MS培养基的基础上添加3.0～5.0mg/L的BA、0.01～0.03mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖，以及6.5～7.5g/L的琼脂；

所述生根培养基为：在MS培养基的基础上添加0.3～0.5mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促隐芽萌发的诱导培养基为：在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、2.0mg/L的TDZ、0.01mg/L的NAA、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促薄片诱导不定芽的培养基为：在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、0.2mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促丛生芽增殖的培养基为：在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的BA、0.02mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为：在MS培养基的基础上添加0.4mg/L的BA、1.0mg/L的NAA、30g/L的蔗糖，以及7g/L的琼脂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)～6)中的培养条件均为：24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx；步骤7)中的培养条件为：温度24～26℃、湿度90-95％、光照10～14h/d、光照强度2000～3000lx。