CN110506632B - 一种黄果野鸦椿的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种黄果野鸦椿的组织培养方法，涉及植物组织培养方法。利用选取黄果野鸦椿复叶为外植体，利用黄果野鸦椿复叶的生理习性，在瓶苗诱导初期设置5～7d缓冲实验的方式，遴选获得无菌外植体，在培养过程中小叶逐渐脱落，叶轴上形成愈伤创面，进而培养愈伤组织，获得黄果野鸦椿的再生植株，很好地解决了黄果野鸦椿的组织培养技术难题。以黄果野鸦椿复叶为外植体，其初步诱导、愈伤组织诱导、成苗诱导、丛生芽诱导、生根诱导和驯化培养过程均为常规组织培养所需的材料，培养基质容易获取，设备简单，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养方法，尤其是涉及一种黄果野鸦椿的组织培养方法。
背景技术
野鸦椿(Euscaphis japonica(Thunberg)Kanitz)为省沽油科(Staphyleaceae)野鸦椿属的常绿或落叶小乔木或灌木，蓇葖果，成熟果皮艳红，具有很高的观赏和药用价值。黄果野鸦椿(Euscaphis japonica(Thunberg)Kanitzvar.wupingensis B.P.Cai etZ.R.Chen)是福建省地理分布区域内的自然变异种，蔡邦平等人于2018年正式发表(Bang-Ping Cai,etc.2018.Euscaphis japonica var.wupingensis,a new variety withyellow pericarp fromFujian,China.Phytotaxa,334(1):055–059)。其一年生枝为黄绿色，奇数羽状复叶，叶对生，叶柄较野鸦椿修长、柔软，茎直立性不及野鸦椿，黄果野鸦椿的成熟内果皮为黄色，外翻呈蝴蝶翅状，肉质假种皮亮黑色；挂果期从9月可至翌年3月左右，极具观赏、药用和研究价值。
传统野鸦椿培育方式多为种子繁殖，而野鸦椿种皮坚硬、种子具深度休眠的特点，播种至出苗历时近3年，且出苗率低。黄果野鸦椿为近年发现的野鸦椿自然变异种，自然分布区域狭窄，种质资源稀少，因其果实营养丰富易被鸟类和动物食用、人类挖取植株作药用和观赏树种，并且在自然生境中植株数量少，自然结实率低，遗传性状受环境、授粉等各种因素影响，黄果野鸦椿一经被发现，便成为珍稀濒危植物。加之为顽拗型种子、实生出苗不整齐、培育周期长等问题，黄果野鸦椿的种子繁殖系数很低。因其果实为黄色的独特特征，明显区别于野鸦椿，在市场上具有极大的需求。单独依靠种子培育繁殖实生苗无法满足市场的需求。
发明内容
本发现的目的在于提供以黄果野鸦椿的带叶柄复叶为外植体，通过组织培养技术获得无性再生植株的一种黄果野鸦椿的组织培养方法。
本发明包括以下步骤：
⑴截取一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，冲洗后室内水培；
⑵选取靠近枝条顶端的叶片清洗，冲洗，沥干水分，置入超净工作台；切取复叶用75％乙醇浸泡后无菌水冲洗，然后汞溶液消毒，再无菌水冲洗，沥干水分，得黄果野鸦椿复叶小段，备用；
⑶将步骤⑵获得的黄果野鸦椿复叶小段接种于MS无激素培养基中进行无菌诱导培养，培养5～7d，得无菌黄果野鸦椿复叶小段；
⑷将步骤⑶获得的无菌黄果野鸦椿复叶小段从培养基中取出，在超净工作台上，沿叶轴方向留0.5cm左右，切除其余小叶，接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，经过120～150d培养，可分化一定数量的黄果野鸦椿愈伤组织；
⑸将步骤⑷获得的黄果野鸦椿愈伤组织，转接至初代诱导培养基中成苗诱导，经30d左右培养出苗，得黄果野鸦椿幼苗；
⑹将步骤⑸获得的黄果野鸦椿幼苗，转接至增殖培养基中，进行丛生芽诱导，培养周期30d左右，得黄果野鸦椿幼苗；
⑺从步骤⑹获得的黄果野鸦椿幼苗中，选取株高大于1cm、着生2～4片复叶、生长健壮的植株，转接至生根培养基进行生根诱导，培养周期30～60d；
⑻从步骤⑺生根诱导后的黄果野鸦椿幼苗中，选取株高2～3cm、着生6片复叶、根数为3～5条，根长大于2cm，生长健壮的幼苗，进行带瓶、揭盖、遮阴、保湿的室外驯化培养，培养周期为5～7d。
在步骤⑴中，所述截取一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，冲洗后室内水培的具体步骤可为：截取一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，自来水下冲洗3～5min，室内水培5～7d，每天更换清水一次，选取靠近枝条顶端的叶片。
在步骤⑵中，所述选取靠近枝条顶端的叶片清洗，冲洗可选取靠近枝条顶端的带叶柄叶片加入洗洁精清洗，自来水下冲洗10～15min；所述切取复叶用75％乙醇浸泡后无菌水冲洗的具体方法可为：切取复叶，每段留叶轴和2～3个完整小叶，按生长方向，上部短截，下部长截，75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗；所述汞溶液消毒可用0.1％升汞溶液消毒4～8min。
在步骤⑶中，所述MS无激素培养基为：1/2MS+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH5.8～6.2。
在步骤⑷中，所述愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH 5.8～6.2。
在步骤⑸中，所述黄果野鸦椿愈伤组织优选质地紧实、微绿色组织块；所述初代诱导培养基为：4/5MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH 5.8～6.2。
在步骤⑹中，所述增殖培养基为：MS+6-BA 1.0～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+25～30g/L蔗糖+8～9g/L琼脂，pH5.8～6.2。
在步骤⑺中，所述生根培养基为：1/2WPS+NAA 1.0～2.0mg/L+2.4-D 1.0～2.0mg/L+20～25g/L蔗糖+8～9g/L琼脂+2～3g/L活性炭，pH5.8～6.2。
本发明的创新点，在于利用选取黄果野鸦椿复叶为外植体，利用黄果野鸦椿复叶的生理习性，在瓶苗诱导初期设置5～7d缓冲实验的方式，遴选获得无菌外植体，在培养过程中小叶逐渐脱落，叶轴上形成愈伤创面，进而培养愈伤组织，获得黄果野鸦椿的再生植株，很好地解决了黄果野鸦椿的组织培养技术难题。
与现有技术相比，本发明的突出优点如下：
易实现性：本发明应用黄果野鸦椿的带叶柄复叶为外植体，通过适宜的组织培养技术可形成再生植株。
无菌高效性：本发明通过黄果野鸦椿复叶的生理习性，在瓶苗诱导初期设置5～7d缓冲实验的方式，遴选无菌外植体，在培养过程中小叶逐渐脱落，叶轴上形成愈伤创面，进而培养愈伤组织，达到黄果野鸦椿的植株再生目的。
生产成本低：本发明以黄果野鸦椿复叶为外植体，其初步诱导、愈伤组织诱导、成苗诱导、丛生芽诱导、生根诱导和驯化培养过程均为常规组织培养所需的材料，培养基质容易获取，设备简单，成本低廉。
附图说明
图1为黄果野鸦椿叶轴诱导培养照片。
图2黄果野鸦椿成苗诱导实验照片。标记H为黄果野鸦椿，4.20为诱导日期。
图3为黄果野鸦椿丛生芽培养照片。
图4为黄果野鸦椿生根培养照片。
图5黄果野鸦椿茎段外植体真菌侵染情况照片(对比例)。
图6黄果野鸦椿茎段、叶片外植体真菌侵染情况照片(对比例)。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例包括以下步骤：
所述外植体的选择与处理方法为：选择一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，枝条在自来水下冲洗3～5min，室内水培5～7d，每天更换清水一次净化；之后，选取其靠近枝条顶端的带叶柄叶片，加入洗洁精清洗消毒，自来水下冲洗10～15min，沥干水分，置入超净工作台；切取复叶，每段留叶轴和2～3个完整小叶，按生长方向，上部短截，下部长截；以切取的复叶为外植体，进行75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，0.1％升汞溶液消毒4～8min，无菌水冲洗，沥干水分备用。
所述的初步诱导方法为：黄果野鸦椿复叶小段接种于无激素培养基1/2MS+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH5.8～6.2，进行无菌诱导培养，培养5～7d。
所述的愈伤组织诱导方法为：将无菌黄果野鸦椿复叶小段，沿叶轴方向留0.5cm左右，切除其余小叶，接种于培养基1/2MS+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH 5.8～6.2，培养120～150d；
所述的成苗诱导方法为：将质地紧实、微绿色组织块，转接于培养基4/5MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH 5.8～6.2，培养30d左右出苗；
所述的丛生芽诱导方法为：黄果野鸦椿幼苗，接种于培养基MS+6-BA 1.0～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+25～30g/L蔗糖+8～9g/L琼脂，pH5.8～6.2，培养30d左右；
所述的生根诱导方法为：选取黄果野鸦椿幼苗，株高大于1cm、着生2～4片复叶、生长健壮的单株，接种于培养基1/2WPS+NAA 1.0～2.0mg/L+2.4-D 1.0～2.0mg/L+20～25g/L蔗糖+8～9g/L琼脂+2～3g/L活性炭，pH5.8～6.2，培养30～60d；
所述的驯化培养方法为：选取黄果野鸦椿幼苗株高2～3cm、着生6片复叶、根数为3～5条，根长大于2cm，生长健壮的幼苗，进行带瓶、揭盖、遮阴的室外驯化，保湿培养周期为5～7d。
瓶苗室内生长环境条件为：室温26℃±2℃，光照强度1500～2500Lux，光照培养12hr/d。
以下给出具体实施例。
实施例：
本发明实施例包括外植体选择与处理、组织培养。
外植体选择与处理：选择一年生黄果野鸦椿无病虫害、健壮枝条，截面斜切，在自来水下冲洗3～5min，移至室内水培5～7d，每天更换清水一次净化；在经过室内水培5d以后的枝条上，选取靠近枝条顶端的带叶柄叶片，加入洗洁精清洗，自来水下冲洗10～15min，沥干水分，置入超净工作台；切取复叶，每段留叶轴和2～3个完整小叶，按生长方向，上部短截，下部长截；以切取的复叶为外植体，75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，0.1％升汞溶液消毒4～8min，无菌水冲洗，沥干水分备用；
组织培养包括初步诱导、愈伤组织诱导、成苗诱导、丛生芽诱导、生根诱导和驯化培养的技术体系。
初步诱导：黄果野鸦椿复叶小段接种于无激素培养基1/2MS+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8-6.0，进行无菌诱导培养，培养5-7d，无菌诱导成活率约5％；
愈伤组织诱导：将无菌黄果野鸦椿复叶小段，沿叶轴方向留0.5cm左右，切除其余小叶，接种于培养基1/2MS+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8-6.2，培养150d左右，叶轴周围愈伤组织直径达0.5cm左右；
成苗诱导：将质地紧实、微绿色组织块，转接于培养基4/5MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA
0.05～0.1mg/L+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH5.8～6.2，培养30d左右出苗；
丛生芽诱导：黄果野鸦椿幼苗，接种于培养基MS+6-BA1.0～1.5mg/L+NAA0.1～0.2mg/L
+25g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH5.8～6.2，培养30d左右，有效增殖系数8.0以上；
生根诱导：选取黄果野鸦椿幼苗，株高大于1cm、着生2-4片复叶、生长健壮的单株，接种于培养基1/2WPS+NAA 1.0mg/L+2.4-D 2.0mg/L+20g/L蔗糖+9g/L琼脂+2g/L活性炭，pH5.8-6.2，培养60d左右，生根率达93.3％；
驯化培养：选取黄果野鸦椿幼苗株高2～3cm、着生6片复叶、根数为3～5条，根长大于2cm，生长健壮的幼苗，进行带瓶、揭盖、遮阴的室外驯化，保湿培养周期为5～7d，成活率达84％。
对比例1：
外植体选择与处理：选择一年生黄果野鸦椿无病虫害、健壮枝条，截面斜切，在自来水下冲洗3～5min，移至室内水培5～7d，每天更换清水一次；在经过室内水培5d以后的枝条上，选取带腋芽茎段，加入洗洁精清洗，自来水下冲洗15～20min，沥干水分，置入超净工作台；75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，0.1％升汞溶液消毒8～12min，无菌水冲洗，沥干水分备用；
初步诱导：黄果野鸦椿带腋芽茎段接种于无激素培养基1/2MS+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8～6.0，进行无菌诱导培养，培养3～5d，茎段切面出现菌丝，且菌丝生长速度优于外植体萌芽速度，7d左右菌丝遍布外植体四周；7～10d后外植体出现褐化死亡。
对比例2：
外植体选择与处理：选择一年生黄果野鸦椿无病虫害、健壮枝条，截面斜切，在自来水下冲洗3～5min，移至室内水培5～7d，每天更换清水一次；在经过室内水培5d以后的枝条上，选取靠近枝条顶端的叶片，加入洗洁精清洗，自来水下冲洗10～15min，沥干水分，置入超净工作台；75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，0.1％升汞溶液消毒4～8min，无菌水冲洗，沥干水分备用；
初步诱导：黄果野鸦椿复叶小叶接种于无激素培养基1/2MS+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8～6.0，进行无菌诱导培养，培养3～5d，小叶切面出现白色菌丝，7d左右菌丝遍布外植体四周；7～10d后外植体出现褐化死亡。
图1给出黄果野鸦椿叶轴诱导培养照片。可见黄果野鸦椿外植体复叶叶轴膨大形成愈伤组织。图2给出黄果野鸦椿成苗诱导实验照片。图3给出黄果野鸦椿丛生芽培养照片。图4给出黄果野鸦椿生根培养照片。图5给出黄果野鸦椿茎段外植体真菌侵染情况照片(对比例)。图6给出黄果野鸦椿茎段、叶片外植体真菌侵染情况照片(对比例)。
由上述实施例和对比例可以看出，以黄果野鸦椿的带腋芽茎段或复叶小叶为外植体材料，进行无菌诱导培养，但7d左右时间，都在外植体的切面上出现菌丝体，过7～10d后外植体出现褐化死亡；而实施例中，以带叶柄复叶为外植体，进行无菌诱导培养的过程中，经过5-7d的无菌苗筛选，再次转接以诱导外植体的愈伤组织形成，避免在诱导过程中的菌类感染，进而引起外植体褐化死亡的现象。
植物组织培养方式可以快速扩繁无性植株。野鸦椿的组织培养方法，近几年来获得突破，具有成熟的技术。在试验研究过程中，采用传统的野鸦椿外植体取材方式，先后对黄果野鸦椿的茎段、腋芽、叶片等进行无菌诱导，均未获得成功。
通过多次的试验研究，利用黄果野鸦椿的带叶柄复叶为外植体，成功诱导获得黄果野鸦椿的再生植株，建立了黄果野鸦椿的组织培养体系。本发明为今后黄果野鸦椿的组织培养和工厂化育苗奠定了重要基础。
Claims (5)
1.一种黄果野鸦椿的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：
⑴截取一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，冲洗后室内水培；
⑵选取靠近枝条顶端的叶片清洗，冲洗，沥干水分，置入超净工作台；切取复叶用75%乙醇浸泡后无菌水冲洗，然后汞溶液消毒，再无菌水冲洗，沥干水分，得黄果野鸦椿复叶小段，备用；
⑶将步骤⑵获得的黄果野鸦椿复叶小段接种于MS无激素培养基中进行无菌诱导培养，培养5～7 d，得无菌黄果野鸦椿复叶小段；所述MS无激素培养基为：1/2 MS + 20～25g/L蔗糖 + 7～8g/L琼脂，pH5.8～6.2；
⑷将步骤⑶获得的无菌黄果野鸦椿复叶小段从培养基中取出，在超净工作台上，沿叶轴方向留0.5 cm，切除其余小叶，接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，经过120～150 d培养，分化一定数量的黄果野鸦椿愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+20～25g/L蔗糖+7～8g/L琼脂，pH 5.8～6.2；
⑸将步骤⑷获得的黄果野鸦椿愈伤组织，转接至初代诱导培养基中成苗诱导，经30 d培养出苗，得黄果野鸦椿幼苗；所述初代诱导培养基为：4/5 MS + 6-BA 0.5～1.0 mg/L +NAA 0.05～0.1 mg/L + 20～25 g/L蔗糖 + 7～8 g/L琼脂，pH 5.8～6.2；
⑹将步骤⑸获得的黄果野鸦椿幼苗，转接至增殖培养基中，进行丛生芽诱导，培养周期30 d，得黄果野鸦椿幼苗；所述增殖培养基为：MS + 6-BA 1.0～1.5 mg/L + NAA 0.1～0.2mg/L + 25～30 g/L蔗糖 + 8～9 g/L琼脂，pH5.8～6.2；
⑺从步骤⑹获得的黄果野鸦椿幼苗中，选取株高大于1 cm、着生2～4片复叶、生长健壮的植株，转接至生根培养基进行生根诱导，培养周期30～60 d；所述生根培养基为：1/2 WPM+ NAA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 1.0～2.0 mg/L + 20～25 g/L蔗糖 + 8～9 g/L琼脂 + 2～3 g/L活性炭，pH5.8～6.2；
⑻从步骤⑺生根诱导后的黄果野鸦椿幼苗中，选取株高2～3cm、着生6片复叶、根数为3～5条，根长大于2cm，生长健壮的幼苗，进行带瓶、揭盖、遮阴、保湿的室外驯化培养，培养周期为5～7d。
2.如权利要求1所述一种黄果野鸦椿的组织培养方法，其特征在于在步骤⑴中，所述截取一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，冲洗后室内水培的具体步骤为：截取一年生黄果野鸦椿无分枝枝条，自来水下冲洗3～5min，室内水培5～7d，每天更换清水一次，选取靠近枝条顶端的叶片。
3.如权利要求1所述一种黄果野鸦椿的组织培养方法，其特征在于在步骤⑵中，所述选取靠近枝条顶端的叶片清洗，冲洗，是选取靠近枝条顶端的带叶柄叶片加入洗洁精清洗，自来水下冲洗10～15min。
4.如权利要求1所述一种黄果野鸦椿的组织培养方法，其特征在于在步骤⑵中，所述切取复叶用75%乙醇浸泡后无菌水冲洗的具体方法为：切取复叶，每段留叶轴和2～3个完整小叶，按生长方向，上部短截，下部长截，75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗；所述汞溶液消毒用0.1%升汞溶液消毒4～8min。
5.如权利要求1所述一种黄果野鸦椿的组织培养方法，其特征在于在步骤⑸中，所述黄果野鸦椿愈伤组织为质地紧实、微绿色组织块。
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