CN107529398B - 一种生姜脱毒繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生姜脱毒繁育方法，包括以下步骤：(1)生姜脱毒苗的制备；(2)生姜脱毒苗的扩大繁殖；(3)移栽驯化：将步骤(2)获得的大量生姜脱毒苗栽入栽培基质中，于20‑28℃培养1‑2周；其中，栽培基质为珍珠岩、泥炭土和生物菌肥按体积比为1‑2:3‑5:0.3‑0.8混合的混合物；前期培养中氮、磷和钾浓度分别为60‑100mg/L、20‑40mg/L和100‑150mg/L，后期氮、磷和钾浓度分别为200‑220mg/L、20‑40mg/L和200‑250mg/L，每周施肥一次。本发明对整个繁育过程各参数进行研究，所优化参数结合起来可有效提高生姜脱毒率、存活率、产量，缩短其繁育周期。

Description

一种生姜脱毒繁育方法

技术领域

本发明属于生姜繁育技术领域，具体涉及一种生姜脱毒繁育方法。

背景技术

生姜(Zingiber officinale Roscoe)为多年生草本植物，具有治疗腹泻、开胃健脾、提神、抗衰老、治疗内科疾病、养生等功效。其繁殖主要通过地下根状茎进行无性繁殖，由于其生长发育未经有性世代，病毒易在体内积累，导致生姜叶片皱缩、生长缓慢、产量降低及品质退化等问题。因此，脱去生姜的病毒，保持优良品种的种性对现代生姜种植十分必要。但现在对生姜进行脱毒效果不佳，脱毒苗的繁育也未能像脱毒马铃薯、草莓等真正实现产业化，主要原因在于生姜为一年单茬种植作物，繁育种姜的周期较长，并且目前尚未形成一套经济有效的根茎繁育方法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种生姜脱毒繁育方法，可有效解决现有技术中生姜脱毒效果不佳，脱毒后的组培苗繁育成成熟的生姜原种周期长的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种生姜脱毒繁育方法，包括以下步骤：

(1)生姜脱毒苗的制备

取生姜根茎萌发的幼芽，剥去外层叶鞘，用无菌水冲洗干净，然后用75％酒精消毒30-40s，用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％的HgCl₂消毒8-10min，继续用无菌水冲洗5-6次，在解剖镜下将幼芽进行剥离，取0.2-0.5cm茎尖生长点接入含有6-BA 0.5-1mg/L、KT 0.5-1.5mg/L、NAA 0.05-0.15mg/L和蔗糖15-20g/L的MS培养基中，置于56-60℃热处理40-60min，然后进行培养，先在黑暗条件下，23-26℃培养2-3天，再置于培养室正常培养28-30天(培养室白天温度23±1℃、夜间温度18±1℃，光照2000-3000lx，光照时间14h/d)，获得再生组培苗，剪取再生组培苗茎叶进行病毒检测，对未带病毒的组培苗基部按单芽分割后，重新转入新的培养基(与前面培养基相同)中进行继代培养，获得生姜脱毒苗；

(2)生姜脱毒苗的扩大繁殖

将步骤(1)获得的生姜脱毒苗剪去茎叶后，对其基部按单芽分割，重新接种到新的含有6-BA 0.5-1mg/L、KT 0.5-1.5mg/L和NAA 0.05-0.15mg/L和蔗糖15-20g/L的MS培养基中进行增殖培养，培养40-45天，获得大量带根生姜脱毒苗；

(3)移栽驯化

成活培养：将步骤(2)获得的大量生姜脱毒苗栽入栽培基质中，置于20-28℃培养1-2周；其中，栽培基质为珍珠岩、泥炭土和生物菌肥按体积比为1-2:3-5:0.3-0.8混合的混合物；

前期培养：对成活后的脱毒苗进行施肥，每2株施肥150-170mL，氮、磷和钾的浓度分别为60-100mg/L、20-40mg/L和100-150mg/L，每周施肥一次；

后期培养：脱毒苗生长13-14周后，每2株施肥150-170mL，氮、磷和钾的浓度分别为200-220mg/L、20-40mg/L和200-250mg/L，每周施肥一次；

前期培养和后期培养过程中每月喷施一次叶面微肥(含多种微量元素)同时每月进行一次病虫防治。

进一步地，步骤(1)中和步骤(2)中所用培养基为含有6-BA 0.5mg/L、KT 1.2mg/L和NAA 0.05mg/L和蔗糖16g/L的MS培养基。

进一步地，步骤(1)中热处理过程为60℃热处理40min。

进一步地，生物菌肥包括以下重量份的组分：复合菌1-3份、玉米粉30-40份、麸皮10-20份、蔗糖2-4份、黄腐植酸20-30份、银杏叶5-10份、钼酸铵0.1-0.3份、硫酸锌0.05-0.08份和水8-15份。

进一步地，生物菌肥包括以下重量份的组分：复合菌2份、玉米粉40份、麸皮15份、蔗糖3份、黄腐植酸28份、银杏叶6份、钼酸铵0.2份、硫酸锌0.06份和水12份。

进一步地，复合菌包括以下重量份的组分：固氮菌1-2份、解磷菌1-2份、解钾菌1-2份、枯草芽孢杆菌2-4份。

进一步地，复合菌包括以下重量份的组分：固氮菌1.2份、解磷菌1份、解钾菌1.5份、枯草芽孢杆菌3份。

进一步地，生物菌肥通过以下方法制备得到：

将银杏叶粉碎，然后与玉米粉、麸皮和适量水混匀，然后加入复合菌，搅拌均匀，然后再加入黄腐植酸和余量水，混匀，然后置于30-35℃发酵15-20天，制得。

进一步地，步骤(3)前期培养过程中每2株施肥150mL，氮、磷和钾的浓度分别为60mg/L、20mg/L和100mg/L。

进一步地，步骤(3)后期培养过程中每2株施肥150mL，氮、磷和钾的浓度分别为200mg/L、20mg/L和200mg/L。

本发明提供的生姜脱毒繁育方法，具有以下有益效果：

(1)本发明采用茎尖组织培养得到无菌苗，再对无菌苗进行剥离，通过设置不同的热处理温度、时间、茎尖长度等指标，筛选出较优的热处理方式，当时60℃热处理40min，茎尖长度为0.2-0.5cm，培育出的脱毒苗死亡率低、增殖率与脱毒率较高。

(2)在移栽驯化过程中，所用栽培基质含有珍珠岩、泥炭土和生物菌肥。

珍珠岩，表观密度轻、导热系数低、化学稳定性好、吸湿能力小，且无毒、无味、防火等功能，在本发明中作为栽培基质的一部分，其可以为生姜脱毒苗提供必需的空气，还可以起到保湿作用，其还含有很多营养物质，可以为生姜脱毒苗的生长提供营养。

泥炭土，含有大量的有机基质，可以为生姜脱毒苗提供大量的营养物质，同时，它还具有保水和透气性好的优势，与珍珠岩结合，协同为生姜脱毒苗提供良好的生长环境，提供必需的营养物质，其保水和透气性，使生姜脱毒苗可以快速的生长。

生物菌肥由特定的组分组成，含有多种有益菌，能改善栽培基质的肥力，还含有多种微量元素和营养物质，其配制合理，增强壮根系，增加生姜脱毒苗对营养物质的吸收，从而达到益根、壮苗的目的；同时，生物菌肥中还含有银杏叶，其具有抑菌作用，与其他物质结合经过发酵后，可以为生姜脱毒苗提供营养物质，促进其生长，同时，还做到了废物利用，降低了其生产成本。

(3)在驯化的各过程中，基于栽培基质之上，本发明还施用了氮磷钾肥料，在每个阶段，所用氮磷钾的含量不同，栽培基质结合所用肥料，可以有效促进叶片和地下根茎的生长，从而缩短了其生长周期，降低了生成成本。

(4)本发明对整个繁育过程各参数进行研究，其所优化各参数结合起来可有效提高生姜脱毒率、存活率、产量，缩短了其繁育周期。

具体实施方式

实施例1生姜脱毒苗的制备

1、不同热处理对生姜无菌苗存活率、增殖率和脱毒率的影响

取生姜根茎萌发的幼芽，剥去外层叶鞘，用无菌水冲洗干净，然后用75％酒精消毒30-40s，用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％的HgCl₂消毒8-10min，继续用无菌水冲洗5-6次，在解剖镜下将幼芽进行剥离，取不同长度的茎尖生长点接入含有6-BA 0.5mg/L、KT 1.2mg/L、NAA 0.05mg/L和蔗糖16g/L的MS培养基中，热处理温度(A)、处理时间(B)和茎尖长度(C)三个因素，共9个处理，每个处理接种8瓶，每瓶接4个茎尖，然后进行培养，先在黑暗条件下，25℃培养2天，再置于培养室正常培养30天(培养室白天温度23±1℃、夜间温度18±1℃，光照2000-3000lx，光照时间14h/d)，获得再生组培苗，剪取再生组培苗茎叶进行病毒检测，对未带病毒的组培苗基部按单芽分割后，重新转入新的培养基(与前面培养基相同)中进行继代培养，得生姜脱毒苗。1周和1月后分别观察并统计数据，计算死亡率和增殖率，死亡率＝死亡的植株的株数/接种数×100％；增殖率＝接种后总苗数/接种数×100％，结果见表1、表2和表3。

其中，脱毒苗的病毒检测如下：

(1)检测液的制备：取培育后的无菌苗植株，置于超净工作台上，每处理随机选取3株(3-5cm)放入事先灭好菌的3个研钵中充分研磨，加入双蒸水以提取汁液，倒入已灭菌的离心管中，2000r/min离心5min后，静置备用，以未经处理的无菌苗作对照。

(2)青枯假单孢杆菌的筛选：分别从每个对应处理的离心管中吸取100μl上清液涂布在蛋白胨培养基平板上，同时做4个空白平板作为环境污染对照。将平板置于28℃-30℃培养箱中培养1天，期间注意观察，待长出菌落后，用分区划线法分离出不同的单菌落，先在光学显微镜下观察其形态特征。将不同的单菌落进行标记，然后挑取不同的单菌落制片→结晶紫液染色1min→碘液染色1min→95％乙醇脱色处理20s→番红复染1min→干燥→镜检，其中染色和脱色后都要进行水洗。

(3)青枯假单孢杆菌的检测：选取经染色后呈红色的标记菌落，喷洒0.005％TTC于菌落上，30min后观察菌落颜色，统计每个处理及其对照呈现紫色菌落的平板数，并计算各个处理及其对照的脱毒率，脱毒率＝检测到有青枯假单孢杆菌的植株数/检测的总植株数×100％。

表1生姜热处理脱毒L₉(3⁴)正交试验

注：CK为热处理对照，“-”表示无。

表2生姜热处理脱毒L₉(3⁴)正交试验结果的直观分析

注：K为因素和，X为平均值，R为极差。

表3生姜热处理脱毒L₉(3⁴)正交试验结果的方差分析

注：F表示方差，P表示显著性差异。

由表1可知，经过不同高温处理后生姜均能正常生长，形成植株。其中，处理1、2、3、4、5、7、9存活率均为100.00％，处理6死亡率最高为30.00％，处理8次之，死亡率为3.33％。从增殖率来看，无菌苗经过热处理后增殖率最高的是处理3(增殖率为256.67％)，增殖系数较CK(热处理对照)多0.1倍系数(246.67％)；其次是处理4＞处理5＞处理7，最差的是处理6，增殖率仅为70.00％。就脱毒率而言，9个无菌苗茎尖+热处理方式脱毒效果差别很大，其平均脱毒率51.85％。其中处理6和处理8脱毒率达100.00％，其次是处理1，脱毒率为66.67％，处理5和CK脱毒效果最差，脱毒率为0.00％。没能脱除病原菌的植株研磨液在蛋白胨琼脂平板上检测到的青枯假单孢杆菌有以下特征：菌落呈近圆形、***、较湿润、光滑，其脓液呈淡黄色，有臭味；其菌株在低倍显微镜下呈杆状；经革兰氏染色呈现红色；喷洒0.005％TTC后，青枯假单孢杆菌菌落呈现紫色。

直观分析(表2)看出，RC＞RA＝RB，影响生姜死亡率的主次关系为茎尖长度＞热处理温度＝热处理时间。用空白因子作为误差项对A、B、C三个因子进行方差分析(表3)，结果为FC(1.37)＞FA(1.00)＝FB(1.00)，因素B和因素A方差相同，三者的显著性差异P均大于0.05，说明差异不显著。由F值的比较可以看出因素C对生姜的死亡率影响最大，这与直观分析结果一致，由直观分析结果和方差分析结果表明，无菌苗的茎尖长度对其死亡率影响最大。综合考虑无菌苗的存活率，最差的为处理6(A2B3C1)，其次是组合8(A3B2C1)。另外，在姜苗生长情况的定期观察中发现，经过热处理后的苗较未经处理的苗(对照)长势慢，说明热处理对其存活和生长有抑制作用。就姜苗的增殖率而言(表3)，影响姜苗增殖率的因素主次关系为C>A>B，以空白因子作为误差项对A、B、C进行方差分析。结果显示，由F值确定他们的主次关系为C>B>A，因素C(茎尖长度)对生姜的增殖率影响最大。由PA(0.7111)＞PB(0.5368)＞PC(0.0790)可以看出，3个因素对增殖率的影响程度均未达到显著水平。考虑姜苗的增殖率，试验最优组合为处理3(A1B3C3D3)，这与考虑主因素和直观分析结果一致。说明将无菌苗剥离，取1.0cm左右的茎尖接种在培养基上，52℃处理60min是最优的处理方法。从表2来看，影响姜苗脱毒率的因素的主次关系为：C＞A＝B，空白因子作为误差项对A、B、C做方差分析，从表3可以看出，FC＞FA＝FB。F值确定的影响其脱毒效果的因素关系为C＞A＝B，即茎尖长度是生姜无菌苗脱毒效果的主要因素。且0.01＜PC(0.0345)＜0.05＜PA(0.1999)＝PB(0.1999)，C因素(无菌苗茎尖长度)达到了显著水平，A因素(热处理温度)和B因素没有达到显著水平。对C因素的3个水平之间的比较显示，茎尖长度在0.6-0.9cm和1.0-1.3cm水平上差异不显著，0.2-0.5cm和0.6-0.9cm、0.2-0.5cm和1.0-1.3cm水平差异显著，说明不同茎尖长度对生姜的脱毒率有显著差异。由此，以处理6(A2B3C1)和处理8(A3B2C1)最优，因为处理8的增殖率(113.33％)高于处理6(70.00％)的增殖率，所以组合8优于组合6，处理8为最优组合。正交表结果和直观分析结果得出，无菌苗茎尖(0.2cm-0.5cm)+60℃处理40min方式最好。

2、不同热处理+冷处理对生姜无菌苗增殖率和脱毒率的影响

经热处理后长势良好、叶片浓绿的健壮无菌苗植株进一步转接，每个处理接种8瓶，每瓶4株，接种后放在5℃的培养箱中培养5天后，再转入25℃培养箱中培养，剩余2瓶不经过冷处理，直接放入25℃培养箱中培养作为对照。一周和20天后分别观察记录数据，计算死亡率和增殖率。

就姜苗的增殖情况而言，只经过热处理而未经冷处理的9个组合中，组合3(A1B3C3D3)的增殖率最高为256.67％，其后依次为处理4＞处理5＞处理7＞处理9，最差的是处理6，为83.33％。冷处理后增殖率顺序为处理3＞处理5＞处理4＞处理9＞处理2，处理6增殖效果最差为70％。在冷处理后的9个处理中，增值效果最好的是处理3，为250.00％，其后依次为处理5＞处理4＞处理9＞处理2，组合6增殖率最低。对比分析冷处理前后增殖率的变化可以发现姜苗经过冷处理后增殖率有所下降，由此判断，冷处理对生姜的正常生长与增殖有一定的抑制作用。没有经过冷处理的9个组合(对照)的脱毒效果差异很大，处理6和处理8的脱毒率高达100.00％，其次是处理1和处理9，脱毒效果最差的组合为组合5，脱除率为0。经过冷处理的9个处理中，组合2、组合3、组合4、组合5、组合7最差，均为33.33％，处理6、处理8的脱毒率仍为100.00％，说明组合6和组合8在冷处理前已经脱除了青枯病菌。因此，最优处理是组合6和组合8。比较冷处理及其对照的数据可以看出，除处理5脱毒率提高了33.33％外，其脱毒率基本没变。由此说明，5℃的冷处理对生姜苗病原菌的脱除效果不显著。

实施例2生姜脱毒苗的扩大繁殖

1、将生姜脱毒苗剪取茎叶后，对其基部按单芽分割，重新接种到新的含有6-BA0.5mg/L、KT 0.5mg/L和NAA 0.05mg/L和蔗糖15g/L的MS培养基中进行培养，23-26℃培养40-45天，获得大量带根生姜脱毒苗。

2、将生姜脱毒苗剪取茎叶后，对其基部按单芽分割，重新接种到新的含有6-BA1mg/L、KT 1.5mg/L和NAA 0.15mg/L和蔗糖20g/L的MS培养基中进行培养，23-26℃培养40-45天，获得大量带根生姜脱毒苗。

3、将生姜脱毒苗剪取茎叶后，对其基部按单芽分割，重新接种到新的含有6-BA0.5mg/L、KT 1.2mg/L和NAA 0.05mg/L和蔗糖16g/L的MS培养基中进行培养，23-26℃培养40-45天，获得大量带根生姜脱毒苗。

通过对培养基中各组分含量进行优化，可知第3种情况中的生姜脱毒苗长势最好。

实施例3移栽驯化

成活培养：将实施例2获得的生长情况相近的单枝生姜脱毒苗分别栽入270个塑料盆中，每盆2株，置于20-28℃培养2周，这个培养过程只需浇水，不需施肥等其他操作；其中，栽培基质为珍珠岩、泥炭土和生物菌肥按体积比为1:3:0.5混合的混合物。

其中，生物菌肥包括以下重量份的组分：复合菌2份、玉米粉40份、麸皮15份、蔗糖3份、黄腐植酸28份、银杏叶6份、钼酸铵0.2份、硫酸锌0.06份和水12份。

复合菌包括以下重量份的组分：固氮菌1.2份、解磷菌1份、解钾菌1.5份、枯草芽孢杆菌3份。

生物菌肥通过以下方法制备得到：将银杏叶粉碎，然后与玉米粉、麸皮和适量水混匀，然后加入复合菌，搅拌均匀，然后再加入黄腐植酸和余量水，混匀，然后置于30℃发酵20天，制得。

前期培养(栽后第3-14周)：对成活后的脱毒苗进行施肥，每盆施肥(氮、磷和钾)150mL，每周施肥一次，施肥时采取基部浇灌方式；同时每月叶面喷施一次微量元素，在此期间根据基质干湿情况适当浇水，并且每月进行一次病虫防治。

其中，N元素的3个水平N1、N2和N3分别是60、120和180mg/L；P元素对应的3个水平P1、P2和P3分别是20、60和100mg/L；K元素对应的3个水平K1、K2和K3分别是100、200和300mg/L。

前期N、P和K的影响结果见表4-6。

后期培养(栽后第15-26周)：该过程与前期培养相比仅是所施氮、磷和钾的浓度不同，其余与前期培养过程一致。

后期主要加大对N、K肥的追肥量，N元素设置的3个水平N1、N2和N3分别是200、250和300mg/L；K元素对应的3个水平K1、K2和K3分别是200、400和600mg/L。

后期N、P和K的影响结果见表7-8。

表4不同N、P、K配比对生姜脱毒苗前期地上部分生长的影响

由表4可知，随着N、P、K施用量的增加，生姜脱毒苗生长前期分枝数、株高、新增叶片数和叶片增长速率整体上均呈下降趋势。对分枝数和株高的影响，均为处理1(N1P1K1)较好，每株平均新增6个分枝，株高增加18.21cm；新增叶片数和叶片增长速率均为处理2(N1P2K2)较好，单株叶片增加32.6片/株，测定期间叶片增长速率为5.43片/(株·周)，处理8(N3P2K3)较差，分枝数平均为2.3个/株，株高增幅最小，仅增加0.66cm，叶片数最少，仅增加1.3片/株，测定期间叶片增长速率仅为0.22片/(株·周)；其余处理介于二者之间。综上认为，生姜脱毒苗生长前期对N、P、K的需求相对较少，较高浓度反而不利于组培苗生长，施肥处理1和2即N60mg/L、P20mg/L、K100mg/L和N60mg/L、P60mg/L、K200mg/L组合较好。

表5不同施肥处理对生姜生长前期茎鲜重及根茎数的影响

处理号	鲜重/g	根茎数/枚
			1＝N1P1K1	41.20	8.40
2＝N1P2K2	33.34	7.93
			3＝N1P3K3	26.99	7.93
4＝N2P1K3	25.22	7.00
			5＝N2P2K1	14.37	5.43
6＝N2P3K2	11.29	5.20
			7＝N3P1K2	14.71	4.80
8＝N3P2K3	7.49	3.93
			9＝N3P3K1	14.34	4.53

由表5可知，生姜脱毒苗生长前期随着N、P、K施用量的增加，新生根茎鲜重及根茎数整体上均呈现下降趋势。其中收获鲜重和根茎数最大的均为处理1，收获鲜重41.20g，新生根茎数8.40枚；收获最小的为处理8，收获鲜重仅7.49g，新生根茎数3.93枚，其余处理介于二者之间。

表6不同施肥处理对生姜生长前期根状茎鲜重及根茎数的直观分析

由表6可知，影响新生根茎鲜重和根茎数的因素的大小关系为N＞P＞K。将这三个因素进行方差分析，其F值均＜F0.05，该结果说明差异不显著。因三者的自由度相同，通过F值确定他们的大小关系是N＞P＞K，即在生姜脱毒苗生长的前期，N对生姜鲜重和根茎数的影响最大，P次之，K最差，结果显示与直观分析(N＞P＞K)相符。从该试验结果可以看出处理1根茎鲜重增值最大，根茎数最多。综上，处理1(N1P1K1)对生姜脱毒苗前期根茎鲜重和根茎数增加较好，即N60mg/L、P20mg/L、K100mg/L组合较好。

表7不同施肥处理对生姜生长后期茎鲜重及根茎数的影响

处理号	鲜重/g	根茎数/枚
			1＝N1K1	38.673	10.53
2＝N1K2	23.814	7.93
			3＝N1K3	27.928	8.36
4＝N2K3	35.644	10.53
			5＝N2K1	28.931	8.40
6＝N2K2	34.266	10.33
			7＝N3K2	34.316	10.27
8＝N3K3	28.658	9.13
			9＝N3K1	27.406	9.57

由表7可知，随着N、K施用量的增加，生姜脱毒苗生长后期根茎鲜重及根茎数整体上均呈现下降趋势。其中鲜重增加值最大的为处理1，增重38.673g；增重最小的为处理2，仅增重23.814g，其余处理介于二者之间；根茎数较多的是处理1，根茎数10.53个，较少的是处理2，仅为7.93个。

表8不同施肥处理对生姜生长后期茎鲜重及根茎数的直观分析

由表8可知，生姜生长后期根茎鲜重和根茎数的直观分析表明，影响根茎鲜重增加和根茎数的因素大小关系为N＞K。将这两个因素进行方差分析，其F值均＜F0.05，该结果说明差异不显著。因二者的自由度相同，通过F值确定他们的大小关系为N＞K，即在生姜脱毒苗生长的后期，N对根茎鲜重和根茎数的影响大于K，结果显示与直观分析(N＞K)相符。从该试验结果可以看出处理1(N1K1)根茎鲜重增值最大，根茎数最多。因此，处理1(N1K1)对生姜脱毒苗后期根茎鲜重和根茎数增加较好，即N200mg/L、K200mg/L组合较好。

综上所述，在生姜脱毒生长前期，综合平均叶片增长速率、株高和分蘖数，以及地下部分根茎鲜重和根茎数的试验结果认为N、P、K的最优施肥方式为N60mg/L，P20mg/L，K100mg/L[ρ(N)∶ρ(P)：ρ(K)＝3：1：5]。由此可见，生姜脱毒苗生长前期需肥量相对较少，在生产过程中应少施。钾对生姜的生长发育作用明显，适量增加钾肥用量能达到显著的增产作用,其根茎的增值大致为11.7～31.8％，平均增产率达14.85％。本试验结果表明在脱毒苗生长后期最佳施肥是N200mg/L，K200mg/L。N、K的施用量相对于前期显著提高。

实施例4

本实施例与实施例3不同之处在于，栽培基质为珍珠岩、泥炭土和生物菌肥按体积比为1:3:0.3混合的混合物，其余参数为实施例3中的最优参数。

实施例5

本实施例与实施例3不同之处在于，栽培基质为珍珠岩、泥炭土和生物菌肥按体积比为2:5:0.3混合的混合物，其余参数为实施例3中的最优参数。

实施例6

本实施例与实施例3不同之处在于，复合菌1份、玉米粉30份、麸皮10份、蔗糖2份、黄腐植酸20份、银杏叶5份、钼酸铵0.1份、硫酸锌0.05份和水8份，其余参数为实施例3中的最优参数。

实施例7

本实施例与实施例3不同之处在于，复合菌3份、玉米粉40份、麸皮20份、蔗糖4份、黄腐植酸30份、银杏叶10份、钼酸铵0.3份、硫酸锌0.08份和水15份，其余参数为实施例3中的最优参数。

实施例8

本实施例与实施例3不同之处在于，不包含复合菌，其余参数为实施例3中的最优参数。

实施例3(优选参数)-实施例8这些实施例栽培的生姜脱毒苗，实施例4-8不管是从地上部分还是地下部分均比实施例3要差，存活率和产量均低于实施例3，实施例4-7与实施例3相差程度不是很大，但实施例8明显比实施例3要差。

综上所述，本发明中制备脱毒苗的以及后期的扩大增殖和移栽驯化，其整个过程是一个整体，所有参数的结合才制备出脱毒率高，存活率高，产量高，生长周期短的生姜。

Claims (9)

1.一种生姜脱毒繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)生姜脱毒苗的制备

取生姜根茎萌发的幼芽，剥去外层叶鞘，用无菌水冲洗干净，然后进行消毒，接着取0.2-0.5cm茎尖生长点接入含有6-BA 0.5-1mg/L、KT 0.5-1.5mg/L、NAA 0.05-0.15mg/L和蔗糖15-20g/L的MS培养基中，置于60℃热处理40min，然后在黑暗条件下，23-26℃培养2-3天后转入白天温度为23±1℃，夜间温度为18±1℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12-14h/天条件下培养28-30天，获得再生组培苗，然后进行病毒检测，筛选出生姜脱毒苗；

(2)生姜脱毒苗的扩大繁殖

将步骤(1)获得的生姜脱毒苗剪去茎叶后，对其基部按单芽分割，重新接种到新的含有6-BA 0.5-1mg/L、KT 0.5-1.5mg/L和NAA 0.05-0.15mg/L和蔗糖15-20g/L的MS培养基中培养40-45天，获得大量带根生姜脱毒苗；

(3)移栽驯化

成活培养：将步骤(2)获得的大量生姜脱毒苗栽入栽培基质中，置于20-28℃培养1-2周；其中，栽培基质为珍珠岩、泥炭土和生物菌肥按体积比为1-2:3-5:0.3-0.8混合的混合物；

前期培养：对成活后的脱毒苗进行施肥，每2株施肥150-170mL，氮、磷和钾的浓度分别为60-100mg/L、20-40mg/L和100-150mg/L，每周施肥一次；

后期培养：脱毒苗生长13-14周后，每2株施肥150-170mL，氮、磷和钾的浓度分别为200-220mg/L、20-40mg/L和200-250mg/L，每周施肥一次；

前期培养和后期培养过程中每月喷施一次叶面微肥，同时每月进行一次病虫防治。

2.根据权利要求1所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，步骤(1)中和步骤(2)中所用培养基为含有6-BA 0.5mg/L、KT 1.2mg/L和NAA 0.05mg/L和蔗糖16g/L的MS培养基。

3.根据权利要求1所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，生物菌肥包括以下重量份的组分：复合菌1-3份、玉米粉30-40份、麸皮10-20份、蔗糖2-4份、黄腐植酸20-30份、银杏叶5-10份、钼酸铵0.1-0.3份、硫酸锌0.05-0.08份和水8-15份。

4.根据权利要求3所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，生物菌肥包括以下重量份的组分：复合菌2份、玉米粉40份、麸皮15份、蔗糖3份、黄腐植酸28份、银杏叶6份、钼酸铵0.2份、硫酸锌0.06份和水12份。

5.根据权利要求3或4所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，复合菌包括以下重量份的组分：固氮菌1-2份、解磷菌1-2份、解钾菌1-2份、枯草芽孢杆菌2-4份。

6.根据权利要求5所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，复合菌包括以下重量份的组分：固氮菌1.2份、解磷菌1份、解钾菌1.5份、枯草芽孢杆菌3份。

7.根据权利要求3或4所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，生物菌肥通过以下方法制备得到：

将银杏叶粉碎，然后与玉米粉、麸皮和适量水混匀，然后加入复合菌，搅拌均匀，然后再加入黄腐植酸和余量水，混匀，然后置于30-35℃发酵15-20天，制得。

8.根据权利要求1所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，步骤(3)前期培养过程中每2株施肥150mL，氮、磷和钾的浓度分别为60mg/L、20mg/L和100mg/L。

9.根据权利要求1所述的生姜脱毒繁育方法，其特征在于，步骤(3)后期培养过程中每2株施肥150mL，氮、磷和钾的浓度分别为200mg/L、20mg/L和200mg/L。