WO2021077755A1 - 一种黑老虎带芽茎段的消毒方法及其快速增殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黑老虎带芽茎段外植体消毒方法，以及直接诱导无菌芽快速增殖的方法。包括外植体的选择、处理及消毒、初代培养、继代增殖培养等过程。本发明克服了黑老虎茎段组织培养初代培养难的问题。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　一种黑老虎带芽茎段的消毒方法及其快速增殖方法 技术领域

本发明属于黑老虎组织培养领域，具体涉及一种黑老虎带芽茎段外植体消毒方法及其直接诱导无菌芽快速增殖的方法。

背景技术

黑老虎(Kadsura coccinea)是木兰科南五味子属常绿藤本植物。果实为聚合果，果大独特似足球，果径10-12cm，果重600g左右，大果达1200g，幼果青绿色，成熟为深红。果肉似葡萄，肉色似荔枝，果香如苹果。色、香、味俱佳，是一个集食用、药用、绿化、观赏于一体的急待开发而又极具开发潜力的多用途的第三代新型果树。黑老虎分布于越南和中国，在中国分布于江西、湖南、广东、香港、海南、广西、四川、贵州和云南(屏边、河口、金平、蒙自、文山、思茅和景东)。生长于海拔1500-2000m的林中。能行气活血，消肿止痛，治胃病，风湿骨痛，跌打瘀痛，并为妇科常用药。黑老虎适应性强，不择土壤，粗生易长，病虫害少，成年树能耐40℃以上的高温和-20℃的严寒，无论山区、丘陵、平原均可种植。

但是目前黑老虎主要靠播种繁殖，没有优良品种的无性繁殖技术体系，限制了优良品种的推广及产业健康发展。本发明通过带芽茎段快速繁殖黑老虎优良品种能够解决苗木繁殖周期长的问题，目前，黑老虎植物组织培养的研究方面还处于起步阶段，主要是外植体消毒非常难，容易污染，无法获得无菌苗，严重限制了黑老虎无性繁殖脱毒苗的生产。在组织培养无性繁殖繁殖方面，利用黑老虎带芽茎段诱导腋芽具有培养周期短，腋芽健壮且增殖系数高等优势，有利于黑老虎的工厂化育苗。

韦荣昌等(2015)研究了扦插季节及茎段处理对黑老虎成活率的影响，结果表明5～7月份扦插成活率最高，其他季节扦插成活率低，不利于黑老虎的大量繁殖。组织培养是一条快速繁殖植物优良品种脱毒苗的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。关于黑老虎组织培养的报道有韦荣昌等(2015)利用黑老虎的幼嫩叶片诱导愈伤组织，再分化不定芽，在整个培养过程中及其复杂，从接种到增殖芽获得最快也要87d，培养周期极长，且未看到长势情况相关的图片。而本发明具有操作简单，污染率低，腋芽长势好，培养周期可缩短 到30d以内，初代诱导的腋芽数可达8.0以上(附图8)，极显著提高了黑老虎初代培养腋芽诱导难的问题。有利于黑老虎后期的生根培养及工厂化育苗。

总之，黑老虎带芽茎段在组织培养过程中存在初代培养外植体容易污染，本发明主要从黑老虎带芽茎段外植体的移栽、消毒、初代培养、继代增殖等一系列过程，短时间内高效获得大量的黑老虎无菌芽，为黑老虎的工厂化育苗及遗传体系转化提供可能。

发明内容

本发明的首要目的是针对目前黑老虎带芽茎段外植体，灭菌较难，易有内生菌发生的问题，提供一种黑老虎带芽茎段外植体的消毒方法。该消毒方法简单高效，灭菌效果好，为黑老虎的组培快繁打下坚实基础。

一种黑老虎带芽茎段外植体消毒的方法，依次包括以下步骤：

(1)材料的获得：将大田栽培的黑老虎移栽到室内，剪掉地上部分的茎段和叶片，3-5个月后用萌发的半木质化的带芽茎段做外植体材料；

(2)外植体处理：将半木质化的带芽茎段切成3-4cm长的茎段，每个茎段一个腋芽，用洗洁精清洗1-2遍，再用流水冲洗至少1h；

(3)外植体消毒：将流水冲洗之后的黑老虎半木质化的带芽茎段用75％的酒精浸泡1min，换新的75％的酒精再浸泡1min，无菌水冲洗3-4次，再用0.1％的升汞消毒45min，中间每15min换一次升汞，共换3次，最后无菌水冲洗5-6次。

进一步的，步骤(1)具体是将大田栽培2-3年生的黑老虎在1-4月份移栽到室内盆栽，剪掉地上部分的茎段和叶片，3-5个月后用萌发的半木质化的带芽茎段做试验材料。

进一步的，步骤(1)盆栽规格是高25-30cm，直径20-25cm的盆。

本发明前期经过大量实验发现直接将大田栽培的黑老虎带芽茎段作为外植体进行消毒非常的困难，尝试过各种消毒灭菌的方式，都没有成功，但意外发现将大田种植的黑老虎移栽到室内，剪掉地上部分的茎段和叶片，3-5个月后用萌发的半木质化的带芽茎段做外植体材料；再进行消毒，效果非常显著。

本发明的第二个目的是提供黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法。该方法通过带芽茎段外植体灭菌直接诱导腋芽，诱导率高，增殖效果好，初代诱导增殖系数可达8以上，为以后工厂化育苗及遗传转化提高可能性。

一种黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，包括以下步骤：

1)腋芽诱导(即初代诱导)：将消毒好的带一个腋芽的茎段，接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA的培养基中诱导腋芽，暗培养2d后转到光照条件下培养；

2)继代增殖：将茎段分化得到的健壮腋芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L IBA的培养基中进行腋芽的增殖培养。

进一步的，诱导腋芽时暗培养2d后，转到光照条件下培养30-35d；继代增殖培养是在光照条件下培养30-35d。

进一步的，培养温度为26士1℃，光照培养强度为2100-2200lx，光照培养时间12-14h/d。

进一步的，腋芽诱导的培养基优选为：1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA。

进一步的，继代增殖培养使用的培养基优选为：1/2MS+3.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L IBA。

进一步的，所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.8。

本发明优选消毒好的带一个腋芽的茎段采用本发明前述的方法进行消毒。

本发明主要针对大田黑老虎组培苗无菌腋芽无法获得，即使75％的酒精消毒3min，0.1％的升汞消毒45min也全部污染(图1)；如果消毒时间再加长，虽然污染可以控制，但所有茎段的组织就会杀死变黑，腋芽无法生长(图2)；通过大量的试验证明用大田材料很难获得无菌的腋芽(表1)，一些茎段虽然前期没有污染，但是到一个月腋芽长大后也会长出真菌污染(图3)，以上试验每次50瓶以上，共计20次，总数1000瓶以上。因此，本发明通过将大田2-3年生的黑老虎苗移栽到花盆中并剪刀地上部分后带到室内培养，以盆栽苗半木质化茎段作为外植体，通过对外植体的预处理，消毒、初代培养、继代增殖培养等方面进行探索，发现黑老虎苗移栽到花盆培养在室内显著降低了初代培养的污染率，克服了初代培养难的技术难题，成功获得了黑老虎带芽茎段组织培的无菌芽，基本控制了初代培养污染问题，为黑老虎初代培养过程中容易污染提供参考依据，而且本发明不经过愈伤组织诱导，直接由带芽茎段诱导无菌芽，显著节省了无菌芽的获得时间，且获得的无菌芽增殖系数高，质量好，形成了一套适合黑老虎试管苗无菌芽组织培养前期快繁技术体系，为黑老虎的工厂化育苗及以后基因工程改良打下了基础。

附图说明

图1为本发明黑老虎大田带芽茎段接种初期污染的照片；

图2为本发明黑老虎大田带芽茎段消毒时间久褐化的照片；

图3为本发明黑老虎大田带芽茎段培养1个月后污染的照片；

图4为本发明黑老虎大田苗移栽到实验室盆中萌发新梢的照片；

图5为本发明黑老虎盆栽苗初代培养10d的照片；

图6、图7为本发明黑老虎盆栽苗初代培养20d的照片；

图8、图9为本发明黑老虎盆栽苗初代培养30d的照片；

图10、图11、图12为本发明黑老虎盆栽苗继代增殖培养10d的照片；

图13为本发明黑老虎盆栽苗初代培养的整体照片。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

依次进行以下操作:

1.大田材料的移栽：在每年的1-4月份将大田栽培2-3年生的黑老虎移栽到高30cm，直径25cm的塑料盆中，剪掉地上部分的茎段和叶片并浇水，带到中南林业科技大学树木楼实验室楼顶温室内正常水肥管理3-5个月后，再用萌发的半木质化的带芽茎段做为本发明的试验材料。

2.外植体处理：将半木质化的带芽茎段切成3-4cm长的茎段，每个茎段一个腋芽，放在烧杯里用洗洁精清洗1-2遍，再用流水冲洗1h，冲洗掉茎段分泌粘液后备用。

3.外植体消毒处理在2018-2019年7-10月间的晴天上午，选取半木质化的黑老虎茎段，带回实验室将采集的茎段去除叶片后，用自来水冲洗1-2遍，然后用适量的洗洁***冲洗1-2遍，再用自来水反复冲洗茎段分泌的粘液60min，置于超净工作台中，用75％的酒精、0.1％的升汞溶液、5％次氯酸钠溶液消毒，设置不同时间梯度，大田直接采回材料如表1，楼顶采回材料如表2。消毒过程中用镊子不断搅动，无菌水冲洗5-6遍，用无菌滤纸吸干茎段表面的水分，用无菌刀片切掉两端褐化的部分，将单芽茎段接种到培养基中统计污染率及褐化率；

表1不同消毒处理对大田黑老虎茎段的消毒效果

表2不同消毒处理对盆栽黑老虎茎段的消毒效果

最终确认本发明优选的消毒方法如下：

(1)材料的获得：将大田移栽到室内萌发的半木质化的带芽茎段做为试验材料。

(2)外植体处理：将半木质化的带芽茎段切成3-4cm长的茎段，每个茎段一个腋芽，用洗洁精清洗2遍，再用流水冲洗1h；

(3)外植体消毒：将流水冲洗之后的黑老虎半木质化的带芽茎段用75％的酒精浸泡1min，换新的75％的酒精再浸泡1min，无菌水冲洗4次，再用0.1％的升汞消毒45min，中间每15min换一次升汞，共换3次，最后无菌水冲洗5-6次。

2.将消毒好的外植体接种到按照表3中激素配方的1/2MS培养基中进行腋芽诱导，暗培养2d，再到光照条件下培养30-35d，最高诱导率可达46.15％。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH 5.5-5.8；培养温度为26士1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图5)，初代培养就能得到增殖系数8以上。

表3不同植物生长调节剂对黑老虎茎段初代培养的影响

3.将腋芽进行继代增殖培养，将初代培养获得的腋芽切下接种在按照表4中激素配方的1/2MS培养基中进行腋芽的增殖培养，光照条件下培养30-35d，最高增殖系数为8.5。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH 5.5-5.8；培养温度为26士1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图10-12)

表4不同植物生长调节剂对盆栽黑老虎继代增殖培养的影响

Claims (10)

1. 黑老虎带芽茎段外植体消毒方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

   (1)材料的获得：将大田栽培的黑老虎移栽到室内，剪掉地上部分的茎段和叶片，3-5个月后用萌发的半木质化的带芽茎段做外植体材料；

   (2)外植体处理：将半木质化的带芽茎段切成3-4cm长的茎段，每个茎段一个腋芽，用洗洁精清洗1-2遍，再用流水冲洗至少1h；

   (3)外植体消毒：将流水冲洗之后的黑老虎半木质化的带芽茎段用75％的酒精浸泡1min，换新的75％的酒精再浸泡1min，无菌水冲洗3-4次，再用0.1％的升汞消毒45min，中间每15min换一次升汞，共换3次，最后无菌水冲洗5-6次。
2. 根据权利要求1所述黑老虎带芽茎段外植体消毒方法，其特征在于，

   步骤(1)具体是将大田栽培2-3年生的黑老虎在1-4月份移栽到室内盆栽，剪掉地上部分的茎段和叶片，3-5个月后用萌发的半木质化的带芽茎段做试验材料。
3. 根据权利要求1所述黑老虎带芽茎段外植体消毒方法，其特征在于，

   步骤(1)盆栽规格是高25-30cm，直径20-25cm的盆。
4. 一种黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，

   1)腋芽诱导：将消毒好的带一个腋芽的茎段，接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.2mg/L IAA的培养基中诱导腋芽，暗培养2d后转到光照条件下培养；

   2)继代增殖：将茎段分化得到的健壮腋芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L IBA的培养基中进行腋芽的增殖培养。
5. 根据权利要求4所述的黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，诱导腋芽时暗培养2d后，转到光照条件下培养30-35d。
6. 根据权利要求4所述的黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，培养温度为26士1℃，光照培养强度为2100-2200lx，光照培养时间12-14h/d。
7. 根据权利要求4所述的黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，腋芽诱导的培养基为：1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LIAA。
8. 根据权利要求4所述的黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，继代增殖培养使用的培养基为：1/2MS+3.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L IBA。
9. 根据权利要求4所述的黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.8。
10. 根据权利要求4-9任一项所述的黑老虎带芽茎段外植体直接诱导无菌芽快速增殖的方法，其特征在于，消毒好的带一个腋芽的茎段采用权利要求1-3任一项所述的方法进行消毒。

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