CN110183521A - 稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入稻瘟菌原生质体；利用同源重组方法将该基因MoRMD1从稻瘟菌中敲除，获得敲除突变体ΔMoRMD1；所得到的稻瘟菌敲除突变体在附着胞形成方面存在缺陷，并且MoRMD1对维持细胞壁的完整性有重要作用。致病性试验表明，MoRMD1的缺失显著降低了稻瘟菌的毒力，在水稻叶片上不能形成明显病斑。本发明证实MoRMD1是稻瘟菌附着胞形成、维持细胞壁完整性和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用。

背景技术

稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上的一种重要病害。全球每年因稻瘟病导致的水稻经济损失约660亿美元，损失的水稻可为6000万人提供食物。稻瘟菌对水稻的侵染过程主要包括：(1)分生孢子随风雨传播，并粘附在水稻叶片表面；(2)分生孢子萌发，形成芽管；(3)芽管分化形成附着胞；(4)附着胞分化形成侵染钉；(5)侵染钉穿透寄主细胞，并在寄主细胞内形成侵染菌丝，在细胞间进行扩展。其中，稻瘟菌成功侵染水稻的关键过程在于形成高度特化的侵染结构-附着胞，附着胞成熟后产生的膨压，能使侵染钉穿透水稻角质层，从而成功侵染水稻细胞。当稻瘟菌不能形成完整的附着胞时，其致病力显著减弱。

DUF结构域(a domain of unknown function)是指一类不含有已知特定功能的蛋白结构域，是未知蛋白功能结构域的统称。在Pfam数据库中，约有3000个DUF蛋白家族。在真核生物中，约含有1500个DUFs。很多DUFs具有高度保守性，推测在真菌的生物学功能中起着重要作用，但其具体功能未知。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用。

稻瘟菌中Sporulation protein RMD1为一个预测的蛋白质(Proteinpredicted)，命名为MoRMD1；经uniprotKB数据库(https://www.uniprot.org/uniprot/)分析，其含有DUF155结构域。但是，目前对于稻瘟菌MoRMD1的具体生物学功能并不清楚。经过试验表明，MoRMD1的缺失显著降低了稻瘟菌的毒力，在水稻叶片上不能形成明显病斑。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用。

进一步的，所述的稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌生长发育中的应用。

进一步的，所述的稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌附着孢形成中的应用。

进一步的，所述的稻瘟菌基因MoRMD1在维持稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。

本发明提供一种稻瘟菌基因MoRMD1在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用。

本发明提供一种稻瘟菌基因MoRMD1作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由稻瘟菌导致的稻瘟病。

本发明再提供一种治疗由稻瘟菌导致的植物稻瘟病的方法，包含阻断或抑制稻瘟菌中基因MoRMD1的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。

阻断或抑制稻瘟菌中基因MoRMD1的表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由稻瘟菌导致的植物稻瘟病。

其中，所述的稻瘟菌基因MoRMD1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、***、缺失而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物；

所述的稻瘟菌基因MoRMD1，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基***、缺失、或替换而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物；

含有上述稻瘟菌基因MoRMD1的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明通过构建基因敲除载体，将其导入稻瘟菌原生质体；利用同源重组方法将该基因MoRMD1从稻瘟菌中敲除，获得敲除突变体ΔMoRMD1；该突变体在附着胞形成方面存在缺陷。对致病性测定结果表明，敲除突变体ΔMoRMD1在水稻叶片上不能形成明显病斑。上述试验证明，稻瘟菌MoRMD1基因为稻瘟菌的致病相关基因。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的稻瘟菌基因MoRMD1含有DUF155结构域，但其在稻瘟菌的生物学功能并不清楚。试验证明，蛋白MoRMD1的编码基因MoRMD1被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(SGFP)置换后，所得到的稻瘟菌敲除突变体在附着胞形成方面存在缺陷，并且MoRMD1对维持细胞壁的完整性有重要作用。致病性试验表明，MoRMD1的缺失显著降低了稻瘟菌的毒力，在水稻叶片上不能形成明显病斑。本发明证实MoRMD1是稻瘟菌附着胞形成、维持细胞壁完整性和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是稻瘟菌MoRMD1基因敲除载体的构建示意图。

图2是部分潮霉素抗性转化子目的基因MoRMD1的PCR扩增；其中，M：Marker5000；泳道1：稻瘟菌野生型WT；泳道2-6：转化子2、12、20、197、323。

图3是部分潮霉素抗性转化子A-hph基因的PCR扩增；其中，M：Marker5000；泳道1：pCT74质粒；泳道2-6：转化子2、12、20、197、323。

图4是阳性转化子Southern blot分析(以目的基因为探针)；其中，泳道1：稻瘟菌野生型WT；泳道2-6：转化子2，12，20，197，323。

图5是阳性转化子Southern blot分析(以hph为探针)；其中，泳道1-5：转化子2，12，20，197，323。

图6是稻瘟菌敲除突变体ΔMoRMD1在YGA培养基上的菌落形态。

图7是稻瘟菌敲除突变体ΔMoRMD1与野生型的产孢量比较；注：所用产孢培养基为西红柿燕麦培养基。

图8是稻瘟菌敲除突变体ΔMoRMD1细胞壁完整性测定。

图9是稻瘟菌敲除突变体ΔMoRMD1分生孢子的萌发；其中，图中的标尺大小均为10μm。

图10是稻瘟菌敲除突变体ΔMoRMD1的致病性分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及植物

稻瘟菌小种为广东省优势小种ZC₁₃，供试水稻为籼稻品系CO39(不含已知抗稻瘟病基因)。

1.2宿主菌及质粒载体

克隆载体为pMD18-T vector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74。

2、实验方法

2.1稻瘟菌敲除载体的构建

稻瘟菌MoRMD1基因敲除载体的构建示意图如图1所示。在MoRMD1基因的上游和下游各选取长度大小约为1500bp左右的序列，并设计引物(表1)。

表1稻瘟菌MoRMD1基因同源臂A片段和同源臂B片段的扩增引物

引物名称	引物序列5′-3′	酶切位点
			MoRMD1-AF	GG<u>GGTACC</u>GAATGGACCTCGGCCTGTAT	Kpn I
MoRMD1-AR	CCG<u>CTCGAG</u>TGTTCATCGGTCGTGCGAA	Xho I
			MoRMD1-BF	CG<u>GAATTC</u>GCATGGAATATCATCAGGGCG	EcoR I
MoRMD1-BR	GC<u>TCTAGA</u>GCGCTGGATGAAGCAGAATC	Xba I

采用真菌DNA提取试剂盒法(OMEGAFungal DNAKit)提取稻瘟菌基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物MoRMD1-AF和MoRMD1-AR进行PCR扩增，获得MoRMD1基因的同源臂A片段(MoRMD1-A)；用引物MoRMD1-BF和MoRMD1-BR进行PCR扩增，获得MoRMD1基因的同源臂B片段(MoRMD1-B)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		MoRMD1-A/BF(20μmol/L)	1.0μL
MoRMD1-A/BR(20μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，67℃反应1min，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min，即获得PCR扩增产物。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.2稻瘟菌MoRMD1基因同源臂的T载体连接及转化

参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将MoRMD1-A和MoRMD1-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-MoRMD1-A和pMD18T-MoRMD1-B。具体为：取1μL pMD 18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(MoRMD1基因同源臂A或同源臂B片段)和5μL solution I，于16℃连接过夜。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃水浴中热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃、150rpm振荡培养45min；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8～12h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用Kpn I、Xho I分别对pMD18T-MoRMD1-A和pCT74载体进行双酶切，回收A片段和pCT74载体。用T4DNA连接酶将A片段与pCT74载体连接，转化大肠杆菌DH 5α；获得重组质粒pCT74-MoRMD1-A。按同样程序，用EcoR I和Xba I双酶切pMD18T-MoRMD1-B和重组质粒pCT74-MoRMD1-A，回收B片段和重组质粒。用T4DNA连接酶将B片段与pCT74-MoRMD1-A连接，转化大肠杆菌DH 5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-MoRMD1-KO。

2.3稻瘟菌原生质体的制备

将稻瘟菌接种到YPS培养基(酵母提取物6g，水解酪蛋白6g，蔗糖10g，蒸馏水定容至1L)中，于28℃、130rpm振荡培养2d；将上述培养物用200目细胞筛过滤，研碎，取适量菌丝液转移至200mL的YPS培养基中，于28℃、130rpm振荡培养1d；用200目细胞筛过滤菌丝液，菌丝用无菌水冲洗2次，0.8mol/L NaCl冲洗1次，对湿菌丝进行称重。按酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，加入适量10mg/mL溶壁酶酶液，30℃酶解3h后，用灭菌KIMTECH无尘纸过滤，收集消解液。于4℃，3500rpm离心10min；将沉淀重悬于1.5～2mL预冷的STC(含1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM CaCl₂)，于4℃，5000rpm离心10min；将沉淀重悬于1mL STC，使原生质体终浓度为1×10⁷个/mL。

2.4稻瘟菌原生质体的转化

用Kpn I和Xba I对敲除载体pCT74-MoRMD1-KO进行双酶切，获得A-hph-sgfp-B片段。将2μg的A-hph-sgfp-B片段与200μL原生质体混匀，冰浴20min；加入1mL PTC转化缓冲液(60％PEG4000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5)，室温放置20min；于4℃下3500rpm离心10min；用4mL再生液体培养基(酵母提取物6.0g，水解酪蛋白6.0g，蔗糖200.0g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养16～18h。加入40mL再生固体培养基(再生液体培养基中含1.5％琼脂粉和200μg/mL潮霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养3～4d；挑取潮霉素抗性转化子，转移到含有200μg/mL潮霉素的YGA培养基(含酵母浸膏5.0g，无水葡萄22.0g，琼脂粉17.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d。

2.5稻瘟菌敲除突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNAKit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物MoRMD1-F/MoRMD1-R进行基因片段MoRMD1的PCR扩增；用引物A-hph-F/A-hph-R进行基因片段A-hph的PCR扩增分析。

MoRMD1-F：5′-CCAATTCCAAGCGAACCGTC-3′，

MoRMD1-R：5′-ACGTCCAGTCGCTCGTTTAG-3′，

A-hph-F：5′-GCTCCTCGTCGTATCGTCTC-3′，

A-hph-R：5′-ACCGCAAGGAATCGGTCAAT-3′；

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		MoRMD1-F/A-hph-F(20μmol/L)	0.5μL
MoRMD1-R/A-hph-R(20μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，61℃反应1min，72℃反应2min，共32个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.6稻瘟菌敲除突变体的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I(RocheLOT28309220)说明书，进行Southern blot杂交。用引物MoRMD1-F/MoRMD1-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。

MoRMD1-F：5′-CCAATTCCAAGCGAACCGTC-3′，

MoRMD1-R：5′-ACGTCCAGTCGCTCGTTTAG-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

模板DNA	1.0μL
		MoRMD1-F/hph-F(20μmol/L)	1.0μL
MoRMD1-R/hph-R(20μmol/L)	1.0μL
		10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Ex Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，54℃反应1min，72℃反应2min，共32个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.7稻瘟菌敲除突变体的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将稻瘟菌野生型和敲除突变体ΔMoRMD1接种于YGA培养基(含酵母浸膏5.0g，无水葡萄22.0g，琼脂粉17.0g，蒸馏水定容至1L)上，于28℃黑暗条件下培养。分别在第2d、4d、6d、8d、10d时测量菌落直径，并观察稻瘟菌野生型与突变体的菌落形态。

(2)分生孢子的产生与萌发观察。将稻瘟菌接种至西红柿燕麦培养基(生燕麦40g，用双蒸水煮沸1h，过滤后加入150mL西红柿汁，0.06g碳酸钙，2.5％～3％琼脂粉，用双蒸水定容至1L)，置于28℃培养箱培养，24h光照7～10d。每皿加入3～5mL无菌水冲洗分生孢子，用3～5层KIMTECH无尘纸过滤，即为分生孢子悬浮液。用血球计数板进行计数，统计产孢量。将分生孢子悬浮液接种于PVDF膜上，分别于2h、4h、6h、8h、10h时取样，用显微镜观察分生孢子的萌发。

(3)细胞壁完整性测定

将稻瘟菌野生型和敲除突变体ΔMoRMD1分别接种在含有0.005％SDS、0.01％SDS、0.02％SDS和200μg/mL刚果红的YGA培养基上，于28℃培养箱倒置培养10～14d后，观察敲除突变体ΔMoRMD1和野生型菌株的菌落生长情况。

2.8稻瘟菌敲除突变体△MoRMD1的致病性分析

取4～5叶期水稻幼苗的第4或第5片叶，用稻瘟菌野生型和敲除突变体ΔMoRMD1的分生孢子悬浮液(1～5×10⁵个/mL，含0.25％吐温20)喷雾接种；于28℃黑暗条件下放置24h，再于光12h/暗12h交替培养，5～7d后观察水稻叶片的发病情况。

3结果与分析

3.1稻瘟菌MoRMD1基因敲除载体的构建

采用PCR扩增方法，分别克隆获得MoRMD1基因同源臂A和同源臂B片段；将其分别与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-MoRMD1-A和pMD18T-MoRMD1-B。将pMD18T-MoRMD1-A与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-MoRMD1-A；将其与pMD18T-MoRMD1-B进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-MoRMD1-KO(图1)。

3.2稻瘟菌敲除突变体的筛选

3.2.1基因片段MoRMD1的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除载体转化稻瘟菌原生质体，获得了215个潮霉素阳性转化子。经稻瘟菌基因组DNA的提取，利用MoRMD1基因特异性引物，对其中的68个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，有63个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这63个转化子仍含有MoRMD1基因；有5个转化子没有扩增到MoRMD1基因，初步鉴定这5个转化子为阳性转化子(图2)。

3.2.2基因片段A-hph的PCR验证

以上述5个没有扩增到MoRMD1基因的转化子基因组DNA为模板，利用A-hph特异性引物进行PCR扩增；结果表明，上述没有扩增到MoRMD1基因5个转化子，都扩增到了约1500bp的目的片段，进一步说明这5个转化子均为阳性转化子(图3)。

3.2.3敲除突变体的Southern blot验证

对没有扩增到MoRMD1基因、而扩增到A-hph基因的5个阳性转化子进行了Southernblot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，5个转化子均未有杂交条带(图4)。以hph为探针进行杂交，发现5个转化子均有单拷贝条带出现(图5)。上述试验证明这5个转化子为阳性转化子。

3.3稻瘟菌敲除突变体的菌落形态和生长速率分析

随机选取2个敲除突变体(△MoRMD1-197和△MoRMD1-323)，接种于YGA培养基中，分别在不同时间对其生长情况进行了观察。结果表明，与稻瘟菌野生型相比，敲除突变体△MoRMD1的菌落形态没有明显区别(图6)。

3.4稻瘟菌敲除突变体的产孢与分生孢子萌发观察

将敲除突变体△MoRMD1-197和△MoRMD1-323接种于西红柿燕麦培养基，培养14d后，进行产孢量分析。结果表明，稻瘟菌野生型与突变体ΔMoRMD1的产孢量无显著性差异(图7)。

3.5稻瘟菌敲除突变体的细胞壁完整性测定

将敲除突变体△MoRMD1-197和△MoRMD1-323接种于含不同浓度SDS和刚果红的YGA培养基，对其菌落形态进行了观察。结果表明，与野生型相比，ΔMoRMD1突变体对0.02％SDS和200μg/mL刚果红更敏感，说明敲除MoRMD1后，影响了稻瘟菌细胞壁的完整性(图8)。

将分生孢子接种于PVDF膜上，置于28℃培养箱培养；分别在不同时间取样进行观察。结果表明，稻瘟菌野生型分生孢子能正常产生芽管和附着孢；但敲除突变体ΔMoRMD1分生孢子萌发后不能形成完整的附着胞(8h)(图9)。

3.6稻瘟病菌敲除突变体的致病性分析

将稻瘟菌野生型与敲除突变体ΔMoRMD1分生孢子分别接种水稻离体叶片，于7d后进行观察。结果表明，稻瘟菌野生型接种后，水稻叶片上出现了明显病斑；而敲除突变体△MoRMD1接种后，水稻叶片未能形成明显病斑(图10)。该结果说明敲除MoRMD1基因后，稻瘟菌致病力明显下降。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由稻瘟菌所导致的稻瘟病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是稻瘟病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2072

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 稻瘟菌基因MoRMD1的核苷酸序列

<400> 1

atggccgaag ccgtgacgga aacctctccg ctgctatcga cggtgtcgga gccgaccact 60

accccggaat tccctcgtcc caattccaag cgaaccgtca ccttcaatcc gaaccctgtc 120

acgcgaacca tcgagcccga acgacaacct ctccgccgcc gcatttccac aaacatcgat 180

gtcgctcgcg catctgggca gaggtcgcct ggcggctcgg gtccgcccac ccccacgagc 240

tcaataagca ccggtagtct cgccggtgct ccgccaatgc tggtcgcact caactctaaa 300

cttcgccgcc gcaactccca tggaggtaca cagggttcca tgccgggctc aaacaaccta 360

ctaccagccc cgggtggtgt gggtctcgtc gccggggccg gtcacctgcc caagattggg 420

ccccagcgta gcaccaagaa ggcgcagaag ctcaagctgc ttcccacgcc tgaacttgcc 480

gacgatggtg acgatgacca agatgaggag agcggacgtg aggtctacag ccagtacacg 540

cgtatcaagg accccaatgc ccgacgagat gccgccaggc taggcaaggc cgatcgcgac 600

cgtctgccgc gcgtcacggc gtactgcacc gccaacaaat accagatgga tggcctgatg 660

cactggctga aggggagcag gagcagagca aagggagcga accccaagct cgtggacgag 720

tgcatataca cgccgtacca gtataaagac acgccaccac cgcccccagg acgtggtgcg 780

aggattcgca gagttgccag tgctcagaat gctgccgacg ctgccgagga tgccgcgagg 840

gctgcggtca acgctgatgg catcctgggg tctgaggtaa ccagtgactc accggagccg 900

atgtctaccc aacagaggag acactcgact ggtgatgtcg aggccacccc accccgattc 960

agccaggagg acctgataga tctggagcca gaggctatct ctgatgtgca agatggacga 1020

agcgaggcac gcatagagag cctcggagaa ggagaccacg cagaaatatc aagcagcccg 1080

caagaacgtg accacgagca tggtcacgac catgatcaat cccccagctc ggcagaccat 1140

cgggatgaaa tgatcagcac gcaccacgag cccatcaacg agcgacctgc cgattttgat 1200

atcgaggtac acaccccgga ggttttcctc tttgactacg gcgtggtggt gatatggggc 1260

atgacgatgg cacaggagcg gaggtttctc aaggaaattg ccaagtttga aaccgagaaa 1320

ctggcgaccg aggaggtcga gactgaacac ttcaactttt actacacccg cgagtatcag 1380

cccaggatat acaacgactt tatcaccctc cgtgacaagc acaactacat gaccaagctg 1440

gccatttcac atgcgctggc acagagtgtc aaggttagta ctctcactct ttggctgttt 1500

tgccatgcgt tctatttcgg tgggcacttc taacacgaac tagacgtctc ttttcgagga 1560

gctcatcgcc tctaccgtcg acacgtgcaa ggacattccg acgcagattg ctttgaccgg 1620

caagatcaat cttagcagga cacagatcaa catgcagatc ggcgagcttt tcattctgag 1680

gatcagtatt cacctcaacg gctccgtcct tgacacgcca gagcttttct gggtcgagcc 1740

tcaactcgag ccgctgtacg ccgctgtgcg gtcctaccta gagatggacc agcgagttgg 1800

cctgctaaac gagcgactgg acgtcattgc ggacttgctt gctgtgctca aagaccaact 1860

gagtcatggt catggtgaga aactcgagtg gattggtaag tttgcttcca ttctttcgcg 1920

cgcccagtcc cttgcgcctt tgaacttgtt ctatggtatc atgaatactg accagcatcc 1980

tttgggttta cacagttatt gtattgattg cagccgaaat ccttgttgct gctgttaaca 2040

tagttgtaga tttatatgcg ggcgtcgact ag 2072

<210> 2

<211> 633

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 稻瘟菌基因MoRMD1的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Glu Ala Val Thr Glu Thr Ser Pro Leu Leu Ser Thr Val Ser

1 5 10 15

Glu Pro Thr Thr Thr Pro Glu Phe Pro Arg Pro Asn Ser Lys Arg Thr

20 25 30

Val Thr Phe Asn Pro Asn Pro Val Thr Arg Thr Ile Glu Pro Glu Arg

35 40 45

Gln Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Thr Asn Ile Asp Val Ala Arg Ala

50 55 60

Ser Gly Gln Arg Ser Pro Gly Gly Ser Gly Pro Pro Thr Pro Thr Ser

65 70 75 80

Ser Ile Ser Thr Gly Ser Leu Ala Gly Ala Pro Pro Met Leu Val Ala

85 90 95

Leu Asn Ser Lys Leu Arg Arg Arg Asn Ser His Gly Gly Thr Gln Gly

100 105 110

Ser Met Pro Gly Ser Asn Asn Leu Leu Pro Ala Pro Gly Gly Val Gly

115 120 125

Leu Val Ala Gly Ala Gly His Leu Pro Lys Ile Gly Pro Gln Arg Ser

130 135 140

Thr Lys Lys Ala Gln Lys Leu Lys Leu Leu Pro Thr Pro Glu Leu Ala

145 150 155 160

Asp Asp Gly Asp Asp Asp Gln Asp Glu Glu Ser Gly Arg Glu Val Tyr

165 170 175

Ser Gln Tyr Thr Arg Ile Lys Asp Pro Asn Ala Arg Arg Asp Ala Ala

180 185 190

Arg Leu Gly Lys Ala Asp Arg Asp Arg Leu Pro Arg Val Thr Ala Tyr

195 200 205

Cys Thr Ala Asn Lys Tyr Gln Met Asp Gly Leu Met His Trp Leu Lys

210 215 220

Gly Ser Arg Ser Arg Ala Lys Gly Ala Asn Pro Lys Leu Val Asp Glu

225 230 235 240

Cys Ile Tyr Thr Pro Tyr Gln Tyr Lys Asp Thr Pro Pro Pro Pro Pro

245 250 255

Gly Arg Gly Ala Arg Ile Arg Arg Val Ala Ser Ala Gln Asn Ala Ala

260 265 270

Asp Ala Ala Glu Asp Ala Ala Arg Ala Ala Val Asn Ala Asp Gly Ile

275 280 285

Leu Gly Ser Glu Val Thr Ser Asp Ser Pro Glu Pro Met Ser Thr Gln

290 295 300

Gln Arg Arg His Ser Thr Gly Asp Val Glu Ala Thr Pro Pro Arg Phe

305 310 315 320

Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asp Leu Glu Pro Glu Ala Ile Ser Asp Val

325 330 335

Gln Asp Gly Arg Ser Glu Ala Arg Ile Glu Ser Leu Gly Glu Gly Asp

340 345 350

His Ala Glu Ile Ser Ser Ser Pro Gln Glu Arg Asp His Glu His Gly

355 360 365

His Asp His Asp Gln Ser Pro Ser Ser Ala Asp His Arg Asp Glu Met

370 375 380

Ile Ser Thr His His Glu Pro Ile Asn Glu Arg Pro Ala Asp Phe Asp

385 390 395 400

Ile Glu Val His Thr Pro Glu Val Phe Leu Phe Asp Tyr Gly Val Val

405 410 415

Val Ile Trp Gly Met Thr Met Ala Gln Glu Arg Arg Phe Leu Lys Glu

420 425 430

Ile Ala Lys Phe Glu Thr Glu Lys Leu Ala Thr Glu Glu Val Glu Thr

435 440 445

Glu His Phe Asn Phe Tyr Tyr Thr Arg Glu Tyr Gln Pro Arg Ile Tyr

450 455 460

Asn Asp Phe Ile Thr Leu Arg Asp Lys His Asn Tyr Met Thr Lys Leu

465 470 475 480

Ala Ile Ser His Ala Leu Ala Gln Ser Val Lys Thr Ser Leu Phe Glu

485 490 495

Glu Leu Ile Ala Ser Thr Val Asp Thr Cys Lys Asp Ile Pro Thr Gln

500 505 510

Ile Ala Leu Thr Gly Lys Ile Asn Leu Ser Arg Thr Gln Ile Asn Met

515 520 525

Gln Ile Gly Glu Leu Phe Ile Leu Arg Ile Ser Ile His Leu Asn Gly

530 535 540

Ser Val Leu Asp Thr Pro Glu Leu Phe Trp Val Glu Pro Gln Leu Glu

545 550 555 560

Pro Leu Tyr Ala Ala Val Arg Ser Tyr Leu Glu Met Asp Gln Arg Val

565 570 575

Gly Leu Leu Asn Glu Arg Leu Asp Val Ile Ala Asp Leu Leu Ala Val

580 585 590

Leu Lys Asp Gln Leu Ser His Gly His Gly Glu Lys Leu Glu Trp Ile

595 600 605

Val Ile Val Leu Ile Ala Ala Glu Ile Leu Val Ala Ala Val Asn Ile

610 615 620

Val Val Asp Leu Tyr Ala Gly Val Asp

625 630

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoRMD1-AF

<400> 3

ggggtaccga atggacctcg gcctgtat 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoRMD1-AR

<400> 4

ccgctcgagt gttcatcggt cgtgcgaa 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoRMD1-BF

<400> 5

cggaattcgc atggaatatc atcagggcg 29

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoRMD1-BR

<400> 6

gctctagagc gctggatgaa gcagaatc 28

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoRMD1-F

<400> 7

ccaattccaa gcgaaccgtc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoRMD1-R

<400> 8

acgtccagtc gctcgtttag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> A-hph-F

<400> 9

gctcctcgtc gtatcgtctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> A-hph-R

<400> 10

accgcaagga atcggtcaat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-F

<400> 11

tgctgctcca tacaagccaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-R

<400> 12

gacattgggg agttcagcga 20

Claims (10)

1.稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟菌基因MoRMD1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、***、缺失而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物。

2.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于：

所述的稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌生长发育中的应用。

3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于：

所述的稻瘟菌基因MoRMD1在调控稻瘟菌附着孢形成中的应用。

4.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于：

所述的稻瘟菌基因MoRMD1在维持稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。

5.权利要求1所述的稻瘟菌基因MoRMD1在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用。

6.权利要求1所述的稻瘟菌基因MoRMD1作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，其特征在于：所述的植物病害是由稻瘟菌导致的稻瘟病。

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的应用，其特征在于：

所述的稻瘟菌基因MoRMD1，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基***、缺失、或替换而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物。

8.一种治疗由稻瘟菌导致的植物稻瘟病的方法，其特征在于：包含阻断或抑制权利要求1所述的稻瘟菌基因MoRMD1的表达。

9.阻断或抑制权利要求1所述稻瘟菌基因MoRMD1的表达的药剂在制备药物中的应用，其特征在于：

所述的药剂是权利要求1所述稻瘟菌基因MoRMD1的反义RNA或siRNA，所述药物用于控制由稻瘟菌导致的植物稻瘟病。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的稻瘟菌基因MoRMD1，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基***、缺失、或替换而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物。