CN109456985A

CN109456985A - 一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcMBF1及其应用

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Publication number: CN109456985A
Application number: CN201811560757.0A
Authority: CN
Inventors: 秦庆明; 刘月; 李桂华; 刘建康; 张莹莹; 王园元; 张明哲
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109456985B

Abstract

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcMBF1及其应用属微生物基因工程技术领域，本发明提供的来自灰霉病菌的控制菌丝分枝和致病性的基因BcMBF1，其DNA序列如SEQ ID No:1所示，由1398个核苷酸组成；提供的BcMBF1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，由465个氨基酸组成；BcMBF1基因可在植物抗灰霉病基因工程领域中应用；通过对灰霉病菌的控制菌丝分枝和致病性的蛋白质BcMbf1进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗灰霉病菌药剂中应用。

Description

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcMBF1及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的新基因的发现及其编码蛋白质的应用。

背景技术

灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门(Ascomycota)真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染1400多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表现为“V”形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20℃-23℃，相对湿度90％以上时发生严重。因此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。

灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等，这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然条件下，灰霉病菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。

当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形成的附着胞侵入；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子，不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。

MBF1是一个灰霉病菌特有的功能未知基因，在其他物种中尚未发现其同源基因。通过分析灰霉病菌MBF1基因的致病功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀灰霉病菌药剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种控制菌丝分枝及致病性的基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的控制菌丝分枝及致病性的基因来源于灰霉病菌，名称为BcMBF1，其DNA序列如SEQ ID No:1所示。该DNA序列为BcMBF1基因的开放阅读框，由1398个核苷酸组成，其中无内含子序列。

本发明提供了BcMBF1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，该序列由465个氨基酸组成。

来自灰霉病菌的控制菌丝分枝及致病性的基因BcMBF1可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。

对来自灰霉病菌的控制菌丝分枝及致病性的基因BcMBF1所编码的蛋白质进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗灰霉病菌药剂中应用。

本发明证明了BcMBF1基因的缺失或突变，导致灰霉病菌致病力显著降低，说明BcMBF1基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂，即本发明所提供的BcMBF1基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗灰霉病菌药剂的设计和筛选。

附图说明

图1为BcMBF1蛋白质的结构域预测示意图

其中：未发现保守的功能结构域；存在跨膜区(图中箭头所示)，预测为跨膜蛋白；

图2为灰霉病菌BcMBF1基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图

其中：B05.10为灰霉病菌野生型菌株，pMFB1-KO为敲除载体，ΔBcmbf1为BcMBF1基因的缺失突变体；引物P1、P2与P5、P6分别用于扩增BcMBF1基因的上下游序列，用作敲除载体的同源臂；引物P3、P4、P7、P8用于验证突变体及互补菌株；

图3为BcMBF1基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图

其中：P7、P8、P3、P4为所用引物，相应结合位置见图2；M1、M2为BcMBF1基因缺失突变体；ΔBcmbf1-C为在突变体M1基础上转入完整BcMBF1基因的互补菌株；

图4为BcMBF1基因的缺失突变体与野生型菌株B05.10及互补菌株ΔBcmbf1-C的培养特征对比照片

其中：所用培养基为PDA，20℃培养，接种后3天观察拍照；WT为灰霉病菌野生型菌株B05.10，其它菌株编号含义如上所述。

图5为BcMBF1基因的缺失突变体与野生型菌株B05.10及互补菌株ΔBcmbf1-C孢子生长的微观对比图片

其中：所用孢子为相应菌株接种于PDA培养基上培养10-15d所产孢子，以1/2PDB培养基接种于载玻片上，接种8h、10h、14h后评价。

图6为BcMBF1基因的缺失突变体与对照菌株的菌丝分枝情况的定量分析图

其中：接种方法同上，接种8h、10h、14h后进行测量统计，换算成相对大小。***表示在p<0.001水平上差异显著。

图7为BcMBF1基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的致病力比较照片

其中：所选择寄主为菜豆，采用离体叶片接种孢子的方法。接种48h、72h后进行评价；

图8为BcMBF1基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意图

其中：接种方法同上，接种48h、72h后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大小。***表示在p<0.001水平上差异显著。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1BcMBF1基因的相关性分析

基因BcMBF1是本研发团队通过分析T-DNA标记的灰霉病菌致病缺陷突变体而鉴定的一个基因。灰霉病菌BcMBF1基因的开放阅读框由1398个核苷酸组成，无内含子。编码的蛋白质产物由465个氨基酸组成，结构域分析发现，BcMbf1蛋白质未检测到保守的功能域，为功能未知蛋白；序列中含一个跨膜区，预测为跨膜蛋白(见图1)。

实施例2BcMBF1基因的敲除

1)敲除载体的构建

采用引物P1(5'-ACTAGTCTGTGCCTCGTGGTGAAGAT-3')与P2(5'-GGTACCTGATGGCAATCCGTTGAAGT-3')，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增BcMBF1基因上游604bp片段，采用P5(5'-GTCGACATGGGTGGTTTATTCTATTTGC-3')与P6(5'-CTGCAGGAGTGGATGGCTCGTGAAG-3')扩增灰霉病菌BcMBF1基因下游655bp片段，反应体系为：10mmol/L dNTP Mixture，0.5μL；10×PCR buffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH₂O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟，然后(1)94℃，变性50秒；(2)58℃，退火50秒；(3)72℃，延伸60秒；(4)循环30次；(5)72℃延伸10分钟。将上述两段DNA扩增产物分别克隆至pXEH载体的Spe I、Kpn I位点与Sal I、Pst I位点，构建成敲除载体pMBF1-KO(见图2)，并进行测序验证。

本发明所使用的灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌株B05.10，购买自美国真菌遗传材料保藏中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)，其他人员如需要该菌株，可从该保藏中心购买获得，相关保藏信息如下：

菌株编号：FGSC 10317。

保藏中心地址：Fungal Genetics Stock Center，Department of PlantPathology，Kansas State University，4024Throckmorton Plant Sciences Center，Manhattan,KS 66506USA。

网址：http://www.fgsc.net/scripts/StrainSearchReturnPage.asp？OrgID＝ 23812。

2)灰霉病菌的转化

a.农杆菌的培养

挑取含有双元载体pMBF1-KO的根癌农杆菌菌株Agl-1单菌落，接种至含50μg/ml卡那霉素、10μg/ml利福平的MM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％)中，250rpm、28℃振荡培养48h；4000rpm，离心5分钟，弃上清，IM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％，200μM AS，MES0.854％，甘油0.5％)重悬，4000rpm离心5分钟，弃上清；IM培养基重悬，28℃，250rpm振荡培养6h，进行预诱导。

b.灰霉病菌的产孢培养

选用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖2％，琼脂1.5％)，置28℃培养8h令孢子快速萌发，然后转移至20℃培养3-5天，待菌体表面被灰色孢子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节孢子浓度为1×10⁶/mL。

c.根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养及转化子筛选

将在IM液体培养基中预先诱导6h的农杆菌菌液和灰霉病菌孢子液等体积混合，加入AS，使终浓度达到500μM，混匀，然后按250～350μL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的IM培养基上，22℃黑暗培养48h；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基上，相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上。

3)缺失突变体的验证

选用两对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的，确定为BcMBF1基因缺失突变体：上游同源臂之外基因组上的引物

P7(5'-AGGGACATCGGTTTCAGCAC-3')与潮霉素抗性基因的引物

P8(5'-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA-3')配对可以扩增到预期大小(1.3kb)的重组片段；而编码区引物P3(5'-CGCAACTCTGATGATGTGGA-3')与

P4(5'-GAGCGTGTAATAAATGGAAGCA-3')无扩增条带(野生型菌株可扩增到0.8kb片段)。结果，从转化子中筛选到2株BcMBF1基因缺失突变体：M1、M2用于后续功能分析(见图3)。

实施例3BcMBF1基因缺失突变体的遗传互补

采用引物C-F(5'-AAAGATCAAAGGATCGAATTCAGAAAGAGGCGATTGTGAAGT-3')与C-R(5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCATATGTTAGCGAACGAAGCAG-3')，扩增灰霉病菌BcMBF1基因全长3208bp(包含启动子、开放阅读框与终止子)，先克隆至pMD18-t载体上，然后再亚克隆至pXEB载体(含有草铵膦抗性基因)的EcoR I位点，构建成遗传互补载体pMBF1-ko-c。载体经测序验证，确认没有氨基酸突变。采用如前所述的农杆菌介导的转化方法，使用200μg/mL草铵膦进行筛选，将该互补片段转入BcMBF1基因缺失突变体M1基因组中，获得遗传互补菌株ΔBcmbf1-C。选用突变体验证时曾使用的引物P7与P8、P3与P4进行PCR扩增，结果符合预期(见图3)：与突变体M1、M2相同，互补菌株ΔBcmbf1-C中原有的BcMBF1基因被替换为潮霉素抗性基因HPH(引P7与P8扩增结果为阳性)，但额外拥有一个后续转入的BcMBF1基因(编码区引物P3与P4扩增结果同样为阳性)。

实施例4BcMBF1基因在灰霉病菌的菌丝生长过程中的作用

采用平板培养法，评价BcMBF1突变体的菌丝生长等相关表型的变异情况。取10μL待测菌株PDB孢子悬浮液(1×10⁶ml^-1)接种在PDA培养基的中心，20℃黑暗培养。三天后观察发现，突变体的菌落形态基本正常，菌落大小与野生型、互补菌株无显著差别，表明BcMBF1不是灰霉病菌菌丝延伸生长所必需的基因(见图4)。显微观察发现，随着培养时间的延长，野生型菌株的分生孢子萌发后，菌丝分枝开始增多，而突变体的分枝能力显著下降(见图5)；孢子培养14h后，突变体的菌丝分枝能力只有野生型的50％左右(见图6)。互补菌株菌丝的分枝能力可恢复到野生型水平(见图5、图6)，上述结果表明，该基因在灰霉病菌菌丝的分枝过程中发挥重要作用。因此，我们将其命名为BcMBF1(B.cinerea mycelial branching-related factor 1)。

实施例5BcMBF1基因在灰霉病菌致病性方面的作用

采用离体叶片接种法，评价BcMBF1突变体的致病力变化情况。从温室培养的菜豆植株上采集成熟叶片，水平放置容器中，取15μL待测菌株PDB孢子悬浮液(1×10⁵ml^-1)点接在叶面上，20℃保湿黑暗培养，分别在48h、72h评价待测菌株的致病力。实验结果显示，BcMBF1突变体相对于野生型发病明显迟缓，虽然仍然形成病斑，但病斑面积明显小于野生型，难以扩展，而互补菌株的致病能力基本恢复到野生型水平(见图7)。对叶片病斑面积进行测量计算，发现48h时，野生型已经形成病斑，BcMBF1突变体未发病，72h时突变体发病，但其侵染引起的病斑面积只有野生型的30％左右(见图8)。该研究结果表明，BcMBF1参与了灰霉病菌对植物的致病过程，是灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果该基因或其编码的蛋白质丧失活性，灰霉病菌侵染寄主引发病害的能力将严重受损。

序列表

SEQ ID No:1的序列

（i）序列特征：（A）长度：1398 bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链

（ii）分子类型：DNA

（iii）序列描述：SEQ ID No:1

1 ATGCCCACCA AAAACCTTCG AGAGATCGAG CCCAAACGCA AGGGACGAGC CCCAAGCGCA

61 AGTGCAAGTG AGTCTGATTC TAGTTCAGAT GACGGCAAAC AAACAGACCC TGTTGGCTCC

121 GGCGGCTCAT CGCTTGAAGG CTCTCACGCA ACTCTGATGA TGTGGATAGG ACTCCTTCTG

181 CTGATTTTGT TTCTGAATTG GGCATATATG ATACCCTATA TGACCCGATG GGTCCATCAT

241 GAGAAACTAC TCAGAAGTGG TTACAATGTC AAACTCATCA CCCCAAGTTG TGTATCTGCA

301 ATTCCGTTGT TATACAAGGA TATCACGTAC AACGCAACCA AAAAGGAAGG AGACATATTT

361 CGGGGACGAT TGGATACATT TCCAGGCAAC ACGCTTTTGA CTTTCAACAG GTACATTAAT

421 GAGATGCCAG ACTACCCGCA AGGCCGCCAA TTCCCGAAAC TATTTGAGGA TGTACAAGCT

481 GATGCTGACG AGATATATCA TGAATATATG GCATATTATG ATCTGGTTCG CCGACACACG

541 GAAGATGCAA TGCTACTCAC AAATGCCGTG ATAGAGGATT TGAACGAACT TATTTCTGAT

601 GTTGGACTCG TCAAAACTTC AAATTTCAAA AAACGGATAA TCAACCGCTT CTATTGGAGA

661 TATCTTTCCA AGAAGCCGAT AAGATCAAGA CTGATTAGAC AAATATTCAT TGAATATCTG

721 AAAGGGTTAC AAAAAGGATA TGTGCTACCG CAGTCAAATT CCCATCTGAA AAAATCCGTG

781 GGGTTACATG AAGTCATCGA GACAGGCAAT GAATTGTTGC CCAAGTTTGA AGAGGTCAAA

841 GATGCAAGTC GAGCGCTACG ATTCACTGTA GAGTTTGGCA TTTACAAAGT CTTGACAGAT

901 CAGAATTTGA CAAATCCTGC ATTTGTACCT CGCTCAGAGA TTTTAAGAAT GCTTCCATTT

961 ATTACACGCT CAAACAGCAG AGCTGGAAGA GGACATGACA ATGATACAAT CGGTTATATG

1021 ACCTATTGGC TCGATAATGA ATTTGCGGCC GGTGAAAATG TGCGTGAAGT GGAGATGCCC

1081 AACTCAGTCC GCCAATTTCA GCAAGCACTA GTCGACATTA CGAAACAGGT TTCAGAACTC

1141 GTTTATGATT TTTCGGATGA GAAGAATGGA ATTCAGGAGC TTTCATCGAC TGTATGTTAC

1201 ATTGATAAAT TAGAAAAAGC ACTCAGAGAT CTGGCCTTTC ATCATAACTT CGATTCAATA

1261 TTCCCAGGTC ACCCAAATCG TCCGAGAGCA ATTTGGAAGG TTCATAAATG TATTTGGGAA

1321 CGAGAAAATA GGGGATCCTT GAAAGAAACG ACTCATTGTG GCAAGCTTGA GGCGTTGATA

1381 AAGGAAAAGG TGTATTGA

SEQ ID No:2的序列

（i）序列特征：（A）长度：465个氨基酸；(B)类型：氨基酸；（C）链性：单链

（ii）分子类型：多肽

（iii）序列描述：SEQ ID No:2

1 MPTKNLREIE PKRKGRAPSA SASESDSSSD DGKQTDPVGS GGSSLEGSHA TLMMWIGLLL

61 LILFLNWAYM

IPYMTRWVHH EKLLRSGYNV KLITPSCVSA IPLLYKDITY NATKKEGDIF

121 RGRLDTFPGN TLLTFNRYIN

EMPDYPQGRQ FPKLFEDVQA DADEIYHEYM AYYDLVRRHT

181 EDAMLLTNAV IEDLNELISD VGLVKTSNFK KRIINRFYWR YLSKKPIRSR LIRQIFIEYL

241 KGLQKGYVLP QSNSHLKKSV GLHEVIETGN ELLPKFEEVK DASRALRFTV EFGIYKVLTD

301 QNLTNPAFVP RSEILRMLPF ITRSNSRAGR GHDNDTIGYM TYWLDNEFAA GENVREVEMP

361 NSVRQFQQAL VDITKQVSEL VYDFSDEKNG IQELSSTVCY IDKLEKALRD LAFHHNFDSI

421 FPGHPNRPRA IWKVHKCIWE RENRGSLKET THCGKLEALI KEKVY

Claims

1.一种来自灰霉病菌(Botrytis cinerea)的控制菌丝分枝和致病性的基因BcMBF1在植物抗灰霉病基因工程领域中的应用，所述BcMBF1基因的DNA序列如SEQ ID No:1所示。