CN113201054B

CN113201054B - 蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

Info

Publication number: CN113201054B
Application number: CN202110556494.1A
Authority: CN
Inventors: 聂燕芳; 李云锋; 刘春奇; 赵雅丽; 李华平
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113201054A

Abstract

本发明公开一种蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体△Foupe1；试验证明，与Foc4相比，△Foupe1菌落生长速率下降且产孢量显著降低，对氧化胁迫耐受性下降；致病性试验表明，FoUPE1的缺失使Foc4的致病力显著降低；将该基因回补后，其致病力得到恢复。本发明证实FoUPE1是香蕉枯萎病菌分生孢子产生、应对氧化胁迫和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌未知蛋白(Uncharacterized protein)FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)引起的一种土传性真菌流行病害，该病在我国几乎所有的香蕉主产区均有发生，成为制约我国香蕉产业发展的最重要因素之一。Foc可分为3个小种，其中以4号小种(Foc4)危害最为严重，几乎能危害目前所有的栽培品种。充分挖掘香蕉枯萎病菌致病相关基因并开展其功能研究，有助于全面了解香蕉枯萎病菌的致病分子机理，并为香蕉枯萎病的防控提供理论基础。

FoUPE1(Uncharacterized protein)是一个未知蛋白，不含已知结构域，在镰刀菌(Fusarium)中具有高度保守性。关于FoUPE1在香蕉枯萎病菌中的具体功能尚不清楚。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明的目的是公开一种香蕉枯萎病菌基因FoUPE1及其编码蛋白FoUPE1的新功能。基因FoUPE1为SEQ ID NO：1中第1位至第2733位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白FoUPE1为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体△Foupe1；通过构建基因回补载体，将其导入△Foupe1原生质体；利用随机***的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体△Foupe1-com。该基因的敲除突变体在分生孢子产生和应对氧化胁迫存在缺陷，并且菌落直径减小。致病性测定表明，敲除突变体△Foupe1致病性显著降低；回补突变体△Foupe1-com的致病性则恢复到Foc4水平。上述试验证明，香蕉枯萎病菌FoUPE1为香蕉枯萎病菌的致病相关基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

进一步的，所述的蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌生长发育中的应用。

进一步的，所述的蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌产孢量中的应用。

进一步的，所述的蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌抗胁迫中的应用。

优选的，所述的胁迫为氧化胁迫。

本发明提供一种蛋白FoUPE1在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用，所述的防治是通过阻断或抑制编码蛋白FoUPE1的基因的表达来实现的。

本发明提供一种蛋白FoUPE1作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含阻断或抑制香蕉枯萎病菌中编码蛋白FoUPE1的基因的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。

阻断或抑制香蕉枯萎病菌中编码蛋白FoUPE1的基因的表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

其中，所述的蛋白FoUPE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、***、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

编码蛋白FoUPE1的基因，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基***、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。

含有上述编码蛋白FoUPE1的基因的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了有一个香蕉枯萎病菌4号小种(Foc4)未表征蛋白FoUPE1(Uncharacterized protein)及其编码基因FoUPE1的新功能。所述基因FoUPE1为SEQ IDNO：1中第1位至第2733位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白FoUPE1为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；FoUPE1蛋白不含有已知结构域，Uniprot分析其亚细胞定位未知，其在香蕉枯萎病菌的生物学功能并不清楚。将潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(SGFP)置换FoUPE1编码基因FoUPE1，得到Foc4敲除突变体△Foupe1；试验证明，与Foc4相比，△Foupe1菌落生长速率下降且产孢量显著降低，对氧化胁迫耐受性下降；致病性试验表明，FoUPE1的缺失使Foc4的致病力显著降低；将该基因回补后，其致病力得到恢复。本发明证实FoUPE1是香蕉枯萎病菌分生孢子产生、应对氧化胁迫和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是香蕉枯萎病菌基因FoUPE1敲除载体的构建示意图。

图2是部分候选敲除转化子hph基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：2000DNA Marker；泳道1：pCT74质粒；泳道2：无菌水；泳道3-6：转化子71、76、113、117。

图3是部分候选敲除转化子目的基因FoUPE1的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：5000DNA Marker；泳道1：Foc4；泳道2：无菌水；泳道3-6：转化子71、76、113、117。

图4是以FoUPE1片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：Foc4；泳道2-4：转化子71、76、113。

图5是以hph片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：Foc4；泳道2-4：转化子71、76、113。

图6是香蕉枯萎病菌基因FoUPE1回补载体示意图。

图7是部分候选回补转化子FoUPE1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；M：5000DNAMarker；泳道1：Foc4；泳道2：无菌水；3-6：回补转化子2、7、10、21。

图8是敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com对不同胁迫条件的分析；其中，A：菌落直径；B：菌落生长抑制率。

图9是敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com的致病性分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及植物

供试菌株为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)，供试植物为具有4～5片叶的巴西蕉(Cavendish，AAA)。

1.2宿主菌及质粒载体

宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株。克隆载体为pMD18-Tvector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)。

2、实验方法

2.1香蕉枯萎病菌FoUPE1基因上下游同源片段的扩增

香蕉枯萎病菌FoUPE1基因敲除载体的构建如图1所示。分别选取FoUPE1基因的上游和下游长度大小约为1000bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段)，并设计引物(表1)。

表1 FoUPE1基因同源臂A片段和B片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			FoUPE1-AF	GG<u>GGTACC</u>GGTGCGACGGGTCCATT	KpnI
FoUPE1-AR	CCG<u>CTCGAG</u>ATGTCTCCGTCTGTTAGCAAGT	XhoI
			FoUPE1-BF	TCCC<u>CCCGGG</u>CTGATGACGATTCTCGGGCT	XmaI
FoUPE1-BR	GC<u>TCTAGA</u>ACCTGATCGCCAACTATTCTTTAC	XbaI

按照OMEGA公司的柱式真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)的说明书提取Foc4基因组DNA；以Foc4基因组DNA为模板，用引物FoUPE1-AF和FoUPE1-AR进行PCR扩增，获得FoUPE1基因的同源臂A片段(FoUPE1-A)；用引物FoUPE1-BF和FoUPE1-BR进行PCR扩增，获得FoUPE1基因的同源臂B片段(FoUPE1-B)。

PCR反应体系为：

2×TSINGKE Master Mix	12.5μL
		模板DNA	0.5μL
FoUPE1-AF/BF(10μmol/L)	0.5μL
		FoUPE1-AR/BR(10μmol/L)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	11.0μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min。使用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.2FoUPE1基因敲除载体的构建

参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将FoUPE1-A和FoUPE1-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoUPE1-A和pMD18T-FoUPE1-B。具体为：取1μL pMD18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μLsolution I，于16℃下连接3～4h。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃下水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃下150rpm培养1h；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8～12h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用KpnI和XhoI分别对pMD18T-FoUPE1-A和pCT74载体进行双酶切，回收A片段和pCT74载体。用T₄ DNA连接酶将A片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；获得重组质粒pCT74-FoUPE1-A。按同样程序，用XmaI和XbaI分别对pMD18T-FoUPE1-B和重组质粒pCT74-FoUPE1-A进行双酶切，回收B片段和重组质粒。用T₄ DNA连接酶将B片段与pCT74-FoUPE1-A连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoUPE1-KO。

2.3 FoUPE1回补片段的扩增

香蕉枯萎病菌FoUPE1基因回补载体的构建如图6所示。选取FoUPE1基因的上游长度为1500bp的启动子序列，下游长度为500bp的终止子序列，并设计引物(表2)。

表2 FoUPE1基因回补片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			FoUPE1-com-F	G<u>ACTAGT</u>TGCATAGTGATGAGAAAGTCCAA	SpeI
FoUPE1-com-R	ATAAGAAT<u>GCGGCCGC</u>AAGTCAAAGAGTGGTGAGCACAT	NotI

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoUPE1-com-F和FoUPE1-com-R进行PCR扩增，获得FoUPE1基因的回补片段(FoUPE1-com)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		FoUPE1-com-F(10μmol/L)	1.0μL
FoUPE1-com-R(10μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		ExTaq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，60℃反应1min，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.4FoUPE1基因回补载体的构建

用SpeI和NotI分别对FoUPE1-com和pCTZN载体进行双酶切，回收FoUPE1-com片段和pCTZN载体。用T₄ DNA连接酶将FoUPE1-com片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；获得重组质粒pCTZN-FoUPE1-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoUPE1-com。

2.5Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到查氏培养基(FeSO₄·7H₂O 0.018g，KCl 0.5g，K₂HPO₄·3H₂O1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaNO₃ 3g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L)中，于28℃下150rpm培养3d，经200目细胞筛过滤后，获得分生孢子液，于4℃下10000×g离心10min，弃上清，获得浓缩的分生孢子液，加入CM培养基(葡萄糖10.0g，蛋白胨2.0g，水解酪蛋白1.0g，酵母浸粉1.0g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，定容至1L，调节pH至6.5，其中，20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分在“201710903818.8、一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用”中公开)，使分生孢子液终浓度为1×10⁶个/mL；于28℃下120rpm培养11～12h，用100目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下4000×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×10⁷个/mL。

香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤制备得到。

2.6Foc4敲除突变体原生质体的转化

用NotI对敲除载体pCT74-FoUPE1-KO进行单酶切，获得敲除载体线性化片段。将200μL Foc4原生质体置于冰上解冻后加入约5μg的敲除载体线性化片段，轻弹混合均匀，冰上静置20min；或者，将pCTZN-FoUPE1-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；逐滴加入1mL PTC(40％PEG-4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/LTris-HCl，pH7.5)，混匀后冰上放置15min；加入15mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去上清，留下5mL混合液，加入3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃下100rpm震荡培养16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素或200μg/mL博来霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素(或博来霉素)抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素(或200μg/mL博来霉素)的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养2～3d，挑取单菌落用于鉴定。

2.7Foc4敲除突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物hph-F/hph-R进行hph基因片段的PCR扩增；用引物FoUPE1-F/FoUPE1-R进行FoUPE1基因片段的PCR扩增分析。

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

FoUPE1-F：5′-AGACCAACAACTAGGCAATCCTTT-3′，

FoUPE1-R：5′-GTCTTGGGCCGGTACTGGTT-3′，

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		FoUPE1-F/hph-F(10μmol/L)	0.5μL
FoUPE1-R/hph-R(10μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.8FoUPE1回补突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGAFungal DNA Kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoUPE1-F/FoUPE1-R进行基因片段FoUPE1的PCR扩增。

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		FoUPE1-F(10μmol/L)	0.5μL
FoUPE1-R(10μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

2.9Foc4敲除突变体的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern blot杂交。用引物FoUPE1 probe-F/FoUPE1 probe-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。

FoUPE1 probe-F：5′-CCACCCTAGAAATCGCTCGT-3′，

FoUPE1 probe-R：5′-GATCTTAGCGGTCTCAGCGT-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

模板DNA	1.0μL
		FoUPE1 probe-F/hph-F(20μmol/L)	1.0μL
FoUPE1 probe-R/hph-R(20μmol/L)	1.0μL
		10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Ex Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

2.10Foc4敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4、△Foupe1和△Foupe1-com分别接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。在5d时采用十字交叉法测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。

(2)分生孢子的获得。将香蕉枯萎病菌接种至查氏培养基，于28℃下120rpm培养，3d后统计产孢量。

2.11敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com抗胁迫分析

将Foc4、△Foupe1和△Foupe1-com分别接种至不同胁迫培养基(分别含1mol/LNaCl、1mol/L山梨醇、50mmol/L H₂O₂、0.1％SDS、100μg/mL荧光增白剂(CFW，钙荧光白)和100μg/mL刚果红)中，于28℃下培养5d，以PDA培养基作为空白对照，采用十字交叉法测量菌落直径，计算不同胁迫条件下的菌落生长抑制率，每个处理设置3个重复。

2.12敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com的致病性分析

取4叶期的巴西蕉，分别用Foc4、△Foupe1和△Foupe1-com的分生孢子(2×10⁵个/mL)悬浮液进行浸根30min，再移栽于营养土中；置于25±1℃的植物培养室内培养，于光/暗12h/12h交替培养，28d后观察香蕉苗叶片和球茎的发病情况。分别以Foc4野生菌株和无菌水作为阳性和阴性对照。

3结果与分析

3.1香蕉枯萎病菌FoUPE1基因敲除载体的构建

采用PCR扩增方法，以Foc4基因组DNA为模板分别克隆获得FoUPE1基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoUPE1-A和pMD18T-FoUPE1-B。将pMD18T-FoUPE1-A与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-FoUPE1-A；将其与pMD18T-FoUPE1-B进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoUPE1-KO(图1)。

3.2敲除突变体△Foupe1的筛选

3.2.1基因片段hph的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除载体pCT74-FoUPE1-KO转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了117个潮霉素抗性转化子。经DNA的提取，利用hph基因特异性引物，对117个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，上述117个转化子均扩增到了hph基因，转化子71、76、113、117的验证结果如图2所示。

3.2.2基因片段FoUPE1的PCR验证

进一步利用FoUPE1基因特异性引物，对上述PCR扩增到hph基因的117个阳性转化子进行FoUPE1的PCR验证分析。结果表明，在117个转化子中，有4个转化子(转化子71、76、113、117)没有扩增到FoUPE1基因，进一步说明这4个转化子为阳性转化子(图3)。

3.2.3敲除突变体△Foupe1的Southern blot验证

对扩增到hph基因、同时没有扩增到FoUPE1基因的3个阳性转化子(转化子71、76、113)进行了Southern blot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，3个转化子均未有杂交条带(图4)。以hph为探针进行杂交，3个转化子均有单拷贝条带出现(图5)。上述试验进一步证明这3个转化子为阳性转化子。

3.3回补突变体的筛选

采用PCR扩增方法，克隆获得FoUPE1基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoUPE1-com(图6)。

利用随机***的方法，将基因回补载体pCTZN-FoUPE1-com转化敲除突变体△Foupe1(△Foupe1-71)原生质体，获得了21个博来霉素抗性转化子。经香蕉枯萎病菌基因组DNA的提取，利用FoUPE1基因特异性引物，对上述转化子进行了PCR验证(图7)。结果表明，4个转化子可以扩增出目的基因，进一步说明这4个转化子为阳性转化子。

3.4敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com的菌落形态和生长速率测定

将Foc4、敲除突变体△Foupe1(△Foupe1-71)和回补突变体△Foupe1-com(△Foupe1-71-com-2)分别接种于PDA培养基中，在接种5d后进行了菌落形态观察及菌落直径测定。结果表明，与Foc4相比，△Foupe1的生长速率显著下降，而回补突变体的生长速率恢复至野生型Foc4水平。

3.5敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com的产孢量分析

将Foc4、敲除突变体△Foupe1(△Foupe1-71)、回补突变体△Foupe1-com(△Foupe1-71-com-2)分别接种于查氏培养基，培养3d后进行产孢量分析。结果表明，敲除突变体△Foupe1的产孢量显著低于其Foc4，而回补突变体△Foupe1-com的产孢量恢复至野生型Foc4水平。

3.6敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com对不同胁迫条件的分析

将Foc4、△Foupe1(△Foupe1-71、△Foupe1-113)和△Foupe1-com(△Foupe1-71-com-2)分别接种在分别含1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.1％SDS、50mmol/L H₂O₂、100μg/mL荧光增白剂(CFW)和100μg/mL刚果红的PDA培养基中，于28℃下培养5d后对其菌落直径进行测定。结果表明，与Foc4相比，△Foupe1对50mmol/L H₂O₂更敏感，对1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.1％SDS、100μg/mL荧光增白剂(CFW)和100μg/mL刚果红的敏感性无明显差异，说明FoUPE1在Foc4应对氧化胁迫反应中具有重要作用(图8)。

3.7敲除突变体△Foupe1和回补突变体△Foupe1-com的致病性分析

利用伤根接种法，将Foc4、△Foupe1(△Foupe1-71)和△Foupe1-com(△Foupe1-71-com-2)分生孢子液分别接种巴西蕉，于28d后进行观察。结果表明，Foc4和△Foupe1-com孢子液接种28d后，巴西蕉苗下部叶片出现黄化，叶片黄化面积约占叶面积的50～60％。纵剖发病巴西蕉苗球茎，可观察到黑褐色病变，褐变面积接近球茎面积的50％；而△Foupe1-71孢子液接种28d后，巴西蕉下部叶片黄化面积约占叶面积的30％。纵剖发病巴西蕉苗，可观察到黑褐色病变，褐变面积约占球茎面积的25％。说明敲除FoUPE1基因后，香蕉枯萎病菌致病力明显下降(图9)。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2733

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1基因的碱基序列

<220>

<222> (1)..(1041)

<223> 非编码区1

<220>

<222> (1042)..(1099)

<223> 外显子1

<220>

<222> (1100)..(1155)

<223> 内含子1

<220>

<222> (1156)..(1996)

<223> 外显子2

<220>

<222> (1997)..(2051)

<223> 内含子2

<220>

<222> (2052)..(2349)

<223> 外显子3

<220>

<222> (2350)..(2733)

<223> 非编码区2

<400> 1

cgtccagtcc acactggagt ctggagtcca gctcgccctg gcatcgtctt gggccggtac 60

tggttccttt ttggtcttca gtgtctgagt gcccctggga taatgggccc cgaaactggt 120

gactgacctg tcggtgccct gcttttgtcc atgaacttag gttttgccat ccaactcgaa 180

cccaccctgg tagctccccc catgccccat gcaggcggcg ccgaattccc accgtgcact 240

catctcggtc gaccatcttt catctcctcc ctcccatctc ctcctctctt tttctctcgc 300

tccttcgaac ttcttctttc ctctccttgt cggtaatatt ctcgtccagt ttttctcttc 360

acgccactcg ttttcgtcag gctctactct gccagacttt atctagttct aggaatattc 420

ttaactgttc cgtgatatat ctcagtcgtt cgccgagaaa ctctcaagga tttgaagaat 480

caacaccatc caacaaaatc acaggatcct ttccccttac aaattaggta cgtacgaacg 540

ttcatcgctc ggtcgactgg ctcgatccat tgtgaggtgc ttgccgagac gcgcatttac 600

ttggcttgtg ctccttgatt ggtttcgacc gttccgtccc gtctttcttg ccgtcttgtt 660

ttctttcttc cttcccctgc ctcaaataat ctttttgtgt acactcttcc tcctccattc 720

actttgcgat ttggtctatt cttgcctacg attggaattg acgcatctcc tcatcccccc 780

ttcacgcatt ccttccaggt tggttgccat tgaacattcc ctttcctgcc aaagggggcg 840

ttgctatcga gcatcgacat ctccacgaca ttgtactgca gttgcttgct cgacaccact 900

ctacatcagc atcacttctt tcgaggcggt tctactttgg accgacattc atagggacca 960

ccgcgacaga ccagcccaca gttttcttca cgcactcgtg tataatcaac gttatctaat 1020

tgtttgttta tccaggccat aatgcattcc gttaaggtcc tctcggccat tgcggccctc 1080

agtgtctctg ccgtttctgg taggtgaaat cagatacacc gtctcggata tcctgctgac 1140

aacgaccttg tctagctgcc acttgtacca aggacgtcaa gatcaccgaa cctacacaag 1200

tcatcagctg cgatgttgtc gacgccgata tcatcattga caagtctgtt gctggtgccg 1260

ttgtcatcaa cggccccaag cagatcaagg gcaacttcca ggccaagaac gccggtgacc 1320

ttatctctat ctccagtacc tctattaatt ccatcactgg aaagttcgag ctcaacaacc 1380

tcgaggctct caacaacctc gacttctctt ctctcgagag ccttggcgag cttagcttca 1440

tcaagcttcc ccgactcggc gagctgaact tcggtaccga aggcgttact aagatcaaga 1500

gcattcgaat taccgacacc ttcatcagtg atcttagcgg tctcagcgtc gccagtgtcg 1560

agagcttcca gattgacaac aaccgaaaga tgaacgtctt caactccgac cttgttaatg 1620

ttactaccca gctcctgatc ttcgacaatg gcaacgacgt tatggaaatt accatgaaca 1680

agctcgagac tgctgccgag atccagattt ctagcgccaa gtccttcaag gtccctgctc 1740

tccaggaggt gaccaagagc ttgaagttga gcgccaaccc cgagctcaag tctttctccg 1800

cccccaacct gaccacgatc acggagaccc tgtcccttat cgacatgaac aagctcacca 1860

acgtttcctt ccccgccctc gaggagattg gcggcggttt caccatccag aacaacacca 1920

agcttgaggc tattgatgat ttccccaagc tcgagaaggt caccggtggt attgccctcc 1980

gaggtagctt cgagaagtga gtaaaacccc tctagcatat agcatttcca tatctaacga 2040

gcgatttcta gggtggaact tcccaagctc gaccaagtta gtggcagtgt cgttgtttcc 2100

tcgaccaccg atattaagga gttctgtgat tacttcgaca acctcaagaa ggacaagaag 2160

atcgatggtg aggagaagtg cacatccaac aacaaggcgg ccaatgaggg caaggacggt 2220

ggtgaggaga gcgacggctc ttccgagagc agcaacagtg acgatcagaa ggatgctgct 2280

ggcattgtca gcgtcaacat ggctgttctt gctcttgcag gtattgctgc cgttgcccag 2340

ctcttttaag catggagatg aagattgctg gcttttcttt taaaggcgtc attatcgtcg 2400

tcatcatgtt tcctgacttt tctctacgac atattgtgct tggtcaacat ggggcacaaa 2460

atgcttttca tgggtggggg taactgtgtg taaaggataa cctgttagag cttaataatc 2520

gattgtattt ggactttatt cttgagatca tgttcgccga gctctgaaaa ttgacatctc 2580

tcttaactca tcatataaag atgtttagtt tgtgataagc gcttcttatt tcttctgaac 2640

atcgagagtc atcaggaaac cttttcggtc tgcaactgat ataaaggatt gcctagttgt 2700

tggtctatta tgaatataag tatatctcca tcc 2733

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1蛋白质的氨基酸序列

<400> 2

Met His Ser Val Lys Val Leu Ser Ala Ile Ala Ala Leu Ser Val Ser

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Ala Thr Cys Thr Lys Asp Val Lys Ile Thr Glu Pro

20 25 30

Thr Gln Val Ile Ser Cys Asp Val Val Asp Ala Asp Ile Ile Ile Asp

35 40 45

Lys Ser Val Ala Gly Ala Val Val Ile Asn Gly Pro Lys Gln Ile Lys

50 55 60

Gly Asn Phe Gln Ala Lys Asn Ala Gly Asp Leu Ile Ser Ile Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Ile Asn Ser Ile Thr Gly Lys Phe Glu Leu Asn Asn Leu Glu

85 90 95

Ala Leu Asn Asn Leu Asp Phe Ser Ser Leu Glu Ser Leu Gly Glu Leu

100 105 110

Ser Phe Ile Lys Leu Pro Arg Leu Gly Glu Leu Asn Phe Gly Thr Glu

115 120 125

Gly Val Thr Lys Ile Lys Ser Ile Arg Ile Thr Asp Thr Phe Ile Ser

130 135 140

Asp Leu Ser Gly Leu Ser Val Ala Ser Val Glu Ser Phe Gln Ile Asp

145 150 155 160

Asn Asn Arg Lys Met Asn Val Phe Asn Ser Asp Leu Val Asn Val Thr

165 170 175

Thr Gln Leu Leu Ile Phe Asp Asn Gly Asn Asp Val Met Glu Ile Thr

180 185 190

Met Asn Lys Leu Glu Thr Ala Ala Glu Ile Gln Ile Ser Ser Ala Lys

195 200 205

Ser Phe Lys Val Pro Ala Leu Gln Glu Val Thr Lys Ser Leu Lys Leu

210 215 220

Ser Ala Asn Pro Glu Leu Lys Ser Phe Ser Ala Pro Asn Leu Thr Thr

225 230 235 240

Ile Thr Glu Thr Leu Ser Leu Ile Asp Met Asn Lys Leu Thr Asn Val

245 250 255

Ser Phe Pro Ala Leu Glu Glu Ile Gly Gly Gly Phe Thr Ile Gln Asn

260 265 270

Asn Thr Lys Leu Glu Ala Ile Asp Asp Phe Pro Lys Leu Glu Lys Val

275 280 285

Thr Gly Gly Ile Ala Leu Arg Gly Ser Phe Glu Lys Val Glu Leu Pro

290 295 300

Lys Leu Asp Gln Val Ser Gly Ser Val Val Val Ser Ser Thr Thr Asp

305 310 315 320

Ile Lys Glu Phe Cys Asp Tyr Phe Asp Asn Leu Lys Lys Asp Lys Lys

325 330 335

Ile Asp Gly Glu Glu Lys Cys Thr Ser Asn Asn Lys Ala Ala Asn Glu

340 345 350

Gly Lys Asp Gly Gly Glu Glu Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ser Ser Asn

355 360 365

Ser Asp Asp Gln Lys Asp Ala Ala Gly Ile Val Ser Val Asn Met Ala

370 375 380

Val Leu Ala Leu Ala Gly Ile Ala Ala Val Ala Gln Leu Phe

385 390 395

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-AF

<400> 3

ggggtaccgg tgcgacgggt ccatt 25

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-AR

<400> 4

ccgctcgaga tgtctccgtc tgttagcaag t 31

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-BF

<400> 5

tccccccggg ctgatgacga ttctcgggct 30

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-BR

<400> 6

gctctagaac ctgatcgcca actattcttt ac 32

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-com-F

<400> 7

gactagttgc atagtgatga gaaagtccaa 30

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-com-R

<400> 8

ataagaatgc ggccgcaagt caaagagtgg tgagcacat 39

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-F

<400> 9

tgctgctcca tacaagccaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-R

<400> 10

gacattgggg agttcagcga 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-F

<400> 11

agaccaacaa ctaggcaatc cttt 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1-R

<400> 12

gtcttgggcc ggtactggtt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1 probe-F

<400> 13

ccaccctaga aatcgctcgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoUPE1 probe-R

<400> 14

gatcttagcg gtctcagcgt 20

Claims

1.蛋白FoUPE1在降低香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的蛋白FoUPE1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述应用是通过敲除编码蛋白FoUPE1的基因实现的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述应用是所述蛋白FoUPE1在抑制香蕉枯萎病菌生长发育中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述应用是所述蛋白FoUPE1在降低香蕉枯萎病菌产孢量中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述应用是所述蛋白FoUPE1在降低香蕉枯萎病菌抗氧化胁迫中的应用。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于：

所述编码蛋白FoUPE1的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

6.一种降低香蕉枯萎病菌致病力的方法，其特征在于：所述方法是通过敲除编码蛋白FoUPE1的基因实现的，所述的蛋白FoUPE1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述编码蛋白FoUPE1的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。