CN111560384B

CN111560384B - 基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

Info

Publication number: CN111560384B
Application number: CN202010322384.4A
Authority: CN
Inventors: 聂燕芳; 何艳秋; 李云锋; 李华平
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN111560384A

Abstract

本发明公开一种基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFoRnt；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoRnt原生质体，获得回补突变体ΔFoRnt‑com。试验证明，ΔFoRnt在孢子形态、菌丝形态、抗高渗透、氧化胁迫等方面与野生型相比没有显著性差异；但FoRnt的缺失导致了其致病力的显著降低；本发明证实FoRnt是香蕉枯萎病菌致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是香蕉生产上最重要的病害之一，给我国香蕉产业造成了严重威胁，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense，Foc)。香蕉枯萎病是一种***性维管束土传病害，可破坏香蕉维管束而导致植株死亡。Foc可划分为3个生理小种，危害我国植蕉区的主要有1号生理小种(Foc1)和4号生理小种(Foc4)。其中，Foc4对我国香蕉的危害最大，几乎能侵染所有品种的香蕉。目前对于Foc的致病机理仍不清楚。充分挖掘Foc致病相关基因并开展其功能研究，对于香蕉枯萎病的防控具有重要意义。

在开展对香蕉枯萎病菌分泌蛋白质组学的研究中，我们鉴定到一个未知蛋白(Uncharacterized protein，命名为FoRnt)；分析表明，该蛋白属于RNase T2家族，含有N-端信号肽，属于经典的分泌蛋白。RNase T2首次在米曲霉中发现，为一种单链特异性转移型核酸内切酶，具有广泛的生物学作用，如清除核酸、自身RNA的降解等；但其在香蕉枯萎病菌中的生物学功能并不清楚。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明公开香蕉枯萎病菌一个新的未知蛋白基因FoRnt及其编码蛋白RNT的功能。基因FoRnt为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白RNT为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFoRnt；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoRnt原生质体；利用随机***的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFoRnt-com。该突变体在生长发育方面不存在缺陷，对高渗胁迫、氧化胁迫等不敏感。致病性测定结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，敲除突变体ΔFoRnt对巴西蕉的致病力显著降低。上述试验证明，香蕉枯萎病菌FoRnt基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明提供一种基因FoRnt在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用。

本发明提供一种基因FoRnt作为用于植物病害防治药物的靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoRnt的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。

阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoRnt表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

其中，所述的香蕉枯萎病菌基因FoRnt，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、***、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

所述的基因FoRnt，其核苷酸序列为下列A、B、C、D之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、如SEQ ID NO：1的第180～1016位所示的CDS序列；

D、以上A、B和C通过碱基***、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。

含有上述基因FoRnt的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明公开了香蕉枯萎病菌4号小种一个未知蛋白(Uncharacterized protein)基因FoRnt及其编码蛋白RNT的新功能。所述基因FoRnt为序列1中第1位至第1126位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白RNT为序列2所示的蛋白质；蛋白RNT属于RNase T2家族，其在香蕉枯萎病菌的生物学功能并不清楚。试验证明，将蛋白RNT的编码基因FoRnt用潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(gfp)置换后，所得到的香蕉枯萎病菌突变体在孢子形态、菌丝形态、抗高渗透、氧化胁迫等方面与野生型相比没有显著性差异；但FoRnt的缺失导致了其致病力的显著降低；本发明证实FoRnt是香蕉枯萎病菌致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是香蕉枯萎病菌基因FoRnt敲除载体的构建示意图。

图2是香蕉枯萎病菌基因FoRnt回补载体的示意图。

图3是转化子的Southern blot分析(以hph片段为探针)；其中，ΔFoRnt-2是指转化子2、ΔFoRnt-12是指转化子12、ΔFoRnt-14是指转化子14、ΔFoRnt-17是指转化子17、ΔFoRnt-24是指转化子24。

图4是敲除突变体△FoRnt和回补突变体ΔFoRnt-com抗高渗透压能力的测定；其中，ΔFoRnt-24是指转化子24，ΔFoRnt-24-com是指由基因回补载体转化ΔFoRnt-24获得的回补转化子2。

图5是敲除突变体△FoRnt和回补突变体ΔFoRnt-com对过氧化氢的敏感性的测定。

图6是敲除突变体△FoRnt和回补突变体ΔFoRnt-com的致病性分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及植物

香蕉枯萎病菌小种为Foc4，供试香蕉品种为巴西蕉Cavendish(AAA)。

1.2宿主菌及质粒载体

宿主菌为大肠杆菌DH5α，克隆载体为pMD18-T vector，基因敲除载体为双元载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)，也在专利“201910986131.4、基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用”中公开。

2、实验方法

2.1香蕉枯萎病菌基因FoRnt上下游同源片段的扩增

香蕉枯萎病菌FoRnt基因敲除载体的构建如图1所示。在FoRnt基因的上游和下游各选取长度大小约为1500bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段，即FoRnt-A和FoRnt-B)，并设计引物(表1)。

表1 FoRnt基因同源臂A片段和B片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			FoRnt-AF	GG<u>GGTACC</u>TTGGCGATGGTGCTGAGTGG	KpnI
FoRnt-AR	CCG<u>CTCGAG</u>TGTTGGTTCCGGGGCTGATA	XhoI
			FoRnt-BF	GG<u>AATTCC</u>ATCGTTCTTTTCAACGTTATC	EcoRI
FoRnt-BR	G<u>ACTAGT</u>TAGGAGCATCACATTCGTAA	SpeI

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoRNT-AF和FoRnt-AR进行PCR扩增，获得FoRnt基因的同源臂A片段(FoRnt-A)；用引物FoRnt-BF和FoRnt-BR进行PCR扩增，获得FoRnt基因的同源臂B片段(FoRnt-B)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		FoRnt-AF/BF(10μmol/L)	1.0μL
FoRnt-AR/BR(10μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup> plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.2 FoRnt基因敲除载体的构建

参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将FoRnt-A和FoRnt-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoRnt-A和pMD18T-FoRnt-B。具体为：取1μL pMD 18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μLsolution I，于16℃连接过夜。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃、150rpm振荡培养45min；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8～12h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用KpnI、XhoI分别对pMD18T-FoRnt-A和pCT74载体进行双酶切，回收A片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将A片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCT74-FoRnt-A。按同样程序，用EcoRI和SpeI双酶切pMD18T-FoRnt-B和重组质粒pCT74-FoRnt-A，回收B片段和重组质粒。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74-FoRnt-A连接，转化大肠杆菌DH5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoRnt-KO。

2.3 Foc4基因RNT(FoRnt)回补载体上下游片段的扩增

FoRnt基因回补载体的构建如图2所示。在FoRnt基因的上游选取长度为1500bp的启动子序列，下游选取长度为500bp的终止子序列，并设计引物(分别命名为com FoRnt-F和com FoRnt-R)(表2)。

表2 FoRnt基因回补片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			com FoRnt-F	GG<u>GGTACC</u>GGAGAAGAAACCGAGATTGTAATT	KpnI
com FoRnt-R	ACGC<u>GTCGAC</u>CGAAACATGCCATAGTGGAGAT	SalI

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物com FoRnt-F和com FoRnt-R进行PCR扩增，获得FoRnt基因的回补片段(记为com FoRnt)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		com FoRnt-F(10μmol/L)	1.0μL
com FoRnt-R(10μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup> plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		ExTaq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min，即获得PCR扩增产物。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.4 Foc4基因RNT(FoRnt)回补载体的构建

用KpnI和SalI分别对com FoRnt和pCTZN载体进行双酶切，回收com FoRnt片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将com FoRnt片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCTZN-FoRnt-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoRnt-com。

2.5 Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到查氏培养基(硝酸钠3g，三水合磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.018g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L，pH为6.0)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用NCM培养基(葡萄糖10g，天冬氨酸4g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，200×铁盐5mL，定容至1L，pH 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为1×10⁶个/mL；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10:1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×10⁷个/mL。

香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体的制备，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤得到。

2.6 Foc4原生质体的转化

用KpnI和SpeI对敲除载体pCT74-FoRnt-KO进行双酶切，获得A-hph-gfp-B片段。将3～5μg的重组片段A-hph-gfp-B片段与200μL的Foc4原生质体混匀，或者，将3～5μg的pCTZN-FoRnt-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴15min。逐滴加入新鲜配制的PSTC转化缓冲液(40％PEG4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/LTris-HCl，pH7.5)1mL，混匀后冰上放置15min。加入10mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6mL上清，用3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。

2.7 Foc4敲除突变体ΔFoRnt的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物FoRnt-F/FoRnt-R进行FoRnt基因片段的PCR扩增；用引物hph-F/hph-R进行hph基因片段的PCR扩增分析。

FoRnt-F：5′-ATGCTCAGTTACGGGTTGCG-3′，

FoRnt-R：5′-CAAGTAAAGTACGT GATTACATACGG-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		FoRnt-F/hph-F(10μmol/L)	0.5μL
FoRnt-R/hph-R(10μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup> plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.8回补突变体ΔFoRnt-com的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoRnt-F/FoRnt-R进行基因片段FoRnt的PCR扩增。

FoRnt-F：5′-ATGCTCAGTTACGGGTTGCG-3′，

FoRnt-R：5′-CAAGTAAAGTACGT GATTACATACGG-3′；

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		FoRnt-F(10μmol/L)	0.5μL
FoRnt-R(10μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup> plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

2.9 Foc4敲除突变体的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern blot杂交。用引物FoRnt-F/FoRnt-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。

FoRnt-F：5′-ATGCTCAGTTACGGGTTGC-3′，

FoRnt-R：5′-CAAGTAAAGTACGTGATTACATACGG-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

模板DNA	1.0μL
		FoRnt-F/hph-F(20μmol/L)	1.0μL
FoRnt-R/hph-R(20μmol/L)	1.0μL
		10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup> plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Ex Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

2.10敲除突变体ΔFoRnt和回补突变体ΔFoRnt-com的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4野生型、ΔFoRnt和ΔFoRnt-com分别接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养5d。分别在第1d、3d、5d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。

(2)分生孢子的产生与萌发观察。将香蕉枯萎病菌接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，7d后统计产孢量。将分生孢子悬浮液接种于NCM培养基，于28℃、120rpm震荡培养，11h时取样，观察分生孢子的萌发情况。

2.11敲除突变体ΔFoRnt和回补突变体ΔFoRnt-com抗胁迫环境能力分析

(1)细胞壁抗高渗透压能力测定

将Foc4野生型、ΔFoRnt和ΔFoRnt-com分别接种在含有1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.02％SDS和200μg/mL刚果红的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察并测定菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

(2)氧化胁迫测定

将Foc4野生型、ΔFoRnt和ΔFoRnt-com分别接种在含有25mmol/L H₂O₂、50mmol/LH₂O₂、75mmol/L H₂O₂的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察ΔFoRnt、ΔFoRnt-com和野生型菌株的菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

2.12 Foc4敲除突变体ΔFoRnt和回补突变体ΔFoRnt-com的致病性分析

采用伤根接种法，分别用Foc4野生型、ΔFoRnt-24和ΔFoRnt-24-com的分生孢子悬浮液(2×10⁵个/mL)接种4叶期的巴西蕉；于25±1℃、光/暗12h/12h交替培养，25d后观察统计香蕉苗叶片和球茎的发病情况。分别以Foc4野生菌株和无菌水作为阳性和阴性对照。

3结果与分析

3.1香蕉枯萎病菌FoRnt基因敲除载体和回补载体的构建

3.1.1采用PCR扩增方法，分别克隆获得FoRnt基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoRnt-A和pMD18T-FoRnt-B。将pMD18T-FoRnt-A与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-FoRnt-A；将其与pMD18T-FoRnt-B进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoRnt-KO(图1)。

3.1.2香蕉枯萎病菌FoRnt基因回补载体的构建

采用PCR扩增方法，克隆获得FoRnt基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoRnt-com(图2)。

3.2敲除突变体ΔFoRnt的筛选

3.2.1基因片段FoRnt的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除载体pCT74-FoRnt-KO转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了36个潮霉素阳性转化子。经DNA的提取，利用FoRnt基因特异性引物，对36个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，有31个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这31个转化子仍含有FoRnt基因；有5个转化子没有扩增到FoRnt基因，初步鉴定这5个转化子为阳性转化子。

3.2.2基因片段hph的PCR验证

以上述5个没有扩增到FoRnt基因的转化子基因组DNA为模板，利用hph特异性引物进行PCR扩增；结果表明，上述没有扩增到FoRnt基因5个转化子，扩增到了约1000bp的目的片段，进一步说明这5个转化子为阳性转化子。

3.2.3敲除突变体ΔFoRnt的Southern blot验证

对没有扩增到FoRnt基因、而扩增到hph基因的5个阳性转化子进行了Southernblot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，5个转化子均未有杂交条带。以hph为探针进行杂交，发现这5个转化子均有单拷贝条带出现(图3)。上述试验证明这5个转化子为阳性转化子。

3.3回补突变体ΔFoRnt-com的筛选

利用随机***的方法，将基因回补载体pCTZN-FoRnt-com转化Foc4敲除突变体ΔFoRnt原生质体，获得了2个博来霉素阳性转化子。经香蕉枯萎病菌基因组DNA的提取，利用FoRnt基因特异性引物，对2个博来霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，2个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这2个转化子含有FoRnt基因；初步鉴定这2个转化子为阳性转化子，记为回补转化子1、回补转化子2。

3.4 ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的菌落形态和生长速率测定

将ΔFoRnt(ΔFoRnt-24)和ΔFoRnt-com(ΔFoRnt-24-com)分别接种于PDA培养基中，分别在不同时间对其生长情况进行了观察。结果表明，与Foc4野生型相比，ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的菌落形态和生长速率没有明显区别。

3.5 ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的产孢量及孢子的萌发观察分析

将ΔFoRnt(ΔFoRnt-24)和ΔFoRnt-com(ΔFoRnt-24-com)分别接种于查氏培养基，培养7d后进行产孢量分析。结果表明，ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的产孢量与Foc4野生型相比无显著性差异。

分生孢子萌发观察结果表明，Foc4野生型分生孢子的萌发率与ΔFoRnt或ΔFoRnt-com无明显差异，说明敲除FoRnt后，不影响香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发。

3.6 ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的抗高渗透压能力测定

将ΔFoRnt(ΔFoRnt-24)和ΔFoRnt-com(ΔFoRnt-24-com)分别接种于分别含1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.02％SDS和200μg/mL刚果红(CR)PDA培养基，对其菌落直径进行了测定。结果表明，与野生型相比，ΔFoRnt或ΔFoRnt-com对NaCl、SDS、刚果红和山梨醇的敏感性无显著性差异，说明敲除FoRnt后，未影响香蕉枯萎病菌抗高渗透压的能力(图4)。

3.7 ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的氧化胁迫敏感性测定

将ΔFoRnt(ΔFoRnt-24)和ΔFoRnt-com(ΔFoRnt-24-com)分别接种于含25mmol/L、50mmol/L和75mmol/L H₂O₂的PDA培养基，28℃培养5d，对其菌落直径进行了测定。结果表明，敲除FoRnt基因后，对过氧化氢的敏感性没有显著变化(图5)。

3.8 ΔFoRnt和ΔFoRnt-com的致病性分析

对巴西蕉苗的致病性试验结果表明，Foc4野生型接种后，香蕉叶片上出现了明显的黄化、枯死，且球茎大面积变褐；而敲除突变体ΔFoRnt(ΔFoRnt-24)接种后，香蕉叶片黄化情况较轻，球茎变色面积较小。回补突变体ΔFoRnt-com(ΔFoRnt-24-com)的发病情况与野生型相似病情指数。病情指数统计结果表明，敲除突变体的病情指数显著低于野生型(图6)。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 香蕉枯萎病菌FoRnt基因的碱基序列

<220>

<222> (180)..(1016)

<223> 香蕉枯萎病菌FoRnt基因的CDS序列

<400> 1

tgatgctcag ttacgggttg cgagtggatg atcgtacaaa ctggatggta tagaaatcgc 60

tcatgtcatg gtcagagcgg tgccgttgag aattataaag ccaggagcca tatcgttgca 120

aaatcaagtg ttgcaaagta acccaagtga agactgcagt accttgagat agcagcaaca 180

tgtcttcgtt tcagattttg tctcttatca cagcagctac ttctgttgtg gcacttgctg 240

ggacaccaaa tgtctacgct ggtagtcgcc gaggctcatg ctatgatgat gctgcagctg 300

atgacacctg ctgctattca tcacctgcga gactaattca gactcaagtc tgggatacac 360

gaccagtcac tggaccttta gactcatgga ctgttggtgg actctggcca atccacaacg 420

acggctccct ccctacccac tgcgacacca accgcacata cacaaacatc acacaaatcc 480

tctaccatgc aggtgccgaa tataccattg acgatatgaa ccaactctgg gagtcaccca 540

atggtgataa cgacgagctc tggcaagatc aatgggctaa gcatggcaca tgcttcagca 600

ccttgagccc ggagtgcttc agccactatg aagtctccga agaagcagcc ccgtacttca 660

aaaaagccat gtctctccac aagaggctgc cgacgtatga ctggcttcgt gacgacggca 720

ttgttccttc atattccatg ttttatcggc tctcagacat ccaagatact ctagaggatc 780

atcatggctc ccgcgtgtca cttcgctgtg ccggacaaag aatacgtgag attgggtatc 840

acttcaatgt tacagggact ttgcaagatg gcttctttac tgactctggc gcattcggcg 900

atttgggcga ttgtccagag ctggtattgt atgaaccgaa gggggaaacc aagaaggcaa 960

tttttaactt tgagacgttt catccgcata ccgctgcgga tgtggaggac ctttagctca 1020

gtccatcagt atacttcacc ttagcttaga taacctttta ataaattccg tatgtaatca 1080

cgtactttac ttgagaacta gcaaccaatc aagtgccgtt tccaag 1126

<210> 2

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基因FoRnt编码的氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Ser Phe Gln Ile Leu Ser Leu Ile Thr Ala Ala Thr Ser Val

1 5 10 15

Val Ala Leu Ala Gly Thr Pro Asn Val Tyr Ala Gly Ser Arg Arg Gly

20 25 30

Ser Cys Tyr Asp Asp Ala Ala Ala Asp Asp Thr Cys Cys Tyr Ser Ser

35 40 45

Pro Ala Arg Leu Ile Gln Thr Gln Val Trp Asp Thr Arg Pro Val Thr

50 55 60

Gly Pro Leu Asp Ser Trp Thr Val Gly Gly Leu Trp Pro Ile His Asn

65 70 75 80

Asp Gly Ser Leu Pro Thr His Cys Asp Thr Asn Arg Thr Tyr Thr Asn

85 90 95

Ile Thr Gln Ile Leu Tyr His Ala Gly Ala Glu Tyr Thr Ile Asp Asp

100 105 110

Met Asn Gln Leu Trp Glu Ser Pro Asn Gly Asp Asn Asp Glu Leu Trp

115 120 125

Gln Asp Gln Trp Ala Lys His Gly Thr Cys Phe Ser Thr Leu Ser Pro

130 135 140

Glu Cys Phe Ser His Tyr Glu Val Ser Glu Glu Ala Ala Pro Tyr Phe

145 150 155 160

Lys Lys Ala Met Ser Leu His Lys Arg Leu Pro Thr Tyr Asp Trp Leu

165 170 175

Arg Asp Asp Gly Ile Val Pro Ser Tyr Ser Met Phe Tyr Arg Leu Ser

180 185 190

Asp Ile Gln Asp Thr Leu Glu Asp His His Gly Ser Arg Val Ser Leu

195 200 205

Arg Cys Ala Gly Gln Arg Ile Arg Glu Ile Gly Tyr His Phe Asn Val

210 215 220

Thr Gly Thr Leu Gln Asp Gly Phe Phe Thr Asp Ser Gly Ala Phe Gly

225 230 235 240

Asp Leu Gly Asp Cys Pro Glu Leu Val Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Glu

245 250 255

Thr Lys Lys Ala Ile Phe Asn Phe Glu Thr Phe His Pro His Thr Ala

260 265 270

Ala Asp Val Glu Asp Leu

275

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoRnt-AF

<400> 3

ggggtacctt ggcgatggtg ctgagtgg 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoRnt-AR

<400> 4

ccgctcgagt gttggttccg gggctgata 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoRnt-BF

<400> 5

ggaattccat cgttcttttc aacgttatc 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoRnt-BR

<400> 6

gactagttag gagcatcaca ttcgtaa 27

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> com FoRnt-F

<400> 7

ggggtaccgg agaagaaacc gagattgtaa tt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> com FoRnt-R

<400> 8

acgcgtcgac cgaaacatgc catagtggag at 32

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoRnt-F

<400> 9

atgctcagtt acgggttgcg 20

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoRnt-R

<400> 10

caagtaaagt acgtgattac atacgg 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-F

<400> 11

tgctgctcca tacaagccaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-R

<400> 12

gacattgggg agttcagcga 20

Claims

1.基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的基因FoRnt，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的基因FoRnt在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用，其特征在于：所述的防治是通过阻断或抑制基因FoRnt的表达来实现的。

3.权利要求1所述的基因FoRnt作为用于植物病害防治药物的靶标的应用，其特征在于：所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoRnt，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、如SEQ ID NO：1的第180～1016位所示的CDS序列。

5.一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，其特征在于：包含阻断或抑制权利要求1所述基因FoRnt的表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述的基因FoRnt，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、如SEQ ID NO：1的第180～1016位所示的CDS序列。