CN110144386A - 用于检测pole基因突变的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测POLE基因突变的引物、探针及试剂盒。本发明所述的引物、探针组合及试剂盒能够基于实时荧光PCR技术平台实现POLE基因突变的准确检测，具有检测速度快、易于判读结果、检测试剂成本低、检测灵敏度高、特异性强的优点，同时适用于检测组织样本DNA和血浆游离DNA。

Description

用于检测POLE基因突变的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种用于POLE基因突变检测的引物、探针组合及试剂盒。

背景技术

癌症发病率近年来呈逐年上升趋势，我国每年新增癌症患者达350万人以上。随着肿瘤细胞分子生物学的发展，癌症免疫治疗已开始进入临床应用，选择合适的患者进行免疫治疗是其成功的关键。

POLE基因负责编码DNA聚合酶ε的催化亚基，具有以DNA为模板的聚合酶活性，以及核酸外切酶区的校正活性，负责对错配碱基进行识别和修复。其中，校正活性能够及时识别并切除复制过程中产生的错误碱基。

POLE基因发生突变，常发生在核酸外切酶区，该区域基因突变可导致所编码的DNA聚合酶ε核酸外切酶区域的校正功能缺失，在DNA复制过程中会导致基因突变率异常增加，异常增加的突变将促进肿瘤的发生。通过外显子组测序发现，POLE突变的体细胞内突变率很高，肿瘤突变负荷(TMB)非常高。POLE体细胞突变常发生在约1～2％的结直肠癌(CRC)中和7～12％的子宫内膜癌(EC)中，并且在脑，胰腺，卵巢，***，胃的超突变肿瘤以及子宫癌肉瘤中被检测到，最常见的突变类型是P286R和V411L，以及S297F、A456P、S459F和F367S，这些突变直接或间接的影响了DNA聚合酶ε核酸外切酶区域的校正功能。另外，POLE种系突变具有家族遗传性及致癌性，主要发生在肠息肉病患者和家族性结直肠癌中，发生率约为0.5～2％，突变类型主要是L424V。

研究发现，POLE基因突变可增强癌症患者免疫应答，可能原因是由于肿瘤细胞积累了大量的基因变异，导致产生的蛋白更容易被患者的免疫***发现。研究人员在肿瘤免疫染色中发现POLE突变的肿瘤中存在大量的CD8+阳性的肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞标志物，PD-1＞90％，并在肿瘤微环境中鉴定出PD-L1的大量表达，表明具有POLE突变的肿瘤可能是靶向PD1-PDL1信号通路药物的候选者。已有临床研究报道携带POLE基因突变的癌症患者接受针对PD-1的免疫治疗具有良好的疗效。

由此可见，在癌症患者中检测POLE基因突变，可以预测免疫治疗的效果，指导医生制定合理的治疗方案，避免延误患者的最佳治疗时机。

针对晚期癌症患者，当无法通过活检取组织样本检测时，可通过采集全血、分离血浆中游离DNA来实现基因突变的检测。由于活检组织量很少，血浆游离DNA浓度也很低，其中所含的基因突变比例也可能很低，因此不论针对组织样本还是血浆样本，均要求基因突变检测试剂具有高灵敏度和高特异性。

目前针对POLE基因突变检测方法包括高通量测序(NGS)、数字PCR(dPCR)。NGS方法检测灵敏度可达0.2％，但其检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信息学分析计算，检测周期长；数字PCR方法检测灵敏度可达0.1％，但其检测步骤较多、试剂费用较实时荧光PCR昂贵很多、结果判读也依赖于专用软件、对阴性/阳性区间的划分主要依赖于针对图形的主观判断。NGS和数字PCR仪器试剂昂贵，因此对操作人员也有很高要求。

鉴于此，目前亟需能够快速、简便、高灵敏度、高特异性、试剂费用低、结果易于判读的检测POLE基因突变的试剂。特提出本发明。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于实时荧光PCR技术平台的、用于同时检测POLE基因8种突变型的引物、探针和试剂盒。本发明包括下列4组16条引物和探针：

第1组

正向引物POLE-1-F1：ACTGCCCCTCAAGTTTAG(SEQ ID No：1)

正向引物POLE-1-F2：ACAGACCAGATTATGATGATTCT(SEQ ID No：2)

反向引物POLE-1-R：AGGAGCTTACTTCCCAGAAG(SEQ ID No：3)

探针POLE-1-PB：ACATGATCGATGGCCAGGTGA(SEQ ID No：4)

第2组

正向引物POLE-2-F：ACACAGACTCACCAGTCAG(SEQ ID No：5)

反向引物POLE-2-R：AGACCAAACCCACCATCA(SEQ ID No：6)

探针POLE-2-PB：AGTCCCCGTTGTAGGTGACCA(SEQ ID No：7)

第3组

正向引物POLE-3-F1：ATTCTCCTTCCAGGTGAC(SEQ ID No：8)

正向引物POLE-3-F2：ATTCTCCTTCCAGGTGAT(SEQ ID No：9)

正向引物POLE-3-F3：CCTGTGGGCAGTCATAACG(SEQ ID No：10)

反向引物POLE-3-R：ACATGTCCTCCGGGTCTA(SEQ ID No：11)

探针POLE-3-PB：ACGGGATCATAGCCTAGCTTGGC(SEQ ID No：12)

第4组

正向引物POLE-4-F1：TTCTCTCCTCAGACTCTAC(SEQ ID No：13)

正向引物POLE-4-F2：AGACTCTGGCCACGTATCT(SEQ ID No：14)

反向引物POLE-4-R：ACGTACTTCATGTACAGGTAGT(SEQ ID No：15)

探针POLE-4-PB：TGTGTCAGATGCTGTCGCCACT(SEQ ID No：16)

本发明另一方面提供一种用于同时检测POLE基因8种突变型的试剂盒。本发明的引物和探针包括SEQ ID No：1～SEQ ID NO：16的序列。

根据所采用的实时荧光PCR方法，本发明的试剂盒还可以包括内控基因。

本发明另一方面提供一种用于检测POLE基因突变的方法，其包括以下步骤：

(1)针对POLE基因突变位点，设计特异性引物和探针，优选SEQ ID No：1～SEQ IDNO：16的序列；

(2)提取检测样本中DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆、胸腔积液、腹腔积液等；

(3)建立实时荧光PCR扩增反应体系；

(4)根据荧光PCR仪显示的Ct值，计算ΔCt值，根据Cutoff判断检测结果：当ΔCt＜Cutoff时，判为阳性；当ΔCt≥Cutoff时，判为阴性或低于检测限。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用了特异性引物和探针技术，可以通过很少数目的引物和探针组合即可特异性的一次性同时检测POLE基因8种突变型，且同时包括POLE基因体细胞突变(somatic mutation)和种系突变(germline mutation)。

(2)因仅涉及实时荧光PCR反应体系的配制、加样和上机，本发明中的试剂盒的操作步骤非常简单，检测速度快、周期短，提出DNA后可在90分钟内获得结果；判读过程简单，无需其他专业数据分析处理软件，也无需通过图形进行阴性/阳性区间的人为主观判断，非常易于判读结果；检测试剂费用相对于NGS、数字PCR等需要使用昂贵的检测仪器配套专用试剂而言要低很多。

(3)检测灵敏度高，可达0.1％；检测特异性强，针对100ng/μl野生型无假阳性结果。

(4)同时适用于检测多种组织样本DNA和血浆游离DNA。

(5)采用实时荧光PCR技术，PCR反应结束后无需开盖，有效避免了核酸气溶胶污染的风险。

(6)相对于NGS、数字PCR方法，本发明中的实时荧光PCR方法和试剂盒检测周期更短、检测试剂成本更低。

附图说明

图1为检测POLE基因S297F突变样本的荧光PCR图。同时选择FAM和HEX通道，其中突变检测在FAM通道(阳性)、内控检测在HEX通道(阳性)。

图2为检测POLE基因野生型样本的荧光PCR图。同时选择FAM和HEX通道，其中突变检测在FAM通道(阴性)、内控检测在HEX通道(阳性)。

具体实施方式

一.原理

本发明的特异性引物和探针同DNA模板结合后，Taq DNA聚合酶以脱氧核苷酸(dNTP)为底物，对内控基因(Internal Control，IC)及POLE基因8种突变型进行体外扩增。检测采用荧光PCR技术，通过特异性探针水解释放荧光，监测PCR反应的进行，通过ΔCt值判定POLE基因突变状态。

根据表1所示的POLE基因突变所在的基因组序列位置，设计特异性引物和探针组合对POLE基因突变型进行检测。

表1：检测POLE基因突变型信息

突变型简称	氨基酸变化	碱基变化	COSMIC ID	备注
					POLE-M1	p.P286R	c.857C＞G	COSM937333	体细胞突变
POLE-M2	p.S297F	c.890C＞T	COSM937331	体细胞突变
					POLE-M3	p.F367S	c.1100T＞C	COSM204095	体细胞突变
POLE-M4	p.V411L	c.1231G＞C	COSM4716440	体细胞突变
					POLE-M5	p.V411L	c.1231G＞T	COSM204094	体细胞突变
POLE-M6	p.L424V	c.1270C＞G	COSM937329	种系突变
					POLE-M7	p.A456P	c.1366G＞C	COSM937319	体细胞突变
POLE-M8	p.S459F	c.1376C＞T	COSM170809	体细胞突变

在本发明中，通过针对引物和探针的设计、筛选和优化，获得了特定的引物和探针的序列，得到了最优的引物和探针组合，共4组16条引物和探针，用于一次性同时检测POLE基因8种突变。

本发明的试剂盒在POLE基因突变检测体系中同时设置了内控基因(InternalControl，IC)检测体系。多个反应体系在同一PCR管中同时进行反应。内控基因检测的是看家基因。将识别内控基因模板的探针修饰为HEX/VIC荧光基团，将识别POLE基因突变模板的探针修饰为FAM荧光基团，从而与内控检测通道区分开。通过检测内控基因扩增情况，可分析待检DNA是否能被正常扩增，从而排除漏加试剂或样本、样本含有PCR抑制剂等造成PCR检测失败的情况。

二.实验材料和设备

1.针对突变位点设计合成特异性引物和探针

针对POLE基因突变型分别设计特异性引物和探针。通过特异性引物和探针优化实现高灵敏度、高特异性和快速检测。当不使用下述引物和探针的最优组合时，无法达到同时具有高灵敏度和高特异性的检测试剂性能结果、无法实现通过很少数目的引物和探针即可一次性同时检测POLE基因8种突变；当不按照下述方式进行引物和探针的分组时，无法实现一次性同时检测POLE基因8种突变。本发明所述共4组16条引物和探针如下：

第1组

正向引物POLE-1-F1：ACTGCCCCTCAAGTTTAG(SEQ ID No：1)

正向引物POLE-1-F2：ACAGACCAGATTATGATGATTCT(SEQ I D No：2)

反向引物POLE-1-R：AGGAGCTTACTTCCCAGAAG(SEQ ID No：3)

探针POLE-1-PB：ACATGATCGATGGCCAGGTGA(SEQ ID No：4)

第2组

正向引物POLE-2-F：ACACAGACTCACCAGTCAG(SEQ ID No：5)

反向引物POLE-2-R：AGACCAAACCCACCATCA(SEQ ID No：6)

探针POLE-2-PB：AGTCCCCGTTGTAGGTGACCA(SEQ ID No：7)

第3组

正向引物POLE-3-F1：ATTCTCCTTCCAGGTGAC(SEQ ID No：8)

正向引物POLE-3-F2：ATTCTCCTTCCAGGTGAT(SEQ ID No：9)

正向引物POLE-3-F3：CCTGTGGGCAGTCATAACG(SEQ ID No：10)

反向引物POLE-3-R：ACATGTCCTCCGGGTCTA(SEQ ID No：11)

探针POLE-3-PB：ACGGGATCATAGCCTAGCTTGGC(SEQ ID No：12)

第4组

正向引物POLE-4-F1：TTCTCTCCTCAGACTCTAC(SEQ ID No：13)

正向引物POLE-4-F2：AGACTCTGGCCACGTATCT(SEQ ID No：14)

反向引物POLE-4-R：ACGTACTTCATGTACAGGTAGT(SEQ ID No：15)

探针POLE-4-PB：TGTGTCAGATGCTGTCGCCACT(SEQ ID No：16)

2.检测样本处理与DNA的提取

检测样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆、胸腔积液、腹腔积液。以下仅以石蜡包埋组织样本为例进行说明。

由于DNA样品质量会影响检测结果，因此应确定DNA样品来源的石蜡包埋组织样本中含有癌组织细胞，并且不少于整个样本的25％；将DNA稀释至5～10ng/μl。

3.适用仪器：荧光定量PCR仪，具有FAM、VIC/HEX荧光通道。

4.试剂盒的组成：见表2。

表2：试剂盒(24测试/盒)组成

其中试剂1用于检测POLE基因M1、M2突变型(FAM通道)和内控基因(HEX/VIC通道)，包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.4的引物和探针。在试剂1荧光PCR反应终体系中，各引物的终浓度为900nM、各探针的终浓度为600nM、氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM、TaqDNA聚合酶的终浓度为1.25U/反应，反应体积为25μL。

其中试剂2用于检测POLE基因M3突变型(FAM通道)和内控基因(HEX/VIC通道)，包含SEQ ID No.5～SEQ ID No.7的引物和探针。在试剂2荧光PCR反应终体系中，各引物的终浓度为900nM、各探针的终浓度为600nM、氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM、TaqDNA聚合酶的终浓度为1.25U/反应，反应体积为25μL。

其中试剂3用于检测POLE基因M4、M5、M6突变型(FAM通道)和内控基因(HEX/VIC通道)，包含SEQ ID No.8～SEQ ID No.12的引物和探针。在试剂3荧光PCR反应终体系中，各引物的终浓度为900nM、各探针的终浓度为600nM、氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM、Taq DNA聚合酶的终浓度为1.25U/反应，反应体积为25μL。

其中试剂4用于检测POLE基因M7、M8突变型(FAM通道)和内控基因(HEX/VIC通道)，包含SEQ ID No.13～SEQ ID No.16的引物和探针。在试剂4荧光PCR反应终体系中，各引物的终浓度为900nM、各探针的终浓度为600nM、氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM、Taq DNA聚合酶的终浓度为1.25U/反应，反应体积为25μL。

其中所述内控基因的具体序列可以由本领域技术人员根据实验情况容易地确定。

三.检测方法

以下仅以石蜡包埋组织样本为例进行说明。

1.使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生产)试剂盒，按照使用说明书进行石蜡包埋组织样本DNA提取。将DNA稀释至5～10ng/μl。

2.取试剂盒中的检测试剂以及阳性质控品(PC)。待检测试剂及阳性质控品PC融化后短暂离心，置于冰上。

3.将2.5μl Taq DNA聚合酶和25μl待检DNA样品、阴性质控品(NC，溶解DNA的缓冲液，由使用者自备)及阳性质控品PC分别混合。按5.5μl/孔分装混合液至八连管中，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心。注意：每种模板与酶的混合液需同时加入试剂1～试剂4的孔中(八连管的A～D孔，或E～H孔)进行后续检测。

4.荧光PCR仪检测通道设定需同时选择FAM、HEX/VIC通道(参比染料设置为“无”)。反应程序见表3：

表3 荧光PCR反应程序

四.检测结果判定

1.Ct值确定：仪器自动设定荧光PCR仪的基线和阈值线，必要时手工调整，确保阈值线处于扩增曲线指数期。从软件中读取各样本在各检测孔的Ct值。

2.定性分析：

(1)实验质量评判：若NC中各通道检测均无扩增(不呈典型的S型曲线。注：典型的S型曲线依次表现为指数期、直线期及平台期)或无Ct值、PC中各通道检测均有扩增(呈典型的S型曲线)且Ct值≤35，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验。

(2)待检DNA样品中内控基因(IC)检测情况评判：若内控基因检测(HEX/VIC通道)有扩增且20≤Ct值≤35，则可继续分析；若其Ct值较小，则认为DNA样品浓度过高；若其Ct值较大或无扩增，则认为DNA样品浓度过低、发生降解，或其中可能含有PCR抑制剂。

(3)待检DNA样品中POLE基因突变状态判定：

分别计算试剂1～试剂4中突变通道(FAM)Ct值与同一孔中内控通道(HEX/VIC)Ct值的差值(ΔCt)，ΔCt＝突变通道Ct-同孔内控Ct。

a.若试剂1～试剂4中的突变检测均无扩增、或Ct值≥38、或ΔCt≥9，则判定为样品中无POLE基因突变或低于试剂检测限。

b.若试剂1～试剂4中存在某一孔或多孔试剂中突变检测Ct值＜38且ΔCt＜9，则判为POLE基因突变阳性。

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例

实施例1：检测POLE基因突变的分析灵敏度(最低检测限)

(1)检测限参考品的制备

a)通过本领域内常规使用的基因克隆技术，根据突变型基因的序列设计并构建对应的突变型质粒，见表1。通过Sanger测序法验证所构建的含POLE突变型基因序列的质粒(以下简称“突变质粒”)的序列符合设计要求。

b)选择人肠癌细胞系HT-29(其中POLE基因为野生型)进行体外培养，收集细胞后使用细胞基因组DNA提取试剂盒，提取HT-29细胞系DNA，并使用微量分光光度计对DNA进行浓度测定，根据测定浓度将DNA用TE(Tris-HCl EDTA pH 8.0)稀释至4ng/μl。

c)将每种突变型对应的突变质粒用TE稀释至不同浓度，分别与上述HT-29细胞基因组DNA(4ng/μl)等体积混合，即可得到2ng/μl基因组DNA且含有不同突变比例的突变参考品。

d)使用NGS(二代测序)试剂盒测定上述参考品中的突变比例，并与野生型DNA混合，即可制备得到不同突变比例(5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％)的检测限参考品。

e)使用超声仪(Covaris M220型)及使用说明书中的参数配置可将基因组DNA超声打断成150±50bp长度的片段化DNA，与血浆游离DNA(cfDNA)的长度几乎一致，可作为cfDNA参考品使用。

(2)最低检测限的测定

分别针对含有不同突变比例(5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％)的各突变型的检测限参考品，采用上述方法连续检测20次，将检出率至少95％的最低突变比例确定为检测试剂的最低检测限。

结果表明，不论使用基因组DNA还是cfDNA参考品，根据上述方法配制出的试剂1～试剂4均可检出对应突变型参考品，最低检测限可达0.1％。

实施例2：检测试剂的分析特异性

(1)野生型参考品的制备

a)选择人肠癌细胞系HT-29(其中POLE基因为野生型)进行体外培养，收集细胞后使用细胞基因组DNA提取试剂盒，提取HT-29细胞系DNA，并使用微量分光光度计对DNA进行浓度测定，根据测定浓度将DNA用TE(Tris-HCl EDTA pH 8.0)分别稀释至2、5、20、50、100ng/μl。

b)使用超声仪(Covaris M220型)及使用说明书中的参数配置可将基因组DNA超声打断成150±50bp长度的片段化DNA，与血浆游离DNA(cfDNA)的长度几乎一致，可作为cfDNA参考品使用。

(2)强阳性参考品的制备

参照实施例1中的方法，配制表1所示的突变型的阳性参考品，使用NGS(二代测序)试剂盒测定阳性参考品中的突变比例，并与野生型DNA混合，即可制备得到较高突变比例(70～90％)的强阳性参考品。

(3)分析特异性的测定

分别针对2、5、20、50、100ng/μl野生型基因组DNA参考品或cfDNA参考品，以及含有较高突变比例(70～90％)的各突变型的强阳性参考品，采用上述方法连续检测5次。

结果表明，不论使用基因组DNA还是cfDNA参考品，根据上述方法配制出的试剂1～试剂4检测野生型DNA时均为阴性，无假阳性结果产生；试剂1可检出对应突变型(M1、M2)参考品、试剂2可检出对应突变型(M3)参考品、试剂3可检出对应突变型(M4、M5、M6)参考品、试剂4可检出对应突变型(M7、M8)参考品，且均不识别其对应突变型之外的其他突变型参考品。此结果表明试剂1～试剂4不存在交叉反应，具有高度特异性。

实施例3：检测用引物和探针序列改变后，影响分析灵敏度和/或分析特异性，使最低检测限无法达到0.1％，且/或存在交叉识别。交叉识别指的是试剂1/试剂2/试剂3/试剂4将野生型DNA误检为阳性，或将与之对应突变型之外的突变型参考品误检为阳性。

因此本发明所述的引物和探针序列，以及引物和探针的分组方式均为最优组合，可一次性同时检测POLE基因8种突变，且可确保在检测POLE基因突变时具有高灵敏度和高特异性。

实施例4：检测100例结直肠癌患者癌组织或血浆样本中POLE基因突变并与NGS结果对比

(1)收集100例结直肠癌患者的癌组织石蜡包埋组织样本(50例)或全血样本(50例)。其中，采集全血盛装在可保护游离DNA稳定性的专用抗凝采血管(Streck公司生产)中，在4～30℃稳定保存7天。

(2)每例样本取2片石蜡切片(5μm厚)，使用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取组织样本DNA，并使用微量分光光度计检测DNA浓度，将其稀释至2ng/μl待用。DNA样本在-20℃或以下冷冻条件下保存时限不超过3个月。

(3)使用全血样本分离血浆：将全血采血管2000g在室温下离心10分钟；将上清小心取出(避免吸到中间絮状白细胞层)，进行第二次离心，4℃下15000g离心10分钟；分离上清得到不含细胞成分(cell free)的血浆样本，放置于-70℃冻存直至DNA提取，或直接进行DNA提取。

(4)使用血浆游离DNA提取试剂盒(Qigan公司生产)从4ml血浆中提取游离DNA(cfDNA)。提取DNA之后应立即用原液检测，无需稀释。

(5)针对提取出的组织DNA和游离DNA，按照上述方法进行POLE基因突变的荧光PCR检测，并与NGS检测结果对比。

结果表明，通过本发明所述的荧光PCR试剂盒检出POLE突变共4例(组织3例、血浆1例)。荧光PCR检测结果与NGS检测结果完全一致，但检测步骤和结果判定更简单方便、检测时间更短。此结果表明通过本发明所述引物、探针和试剂盒可以准确检测出组织样本和血浆样本中POLE基因突变，且检测操作简单、时间短、结果易于判定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于POLE基因突变检测的引物、探针组合，其包括下列4组16条引物和探针：

第一组：SEQ ID No：1～SEQ ID No：4；

第二组：SEQ ID No：5～SEQ ID No：7；

第三组：SEQ ID No：8～SEQ ID No：12；

第四组：SEQ ID No：13～SEQ ID No：16。

2.一种用于检测POLE基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的4组16条引物和探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括内控基因。

4.一种用于检测POLE基因突变的方法，其包括以下步骤：

(1)针对POLE基因突变位点，设计特异性引物和探针；

(2)提取检测样本中DNA；

(3)建立实时荧光PCR扩增反应体系；

(4)根据荧光PCR仪显示的Ct值，计算ΔCt值，根据Cutoff判断检测结果：当ΔCt＜Cutoff时，判为阳性；当ΔCt≥Cutoff时，判为阴性或低于检测限。

5.权利要求4的方法，其中所述引物和探针为权利要求1的引物、探针组合。