CN110468197A - 一种aldh2基因g1510a多态性快速分析检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种aldh2基因g1510a多态性快速分析检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种ALDH2基因G1510A多态性快速分析检测试剂盒及方法。具体地，本发明采用经简单处理口腔拭子样本，然后采用经典的荧光PCR直接对ALDH2 c.1510 G>A位点多态性进行检测。此检测方法一方面无需采集人外周血，以少量口腔上皮细胞为样本；另一方面无需对样本进行核酸提取或纯化，便可对ALDH2 c.1510 G>A位点准确分型，克服了传统PCR对核酸提取的依赖及对样本质量要求高的缺点，简化了样本采集及处理检测流程、避免了样本采集的创伤性，极大缩短了SNP分型时间、降低了研究成本和技术复杂性。

Description

一种ALDH2基因G1510A多态性快速分析检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术和检测领域，具体地说，本发明涉及一种ALDH2基因G1510A多态性快速分析检测试剂盒及方法。
背景技术
ALDH2是乙醛脱氢酶中活性最强的同工酶,存在于线粒体内，该酶催化***转化为1,2-二***、亚硝酸盐和NO，是使***活化并释放NO的关键酶。ALDH2基因c.1510G>A位点多态性导致该酶活性存在明显差异，进而导致***转化效率不同。研究表明ALDH2突变导致患者对***有效率及快速起效率明显降低。
目前，ALDH2基因c.1510G>A位点常用的检测方法有基于PCR方法的等位基因特异性PCR法(AS-PCR)、荧光PCR法和测序法、高分辨率溶解曲线法，这些检测方法均需要以核酸为模板进行检测，常用的核酸提取方法有磁珠核酸提取法和柱提核酸提取法。
常见的单核苷酸多态性检测方法包括：
(1)等位基因特异性聚合酶链反应(allele specific PGR，AS-PCR)是一种较为简单的检测SNP基因型的策略。其基本原理是根据SNP位点的碱基类型设计引物，这种引物包括一条共用的上游引物(或下游引物)链，一条特异性下游引物(或上游引物)链。共用引物链按常规方法进行设计，特异性引物链需根据SNP位点的突变方向及类型对特异链的3'端最后一个碱基进行设置。野生型和突变型特异性引物链是分别与共用引物链在两支不同的PCR管中进行反应的，随后通过琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的PCR产物的产生，从而达到SNP基因分型的目的。
(2)荧光PCR法是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端～3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
采用“等位基因特异PCR”技术结合荧光探针检测特异性扩增产物。只有当等位基因特异性引物3’末端碱基与对应的等位基因型模板完全互补配对时，PCR扩增反应可以正常进行而得到特定产物，并产生荧光信号，反之，则无特异性PCR扩增反应，因而观察不到荧光信号或其Ct值非常高。
(3)CE测序法适合对短基因片断的SNP筛查，通过直接测序方法进行SNP检测的检出率准确度接近100％；其原理为：将可能的SNP位点进行PCR扩增，结合DNA测序找到SNP位点并确定碱基替换类型。但是缺点是周期长，费用大，且容易发生交叉污染。
常见的核酸提取方法包括：
(1)磁珠核酸提取法是依据磁珠结合液中含强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使核酸解离出来；在其存在的情况下，释放出来的核酸成分可以结合在磁珠上，随后通过磁珠洗涤液的作用，将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂志去除。然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。
(2)柱提核酸提取法是采用高效裂解缓冲***，结合硅胶膜吸附柱技术快速高效的提取样本中的核酸。裂解液中含强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使蛋白质解离出来；在裂解液和乙醇存在下，释放出来的核酸成分可以结合在硅胶膜上；随后通过抑制物去除液、去离子液作用，将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质除去。然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。
目前单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism SNP)的检测多采用外周血样本提取的基因组DNA，由于该方法不适于现场操作，且受到样本保存条件和DNA提取效果的限制，在大规模人群SNP筛检中不易推广。
因此，本领域迫切需要开发高特异性、高灵敏度、操作简单的检测ALDH2基因G1510A位点基因多态性的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ALDH2基因G1510A多态性快速分析检测试剂盒及方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测ALDH2基因多态性的引物组，所述引物组包括：
ALDH2基因G1510A位点的上游引物：SEQ ID NO：1；
ALDH2基因G1510A位点野生型下游引物：SEQ ID NO：2；
ALDH2基因G1510A位点突变型下游引物：SEQ ID NO：3；
ALDH2基因G1510A位点野生型封闭引物：SEQ ID NO：4；和
ALDH2基因G1510A位点突变型封闭引物：SEQ ID NO：5。
在另一优选例中，所述引物组还包括：
内控上游引物：SEQ ID NO：6；和
内控下游引物：SEQ ID NO：7。
本发明的第二方面，提供了一种检测ALDH2基因多态性的探针组，所述探针组包括：
ALDH2基因G1510A位点探针：SEQ ID NO：8。
在另一优选例中，所述探针组还包括：
内控探针：SEQ ID NO：9。
在另一优选例中，所述ALDH2基因G1510A位点探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述内控探针的5’端包含有不同于所述ALDH2基因G1510A位点探针的荧光报告基团；和/或，所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测ALDH2基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物组。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括独立分装的第一引物探针混合液和第二引物探针混合液，
其中，所述第一引物探针混合液包括：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
所述第二引物探针混合液包括：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
在另一优选例中，所述第一引物探针混合液和/或所述第二引物探针混合液还包括：
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：9所示的核酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括独立分装的阳性对照，和/或阴性对照。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括荧光PCR反应酶；和/或荧光PCR用缓冲液。
本发明的第四方面，提供了一种检测ALDH2基因多态性的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的DNA样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述DNA样本、本发明第一方面所述的引物组、和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述DNA样本来自口腔拭子。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，步骤(1)中包括步骤：
制备口腔拭子样本，加入细胞裂解液，用振荡器剧烈振荡混匀后瞬时离心，95℃-100℃处理5～15分钟；离心分离上清液即得所述DNA样本(口腔拭子上清液)。
在另一优选例中，口腔拭子样本和细胞裂解液的体积比为1：1～3；优选为1：1。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述PCR反应体系包含0.75μL～1.25μL所述DNA样本。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，分别配制第一PCR反应体系和第二PCR反应体系并分别进行PCR反应，其中所述第一PCR反应体系中包含所述第一引物探针混合液，所述第二PCR反应体系中包含所述第二引物探针混合液。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶；和/或PCR用缓冲液。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物组、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测ALDH2基因多态性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1ALDH2基因C.1510G>A位点野生型PCR反应管阴性对照的PCR结果。
图2本发明检测ALDH2基因C.1510G>A位点突变型PCR反应管阴性对照的PCR结果。
图3本发明检测ALDH2基因C.1510G>A位点野生型PCR反应管阳性对照的PCR结果。
图4本发明检测ALDH2基因C.1510G>A位点突变型PCR反应管阳性对照的PCR结果。
图5对照引物组1检测ALDH2基因C.1510G>A位点突变型PCR反应结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，开发了一种检测ALDH2基因G1510A位点多态性的方法及试剂盒，本发明的试剂盒能够以口腔拭子样品进行直接PCR扩增，省去了核酸提取步骤，因此使用更加方便，具有检测快速、高准确性、高灵敏度和低成本的特点。
目前单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism SNP)的检测多采用外周血样本提取的基因组DNA，由于该方法不适于现场操作，且受到样本保存条件和核酸质量的限制，在大规模人群SNP筛检中不易推广。本发明可以直接采用简单处理后的口腔拭子作为PCR反应的模板，应用常规PCR Buffer进行ALDH2基因C.1510G>A位点多态性检测。此检测方法克服了传统PCR反应样本采集具有创伤性，且检测依赖于核酸提取和对核酸质量要求高的缺点，简化了操作过程，降低了检测成本和技术复杂性，缩短了检测时间。
本发明为PCR直接扩增技术，采用样本处理液对样本进行简单处理，然后采用经典的荧光PCR直接对ALDH2 c.1510G>A位点多态性进行检测。此检测方法一方面无需采集人外周血，以少量口腔上皮细胞为样本；另一方面无需对样本进行核酸提取或纯化，便可对ALDH2 c.1510G>A位点准确分型，克服了传统PCR对核酸提取的依赖及对样本质量要求高的缺点，简化了样本采集及处理检测流程、避免了样本采集的创伤性，极大缩短了SNP分型时间、降低了研究成本和技术复杂性。
在本发明的具体实施方式中，本发明提供了一种基于实时荧光PCR平台，使用免核酸提取的快速定性检测人口腔拭子中的ALDH2基因c.1510G>A位点多态性的方法、样本快速处理方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，具有操作流程简单、检测时间短、检测成本低等优点。
本发明的技术方案如下：
一种基于实时荧光PCR平台，免核酸提取的快速定性检测人外周全血样本中的ALDH2基因c.1510G>A位点多态性的方法、样本快速处理方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。提供了用于检测ALDH2基因c.1510G>A位点多态性所需的特异性引物及探针。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明公开了一种简单的样本处理方法，其上清液可直接进行PCR扩增检测：
所述样本处理方法是将吸取口腔拭子样本200μL，加入200μL细胞裂解液，用振荡器剧烈振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。100恒温处理8～15分钟；12,000rpm离心5分钟，分离上清液备用。上清液可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用。
所述细胞裂解液组分包括Tri-HCl(PH8.3)、EDTA(PH8.0)、NP-40和纯化水。
优选地，所述Tri-HCl(PH8.3)在细胞裂解液中的终浓度为5.6～10.8mmol/L，所述EDTA(PH8.0)在细胞裂解液中的终浓度为0.5～2.0mmol/L，所述NP-40在细胞裂解液中的含量为0.1～1.5％。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明公开了一种快速定性检测人口腔上皮细胞中的ALDH2基因c.1510G>A位点多态性的引物、探针：
所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点野生型的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A突变型的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的野生型封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的突变型封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述检测内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述检测内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述探针包括检测ALDH2基因c.1510G>A位点多态性的探针和内控基因探针；所述ALDH2基因c.1510G>A位点的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：8，内控的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步，所述SEQ ID NO：8核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1，所述SEQ ID NO：9核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
优选地，所述ALDH2基因c.1510G>A位点上游引物在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L，所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的野生型封闭引物在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L，所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的突变型封闭引物在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L，所述ALDH2基因c.1510G>A位点野生型的下游引物在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L，所述ALDH2基因c.1510G>A位点突变型的下游引物在反应体系中的终浓度为0.9μmol/L，所述ALDH2基因c.1510G>A位点探针在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L；所述内控上游引物在反应体系中的终浓度为1μmol/L，所述内控下游引物在反应体系中的终浓度为1μmol/L，所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L。
表1检测ALDH2基因c.1510G>A位点的引物探针核苷酸序列信息
上述PCR引物和标有不同荧光标记的探针可分别用于对ALDH2基因c.1510G>A位点多态性进行检测，根据野生反应管和突变反应管结果呈现的荧光信号有无，判断样本中ALDH2基因c.1510G>A位点型别；上述引物和探针根据人ALDH2基因c.1510G>A位点所在区段和内控基因DNA序列设计并合成，可以检测ALDH2基因c.1510G>A位点的型别；所述特异性引物和探针，能够准确检测ALDH2基因c.1510G>A位点的型别。
在本发明的另一个优选的实施方式中，本发明还公开了一种ALDH2基因c.1510G>A位点多态性快速检测试剂盒，包括用于配制PCR反应液的引物探针混合液、细胞裂解液、5×DNA buffer、热启动Taq酶、对照样本和纯化水，其中，引物探针混合液包括如下成分，如表2，
表2引物探针混合液
其中，所述用于检测ALDH2基因c.1510G>A位点和内控基因的引物与探针分别如下：
所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点野生型的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A突变型的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的野生型封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述检测ALDH2基因c.1510G>A位点的突变型封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述检测内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述检测内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述探针包括检测ALDH2基因c.1510G>A位点多态性的探针和内控基因探针；所述ALDH2基因c.1510G>A位点的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：8，其5’端标记有FAM荧光报告基团；内控的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，其5’端标记有VIC荧光报告基团；所述所有探针的3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
检测ALDH2基因C.1510G>A位点多态性时，ALDH2基因C.1510G>A位点的探针和上游引物分别与野生型和突变型下游引物组成野生型反应管和突变型反应管，分别与所扩增的目的片段上C.1510G>A位点所在的片段结合，分别释放FAM荧光信号；所述内控引物与探针是根据人管家基因保守片段设计并合成的，用于样本和实验过程的监控。
所述PCR反应液的样本处理液包括如下成分，如表3，
表3样本处理液
编号 组分 组分中的主要成分
1 细胞裂解液 Tri-HCl、EDTA、NP-40
所述PCR反应液的5×DNA buffer包括如下成分，如表4，
表4 5×DNA buffer
编号 组分 组分中的主要成分
1 5×DNA buffer (NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>、DTT
所述对照品包括如下成分，如表5：
表5对照样本
编号 组分 组分中的主要成分
1 阴性对照 纯化水
2 阳性对照 细胞核酸溶液
所述阳性对照的为ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型细胞核酸溶液，阴性对照样本为纯化水。
本发明所述试剂盒适用样本为人口腔上皮细胞。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组均为阴性时，表明实验结果有效。
在本发明的另一个优选的实施放肆中，本发明还公开了一种ALDH2基因C.1510G>A位点多态性快速检测的方法，具体步骤包括：
1.处理待测样本；优选地，待测样本为人口腔上皮细胞；
采用口腔拭子取口腔上皮细胞于样本保存液中，振荡10s，8000rpm离心30s，吸出500μL上清，再将剩余样本保存液振荡10s，取200μL样本，加入200μL细胞裂解液，振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理5～15分钟；12,000rpm离心5分钟，取上清液备用。
2.配制PCR反应体系，将特异性引物和探针、5×DNA buffer、热启动Taq酶、纯化水混合，加入处理后的待测样本上清液1μL，制备得到野生型PCR反应液和突变型PCR反应液；PCR反应液构成分别如表6和表7，
表6野生型PCR反应液
表7突变型PCR反应液
3.将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。
4.荧光通道选择：
1)选择FAM通道检测ALDH2基因C.1510G>A位点野生型和突变型；
2)选择VIC通道检测内标通道；
3)选择参比荧光(Passive Reference)为None(ABI7500需)。
5.设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL。
6.设置完成后，保存文件，运行程序。
7.本申请采用的PCR检测原理如下：主要应用实时荧光PCR技术，对人类外周全血基因组中ALDH2基因C.1510G>A多态性位点设计特异性引物和探针，扩增以区分其型别。设计特异性引物和探针，配以热启动DNA聚合酶等成分组成核酸扩增试剂，使用荧光PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，经煮沸处理后的外周全血上清液加入PCR反应管中，仪器软件***自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(Ct值)实现对未知样本的定性检测。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种ALDH2基因C.1510G>A位点快速定性检测的方法、样本快速处理方法、引物、探针及试剂盒，该试剂盒基于实时荧光PCR平台，使得检测体系可以直接对简单处理后的血液样本进行检测。具体实施步骤如下，
步骤一、待测样本处理采集人口腔上皮细胞于样本保存液中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。振荡10s，8000rpm离心30s，吸出500μL上清，再将剩余样本保存液振荡10s，取200μL样本，加入200μL样处理液，振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理5～15分钟；12,000rpm离心5分钟，取上清液备用。上清液可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用。
步骤二、PCR体系的制备
PCR体系配制前准备：取出试剂盒中的特异性引物和探针、5×DNA buffer、热启动Taq酶、纯化水等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制PCR体系；PCR体系构成如表8和表9：
表8野生型PCR体系
表9突变型PCR体系
所述引物探针的核苷酸序列信息分别如下：
检测ALDH2基因C.1510G>A位点多态性的引物探针核苷酸序列信息：
步骤三、加样
取步骤一所制备的人口腔拭子样本和阴阳性质控品处理后的上清液各1μL，加入至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液的总体积为25μL；盖紧八联管管盖，充分混匀，高速离心10秒；所述试剂盒的对照样本如表10：
表10试剂盒的对照样本
编号 组分 组分中的主要成分
1 阴性对照 纯化水
2 阳性对照 细胞核酸溶液
所述阳性对照为ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型细胞核酸溶液，阴性对照样本为纯化水。
步骤四、PCR扩增
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测ALDH2基因C.1510G>A位点野生型和突变型；选择VIC通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
步骤五、结果读取及分析
反应结束后自动保存结果，根据扩增曲线划定合适的基线和阈值。基线(Baseline)的起始值(Start值)一般建议在3～15之间；基线的终止值(End值)一般建议在5～20之间；阈值(Threshold值)建议为各通道检测最高荧光值的1/20。基线和阈值设置完成后，点击分析(Reanalyse)自动获得各通道的Ct值，根据各通道Ct值进行结果判断。
本发明的主要优点在于：
(1)本试剂盒优化了特异性引物探针，分别针对ALDH2基因C.1510G>A位点野生型和突变型进行检测，能够用经简单处理的人口腔上皮细胞直接进行PCR扩增检测。
(2)使用本发明提供的快速处理后的人口腔上皮细胞作为PCR反应的模板，配以本试剂盒特异性引物与探针，可实现对ALDH2基因C.1510G>A位点多态性的快速检测。
(3)本发明的检测方法克服了传统PCR反应依赖于核酸提取，对核酸样本质量要求高的缺点，极大的简化了操作过程，降低了研究成本和技术复杂性，缩短了检测时间。
(4)本发明适用于对孕妇的ALDH2基因C.1510G>A位点多态性进行检测，ALDH2基因突变可导致其酶活性降低，引起***代谢障碍；通过型别鉴定可指导***的用药，提高治疗效果。
本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在新药研发过程中，使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息，这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需，也可以用于药物代谢机制的研究及靶向新药研发。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：ALDH2基因C.1510G>A位点快速分型检测的试剂盒
本实施例的试剂盒的组成成分、包装及数量(48反应/盒)，如表11：
表11试剂盒的组成成分、包装及数量
实施例2：检测范围及灵敏度检测
选取检测结果ALDH2基因C.1510G>A位点野生型20例作为检测样本，编号为A1～A20，选取检测结果ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型20例作为检测样本，编号为B1～B20，选取检测结果ALDH2基因C.1510G>A位点纯合突变型20例作为检测样本，编号为C1～C20。将样本振荡10s，8000rpm离心30s，吸出500μL上清，再将剩余样本保存液振荡10s，取200μL样本，加入200μL细胞裂解液，振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理5～15分钟；12,000rpm离心5分钟，取上清液备用。各0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL、1.75μL、2μL上清液上样检测，阴性对照为纯化水，加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测ALDH2基因C.1510G>A位点野生型和突变型；选择VIC通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
用PCR***对本发明的样本检测范围进行测定，实际测得的结果如表12所示，
表12样本检测范围实验结果
本试剂盒的最低检测限为0.5μL，最高检测限为1.5μL，通过对ALDH2基因C.1510G>A位点不同型别的0.5μL、1μL和1.5μL样本上清液分别重复20次进行检测，灵敏度检测良好；因此，本发明的样本检测范围为0.5μL～1.5μL。推荐上样量为1μL。
实施例3：准确性检测
试剂盒检测含ALDH2基因C.1510G>A位点野生型阳性参考品P1、ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型阳性参考品P2和ALDH2基因C.1510G>A位点纯合突变型阳性参考品P3，各20个重复，阴性对照为纯化水，将样本振荡10s，8000rpm离心30s，吸出500μL上清，再将剩余样本保存液振荡10s，取200μL样本，加入200μL样处理液，振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。
100℃恒温处理5～15分钟；12,000rpm离心5分钟，取上清液检测，阴性对照为纯化水，加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测ALDH2基因C.1510G>A位点野生型和突变型；选择VIC通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
用PCR***对本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表13，
表13准确性检测结果
根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。
实施例4：临床应用实验
抽取20例人口腔拭子样本于样本保存液中，该样本已经通过核酸提取后，测序进行检测，并且明确为ALDH2基因C.1510G>A位点型别的1种，做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。将样本振荡10s，8000rpm离心30s，吸出500μL上清，再将剩余样本保存液振荡10s，取200μL样本，加入200μL细胞裂解液，振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理5～15分钟；12,000rpm离心5分钟，分离上清液。上清液可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
取每个样本的上清液1μL及试剂盒中对照样本各1μL，加样至步骤二配制的PCR反应体系的八联管中，使每管PCR反应液的总体积为25μL；盖紧管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测ALDH2基因C.1510G>A位点野生型和突变型；选择VIC通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
用本发明试剂盒对20例人口腔拭子样本进行检测，得到结果如表14，
表14 20例人口腔拭子样本检测结果
检测结果为：20例样本中，12例样本呈ALDH2基因C.1510G>A位点野生型，6例样本呈ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型，2例样本呈ALDH2基因C.1510G>A位点纯合突变型，所检结果与测序检测结果一致性为100％。
对比例1
本发明人在研究过程中，针对ALDH2基因C.1510G>A位点筛选了数十组PCR引物和探针，其中绝大部分无法用于口腔拭子上清液样品的检测，显示出特异性低、灵敏度差、准确性低等问题，无法满足应用需求。
部分实验结果例举如下，检测方法同实施例2(ALDH2基因C.1510位点杂合突变型样本)：
对照引物组1：
ALDH2基因c.1510G>A位点的上游引物：5’-CTTTGGGGCAATACAGGG-3’(SEQ ID NO：10)
ALDH2基因c.1510G>A位点位点野生型下游引物:5’-GAAGTGAAAACTGTGAGT-3’(SEQID NO：11)
ALDH2基因c.1510G>A位点位点突变型下游引物：5’-AAAGTGAAAACTGTGAGT-3’(SEQID NO：12)
ALDH2基因c.1510G>A位点探针：5’-TGCTATGATGTGTTTGGAGCC-3’(SEQ ID NO：19)
其它引物探针同表1。
检测结果如图5所示，结果表明，对照引物组1完全无法适用于口腔拭子上清液样品的检测。
对照引物组2：
ALDH2基因C.1510G>A位点的上游引物：5’-CAGGGGGTCCTGGGAGTG-3’(SEQ ID NO：13)
ALDH2基因C.1510G>A位点野生型下游引物：5’-GAAGTGCAAACTGTGAGT-3’(SEQ IDNO：14)
ALDH2基因C.1510G>A位点突变型下游引物：5’-AAAGTGCAAACTGTGAGT-3’(SEQ IDNO：15)
ALDH2基因c.1510G>A位点探针：5’-TGTTTGGAGCCCAGTCACC-3’(SEQ ID NO：20)
其它引物探针同表1。
检测结果表明，使用对照引物组2检测口腔拭子上清液样品，经检测限优化后，20例ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型样本的最高符合率仅为60％(12/20)。
对照引物组3：
ALDH2基因C.1510G>A位点的上游引物：5’-GCAACAGAGAAAGATTCT-3’(SEQ ID NO：16)
ALDH2基因C.1510G>A位点野生型下游引物：5’-GAAGCGAAAACTGTGAGT-3’(SEQ IDNO：17)
ALDH2基因C.1510G>A位点突变型下游引物：5’-AAAGCGAAAACTGTGAGT-3’(SEQ IDNO：18)
ALDH2基因c.1510G>A位点探针：5’-TCTGCAATCTCGTTTCAA-3’(SEQ ID NO：21)
其它引物探针同表1。
检测结果表明，使用对照引物组3检测口腔拭子上清液样品，经检测限优化后，20例ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型样本的最高符合率能够达到90％(18/20)。
采用实施例3的方法进行准确性检测，检测样品包括含ALDH2基因C.1510G>A位点野生型阳性参考品P1、ALDH2基因C.1510G>A位点杂合突变型阳性参考品P2和ALDH2基因C.1510G>A位点纯合突变型阳性参考品P3，各20个重复。对照引物组3针对P1、P2、P3的检测准确率分别为80％、90％、85％，无法满足实际临床需求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 一种ALDH2基因G1510A多态性快速分析检测试剂盒及方法
<130> 00035
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
aaagactttg gggcaata 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gaattgcaaa ctgtgagt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aaattgcaaa ctgtgagt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
aaagtgaaaa ctgtgagt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gaagtgaaaa ctgtgagt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
cctgactgac tacctcat 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
tgagtggaga ctgtctcc 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
caaattacag ggtcaactgc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
ctacagcttc accaccacgg c 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
ctttggggca atacaggg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
gaagtgaaaa ctgtgagt 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
aaagtgaaaa ctgtgagt 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
cagggggtcc tgggagtg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
gaagtgcaaa ctgtgagt 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
aaagtgcaaa ctgtgagt 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
gcaacagaga aagattct 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
gaagcgaaaa ctgtgagt 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
aaagcgaaaa ctgtgagt 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
tgctatgatg tgtttggagc c 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
tgtttggagc ccagtcacc 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
tctgcaatct cgtttcaa 18

Claims (10)

1.一种检测ALDH2基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
ALDH2基因G1510A位点的上游引物：SEQ ID NO：1；
ALDH2基因G1510A位点野生型下游引物：SEQ ID NO：2；
ALDH2基因G1510A位点突变型下游引物：SEQ ID NO：3；
ALDH2基因G1510A位点野生型封闭引物：SEQ ID NO：4；和
ALDH2基因G1510A位点突变型封闭引物：SEQ ID NO：5。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括：
内控上游引物：SEQ ID NO：6；和
内控下游引物：SEQ ID NO：7。
3.一种检测ALDH2基因多态性的探针组，其特征在于，所述探针组包括：
ALDH2基因G1510A位点探针：SEQ ID NO：8；
优选地，所述探针组还包括：
内控探针：SEQ ID NO：9。
4.一种用于检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针组。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立分装的第一引物探针混合液和第二引物探针混合液，
其中，所述第一引物探针混合液包括：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：8所示的核酸序列；
所述第二引物探针混合液包括：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液和/或所述第二引物探针混合液还包括：
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：9所示的核酸序列。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括独立分装的阳性对照，和/或阴性对照。
9.一种检测ALDH2基因多态性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的DNA样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述DNA样本、权利要求1所述的引物组、和权利要求3所述的探针组。
10.权利要求1所述的引物组、和/或权利要求3所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测ALDH2基因多态性。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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CB02 Change of applicant information
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Address after: 510665 No. 19 incense Hill Road, hi tech Industrial Development Zone, Guangdong, Guangzhou

Applicant after: Guangzhou Da'an gene Co.,Ltd.

Address before: 510665 No. 19 incense Hill Road, hi tech Industrial Development Zone, Guangdong, Guangzhou

Applicant before: DA AN GENE CO., LTD. OF SUN YAT-SEN University