CN105274104A - 一种预测抗pd-l1抗体药物药效的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预测抗PD-L1抗体药物药效的检测试剂盒,其中包括检测POLD蛋白和POLE蛋白纠正DNA合成错误的结构域对应的基因位点的引物及探针。本发明通过荧光定量PCR基因突变检测来预测抗PD-L1抗体药物疗效,为临床癌症患者用药前疗效预测快速检测开辟新的、简洁方便的检测途径。荧光定量PCR扩增结束后,通过曲线形状及Ct值判断POLE及POLD1基因突变,检测结果可用于用药前的辅助检测及疗效预测,为临床诊断和治疗提供分子诊断依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种预测抗PD-L1抗体药物药效的检测试剂盒。
背景技术
治疗癌症传统的方法是使用特定的物理或者化学手段,直接杀死特定肿瘤的癌细胞。经过科学家们的努力发现了一种新的治疗癌症的方法,即利用一种药物松绑免疫***,剿灭恶性细胞成为了现实,为癌症的治疗打开了一片新的天地。
近几年发现,多种肿瘤细胞表面高表达PD-L1(也叫CD274或者B7-H1),通过与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合,抑制淋巴细胞的功能,是导致肿瘤发生免疫逃逸的重要原因之一。因此靶向竞争PD-L1分子,阻断PD-L1与PD-1分子的结合,可以阻止肿瘤细胞的免疫逃逸,从而让免疫***重新识别并杀灭肿瘤细胞。
目前PD-L1抑制药有罗氏公司的MPDL3280A和阿斯利康的MEDI4736,这两个公司的药物在癌症治疗临床试验中获得了很大的进展。其中罗氏公司的MPDL3280A已经结束了I期临床研究,这是一项单组、多中心、开放标签研究,涉及68例经治转移性膀胱癌患者,其中30例为PD-L1阳性。经MDPL-3280A治疗后随访6周,客观解缓率(ORR)为43%(13/30),在随访的12周,ORR为52%(13/25)。阿斯利康的MEDI-4736已经在肺癌和头颈部癌症治疗中发挥了很好的潜力。虽然这些药物的疗效相比传统的方法疗效好,但是对癌症病人的分层并没有一个好的具有用药指导意义的分子标记。这对服用这种药物无效的人群会造成经济上不必要的浪费,并且会延误更好的治疗时机。
关于预测该类药物的疗效目前科学家们做了大量的研究并发表了大量的文章,目前有一些假说比如肿瘤细胞表面PD-L1分子的表达、免疫细胞的浸润、突变负担、新抗原的数量、微卫星不稳定性等等指标与该类药物的疗效相关,但是因为缺乏临床数据或者是检查方法花费巨大以及缺乏临床操作性等等原因,并不能够很好的实行。
具体的现有技术及其缺陷如下:
(1)全外显子测序技术预测突变负担,通过软件计(NetMHCpantool9(version2.4))算新抗原的数量。新抗原的数量大,患者的疗效好。全外显子测序技术直接测序法:该方法的检测周期较长,成本相对较高。
(2)检测MSI(微卫星不稳定)预测肿瘤组织的突变负担,包括:
a)免疫组化方法(使用特异性抗体结合肿瘤细胞中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的蛋白,结合上才会显色,如果没有结合任何的蛋白,则证明发生了MSI);
b)直接检测微卫星的重复数量(微卫星位点包括21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26等)。
由于DNA损伤修复涉及的蛋白不仅仅有MMR(错配修复),DNA复制过程中的POLD以及POLE基因也参与了DNA修复,如果仅仅检测MSI会让一部分突变负担重的患者不能被检测到。
(3)通过免疫组化的方法检测肿瘤组织的PD-L1蛋白的表达。根据视野范围内,显色的细胞的数量比例,来确定结果的分级。(IHC0(<1%)、1(1%-5%)、2(5%-49%)、3(>50%)。
通过免疫组化的方法检测肿瘤组织的PD-L1蛋白的表达。现有的技术不够客观,并且很多的临床研究数据显示,肿瘤组织的PD-L1蛋白的表达与PD-L1的疗效并不相关,相关的是肿瘤微环境中的淋巴细胞表面表达的PD-L1。
现有的技术都是基于一个假说的前提下,即突变负担重的肿瘤,会产生大量的新抗原,因此会吸引大量的具有杀伤性的T细胞,在PD-1和PD-L1的结合被阻断了之后,免疫抑制被松绑,这些本已存在或者因为新抗原吸引的T细胞就会过来起到杀灭肿瘤细胞的作用。因此,目前公认的技术都是通过各种指标来预测肿瘤组织中可能产生新抗原的数量程度。
发明内容
由于DNA损伤修复涉及的蛋白不仅仅有MMR(错配修复),DNA复制过程中的POLD以及POLE基因也参与了DNA修复,如果仅仅检测MSI会让一部分突变负担重的患者不能被检测到。本发明旨在解决该问题,提出一种预测抗PD-L1抗体药物药效的检测试剂盒。
为了达到上述目的,本发明提供的技术方案为:
所述预测抗PD-L1抗体药物药效的检测试剂盒中包括检测POLD蛋白和POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的引物及探针。
所述POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点位于POLD1的9-14外显子,所述POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点位于POLE的6-12外显子。
所述POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点为C284Y、E374K或/和S478N,所述POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点为P286R或/和L424V。这五个突变位点的关系是并列的,即任何一项的结果是阳性的,该患者的疗效对PD-L1抗体药的疗效会好。
优选地,所述引物和探针如下:
①检测POLD1C284Y、E374K或/和S478N突变的引物和探针:
C284Y:
上游引物:5’-CATGCCCACAGGCTACGCAGTA-3’(SEQIDNO.1)
下游引物:5’-ATCGAGTGCGCCGGCCGCAAAG-3’(SEQIDNO.2)
探针:5’-AGTCACCCACCGGAAGGGCC-3’;(SEQIDNO.3)
E374K:
上游引物:5’-GGTGCAGAGCTACGAGAAGA-3’(SEQIDNO.4)
下游引物:5’-GGGTTCTGCAGGATTTTCAG-3’(SEQIDNO.5)
探针:5’-CATTTCCCGGGGTCCCCGC-3’;(SEQIDNO.6)
S478N:
上游引物:5’-CTACACGCTCAATGCCGTGAA-3’(SEQIDNO.7)
下游引物:5’-TTGACCTGCTGTTATGACC-3’(SEQIDNO.8)
探针:5’-CACCCCAACCTCTGACCTC-3’;(SEQIDNO.9)
②检测POLEP286R或/和L424V突变的引物和探针:
P286R:
上游引物:5’-TGAGACGACCAAACTGCCCG-3’(SEQIDNO.10)
下游引物:5’-TGTCTGGTCCCCATACTAC-3’(SEQIDNO.11)
探针:5’-ACCAGATTATGATGATTTCC-3’;(SEQIDNO.12)
L424V:
上游引物:5’-TCCTGTGGGCAGTCATAATG-3’(SEQIDNO.13)
下游引物:5’-TCCCGGCTGCCCCTGCTGCC-3’(SEQIDNO.14)
探针:5’-TGATCCCGTGGAGCTAGACC-3’;(SEQIDNO.15);
③检测内标的引物和探针:
上游引物:5’-GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG-3’(SEQIDNO.16)
下游引物:5’-TGAAGATCCACGTGGCTCATTG-3’(SEQIDNO.17)
探针:5’-TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’。(SEQIDNO.18)
所述试剂盒中还包括内标,所述内标是含有如SEQIDNO.21所示序列的重组载体。优选地,所述内标为pUC18T载体***如SEQIDNO.21所示序列(5’-CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG-3’)后形成的重组载体,浓度为1.00E+04copies/ml~5.00E+04copies/ml,作为PCR扩增体系中的阳性内对照,预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性;
所述试剂盒中还包括如下试剂:
核酸释放剂:浓度为60~100mM/L的氯化钾,质量百分比浓度为0.01%~2%的十二烷基磺酸钠,体积百分比浓度为0.05%~1%的乙醇;
酶混合液:Taq酶1U/μl~5U/μl,UNG酶0.5U/μl~2U/μl;
阳性对照:为强阳性质粒,其浓度为1.00~5.00E+05copies/ml;所述检测POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的强阳性质粒序列如SEQIDNO.19所示,所述检测POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的强阳性质粒序列如SEQIDNO.20所示;上述质粒是找上海生工人工合成的DNA,连接于T载体,并转化如大肠杆菌活化后提取的;
阴性对照:为灭菌生理盐水。
试剂盒的PCR反应液:10×PCR反应缓冲液5μl,0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸,0.2μmol/L~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物(即所述试剂盒中的引物),0.2μmol/L~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针(即所述试剂盒中的探针),0.2μmol/L~0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物,0.1μmol/L~0.2μmol/L的用于检测内标的探针。所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
针对MSI阴性的患者我们在检测MSI的同时考虑把POLD以及POLE蛋白阅读框外切酶结构域对应的基因位点加进去,从而增加检测的敏感性。因为MMR和MSI检测检验的是DNA复制过程中由于DNA聚合酶滑移而引起碱基-碱基错配和***-缺失突环的形成,因此如果检测结果是MMR或者MSI(微卫星不稳定),主要检测的是DNA的***和缺失突变。而本发明中POLD以及POLE蛋白阅读框外切酶结构域关键的核苷酸突变会导致DNA合成中产生的新的突变比如(SNP单核苷酸位点多态)不被纠正,因而产生大量的SNP,从而增加肿瘤的突变负担,这种情况MSI是检测不出来的。本发明通过荧光定量PCR基因突变检测来预测抗PD-L1抗体药物疗效,为临床癌症患者用药前疗效预测快速检测开辟新的、简洁方便的检测途径。荧光定量PCR扩增结束后,通过曲线形状及Ct值判断POLE及POLD1基因突变,检测结果可用于用药前的辅助检测及疗效预测,为临床诊断和治疗提供分子诊断依据。
具体实施方式
实施例1
所述预测抗PD-L1抗体药物药效的检测试剂盒中包括检测POLD蛋白和POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点(分别位于POLD1的9-14外显子和POLE的6-12外显子)的引物及探针。
所述引物探针如下:
①检测POLD1C284Y、E374K或/和S478N突变的引物和探针:
C284Y:
上游引物:5’-CATGCCCACAGGCTACGCAGTA-3’(SEQIDNO.1)
下游引物:5’-ATCGAGTGCGCCGGCCGCAAAG-3’(SEQIDNO.2)
探针:5’-AGTCACCCACCGGAAGGGCC-3’;(SEQIDNO.3)
E374K:
上游引物:5’-GGTGCAGAGCTACGAGAAGA-3’(SEQIDNO.4)
下游引物:5’-GGGTTCTGCAGGATTTTCAG-3’(SEQIDNO.5)
探针:5’-CATTTCCCGGGGTCCCCGC-3’;(SEQIDNO.6)
S478N:
上游引物:5’-CTACACGCTCAATGCCGTGAA-3’(SEQIDNO.7)
下游引物:5’-TTGACCTGCTGTTATGACC-3’(SEQIDNO.8)
探针:5’-CACCCCAACCTCTGACCTC-3’;(SEQIDNO.9);
②检测POLEP286R或/和L424V突变的引物和探针:
P286R:
上游引物:5’-TGAGACGACCAAACTGCCCG-3’(SEQIDNO.10)
下游引物:5’-TGTCTGGTCCCCATACTAC-3’(SEQIDNO.11)
探针:5’-ACCAGATTATGATGATTTCC-3’;(SEQIDNO.12)
L424V:
上游引物:5’-TCCTGTGGGCAGTCATAATG-3’(SEQIDNO.13)
下游引物:5’-TCCCGGCTGCCCCTGCTGCC-3’(SEQIDNO.14)
探针:5’-TGATCCCGTGGAGCTAGACC-3’;(SEQIDNO.15);
③检测内标的引物和探针:
上游引物:5’-GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG-3’(SEQIDNO.16)
下游引物:5’-TGAAGATCCACGTGGCTCATTG-3’(SEQIDNO.17)
探针:5’-TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’(SEQIDNO.18)。
所述试剂盒中还包括内标,所述内标为pUC18T载体***如SEQIDNO.21所示序列(5’-CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG-3’)后形成的重组载体,浓度为1.00E+04copies/ml~5.00E+04copies/ml;
所述试剂盒中还包括如下试剂:
核酸释放剂:浓度为60~100mM/L的氯化钾,质量百分比浓度为0.01%~2%的十二烷基磺酸钠,体积百分比浓度为0.05%~1%的乙醇;
酶混合液:Taq酶1U/μl~5U/μl,UNG酶0.5U/μl~2U/μl;
阳性对照:为强阳性质粒,其浓度为1.00~5.00E+05copies/ml;所述检测POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的强阳性质粒序列如SEQIDNO.19所示,所述检测POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的强阳性质粒序列如SEQIDNO.20所示;
阴性对照:为灭菌生理盐水。
试剂盒的PCR反应液:10×PCR反应缓冲液5μl,0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸,0.2μmol/L~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物(即所述试剂盒中的引物),0.2μmol/L~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针(即所述试剂盒中的探针),0.2μmol/L~0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物,0.1μmol/L~0.2μmol/L的用于检测内标的探针。所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
将本发明检测POLD1基因和POLE基因突变预测抗PD-L1抗体药物疗效的试剂盒用于检测未知样本的操作步骤是:
1试剂准备:
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量,按比例(反应液40μl/人份+酶混合液3μl/人份+内标0.5μl/人份)取相应量的反应液、酶混合液及内标,充分混匀成PCR-mix,瞬时离心后备用,单个样本配置1管。
2样本处理与加样
2.1样本处理
2.1.1提取样本核酸
2.1.2阴性对照、阳性对照同样处理
2.2加样
2.2.1每个PCR反应管中加入上述处理后的待测样本、阴性对照、阳性对照各10μl;
2.2.2静置10分钟后,每管加入PCR-mix40μl,吸打混匀2-3次,盖上管盖(去除气泡后),2000rpm离心30秒。
3荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽,按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。
2)荧光检测通道选择:选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测融合基因;选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标;参比荧光(PassiveReference)设置为none。
3)荧光定量PCR反应条件如表1所示:
表1
4)结果分析
反应结束后,仪器自动保存结果,可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析),然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点,称为Ct(即cyclethreshold,指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值);如果样本扩增曲线呈S型,有Ct值且Ct≤39,可以判为相应基因有突变;如果样本扩增曲线平直,无Ct值显示(Undet)显示,可以判为相应基因没有突变。
按照上述操作步骤对148例使用罗氏公司的MPDL3280A的肿瘤患者的肿瘤组织进行检测,其中20例患者POLD1基因有突变,15例患者的POLE基因有突变,相应临床疗效较好。
Claims (7)
1.一种预测抗PD-L1抗体药物药效的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括检测POLD蛋白和POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的引物及探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点位于POLD1的9-14外显子,所述POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点位于POLE的6-12外显子。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点为C284Y、E374K或/和S478N,所述POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点为P286R或/和L424V。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述引物和探针如下:
①检测POLD1C284Y、E374K或/和S478N突变的引物和探针:
C284Y:
上游引物:5’-CATGCCCACAGGCTACGCAGTA-3’
下游引物:5’-ATCGAGTGCGCCGGCCGCAAAG-3’
探针:5’-AGTCACCCACCGGAAGGGCC-3’;
E374K:
上游引物:5’-GGTGCAGAGCTACGAGAAGA-3’
下游引物:5’-GGGTTCTGCAGGATTTTCAG-3’
探针:5’-CATTTCCCGGGGTCCCCGC-3’;
S478N:
上游引物:5’-CTACACGCTCAATGCCGTGAA-3’
下游引物:5’-TTGACCTGCTGTTATGACC-3’
探针:5’-CACCCCAACCTCTGACCTC-3’;
②检测POLEP286R或/和L424V突变的引物和探针:
P286R:
上游引物:5’-TGAGACGACCAAACTGCCCG-3’
下游引物:5’-TGTCTGGTCCCCATACTAC-3’
探针:5’-ACCAGATTATGATGATTTCC-3’;
L424V:
上游引物:5’-TCCTGTGGGCAGTCATAATG-3’
下游引物:5’-TCCCGGCTGCCCCTGCTGCC-3’
探针:5’-TGATCCCGTGGAGCTAGACC-3’;
③检测内标的引物和探针:
上游引物:5’-GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG-3’
下游引物:5’-TGAAGATCCACGTGGCTCATTG-3’
探针:5’-TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括内标,所述内标是含有如SEQIDNO.21所示序列的重组载体。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述内标为pUC18T载体***如SEQIDNO.21所示序列后形成的重组载体。
7.如权利要求1至6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括如下试剂:
核酸释放剂:浓度为60~100mM/L的氯化钾,质量百分比浓度为0.01%~2%的十二烷基磺酸钠,体积百分比浓度为0.05%~1%的乙醇;
酶混合液:Taq酶1U/μl~5U/μl,UNG酶0.5U/μl~2U/μl;
阳性对照:为强阳性质粒,其浓度为1.00~5.00E+05copies/ml;所述检测POLD蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的强阳性质粒序列如SEQIDNO.19所示,所述检测POLE蛋白外切酶阅读框结构域对应的基因位点突变的强阳性质粒序列如SEQIDNO.20所示;
阴性对照:为灭菌生理盐水。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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