CN108949926A - 一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法 - Google Patents

一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测体系。这一方法是基于ABI QuantStudio™3D数字PCR***对EGFR基因Exon19缺失进行突变检测。本发明利用MGB探针特异性的区分野生型和突变型的样本，能够同时在低丰度和低灵敏度的样本中得到很好的检测结果，实验可重复性能好，误差小，是检测低丰度地突变比例的优势技术。

Description

一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测方法技术领域，具体涉及一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法。
背景技术
自从PCR技术在20世纪80年代被发明以来，这一方法已经成为生命科学研究领域中最基础和最常规的实验方法之一。第一代传统的PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这一方法主要适用于定性和半定量研究。在2()世纪9()年代初出现了第二代的定量PCR(quantitative PCR，qPCR)技术，通过在反应方法中加入荧光染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值(cycle threshold，Ct)来计算目的酸序列的含量。qPCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前仍被各实验室广泛地使用。但qPCR技术所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应方法中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。在这种背景下，第三代PCR—— 数字PCR(digitalPCR，dPCR)应运而生了。数字PCR的原理为dPCR把反应方法均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。在dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。dPCR 技术qPCR技术有着以下的优势：(1)高灵敏度。dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。(2)高精确度。dPCR通过计算在数万个反应单元中阳性反应单元数量和比例，可以精确地检测出变化很小的目的序列差异。(3)高耐受性。dPCR技术第一步反应方法分配的过程，可以使背景序列和PCR反应抑制物被均匀分配到每个反应单元，而大部分反应单元中并不含有目的序列，低丰度的目的序列被相对富集于某些反应单元中，从而显著地降低了这些反应单元中背景序列和抑制物对反应的干扰。另外，dPCR在对每个反应单元进行结果判读时仅判断阳性／阴性两种状态，不依赖于Ct值，受扩增效率的影响大为降低，对背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。(4)绝对定量。PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。
EGFR(epidermal growth factor receptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR分为三区:胞外配体结合区，跨膜区和胞内激酶区。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，应用数字PCR平台的低丰度检出率、高灵敏度、高特异性的优势，提高对基因突变位点的检出性能，以便更好的满足科研及临床的要求。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法：所述检测方法包括如下步骤：
（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、EGFR基因Exon19位点正向和反向扩增引物、EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；
（2）制备数字PCR反应芯片；
（3）进行数字PCR扩增程序；
（4）进行PCR芯片荧光信号读取；
（5）数据分析和结果统计。
优选地，所述步骤（1）中设计的EGFR基因Exon19缺失位点正向和反向扩增引物包括用于扩增POLE基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：1和一条反向引物SEQ ID Nos：2，正向引物SEQ ID Nos：1的序列为：CAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTC，反向引物SEQ ID Nos：2的序列为：CATCGAGGATTTCCTTGTTG。
优选地，所述步骤（1）中EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan 探针包含两条可以特异性杂交EGFR基因Exon19缺失区域的探针SEQ ID Nos：3和SEQ ID Nos：4，探针SEQ IDNos：3特异性杂交野生型扩增产物，SEQ ID Nos：3的序列为：GCTTCTCTTAATTCCT；探针SEQID Nos：4特异性杂交突变型扩增产物，SEQ ID Nos：4的序列为：GCTATCAAAACATCT。
优选地，所述步骤（1）中设计的内参基因正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因B2M的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：5和一条反向引物SEQ ID Nos：6，正向引物SEQ ID Nos：5的序列为：CACTGAATTCACCCCCACTG，反向引物SEQ ID Nos：6的序列为：AAGCAGAATTTGGAATTCATCC。
优选地，所述步骤（1）中的内参基因标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因B2M扩增区域的探针SEQ ID Nos：7，探针SEQ ID Nos：7序列为：ATGGAGGTTTGAAGA。
优选地，EGFR基因Exon19缺失位点SEQ ID Nos：3特异性杂交野生型扩增产物的探针标记的荧光素为VIC，EGFR基因Exon19缺失位点SEQ ID Nos：4特异性杂交突变型扩增产物的探针标记的荧光素为FAM。
优选地，内参基因B2M标记TaqMan 探针标记的荧光素为ROX。
优选地，所述步骤（3）的数字PCR扩增程序为：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法在检测灵敏度方面较传统方法有显著的提高，以往传统的荧光定量PCR检测基因突变时最低可以检测到1%的突变比例，而本发明基于数字PCR平台开发的检测方法其最低检测比例可以达到0.1%，在突变比例低的检测需求中有很大的优势。
（2）本发明所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法具有绝对定量的优势，传统荧光定量PCR是属于相对定量的检测方法，需要根据标准曲线取计算出待测样本的浓度，而本法明基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法是一种绝对定量的检测方法，其检测结果中直接提示待检样本的浓度及对应的含有突变基因的样本的数量，从而统计出突变比例。
（3）本发明所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法操作简单，与传统荧光定量PCR技术的兼容性高，结果检测一致性好，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为sample01的数字PCR检测结果图；
图2为sample02的数字PCR检测结果图。
具体实施方式
以下通过结合下述具体实施方式进一步说明本发明。需要指出的是，以下具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于对本发明的内容进行限定。
一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、EGFR基因Exon19位点正向和反向扩增引物、EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；
（2）制备数字PCR反应芯片；
（3）进行数字PCR扩增程序；
（4）进行PCR芯片荧光信号读取；
（5）数据分析和结果统计。
本发明所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法主要是基于数字PCR平台对EGFR基因Exon19缺失位点进行检测的方法。根据数字PCR的统计原理，本方法可以检测低丰度的样本量以及低突变比例的样本。首选是基于EGFR基因Exon19缺失位点的序列设计一对特异性扩增的引物对，同时在缺失区域设计两条TaqMan探针，分别通过与野生型和突变型扩增产物杂交，得到荧光信号。进一步通过CCD成像技术对反应芯片进行信号收集，最终经过软件计算，利用泊松分布的统计原理对野生型探针信号和突变型探针信号进行数据统计计算，最终得到待检样本的浓度信息，突变比例信息。
本发明所涉及到的数字PCR平台为ABI QuantStudio™ 3D 数字PCR***，所采用的实验试剂均为该平台配套的PCR扩增反应方法。
下面通过实施例进一步阐明本发明。需要指出的是，本发明并非仅局限于所述实施例。
实施例1
（1）病人基因组DNA提取
在生物安全柜中对病人的肿瘤样本进行基因组DNA提取操作。采用QIAamp DNA FFPETissue Kit (Qiagen Cat No: 56404)进行提取实验。
（2）引物设计
针对人EGFR基因Exon19缺失位点进行引物设计，分别针对这个位点设计一对特异性的PCR引物和两条杂交探针，分别用于杂交野生型扩增产物和突变型扩增产物，同时根据内参基因B2M的序列设计一对扩增引物，同时用ROX标记杂交探针。所设计的PCR引物及探针序列如表1所示。
表1
引物名称 序列号 5'-3'
EGFR-Exon19-F SEQ ID Nos 1 CAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTC
EGFR-Exon19-R SEQ ID Nos 2 CATCGAGGATTTCCTTGTTG
EGFR-Exon19-WT SEQ ID Nos 3 VIC-GCTTCTCTTAATTCCT-MGB
EGFR-Exon19-MT SEQ ID Nos 4 FAM-GCTATCAAAACATCT-MGB
B2M-F SEQ ID Nos 5 CACTGAATTCACCCCCACTG
B2M-R SEQ ID Nos 6 AAGCAGAATTTGGAATTCATCC
B2M-T SEQ ID Nos 7 ROX-ATGGAGGTTTGAAGA-MGB
（3）特异性PCR反应
利用特异性PCR技术扩增出包含EGFR基因Exon19缺失位点的目的片段，按照表2的反应方法配制扩增反应，反应方法配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。
表2
表3
（4）进行PCR芯片荧光信号读取：
PCR反应结束后，将芯片放入数据读取的卡槽，推入，仪器自动读取；屏幕显示读取时间结束后，可直接取出芯片，即可。若一次实验检测多个样本，则可以取出上一张芯片后直接放入下一张待读取的芯片，直至最后一张芯片读取结束后，一起分析之前读取的所有芯片。待所有芯片分析完全后，将数据导出至USB。
（5）数据分析和结果统计：
将PCR芯片检测数据导入至Thermo的云服务器上，利用云端处理软件，对检测数据进行分析。数据分析之前需要注册用户账号，完成注册流程后可以***。
本实施例的分析结果如表4、表5和图1、图2所示。本实施例样本检测了两例不同的FFPE样本，分别记为Sample01和Sample02。其检测结果为Sample01为野生型样本，在EGFR基因Exon19缺失位点没有发生缺失突变，Sample02为突变型样本，在EGFR基因Exon19缺失位点发生缺失突变，且突变比例为0.37%，整张反应芯片的有效数据分别为14709/15213，其中突变型有效数据为0/11，野生型有效数据为2201/3146，与实际PCR上样量10 ng基本一致。
表4
Assay Sample Target/Total Copies/microliter (VIC) Copies/microliter (FAM)
FAMVIC Sample01 0% 185 0
FAMVIC Sample02 0.37% 181.42 0.668
表5
Chip #FAM #VIC #FAMVIC #Undetermined #NOAMP
Sample01 0 2201 0 0 14709
Sample02 11 3146 7 0 15213
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、EGFR基因Exon19位点正向和反向扩增引物、EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；
（2）制备数字PCR反应芯片；
（3）进行数字PCR扩增程序；
（4）进行PCR芯片荧光信号读取；
（5）数据分析和结果统计。
2.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中设计的EGFR基因Exon19缺失位点正向和反向扩增引物包括用于扩增POLE基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：1和一条反向引物SEQ ID Nos：2，正向引物SEQ ID Nos：1的序列为：CAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTC，反向引物SEQ ID Nos：2的序列为：CATCGAGGATTTCCTTGTTG。
3.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan 探针包含两条可以特异性杂交EGFR基因Exon19缺失区域的探针SEQ ID Nos：3和SEQ ID Nos：4，探针SEQ ID Nos：3特异性杂交野生型扩增产物，SEQ ID Nos：3的序列为：GCTTCTCTTAATTCCT；探针SEQ ID Nos：4特异性杂交突变型扩增产物，SEQ ID Nos：4的序列为：GCTATCAAAACATCT。
4.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中设计的内参基因正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因B2M的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：5和一条反向引物SEQ IDNos：6，正向引物SEQ ID Nos：5的序列为：CACTGAATTCACCCCCACTG，反向引物SEQ ID Nos：6的序列为：AAGCAGAATTTGGAATTCATCC。
5.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的内参基因标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因B2M扩增区域的探针SEQ ID Nos：7，探针SEQ ID Nos：7序列为：ATGGAGGTTTGAAGA。
6.根据权利要求3所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，EGFR基因Exon19缺失位点SEQ ID Nos：3特异性杂交野生型扩增产物的探针标记的荧光素为VIC，EGFR基因Exon19缺失位点SEQ ID Nos：4特异性杂交突变型扩增产物的探针标记的荧光素为FAM。
7.根据权利要求5所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，内参基因B2M标记TaqMan 探针标记的荧光素为ROX。
8.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）的数字PCR扩增程序为：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温。
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