CN113564111B - 一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法 - Google Patents
一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及间充质干细胞培养方法的技术领域，具体公开了一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法。包括以下步骤：将原代脐带来源间充质干细胞接种在培养基上，置于培养温度37℃，氧气体积分数1‑3％，二氧化碳体积分数2‑2.5％，余量氮气的环境中进行传代扩增96‑108h后，收集间充质干细胞；培养基包括基础培养基和传代添加物；基础培养基为MEM、F12、低糖DMEM和高糖DMEM中的一种或多种组合物；传代添加物以培养基终浓度计，包括以下组分，谷胱甘肽11‑15μg/ml，α‑生育酚0.5‑2.5μg/ml，β‑生育酚0.5‑2.0μg/ml，乙酰唑胺2.5‑3.0ng/ml，胰岛素10‑20μg/ml，维生素C8‑10μg/ml。本申请方法可用于对脐带来源间充质干细胞进行扩增培养，且培养所得的干细胞活性高，增殖倍数高，有利于脐带间充质干细胞生物制品的推广应用。
Description
技术领域
本申请涉及间充质干细胞培养方法的技术领域，更具体地说，它涉及一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。目前，主要从脐带、骨髓、脂肪组织、牙髓和胎盘中提取间充质干细胞，间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后，仍具有多向分化潜能，为临床治疗多种疾病，如神经***疾病、肾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。
脐带来源间充质干细胞是指存在新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有取材方便，来源丰富，生物学特性稳定，免疫原性低的特点，使其成为未来干细胞在医疗应用的理想种子细胞。此外，脐带来源间充质干细胞能在培养过程中可分泌多种干细胞因子，包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可促进细胞生长，维持细胞干性，并且在美容护肤领域有广泛的应用。
目前对脐带来源间充质干细胞的培养主要分为两种，其一是血清培养法，大多使用DMEM/F12+血清，或者在此基础上添加一些营养物质助于细胞生长，这一方法适用于脐带来源间充质干细胞的大规模培养，但是这一方法中使用的血清可能包含一些未知的过敏原和病原体，对细胞培养的安全性造成影响；其二是无血清培养法，单纯使用培养基及各种营养物质添加剂对期待来源间充质干细胞进行培养，然而这一方法培养的细胞生长缓慢，且细胞活性差，培养基中细胞生长因子含量较低，影响了脐带来源间充质干细胞生物制品的推广应用。
发明内容
为了改善上述提到的问题，本申请提供一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法。
本申请提供的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，采用如下的技术方案：
一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将原代脐带来源间充质干细胞接种在培养基上，接种密度为10000-50000个/ml，置于培养温度37℃,氧气体积分数1-3％，二氧化碳体积分数2-2.5％，余量氮气的环境中进行传代扩增96-108h后，收集间充质干细胞；所述培养基是由基础培养基和传代添加物组成；所述基础培养基为F12与MEM、低糖DMEM或高糖DMEM其中一种的组合物；所述传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽11-15μg/ml，α-生育酚0.5-2.5μg/ml，β-生育酚0.5-2.0μg/ml，乙酰唑胺2.5-3.0ng/ml，胰岛素10-20μg/ml，维生素C8-10μg/ml。
优选的，原代脐带来源间充质干细胞培养时，初始氧气体积分数为1％，氧气体积分数以0.1％/2h的速率增长至3％后，保持培养10h，氧气体积分数以0.1％/5h的速率下降至2.3-2.4％，保持培养至传代培养结束。
优选的，间充质干细胞培养过程中，每2天更换一次培养基。
优选的，所述原代脐带来源间充质干细胞由以下步骤制得：采用组织贴壁法，取离体的脐带，剥离羊膜和血管后，剪碎组织，放入含10％FBS的α-MEM完全培养基进行培养，待细胞从组织块中爬出，得原代脐带来源间充质干细胞。
优选的，所述传代添加物以培养基终浓度计，还包括TGF-β0.8-1.0ng/ml。
优选的，所述传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽12μg/ml，α-生育酚2.1μg/ml，β-生育酚1.6μg/ml，乙酰唑胺2.8ng/ml，胰岛素16μg/ml，维生素C9μg/ml，TGF-β0.8ng/ml。
综上所述，本申请具有以下有益效果：将间充质干细胞放置在低氧环境中，且在培养基中加入多种传代添加物后，进行干细胞传代扩增培养，能够提高间充质干细胞的增殖倍数和培养所得的干细胞细胞活性。
具体实施方式
以下结合实施例1-4和对比例1-2对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1
制备扩增用的原代脐带来源间充质干细胞：取新鲜健康的人脐带，用PBS缓冲液冲洗干净后，用镊子剥离羊膜和血管，将分离后的脐带胶质剪碎成1-3mm3的组织块，平铺再培养瓶底部，加入含10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的α-MEM培养基中，置于37℃,5％二氧化碳的培养箱中进行培养；培养至第七天时，组织块周边出现脐带间充质干细胞，继续培养，待脐带间充质干细胞达到80％的融合时，弃去脐带组织块和原有培养基，生理盐水洗涤后加入0.25％的胰酶消化，即得到扩增用的原代脐带来源间充质干细胞。
实施例
实施例1
本实施例1中对脐带来源间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
将制备例1中的原代脐带来源间充质干细胞接种在培养基上，细胞接种密度为30000个/ml，置于培养箱中进行细胞扩增培养，培养箱中的培养温度为37℃,保持培养箱中氧气体积分数为2.3-2.4％，二氧化碳体积分数为2-2.5％，余量均为氮气；将原代脐带来源间充质干细胞在培养箱中培养96-108h，且在培养过程中，每48h(2天)更换一次培养基，培养结束后，收集培养所得的间充质干细胞。
其中，培养基包括基础培养基和传代添加物，基础培养基为MEM和F12的1：1混合物，在其他实施例中，基础培养基为F12与MEM、低糖DMEM或高糖DMEM其中一种的组合物，传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽13μg/ml，α-生育酚1.6μg/ml，β-生育酚1.1μg/ml，乙酰唑胺2.6ng/ml，胰岛素12μg/ml，维生素C9μg/ml。
实施例2
本实施例2与实施例1的不同之处在于，培养基中传代添加物的组分含量不同，实施例2中传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽15μg/ml，α-生育酚2.5μg/ml，β-生育酚2.0μg/ml，乙酰唑胺3.0ng/ml，胰岛素20μg/ml，维生素C10μg/ml。
实施例3
本实施例3与实施例1的不同之处在于，培养基中传代添加物还包括TGF-β,传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽12μg/ml，α-生育酚2.1μg/ml，β-生育酚1.6μg/ml，乙酰唑胺2.8ng/ml，胰岛素16μg/ml，维生素C9μg/ml，TGF-β0.8ng/ml。
实施例4
实施例4与实施例3的不同之处在于，进行原代脐带来源间充质干细胞的培养时，培养箱中初始氧气体积分数为1％，氧气体积分数以0.1％/2h的速率增长至3％后，保持培养10h，氧气体积分数以0.1％/5h的速率下降至2.3-2.4％，保持培养至传代培养结束。
对比例
对比例1
本对比例1与实施例1的不同之处在于，培养基中传代添加物不包括α-生育酚，传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽13μg/ml，β-生育酚2.7μg/ml，乙酰唑胺2.6ng/ml，胰岛素12μg/ml，维生素C9μg/ml。
对比例2
本对比例2与实施例1的不同之处在于，培养基中传代添加物不包括β-生育酚，传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽13μg/ml，α-生育酚2.7μg/ml，乙酰唑胺2.6ng/ml，胰岛素12μg/ml，维生素C9μg/ml。
性能检测试验
采用0.4％的台盼蓝对实施例1-4和对比例1-2中扩增培养的间充质干细胞进行染色，细胞计数后，统计实施例1-4和对比例1-2中间充质干细胞的增殖倍数及细胞活率，增殖倍数＝培养后细胞总数量/初始接种细胞数，细胞活率＝(活细胞数量/培养后细胞总数量)×100％，其结果如表1所示。
表1实施例1-4和对比例1-2中间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率
结合实施例1-4和对比例1-2，并结合表1可以看出，本申请中一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法对间充质干细胞的培养效果更好，培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率都更优于对比例1-2。
结合实施例1-2和实施例3，并结合表1可以看出，在培养基中加入TGF-β后，能够提高细胞培养的增殖倍数和细胞活率。
结合实施例3和实施例4，并结合表1可以看出，对间充质干细胞进行培养时，在低氧环境中，且培养箱中的氧气体积随着培养时间的延长发生改变，最后持续稳定，能够提高间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率。
结合实施例1和对比例1-2，并结合表1可以看出，在培养基中单独添加α-生育酚或β-生育酚的效果，没有α-生育酚和β-生育酚复配使用时对间充质干细胞的培养促进效果突出。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将原代脐带来源间充质干细胞接种在培养基上，接种密度为10000-50000个/ml，置于培养温度37℃,氧气体积分数1-3％，二氧化碳体积分数2-2.5％，余量氮气的环境中进行传代扩增96-108h后，收集间充质干细胞；
所述培养基是由基础培养基和传代添加物组成；
所述基础培养基为F12与MEM、低糖DMEM或高糖DMEM其中一种的组合物；
所述传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽11-15μg/ml，α-生育酚0.5-2.5μg/ml，β-生育酚0.5-2.0μg/ml，乙酰唑胺2.5-3.0ng/ml，胰岛素10-20μg/ml，维生素C8-10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，其特征在于：原代脐带来源间充质干细胞培养时初始氧气体积分数为1％，氧气体积分数以0.1％/2h的速率增长至3％后，保持培养10h，氧气体积分数以0.1％/5h的速率下降至2.3-2.4％，保持培养至传代培养结束。
3.根据权利要求1所述的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，其特征在于：间充质干细胞培养过程中，每2天更换一次培养基。
4.根据权利要求1所述的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，其特征在于，所述原代脐带来源间充质干细胞由以下步骤制得：采用组织贴壁法，取离体的脐带，剥离羊膜和血管后，剪碎组织，放入含10％FBS的α-MEM完全培养基进行培养，待细胞从组织块中爬出，得原代脐带来源间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，其特征在于：所述传代添加物以培养基终浓度计，还包括TGF-β0.8-1.0ng/ml。
6.根据权利要求5所述的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，其特征在于：所述传代添加物以培养基终浓度计，各组分的用量为，谷胱甘肽12μg/ml，α-生育酚2.1μg/ml，β-生育酚1.6μg/ml，乙酰唑胺2.8ng/ml，胰岛素16μg/ml，维生素C9μg/ml，TGF-β0.8ng/ml。
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