CN109922826A - 焦谷氨酸淀粉样蛋白-β的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合到3pE Aβ的抗体或其抗原结合片段以及制备和使用该抗体或其抗原结合片段的方法，包括用于制剂、给药和试剂盒的用途。所公开的抗体及其抗原结合片段和方法可用于诊断、预后和治疗阿尔茨海默病或其它β‑淀粉样蛋白相关疾病。

Description

焦谷氨酸淀粉样蛋白-β的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及淀粉样蛋白-β(Aβ)肽的抗体领域和使用该抗体的治疗方法。具体地，抗体可用于鉴定和治疗淀粉样蛋白相关的疾病。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)为退行性脑疾病，其临床特征是渐进性的记忆、认知、推理、判断和情感稳定性的丧失，这种丧失会逐渐导致重度精神衰退并最终死亡。阿尔茨海默病是老年人渐进式心智衰退(失智症)的常见原因。阿尔茨海默病在世界范围内都已发现，并且代表了主要的公共健康问题。据估计仅在美国该疾病当前影响超过约五百万人。目前它是不可治愈的，并且任何治疗均不有效地预防AD或逆转其症状或过程。
患有AD的个体的脑显示出称作淀粉样蛋白斑、淀粉样蛋白血管病(淀粉样蛋白在血管中沉积)和神经原纤维缠结的特征性病变。通常可在对于记忆和认知功能重要的几个大脑区域中发现大量这些病变，具体地，淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结。患有21号染色体三体性(唐氏综合征)、弥散性路易体病和荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样蛋白变性(HCHWA-D)的个体的大脑也是以淀粉样蛋白斑和淀粉样蛋白血管病为特征。
淀粉样蛋白斑的主要组分是多种淀粉样蛋白-β(Aβ)肽，它们由β-淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)的切割产生。假设Aβ肽在脑中的沉积是导致AD的疾病级联中的早期且必要的步骤。淀粉样蛋白前体蛋白和早老蛋白基因中鉴定出导致改变的Aβ产生并导致家族早期起始AD的突变提供了改变的淀粉样蛋白代谢是构成该疾病基础的致病过程中的中心事件的有力证据。
在第三残基处具有焦谷氨酸的淀粉样蛋白-β肽(3pE Aβ)是沉积在AD患者脑中的主要物质。3pE Aβ存在于AD中的几乎所有弥散性和成熟斑块中，是代谢稳定的并且可在斑块接种和稳定两者中起作用(Cynis等人，Molecular Neurodegeneration，2016；11:48)。尚未报道CSF或血浆中3pE Aβ的可检测量，因此表明靶肽是病理特异性的(DeMattos等人，Neuron，2012；76:1-13)。选择性地结合到3pE Aβ的抗体可用于免疫疗法。
发明内容
如本发明所实施且完整描述的，本发明涉及结合到在第三残基处具有焦谷氨酸的淀粉样蛋白-β(3pE Aβ)的抗体或其抗原结合片段，制备结合到3pE Aβ的抗体或其抗原结合片段的方法，使用此类抗体或其抗原结合片段的测定方法，以及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制造药物、治疗、延缓或逆转阿尔海默兹病和其它β-淀粉样蛋白相关疾病的至少一种病变或症状的用途。与不含有3pE的Aβ肽相比，本发明的抗体优先结合含有3pE的Aβ肽。
具体地，本发明涉及结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ IDNO:1的重链和SEQ ID NO:12的轻链。在其它实施方案中，本发明涉及结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:13的轻链可变区。在其它实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:3、6和9中任一种的CDR1，SEQ ID NO:4、7和10中任一种的CDR2，SEQ ID NO:5、8和11中任一种的CDR3，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:14、17和20中任一种的CDR1，SEQ ID NO:15和18中任一种的CDR2，SEQ ID NO:16和19中任一项的CDR3。在一个具体实施方案中，重链可变区分别包含SEQ ID NO:3-5的CDR1、CDR2和CDR3，并且轻链可变区分别包含SEQ ID NO:14-16的CDR1、CDR2和CDR3。在另一具体实施方案中，重链可变区分别包含SEQ ID NO:6-8的CDR1、CDR2和CDR3，并且轻链可变区分别包含SEQ ID NO:17-19的CDR1、CDR2和CDR3。在另一具体实施方案中，重链可变区分别包含SEQID NO:9-11的CDR1、CDR2和CDR3，并且轻链可变区分别包含SEQ ID NO:20、18和16的CDR1、CDR2和CDR3。
在另一实施方案中，本发明涉及结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的实施方案为分离抗体或其抗原结合片段，其包含具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基31-35的CDR1序列的重链可变区，具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基50-66的CDR2序列的重链可变区，具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基99-108的CDR3序列的重链可变区，具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基24-39的CDR1序列的轻链可变区，具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基55-61的CDR2序列的轻链可变区；和具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基94-102的CDR3序列的轻链可变区。
本发明的一个优选实施方案为分离抗体及其抗原结合片段，其包含含有SEQ IDNO:3的重链可变区CDR1序列，包含SEQ ID NO:4的重链可变区CDR2序列，包含SEQ ID NO:5的重链可变区CDR3序列，包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1序列，包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR2序列，以及包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR3序列。
在优选的实施方案中，上述抗体为单克隆抗体。在一些优选的实施方案中，抗原结合片段选自由Fv、F(ab')、F(ab')2和scFv构成的片段。抗体或其抗原结合片段选择性地结合至3pE Aβ肽(例如Aβ3pE-40和Aβ3pE-42)，与其它Aβ肽或β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)具有很少或不具有交叉反应性。
本发明的实施方案包括生成对3pE Aβ的单克隆抗体的方法。本发明的具体实施方案涉及产生结合至3pE Aβ的单克隆抗体的杂交瘤。在另一实施方案中，结合至3pE Aβ的单克隆抗体重组产生。在实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤细胞表达或重组表达。产生的单克隆抗体包含由SEQ ID NO:2组成的重链可变区，和由SEQ ID NO:13组成的轻链可变区。
本发明的实施方案涉及治疗阿尔茨海默病和其它β-淀粉样蛋白相关疾病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关疾病的个体施用上述结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一实施方案是清除与阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关疾病相关的斑块的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关疾病的个体施用上述结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段。
其它实施方案涉及一种预防3pE Aβ的菌斑接种活性的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关疾病的个体施用上述结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段。
实施方案包括一种药物组合物，包含上述抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。此类药物组合物可施用于患有阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关疾病的受试者，或用于治疗阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关疾病的方法，诸如上述方法中。
一个实施方案包括包含上述抗体或其抗原结合片段的试剂盒和装置。由下文的优选实施方案的详细描述，本发明更多的目的、特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1示出全长人(Aβ1-42)(SEQ ID NO:25)、N-截短(Aβ3-42)(SEQ ID NO:26)和焦谷氨酸修饰(Aβ3pE-42)(SEQ ID NO:30)Aβ肽的氨基酸序列。
图2示出了通过检测夹心ELISA中的合成人Aβ肽的Aβ/pE3/1选择性。Aβ/pE3/1结合至(A)Aβ3pE-40和(B)Aβ3-40，但不限于(C)Aβ1-40和(D)AβpE11-40。
图3A-3B示出了通过免疫组织化学由(A)Aβ/pE3/1和(B)阳性对照多克隆抗体对福林固定的石蜡包埋(FFPE)AD脑组织中的斑块的反应性。
图4A-4B示出了通过免疫组织化学由(A)Aβ/pE3/1)和(B)阳性对照多克隆抗体对非固定冷冻保存的AD脑组织中的斑块的反应性。
图5A-5E示出了用Aβ抗体或对照处理的小鼠的脑的代表性图像。六个月大的小鼠用(A)PBS、(B)末端特异性Aβ抗体3D6(60mg/kg)或(C)3D6(20mg/kg)处理。十九至二十个月大的小鼠用(D)PBS或(E)Aβ/pE3/1(60mg/kg)处理。箭头指示解剖时观察到出血。
图6A-6D示出了在用(A和C)PBS或(B和D)Aβ/pE3/1处理后表达升高的水平的人Aβ42和Aβ40的小鼠脑的冷冻切片。(A和B)仅使用第二抗小鼠IgG2a抗体染色。(C和D刻度条表)在提供第一抗体和第二抗体之后染色。比例尺表示2.5mm。
图7A-7C示出了在表达升高水平的人Aβ42和Aβ40的6个月或19-20个月大的小鼠中用(A)3D6抗体、(B)Aβ/pE3/1或(C)PBS处理后用苏木精和伊红(H&E)染色。
图8为来自Aβ/pE3/1与人Aβ(3pE-40)肽的亲和力结合相互作用的表面等离子体共振无标记检测的传感图(单循环动力学)。
具体实施方式
应当理解，本发明并非仅限于特定的方法、试剂、化合物、成分、或生物***，该方法、试剂、化合物、成分、或生物***可发生变化。另外应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。
本发明提供了结合到3pE Aβ肽的抗体或其抗原结合片段，尤其是优先于不含有3pE的Aβ肽的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了制备结合至3pE Aβ肽的抗体或其抗原结合片段的方法，以及制备生成结合至3pE Aβ肽的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤的方法。本发明还包括治疗个体的阿尔茨海默病和其它β-淀粉样蛋白相关疾病的方法，清除与阿尔茨海默病或其它β-淀粉样蛋白相关联疾病的斑块的方法，以及预防3pE Aβ的斑块接种活性的方法。本发明还提供了包含用于本发明所述方法的抗体或其抗原结合片段的试剂盒和装置。
在一个实施方案中，本发明涉及结合至3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，该重链可变区包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，轻链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的实施方案为分离抗体或其抗原结合片段，其包含具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基31-35的CDR1序列的重链可变区，具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基50-66的CDR2序列的重链可变区，具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基99-108的CDR3序列的重链可变区，具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基24-39的CDR1序列的轻链可变区，具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基55-61的CDR2序列的轻链可变区；和具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基94-102的CDR3序列的轻链可变区。
一个优选的实施方案是抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1序列，包含SEQ ID NO:4的重链可变区CDR2序列，包含SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR3序列，包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1序列，包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR2序列，以及包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR3序列。
抗体
本发明提供了结合到3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段。术语“抗体”在本文中是指能够结合抗原或其部分的免疫球蛋白，尤其是能够特异性结合至3pE Aβ的免疫球蛋白。结合至抗原的抗体可通过本领域技术人员已知的方法测量，示例为使用BIAcoreTM仪器。一般来讲，据说当解离常数小于或等于1μm，优选小于或等于100nM，并且最优选小于或等于10时，抗体或抗原结合抗体片段特异性结合抗原。
抗体的抗原结合片段是指抗体的片段，其可与完整抗体结合于其上的抗原结合，并且与完整抗体竞争抗原结合。抗原结合片段包含允许抗原结合的完整抗体的一部分(即完整抗体的可变区)。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；单链抗体分子(例如，scFV)、双抗体、微抗体和线性抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体由两个重链和两个轻链组成。每个重链具有一个可变结构域或区(VH)，之后是恒定结构域或区(CH1)、铰链区、以及另外两个恒定结构域或区(CH2和CH3)。每个轻链具有一个可变结构域或区(VL)和一个恒定结构域或区域(CL)。重链和轻链的可变结构域或区形成抗体的互补位(与锁类似的结构)，其特异于特定表位(类似于键)，从而允许互补位和表位以精确的方式结合在一起。在可变结构域内，β链的可变环(在轻链和重链上各三个)负责与抗原结合。这些环被称为互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)。
CDR被定义为抗体的互补决定区。这些是主要负责结合至抗原的抗体重链和轻链的高可变区。在重链和轻链可变区中的每一个中存在三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。抗体的CDR可以多种方式定义。例如，可根据Kabat、Chothia、IMGT和/或构象的定义或本领域熟知的任何CDR确定的方法来鉴定可变区内的CDR。抗体CDR可以被鉴定为最初由Kabat定义的高可变区(Kabat等人，1992，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NIH，Washington D.C.)，最初由Chothia定义的结构环结构(Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))或IMGT的独特编号***(Lefranc，TheImmunologist 7:132-136(1999)；Lefranc等人，Nucleic Acids Res.27:209-212(1999)；Scaviner等人，Exp.Clin.Immunogenet.16:234-240(1999)；Lefranc等人，Nucleic AcidsRes.43:D413-422(2015))。
当在抗体的上下文中使用时，“分离”意指“通过人工”自任何自然状态改变；即，如果其天然存在，则其已从原始环境改变或移除或者两者兼有。例如，以其自然状态天然存在于活的动物中的天然存的抗体不是“分离的”，但是与其自然状态的共存物质分离的相同抗体是“分离的”，如本文所用的术语。抗体可存在于组合物诸如免疫测定试剂中，其不是天然存在的组合物，并且其中仍然是该术语(如本文所用的)的含义内的分离抗体。
产生抗体的方法包括用期望的免疫原接种宿主。合适的宿主包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、鸡、驴、马、猴、黑猩猩、猩猩、大猩猩、人以及能够建立成熟免疫应答的任何物种。免疫程序在本领域中良好建立，并且在许多论文和出版物中有所阐述，包括“TheImmunoassay Handbook”，第二版，David Wild编辑(Nature Publishing Group，2000)。
优选地，将包含本发明特征的免疫原与佐剂联合施用于宿主受试者，例如动物或人类。合适的佐剂包括但不限于弗氏佐剂、粉末氢氧化铝(alum)、氢氧化铝连同百日咳嗜血杆菌(Bordetella pertussis)、以及单磷酰类脂A-合成海藻糖二棒状霉菌酸酯(MPL-TDM)。
通常，通过一次或多次皮下注射或腹膜内注射将免疫原或免疫原与佐剂的组合注入哺乳动物宿主中。优选地，免疫方案在至少一周内进行，并且更优选在两个或更多个星期内进行。可利用本领域熟知的方法分离和纯化以这种方式产生的多克隆抗体。
单克隆抗体可通过Kohler和Milstein的良好建立的杂交瘤方法产生，例如，Nature 256：495-497(1975)。杂交瘤方法通常涉及使宿主或来自宿主的淋巴细胞面积，收获分泌或具有分泌淋巴细胞的潜力的单克隆抗体，将淋巴细胞融合至无限增殖化细胞，以及选择分泌期望的单克隆抗体的细胞。
宿主可经免疫诱导淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生对免疫具有特异性的抗体。另选地，可将淋巴细胞在体外免疫。如果期望人类细胞，则可使用外周血淋巴细胞，但优选来自其它哺乳动物源的脾细胞或淋巴细胞。
淋巴细胞可与无限增殖化细胞系融合以形成杂交瘤细胞，这是可通过使用融合剂，例如聚乙二醇促进的过程。以示例的方式，可使用通过转化而无限增殖化的突变型啮齿动物、牛或人骨髓瘤细胞。相对于未融合的无限增殖化细胞，优选基本上纯的融合瘤细胞群。因此，在融合之后，例如通过使用缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)的突变骨髓瘤细胞，细胞可在抑制未融合的无限增殖化细胞生长或存活的合适培养基中生长。在此类情况下，可将次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶核苷加入培养基(HAT培养基)中，以在允许杂交瘤生长的防止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
优选地，无限增殖化细胞有效地熔合，可通过在诸如HAT的培养基中的选择从混合种群中分离，并且在融合之后支持抗体的稳定和高水平表达。优选的限增殖化细胞系包括购自American Type Culture Collection(Manassas，VA)的骨髓瘤细胞系。
本发明的一个方面是产生能够产生结合至淀粉样蛋白β肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法。此类方法为本领域技术人员公知的，并且通常包含：(i)选择用于抗体制备的宿主；(ii)用期望的免疫原接种该宿主；(iii)将该接种宿主的细胞系与连续***细胞融合以生成能够产生结合到免疫原的单克隆抗体的融合细胞；以及(iv)克隆该融合细胞以获得杂交瘤细胞系。
本发明的方法包括产生能够产生结合至3pE Aβ肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法。杂交瘤可通过以下方法制备：用期望的免疫原(诸如具有弗氏佐剂中的焦谷胺酸的Aβ肽)的初始腹膜内注射，之后进行例如每一周至两周的追加注射，将可由此产生杂交瘤的动物(诸如Balb/c小鼠)进行免疫。分离的脾的后续融合可使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术进行，优选通过Kohler和Milstein的修改程序使用SP2/0细胞来进行(Eur.J.Immunol.，1976；6:292-295)。可以标准测定法，诸如ELISA或RIA测定法，来进行杂交瘤的筛选以确定产生对3pE Aβ肽具有特异性的抗体的那些。本发明的一个方面是产生杂交瘤细胞系的方法，所述杂交瘤细胞系生成单克隆抗体Aβ/pE3/1。
单克隆抗体也可通过重组方法来制备，诸如本领域已知的那些，例如，如美国专利4,166,452中所述的。编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序分离和测序，例如使用特异性结合至鼠科重抗体链基因及轻抗体链基因的寡核苷酸探针，优选以探测从单克隆抗体融合瘤细胞系(其分泌对具有焦谷胺酸的Aβ具特异性的抗体)分离的DNA。
还可产生含有淀粉样β肽的特异性结合位点的抗体片段。此类片段包括但不限于F(ab')2片段，其可通过胃蛋白酶消化抗体分子来制造；及Fab片段，其可通过还原F(ab')2片段的双硫键生成。另选地，可构建Fab表达文库以允许快速且容易地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab片段(Huse等人，Science 256:1270-1281(1989))。Fab、Fv和ScFv抗体片段全部均可在大肠杆菌中表达并分泌，从而允许产生大量的这些片段。另选地，Fab'-SH片段可从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人，BioTechnology 10:163-167(1992))。用于产生抗体片段的其它技术是本领域技术人员所已知的。还设想了单链Fv片段(scFv)(参见美国专利5,761,894和5,587,458)。Fv和sFv片段是唯一具有缺乏恒定区域的完整组合位点的物种；因此，它们可能示出减少的非特异性结合。该抗体片段也可以为“线性抗体”，例如，如美国专利5,642,870中所述的。
因此，本发明的目的是提供由上述杂交瘤细胞表达的分离的单克隆抗体，该抗体能够特异性识别3pE Aβ。分离的单克隆抗体可由杂交瘤细胞表达或重组表达。
优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段选择性地结合至3pE Aβ，与不具有3pE或β淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的其它Aβ具有很少或不具有交叉反应性。具体地，本发明的抗体或其抗原结合片段选择性地结合至Aβ3pE-40(SEQ ID NO:22)和Aβ3pE-42(SEQ ID NO:30)肽，其与含有Aβ肽或APP的其它非-3pE具有很少交叉反应性或不具有交叉反应性。
表1提供了本发明的抗体的氨基酸序列。如由Kabat、Chothia和IMGT限定的重链可变区和轻链可变区的CDR以单独的序列示出。
表1：Aβ/pE3/1抗体序列。
1 如由IMGT定义的LCDR2与如由Chothia定义的LCDR2相同。
2 如由IMGT定义的LCDR3与如由Kabat定义的LCDR3相同。
本发明的抗体还涵盖衍生自Aβ/pE3/1的分离抗体或其抗原结合片段，并且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，衍生的抗体或其抗原结合片段的CDR与Aβ/pE3/1相同。
术语“序列同一性”意指当两个氨基酸序列进行最佳比对时，关于它们的相似程度，可在比较窗内进行的比较(即，基于逐个氨基酸残基)，如通过熟知的序列同一性确定算法(诸如BLAST、ToPLign、Supermatcher和Matcher)来测量。
体外方法
应当理解，设想了采用抗体或其抗原结合片段的免疫测定法的所有方式根据目前优选的实施方案的用途，包括其中抗体或其抗原结合片段结合至固相的测定和抗体处于液体培养基中的测定法。可用于使用体现本发明特征的抗体来检测分析物的免疫测定方法包括但不限于竞争性(试剂受限的)测定，其中样品中的标记分析物(分析物类似物)和分析物竞争抗体，以及单位点免疫测定法，其中抗体被标记；等。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段可用于常规免疫技术中以用于检测Aβ3pE，无论其可出现在何处，包括用于监测β淀粉样蛋白相关疾病的生物样品和用于监测APP的细胞内处理的来自细胞培养的条件培养基。合适的免疫技术是本领域技术人员所熟知的，并且包括例如ELISA、蛋白质印迹分析、竞争性或夹心免疫测定法等，如以其它方式所熟知的，它们全部均取决于抗原-抗体免疫复合物的形成，其中出于测定的目的，抗体或其抗原结合片段可被可检测地标记，例如用放射、酶、发光或荧光标记，或其可固定在不溶性载体上。因此，本发明的一个目的是提供用于确定或检测样品中的Aβ3pE或其片段的免疫测定法，所述方法包括使样品与根据本发明的对Aβ3pE的抗或其抗原结合片段接触，并确定抗体或其抗原结合片段与Aβ3pE或其片段之间是否形成免疫复合物。这些方法可在组织样品或体液样品上进行，并且一般包括从受试者的身体获得样品；使所述样品与成像有效量的经可检测地标记的根据本发明的抗体或其抗原结合片段接触；并且检测该标记以确定该样品中Aβ3pE或其片段的存在。使用本发明的抗体或其抗原结合片段的测量方法没有特别限制。可使用任何测量方法，只要对应于待检测的溶液中的抗原的量，具体地，Aβ3pE或其片段的量的抗体、抗原或抗原-抗体复合物的量被化学或物理方式检测，并且由通过使用含有已知量的抗原的标准溶液制得的标准曲线计算。例如，适合使用比浊法、竞争法、免疫测定法和夹心法。就灵敏度和特异性而言，特别优选使用夹心法。
在夹心法中，使测试溶液与不溶性抗体(诸如不溶性抗-Aβ3pE抗体)反应(第一反应)，另外，使标记的第二抗体反应(第二反应)；然后测定不溶性载体上的标记试剂的活性，从而可确定测试溶液中Aβ3pE或其片段的量。第一反应和第二反应可同时或顺序进行。
在测量方法中，标签物质、放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等被用作标记试剂。放射性同位素的示例包括1251、131I、3H和14C。酶通常通过共轭适当的继而催化可检测反应的基质而制成可检测的。其示例包括，例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选为辣根过氧化物酶。所述发光物质包括，例如，发光氨(luminol)、发光胺衍生物、虫荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶此外，抗生物素蛋白-生物素体系也可用于标记本发明的抗体和免疫原。当免疫原或抗体不溶解时，可采用通常用于蛋白质或酶的不溶解化或固定的物理吸附或化学结合。载体的示例包括不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素、合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷聚合物、以及玻璃。
在用于检测或诊断β-淀粉样蛋白相关疾病的另一个实施方案中，含有包括组织、体液诸如CSF、血液、血浆、血清、尿液等在内的生物样品，并使其与适当量的第一抗体接触以产生免疫复合物。该接触通常涉及将样品添加到涂覆有第一抗体的固体基质中。通过洗脱将由样品与第抗体接触产生的氟化物与样品分离。然而，可采用其它回收方法。将回收的复合物与至少一种第二抗体接触，所述第二抗体针对抗原上的抗原决定簇并且能够结合复合物上的抗原。第二抗体所针对的抗原决定簇可以为第一抗体所针对的相同抗原决定簇，这是由于抗原实体的多表位特性。可使用上述标签中的任一个使第一抗体或第二抗体可检测。在一个优选的实施方案中，使第二抗体可检测。结合到复合物的可检测抗体的存在可以容易地使用本领域已知的技术进行检测，所述复合物由结合到第一抗体和第二抗体的抗原组成。通过将生物样品中获得的结果与对照样品上获得的那些结果进行比较，可确定改变的Aβ3pE或其片段水平的存在。
体内方法
本发明的方面涉及用于预防、改善、治疗和/或减少淀粉样蛋白-β相关病症中淀粉样蛋白-β沉积的方法，其包括以治疗有效量向本发明的受试者施用本文所公开的抗体或其抗原结合片段。本发明的附加方面包括用于预防、改善、治疗和/或减少淀粉样蛋白-β相关病症中淀粉样蛋白沉积的药物组合物，其包含如本文所公开的抗体或其抗原结合片段。本发明的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本发明涉及预防、改善、治疗和/或减少人类中特征在于形成含有β-淀粉样蛋白的斑块的病症中的淀粉样蛋白-β沉积的方法，所述方法包括向对其有需要的人施用，优选外周施用治疗或预防有效量的根据本发明的抗体或其免疫活性片段，所述抗体特异性地结合到人Aβ3pE。在另一方面，本发明涉及抑制淀粉样蛋白斑的形成和/或清除人类中的淀粉样蛋白斑的方法，所述方法包括向需要此类抑制或清除的人受试者施用有效量的根据本发明的抗体，所述抗体在脑中多价螯合Aβ3pE肽并诱导脑中改变的Aβ3pE清除。在附加的方面，本发明涉及此类人源化抗体，包括其免疫有效部分，以及它们的制备方法。在具体实施方案中，人源化抗体具有Aβ/pE3/1的CDR(即SEQ ID NO:3-11和14-20中的任一种)。
对其有需要的受试者是患有或易患有特征在于形成含有β淀粉样蛋白的斑块的病症的人。在一个实施方案中，所述病症是阿尔茨海默病。在其它实施方案中，所述病症为与21号染色体三体性相关联的痴呆(唐氏综合征)、弥散性路易体病、包涵体肌炎、大脑淀粉样蛋白血管病或荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样蛋白变性(HCHWA-D)。
人源化抗体是来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加它们与人中天然产生的抗体变体的相似性。一般来讲，人源化抗体的蛋白质序列与人类变体的蛋白质序列基本上相同，除了其互补决定区(CDR)片段负责抗体结合到其靶抗原的能力的一些或全部的非人源之外。将可变区的构架区替代为相应的人构架区，保留非人CDR基本上完整。在一些情况下，人源化抗体在非人CDR区中的一个或多个中确实具有少量取代，以保留非人抗体的结合亲和力和/或解离常数。
人源化抗体同样指这样的抗体，其含有人构架、至少一个来自非人抗体的CDR，并且其中存在的任何恒定区基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少约85％、90％，优选至少95％相同或98％相同。因此，除了CDR中的一个或多个之外，人源化抗体的所有部分均与人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。例如，人源化免疫球蛋白将通常不涵盖嵌合小鼠可变区/人恒定区抗体。
对于用于人治疗而言，人源化抗体具有优于非人抗体和嵌合抗体的至少三个潜在的优点：1)因为效应子部分是人的，所以其可与人体免疫***的其它部分更好地相互作用(例如，活化微胶细胞以清除斑块)；2)人免疫***应当不将人源化抗体的构架区或C区识别为外源的，因此针对此类施用的抗体的抗体应答应当小于针对完全外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体的抗体应答。以及3)已经报道施用的非人抗体在人体循环中的半衰期地短于人抗体的半衰期。
在治疗和预防特征在于形成含有β淀粉样蛋白的斑块的方法中，使用标准的施用技术，将本发明的抗体或其抗原结合片段(包括免疫活性片段)施用于处于以下情况的风险或表现出以下情况的受试者：淀粉样蛋白β相关症状或病理学，诸如临床或临床前阿尔茨海默病、与唐氏综合征相关的痴呆、或临床或临床前淀粉样蛋白血管病变。优选地，通过静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂给药来外周给药(即不通过施用于中枢神经***中)。虽然抗体或其结合片段可直接施用到心室***、脊髓液或脑实质中，并且用于访问这些位置的技术在本领域中是熟知的，但是不必使用这些更加困难的程序。在通过依赖于外周循环***的更简单技术进行施用时，本发明的抗体或其结合片段是有效的。本发明的优点包括抗体或其抗原结合片段即使不直接提供至中枢神经***本身也能发挥其有益效果的能力。
用于施用的药物组合物被设计成适于所选的施用模式，并且适当地使用药学上可接受的赋形剂，诸如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。Remington's Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton Pa.，最新版，以引用方式并入本文，提供了从业者通常已知的制剂技术概要。
可能尤其有用的是改变本发明抗体的溶解度特性，从而使其更具亲脂性，例如通过将其包封在脂质体中或通过阻断极性基团。
优选通过静脉注射或腹膜内注射或皮下注射的外周全身性递送。用于此类注射的合适载体是明确的。然而，此外，施用也可借助于鼻用气溶胶或栓剂通过粘膜执行。适用于此类施用模式的制剂是熟知的，并且通常包括有利于跨膜转移的表面活性剂。此类表面活性剂通常衍生自类固醇或阳离子脂质，诸如N-[1-(2,3-二油酰基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或各种化合物，诸如胆固醇半琥珀酸酯、磷脂酰甘油等。
根据所选的具体施用模式，主要基于流体体积、粘度等，选择低至约0.1重量％至多达约15重量％或20重量％的制剂中的人源化抗体的浓度。因此，用于注射的典型药物组合物可被制成含有1mL磷酸盐缓冲盐水的无菌缓冲水和1-100mg本发明的人源化抗体。制剂可在制备制剂后无菌过滤，或换句话讲制成微生物学上可接受的。用于静脉输注的典型组合物可具有多达250mL流体诸如无菌林格氏溶液的体积，和1-100mg/mL或更多的抗体浓度。
对于抗体施用而言，剂量的范围是从宿主体重的约0.0001mg/kg至100mg/kg，并且优选0.01mg/kg至75mg/kg。例如，剂量可以为宿主体重的0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、20mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、或75mg/kg。在实施方案中，剂量在0.01-10mg/kg范围内，或在0.1-15mg/kg范围内，或在0.1-20mg/kg范围内，或在0.1-30mg/kg范围内，或在0.1-40mg/kg范围内，或在0.1-50mg/kg范围内，或在0.1-60mg/kg范围内，优选至少1mg/kg、至少5mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg、至少50mg/kg或至少60mg/kg。在一个优选的示例中，剂量可为约10kg/mg、约20kg/mg、约30kg/mg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg或约70mg/kg。在一个特别优选的示例中，抗体以约0.3mg/kg至约60mg/kg的剂量范围腹膜内施用。在示例性治疗方案中，抗体以约10kg/mg、约20kg/mg、约30kg/mg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg的剂量腹膜内施用。
如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量时，其意指涵盖与指定值之间的以下变型：±20％和±0.1％，优选±15％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且还更优选±0.5％、±0.1％、0.05％或0.01％，因为此类变型是适合的。
示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在此类情况下，施用的每种抗体的剂量落在指示的范围内。抗体通常在多个场合施用。单次剂量之间的时间间隔可以为每周、每月或每年。时间间隔也可以是不规律的，如通过测量受试者中抗体与Aβ的血液水平所指示。另选地，抗体可作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般来讲，人抗体示出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。
施用的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在较长时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些受试者在其余生中继续接受治疗。在治疗应用中，可能需要相对较短时间间隔下的相对高剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至受试者示出疾病症状的部分或完全改善。然后，可施用预防性机制。
在一些方法中，施用所述剂量以实现1-1000μg/mL的等离子体抗体浓度，并且在一些方法中25-300μg/mL的等离子体抗体浓度。另选地，抗体可作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率根据抗体在受试者中的半衰期而变化。
用本发明的抗体治疗可以是独立治疗。另选地，用本发明的抗体治疗可以是联合治疗方案的一个组分或阶段，其中一种或多种附加治疗剂也用于治疗个体。
当用于体内治疗时，本发明的抗体或其抗原结合片段以治疗有效量施用于个体，例如，减少、清除或预防β淀粉样蛋白斑块或改善患有AD或其它β淀粉样蛋白相关疾病的受试者的认知功能的量。抗体或其抗原结合片段根据已知的方法，诸如静脉注射给药，例如，推注或通过一段时间连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用于个体。本发明的试剂可任选地与至少部分有效治疗淀粉样蛋白形成病的其它试剂组合施用。在其中淀粉样蛋白沉积物在脑中发生的阿尔茨海默病和相关病症相关病症的情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可以与增加本发明试剂穿过血脑屏障的其它试剂结合施用。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与斑块沉积物中的3pE Aβ结合。通过与牙斑沉积物中的3pE Aβ结合，抗体或其抗原结合片段可诱导斑块去除。斑块移除的诱导可以通过激活斑块周围的小胶质细胞和通过移除稳定的Aβ形式使斑块去稳定化来进行。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可抑制3pE Aβ的斑块接种活性。与血管淀粉样蛋白相比，斑块中3pE Aβ的可能富集可以增加免疫疗法的治疗安全窗。
试剂盒和装置
本发明提供可用于上述方法的试剂盒和装置。优选地，试剂盒和装置包含结合到3pE Aβ的抗体或其抗原结合片段。此外，试剂盒可包含试剂和指示材料。指令可例如印刷在纸上和/或以电子可读介质提供。另选地，指令可通过将用户引导至互联网网站，例如由试剂盒的制造商或经销商指定的互联网网站来提供。
包含在本发明的试剂盒中的试剂可以以各种方式的容器形式提供，使得不同组分的活性基本上被保持，同时组分本身基本上不被容器的材料吸附或改变。
在一个实施方案中，试剂盒或装置包含本发明的抗体或其抗原结合片段，优选纯化抗体，更优选为单克隆抗体，甚至更优选为结合3pE Aβ肽的分离的单克隆抗体。在实施方案中，抗体由杂交瘤细胞表达。
实施例
鉴于以下非限制性实施例，可另外理解本发明。
实施例1
单克隆抗体的生成
三只Balb/c小鼠(Janvier Lab)用H2N-pEFRHDSGC-COOH(SEQ ID NO:21)(Eurogentec)的完全弗氏佐剂(Sigma)溶液接种。根据制造商的说明，使用可商购获得的试剂盒，诸如Imject Maleimide Activated BSA试剂盒(Pierce，Rockford，IL)，通过经由COOH-末端半胱氨酸残基将肽偶联到马来酰亚胺活化的牛血清白蛋白(LifeTechnologies)来制备所述肽。每两周用100μg或200μg BSA-偶联肽对小鼠进行加强免疫，该肽首先处于完全弗氏佐剂中，随后处于不完全弗氏佐剂中。
杂交瘤和抗体生产：选择示出最高血清滴度的小鼠进行融合，而将其它小鼠的脾分离并在液氮中冷冻。在融合或脾脏提取前第4天，用盐水中的100μg与BSA(Merck)偶联的pEFRHDSGC(SEQ ID NO:21)经腹膜内对所有小鼠进行加强免疫。通过改进的Kohler和Milstein的方法，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞(ATCC，Manassas，VA)融合(Euro.J.Immunol.，1976；292-295)。将融合瘤接种于30×96-孔盘中，并在10天后在直接ELISA中对于0.5μg/孔非偶联的Aβ3pE-40肽(SEQ ID NO:22)(AnaSpec，Fremont，USA)进行筛选。在0.5μg/mL涂布Aβ1-40肽(SEQ ID NO:23)(AnaSpec，Fremont，USA)测试阳性细胞的交叉反应性(的缺乏)，并立即进行亚克隆。
在第一次融合后，在直接涂布ELISA筛选中，17个克隆体与人Aβ3pE-40(SEQ IDNO:22)合成肽反应成阳性并且在液氮中冷冻。该17个克隆体被命名为Aβ/pE3/1至Aβ/pE3/7。进行二次融合，并且在进一步表征中还包含来自该二次融合的2个其它克隆体(Aβ/pE3/18及Aβ/pE3/19)
所有杂交瘤均在达尔贝科改良伊格尔培养基中生长，所述培养基补充有10％胎牛血清(Hyclone,Europe)、杂交瘤融合克隆补充物(2％)(Roche,Brussels,Belgium)、2％HT(Sigma,USA)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺以及青霉素(100U/mL)和链霉素(50mg/mL)。所有产品均可商购获得，并且购自Life Technologies(Paisley，UK)。将细胞在加湿的8％CO2空气培养箱中温育。
用于抗体选择的直接ELISA：用于检测上述Aβ3pE-40抗体的筛选ELISA是直接ELISA，用0.5μg/mL游离人Aβ3pE-40肽(SEQ ID NO:22)在4℃下，在50μL/孔涂布缓冲液(10mM Tris，10mM NaCl，和10mM NaN3，pH 8.5)中在NUNC Maxisorp(Life Technologies)平底高结合性96孔微量盘中涂布过夜。
第二天，在室温下用75μL/孔的在PBS中的0.1％酪蛋白(Merck)封闭平板60分钟以减少非特异性结合。接下来，添加50μL杂交瘤上清液，并且在37℃下温育1小时。在洗涤后，用50μL/孔的与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠IgG(Amersham-Pharmacia Biotech)在37℃下检测结合的单克隆抗体1小时。两种试剂均在0.1％酪蛋白/PBS中稀释。将板洗涤，并且添加50μL的0.42mM 3,5,3',5'-四甲基联苯胺(Biorad)、0.003(体积/体积)％H2O2(Biorad)的100mM柠檬酸(Biorad)溶液；100mM磷酸氢二钠(pH 4.3)(Biorad)作为底物。允许反应在室温下在平板振荡器上进行最多15分钟，此后用50μL/孔的2N H2SO4停止显色，并且在微量滴定板阅读器(Thermomax，Molecular Devices)上在450nm处阅读该板。利用与筛选测定相同的直接ELISA，测试具有全尺寸人游离Aβ1-40(SEQ ID NO:23)的所选单克隆抗体的交叉反应性。
确定Aβ/pE3/1具有鼠IgG1同种型重链和鼠k轻链。虽然鼠IgG1Fc与鼠IgG2a Fc仅具有70％的序列同一性和76％的序列相似性，但这些同种型具有不同的活性和蛋白质谱。与鼠IgG2a相比，由于与鼠FcγRI、FcγRIII和FcγRIV受体和鼠C1q的较弱结合，鼠IgG1具有较少鼠Fc效应和互补功能。鼠IgG2a被认为是最接近人IgG1活性的同种型，其结合至鼠FcγRI、FcγRIII和FcγRIV受体以及鼠C1q，从而具有可有助于Aβ斑块的清除的补体、ADCC和ADCP活性。
Aβ/pE3/1重链的序列从鼠IgG1(SEQ ID NO:31)改变成鼠IgG2a(SEQ ID NO:1)。下文所述的实验数据使用具有IgG2a重链的Aβ/pE3/1。重链可变区(包括CDR)未改变。
实施例2
用于敏感性测试的夹心ELISA
对于所选择的Aβ3pE单克隆抗体，在使用合成肽作为标准物的夹心测定法中评估Aβ3-40(SEQ ID NO:24)(AnaSpec，Fremont，USA)和Aβ3pE-40(SEQ ID NO:22)(AnaSpec，Fremont，USA)的检测灵敏度。用于涂覆的JRF/cAβ40/28-HRPO和用于检测的Aβ/pE3/1-19抗体和的组合用于研究检测的灵敏度。
材料和方法：将Aβ3-40(SEQ ID NO:24)和Aβ3pE-40(SEQ ID NO:22)肽的标准物以0.l mg/mL溶于二甲亚砜(DMSO)(Sigma)中并在-80℃下储存。对于用于ELISA中而言，将肽在0.1％酪蛋白的PBS溶液中进一步稀释至1pg/mL。九十六孔板(半区黑板；Costar)用单克隆抗体Aβ/pE3/1-Aβ/pE3/9以在涂覆缓冲液中1.5μg/mL的浓度，在4℃下涂覆过夜。第二天，洗涤板，并在室温下用0.1％酪蛋白的PBS溶液阻断1-4小时。将标准物与HRPO标记的第二抗体一起在4℃下温育过夜。在过夜温育之后，洗涤板，并根据制造商的建议，用Quantablu底物(Pierce，Rockford，IL)使测定显色。
结果：基于对于Aβ3pE-40(SEQ ID NO:22)肽的高敏感性及选择性，选择抗体Aβ/pE3/1用于进一步表征(表2)。此外，该抗体展示出转基因小鼠和人AD脑上的斑块标记(表2以及实施例5和6)。
表2
实施例3
交叉反应性测试的夹心ELISA
对于所选的Aβ3pE单克隆抗体Aβ/pE3/1，使用合成肽评价与啮齿动物Aβ3pE-40和人Aβ1-40(SEQ ID NO:23)、Aβ3-40(SEQ ID NO:24)、Aβ1-42(SEQ ID NO:25)、Aβ3-42(SEQID NO:26)、Aβ11pE-40(SEQ ID NO:28)和Aβ11pE-42(SEQ ID NO:29)的交叉反应性。使用组合Aβ/pE3/1+JRF/cAβ40/28-HRPO来研究与Aβ1-40(SEQ ID NO:23)、Aβ3-40(SEQ ID NO:24)、Aβ11pE-40和啮齿动物Aβ3pE-40的交叉反应性。使用组合Aβ/pE3/1+JRF/cAβ42/26-HRPO来研究与Aβ1-42(SEQ ID NO:25)、Aβ11pE-42和Aβ3-42(SEQ ID NO:26)的交叉反应性。测试最高至10,000pg/mL的浓度。
材料和方法：以0.1mg/mL将标准物溶于二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)中并储存于-80℃下。对于用于ELISA中而言，将肽在0.1％酪蛋白的PBS溶液中进一步稀释至1pg/mL。将九十六孔板(Maxisorb ELISA板，NUNC)在4℃下用来自Aβ/pE3/1的单克隆抗体以在涂布缓冲液1.5μg/mL的浓度涂布过夜。第二天，洗涤板，并在室温下用0.1％酪蛋白的PBS溶液阻断1-4小时。将标准物与HRPO标记的第二抗体(JRF/cAβ40/28-HRPO或JRF/cAβ42/26-HRPO)在4℃下一起温育过夜。在过夜温育之后，洗涤板，并根据制造商的建议，用TMB过氧化物EIA底物试剂盒(Biorad)使测定显色。
结果：Aβ/pE3/1Aβ/pE3/1示出具有与Aβ3pE-40(SEQ ID NO:22(图2A)和Aβ3pE-42(SEQ ID NO:30)(数据未示出)的选择性结合。未检测到与人Aβ1-40(SEQ ID NO:23)(图2C)和AβpE11-40(图2D)的结合。在最高至10ng/mL的浓度下，还未检测到与人Aβ1-42(SEQ IDNO:25)、人AβpE11-42和啮齿动物Aβ3pE-40的结合(数据未示出)对于Aβ3-40(SEQ ID NO:24)(图2B)和Aβ3-42(SEQ ID NO:26)(数据未示出)肽检测到有限的交叉反应性(表2和图2)。
实施例4
用于检测抗体对人AD脑组织中的斑块的反应性的免疫组织化学
在***固定、石蜡包埋(FFPE)以及非固定的冷冻保存的脑组织中，研究了Aβ/pE3/1对人AD脑组织中的斑块的反应性。
材料和方法
***固定的石蜡包埋的AD脑：使用显微镜用薄片切片机(Leica，Wetzlar，Germany)，由***固定的石蜡包埋脑部制备6μm厚度的切片。在Labvision自动染色机(Thermo Fisher Scientific，CA)上进行染色。简而言之，在脱蜡和70％甲酸(Merck)表位恢复后，将切片针对内源性过氧化酶进行阻断并与Aβ/pE3/1第一抗体一起培养。施用缀合到HRPO的第二抗小鼠或抗兔抗体(Envision)并且将3,3'-二氨基联苯胺(DAB；Dako)用作色原体。最后，用苏木精(Dako)对所有切片进行染色。
非固定冷冻保留AD脑部：切片购自商业源(T1236051A1z-sections，Gentaur)并且在室温下风干2小时。在PBS中冲洗后，在37℃下将切片与Aβ/pE3/1第一抗体一起温育。将下一切片固定在NBF 4％(***，)/乙醇中并在PBS中冲洗。将第二Cy3标记的抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温下温育2小时，之后在PBS中冲洗。最后，用Hoechst(Invitrogen)复染所有切片，并且添加盖玻片。
就对于FFPE和冷冻保存的AD脑组织中的斑块进行反应性的Aβ/pE3/1免疫组织化学测试而言，将多克隆抗体用作对照。
结果：对于FFPE(图3A)和未固定冷冻保存(图4A)人AD脑部，展示出Aβ/pE3/1的反应性，其显示出与参考抗体(抗人淀粉样蛋白β(N3pE)兔IgG，IBL，Japan)相似的染色图案(图3B和4B)。这展示出Aβ/pE3/1检测到了人脑组织中的斑块。
实施例5
抗体在脑组织中的靶接合和毒性
研究了用Aβ/pE3/1(来自克隆体1的抗体)处理后的靶接合和毒性。
材料和方法：用3次腹腔注射的60mg/kg的Aβ/pE3/1(克隆体1)抗体(IgG2a)在第1天、第4天和第8天(n＝10)处理人Aβ42和Aβ40肽(19-20个月大)的表达水平升高的老年转基因小鼠。实验包括接受PBS注射的对照组(n＝6)。在第一次注射后的第12天，将动物安乐死。每一组中有一半经处理的小鼠接受PBS灌注，然而另一半未经灌注以允许评估解剖时的潜在异常。将左半球冷冻保存的，然而将右半球固定在DMFA中，之后进行石蜡包埋。
在第1天，用单次腹腔注射剂量20mg/kg或60mg/kg Aβ抗体3D6(IgG2a；结合到Aβ的N末端)处理表达升高水平的人Aβ42和Aβ40肽的6个月大的转基因小鼠(n＝4只每组)。在该年龄下，已知动物在脑中具有显著的Aβ沉积。实验包括接受PBS注射的对照组(n＝3)。在4天将动物安乐死。小鼠不接受灌注以允许评估解剖时的潜在异常。
为了评价在全身性施用抗体后脑中的靶接合，对来自经灌注小鼠的冷冻切片执行免疫组织化学，其利用第二抗小鼠同型特异性抗体(生物素化抗-mIgG2a第二抗体；LifeTechnologies)，并且将经标记区域(皮质和海马)％归一化为与第一抗体和第二抗体一起温育的相邻切片的相同量度，以获得每只小鼠的斑块标记％。
为了评估潜在毒性，在未经灌注动物的组中，评估剖检时的出血现象。另外，对所有经处理小鼠的脑部进行苏木精和伊红(H&E)染色。
结果：在表达升高水平的人Aβ42和Aβ40的19-20个月大的小鼠中观察到在用3次剂量60mg/kg的来自Aβ/pE3/1的抗体处理之后的靶接合(斑块结合)和无毒性。在非灌注动物中，在解剖时未观察到出血(图5E)。在用单剂量20mg/kg或60mg/kg抗体3D6处理后，在75％的表达升高水平的人Aβ42和Aβ40(6个月大)的经处理小鼠中，在解剖时容易观察到出血(图5B和图5C，由箭头指示)。在经PBS处理的组中，在解剖时没有动物示出出血(图5A和5D)。
来自经Aβ/pE3/1处理小鼠的冷冻切片的研究揭示出高水平的靶接合，如60％的由皮质中的斑块标记％平均值和84％的海马中出血所证明的(图6B)。在经PBS注射的动物中未观察到斑块标记(图6A)。作为对照，将第一抗体(Aβ/pE3/1)加入脑的平行切片中，并用第二抗体染色，以示出两个大脑(经PBS和Aβ/pE3/1-处理的)中斑块的存在(图6C-6D)。
在用H&E染色评估脑组织时，与经PBS注射的对照(图7C)相比，用Aβ/pE3/1处理的小鼠未展现出异常(图7B)。在另一方面，用3D6抗体处理导致观察到以下异常：皮质中退化/坏死(在20mg/kg和60mg/kg组中分别为经3D6处理小鼠的20％和40％)、伴随充血及微血管病变的脑膜发炎性浸润(在20mg/kg和60mg/kg组中分别为经3D6处理小鼠的100％及80％)以及皮质微出血(在20mg/kg和60mg/kg两组中分别为经3D6处理小鼠的60％)(图7A)。在经PBS处理组中，动物在H&E染色的脑载玻片上均不表现出异常(图7C)。经Aβ/pE3/1和PBS处理的小鼠为19-20个月大，然而经3D6个处理的小鼠为6个月大。
总之，在斑块沉积小鼠模型中在用Aβ/pE3/1腹腔内注射后，展示出靶接合但不导致出血，从而指示在用Aβ/pE3/1抗体处理后，靶接合相对于毒性的有利比率。
实施例6
Aβ/pE3/1的生物分子亲和力结合
表面等离子体共振(SPR)是用于研究生物分子相互作用的无标记检测方法。监测传感器表面上的质量的微小变化，该直接实时结合测定提供了关于生物分子之间相互作用的定性和定量数据；即确定平衡结合常数(亲和力，KD)和动力学速率常数(ka/kd；复合体缔合速率ka、以及复合体解离速率kd)。该方法可用于研究蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用，以及蛋白质与小分子之间的相互作用。在此，研究了Aβ/pE3/1和Aβ-3pE-40肽之间的相互作用。
材料和方法：来自A GE Healthcare的小鼠抗体捕获试剂盒用于Aβ/pE3/1对Aβ-3pE-40肽(SEQ ID NO:22)的亲和力研究。按照制造商的方案，在CM5传感器芯片上经由胺偶联执行抗小鼠抗体的固定化。随后，由抗小鼠抗体捕集Aβ/pE3/1(1μg/mL)到300RU水平，之后以各种浓度(3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM和50nM)注射人Aβ3pE-40肽(SEQ ID NO:22)，所述人Aβ3pE-40肽在运行缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，其具有2.7mM KCl、137mMNaCl和0.05％表面活性剂P20(TweenTM20))中稀释。用pH 1.7的10mM甘胺酸HCl盐使表面再生并持续至少180秒和另外的60秒。将人Aβ(1-40)肽用作阴性对照。
使用光学生物传感器T200进行亲和力测量。根据1:1结合拟合模型，用Biacore T200评估软件(第2.0版)，执行动力学分析。
结果：单克隆抗体Aβ/pE3/1的动力学分析证实与Aβ-3pE-40肽的亲和力结合。平衡结合常数(亲和力，KD)和动力学速率常数(ka/kd)示于表3中。展示出Aβ/pE3/1与人Aβ-3pE-40肽的结合相互作用的传感图(单循环动力学)示于图8中。
表3：Aβ/pE3/1的动力学(n＝6)
在描述本发明及其各种实施方案中，为了清楚起见，采用特定术语。然而，本发明不旨在被限制于如此选择的特定术语。相关领域的技术人员将会认识到，在不脱离本发明广泛构思的情况下，可采用其它等同部件，并且可开发出其它方法。在本说明书中任何地方引用的所有参考文献均引入作为参考，如同每个参考文献已单独结合。

Claims (19)

1. 一种结合到3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:2的重链可变区的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及
b)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:13的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
2.根据权利要求1中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:3，
b)所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:4，
c)所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:5，
d)所述轻链可变区CDR1包含SEQ ID NO:14，
e)所述轻链可变区CDR2包含SEQ ID NO:15，并且
f)所述轻链可变区CDR3包含SEQ ID NO:16。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区CDR1为SEQ ID NO:3，
b)所述重链可变区CDR2为SEQ ID NO:4，
c)所述重链可变区CDR3为SEQ ID NO:5，
d)所述轻链可变区CDR1为SEQ ID NO:14，
e)所述轻链可变区CDR2为SEQ ID NO:15，并且
f)所述轻链可变区CDR3为SEQ ID NO:16。
4.根据权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:6，
b)所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:7，
c)所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:8，
d)所述轻链可变区CDR1包含SEQ ID NO:17，
e)所述轻链可变区CDR2包含SEQ ID NO:18，并且
f)所述轻链可变区CDR3包含SEQ ID NO:19。
5.根据权利要求1或4中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区CDR1为SEQ ID NO:6，
b)所述重链可变区CDR2为SEQ ID NO:7，
c)所述重链可变区CDR3为SEQ ID NO:8，
d)所述轻链可变区CDR1为SEQ ID NO:17，
e)所述轻链可变区CDR2为SEQ ID NO:18，并且
f)所述轻链可变区CDR3为SEQ ID NO:19。
6.根据权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:9，
b)所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:10，
c)所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:11，
d)所述轻链可变区CDR1包含SEQ ID NO:20，
e)所述轻链可变区CDR2包含SEQ ID NO:18，并且
f)所述轻链可变区CDR3包含SEQ ID NO:16。
7.根据权利要求1或6中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区CDR1为SEQ ID NO:9，
b)所述重链可变区CDR2为SEQ ID NO:10，
c)所述重链可变区CDR3为SEQ ID NO:11，
d)所述轻链可变区CDR1为SEQ ID NO:20，
e)所述轻链可变区CDR2为SEQ ID NO:18，并且
f)所述轻链可变区CDR3为SEQ ID NO:16。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；并且
b)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体。
11.一种结合到3pE Aβ的分离抗体，所述分离抗体包含：
a)SEQ ID NO:1的重链；以及
b)SEQ ID NO:12的轻链。
12.一种杂交瘤，所述杂交瘤产生根据权利要求1-11中任一项所述的抗体。
13.一种产生单克隆抗体的方法，所述方法包括使用根据权利要求12所述的杂交瘤。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
15.一种治疗与含有β-淀粉样蛋白的斑块的形成相关联的病症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述病症为阿尔茨海默病。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述病症选自与21号染色体三体性相关联的痴呆（唐氏综合征）、弥散性路易体病、包涵体肌炎、大脑淀粉样蛋白血管病和荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样蛋白变性（HCHWA-D）。
18.一种减少与阿尔茨海默病相关联的斑块的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
19.一种预防3pE Aβ的接种活性的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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