ES2962767T3 - Anticuerpos contra piroglutamato amiloide-beta y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra piroglutamato amiloide-beta y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

La invención proporciona un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen a 3pE Aβ y métodos para preparar y usar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, incluido el uso para formulaciones, administración y kits. El anticuerpo y sus fragmentos de unión a antígeno y los métodos descritos son útiles para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades relacionadas con el β-amiloide. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra piroglutamato amiloide-p y usos de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere al campo de anticuerpos dirigidos a péptidos de amiloide-beta (Ap) y métodos terapéuticos que usan los anticuerpos. En particular, los anticuerpos pueden usarse para identificar y tratar trastornos relaciones con amiloides.
ANTECEDENTES
La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno cerebral degenerativo caracterizado clínicamente por pérdida progresiva de memoria, capacidad intelectual, razonamiento, sentido de la realidad y estabilidad emocional, que da lugar gradualmente a un deterioro mental profundo y finalmente muerte. La enfermedad de Alzheimer es una causa común de incapacidad mental progresiva (demencia) en los ancianos. La enfermedad de Alzheimer se ha observado en todo el mundo y representa un problema de salud pública principal. Actualmente se estima que la enfermedad afecta a más de cinco millones de individuos solo en los Estados Unidos. Actualmente es incurable, y ningún tratamiento previene de forma eficaz la AD o revierte sus síntomas o evolución.
El cerebro de individuos con AD presenta lesiones características denominadas placas amiloides, angiopatía amiloide (depósitos amiloides en vasos sanguíneos) y ovillos neurofibrilares. Grandes cantidades de estas lesiones, particularmente las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares, en general se encuentra en varias zonas del cerebro importantes para la memoria y la función cognitiva. Las placas amiloides y la angiopatía amiloide también caracteriza el cerebro de individuos con trisomía del 21 (síndrome de Down), enfermedad con cuerpos de Lewy difusos y hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis del tipo Dutch (HCHWA-D).
Un constituyente principal de las placas amiloides es una diversidad de péptidos amiloide-beta (Ap) que se producen por escisión de la proteína precursora p-amiloide (APP). Existe la hipótesis de que el depósito de péptidos Ap en el cerebro es una etapa inicial y necesaria en la secuencia en cadena de la enfermedad que da lugar a A<d>. La identificación de mutaciones en los genes de proteína precursora amiloide y presenilina que provocan producción alterada de Ap y que producen AD familiar de aparición temprana proporciona fuertes evidencias de que el metabolismo alterado de amiloides es un acontecimiento central en el proceso patológico subyacente a la enfermedad.
Los péptidos amiloide-p que tiene piroglutamato en el tercer residuo (3pE Ap) son una especie principal depositada en el cerebro de pacientes con AD. 3pE Ap está presente en casi todas las placas difusas y maduras en AD, es metabólicamente estable y puede desempeñar una función tanto en la siembra como en la estabilización de las placas (Cyniset al.,Molecular Neurodegeneration, 2016; 11:48). No se ha informado de cantidades detectables de 3pE Ap en LCR o plasma, lo que sugiere, por tanto, que el péptido diana es específico de patología (DeMattoset al.,Neuron, 2012; 76:1-13). Anticuerpos que se unan selectivamente a 3pE Ap pueden ser útiles para inmunoterapia. El documento WO 2015/191825 describe métodos para detectar y medir pE3-Ap y usos de los métodos para diagnóstico y pronóstico. El documento WO 2012/021469 se refiere a anticuerpos anti-N3pGlu Ap y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. El documento WO 2010/009987 describe un ensayo de anticuerpos de diagnóstico para el diagnóstico de amiloidosis. El documento WO 2016/097305 se refiere a un método para la detección de péptidos pGlu-Ap. El documento WO 2011/151076 describe anticuerpos que se dirigen a oligómeros Ap. Frostet al.(2015)Neurobiol Aging 36(12)3187-3199describe inmunización anti-piroglutamato-3 Ap y sus efectos en ratones APPswe/PS1AE9.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Como se plasma y se describe completamente, la invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a amiloide-p que tiene piroglutamato en el tercer residuo (3pE Ap), métodos de producción de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a 3pE Ap, métodos de ensayo que usan dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención para su uso en el tratamiento, retardo de la aparición de o reversión de al menos una patología o síntoma de enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades relacionadas con p-amiloide. Los anticuerpos de la invención se unen preferentemente a péptido Ap que contiene 3pE sobre péptido Ap que no contiene 3pE.
La invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a péptidos amiloide-p que tienen piroglutamato en el tercer residuo (3pE Ap), que comprende:
a) una región variable de la cadena pesada que tiene una región determinante de la complementariedad (CDR) 1, CDR2 y CDR3 de una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:2, y
b) una región variable de la cadena ligera que tiene una CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 13,
en donde las CDR de las regiones variables de la cadena pesada y ligera se definen por Kabat, Chothia o IMGT, y en donde:
I) como se define por Kabat:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:3,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:4,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:5,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 14,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 15, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 16;
II) como se define por Chothia:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:6,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:7,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:8,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 17,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 18, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 19; o
III) como se define por IMGT:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:9,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 10,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 11,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO:20,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 18, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 16; y
en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13.
La invención proporciona además un hibridoma que produce el anticuerpo de la invención.
La invención también proporciona un método de producción de anticuerpos monoclonales que comprende usar el hibridoma de la invención.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en un método de tratamiento de una afección asociada con la formación de placas que contienen proteína beta-amiloide en un sujeto, que comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto, en donde
a) la afección es enfermedad de Alzheimer, o
b) la afección se selecciona del grupo que consiste en demencia asociada con trisomía del 21 (síndrome de Down), enfermedad con cuerpos de Lewy difusos, miositis por cuerpos de inclusión, angiopatía amiloide cerebral y hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis del tipo Dutch (HCHW A-D).
En particular, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a 3pE Ap, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 12. En otras realizaciones, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a 3pE Ap, que comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:2 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 13. En una realización particular, la región variable de la cadena pesada comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:3-5, respectivamente y la región variable de la cadena ligera comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 14-16, respectivamente. En otra realización particular, la región variable de la cadena pesada comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:6-8, respectivamente y la región variable de la cadena ligera comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 17-19, respectivamente. En otra realización particular, la región variable de la cadena pesada comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:9-11, respectivamente y la región variable de la cadena ligera comprende CDR1, CDR2 y c Dr 3 de SEQ ID NO:20, 18 y 16, respectivamente.
La invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a 3pE Ap, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98%de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:13.
Una realización de la invención es un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de CDR1 que comprende los residuos aminoacídicos 31-35 de SEQ ID NO:2, una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de CDR2 que comprende los residuos aminoacídicos 50-66 de SEQ ID NO:2, una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de CDR3 que comprende los residuos aminoacídicos 99-108 de SEQ ID NO:2, una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 que comprende los residuos aminoacídicos 24-39 de SEQ ID NO: 13, una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR2 que comprende los residuos aminoacídicos 55-61 de SEQ ID
NO: 13; y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR3 que comprende los residuos aminoacídicos 94-102 de SEQ ID NO: 13.
Una realización preferida de la invención es un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:3, una secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:4, una secuencia CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:5, una secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 14, una secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 15, y una secuencia CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 16.
En realizaciones preferidas, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones preferidas, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo de fragmentos que consiste en Fv, F(ab'), F(ab')2 y scFv. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une selectivamente al péptido 3pE Ap (por ejemplo, Ap3pE-40 y Ap3pE-42), con poca o ninguna reactividad cruzada con otros péptidos Ap o proteína precursora p-amiloide (APP).
Realizaciones de la invención incluyen un método de generación de anticuerpos monoclonales contra 3pE Ap de la invención. Una realización particular de la invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la invención que se une a 3pE Ap. En otra realización, un anticuerpo monoclonal de la invención que se une a 3pE Ap se produce de forma recombinante. En realizaciones, los anticuerpos monoclonales de la invención se expresan por células de hibridoma o se expresan de forma recombinante. Los anticuerpos monoclonales generados comprenden una región variable de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO:2 y una región variable de la cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 13.
Realizaciones de la invención se refieren a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades relacionadas con pamiloide, que comprende administrar el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une a 3pE Ap a un individuo con enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad relacionada con p-amiloide.
Una realización adicional de la invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en la eliminación de placas asociadas con enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad relacionada con p-amiloide, que comprende administrar el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une a 3pE Ap a un individuo con enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades relacionadas con p-amiloide.
Otras realizaciones se refieren a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en la prevención de actividad de siembre de placas de 3pE Ap, que comprende administrar el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une a 3pE Ap a un individuo con enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad relacionada con p-amiloide.
Realizaciones incluyen una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un sujeto con enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad relacionada con p-amiloide, o usarse para tratar la enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad relacionada con p-amiloide tal como se describe anteriormente.
Objetos, rasgos característicos y ventajas adicionales de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la consideración detallada de las realizaciones preferidas que siguen.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra secuencias de aminoácidos de péptidos Ap de longitud completa humano (Ap 1-42) (SEQ ID NO:25), N-truncado (Ap 3-42) (SEQ ID NO:26) y modificado con piroglutamato (Ap 3pE-42) (SEQ ID NO:30).
La figura 2 muestra la selectividad de Ap/pE3/1 por detección de péptidos Ap humanos sintéticos ELISA competitivo. Ap/pE3/1 se unión a (A) Ap3pE-40 y (B) Ap3-40, pero no a (C) Ap1-40 y (d ) AppE11-40.
Las figuras 3A-3B muestran la reactividad a las placas en tejido cerebral con AD, fijado en formol, incluido en parafina (FFPE) por inmunohistoquímica mediante (A) Ap/pE3/1 y (B) anticuerpo policlonal de control positivo.
Las figuras 4A-4B muestran la reactividad a placas en tejido cerebral con AD crioconservado no fijado por inmunohistoquímica mediante (A) Ap/pE3/1 y (B) anticuerpo policlonal de control positivo.
Las figuras 5A-5E muestran imágenes representativas de cerebros en ratas que se trataron con anticuerpos contra Ap o control. Ratones de seis meses de edad se trataron con (A) PBS, (B) anticuerpos contra Ap específico d extremo 3D6 (60 mg/kg) o (C) 3D6 (20 mg/kg). Ratones de diecinueve a veinte meses de edad se trataron con (D) PBS o (E) Ap/pE3/1 (60 mg/kg). Las flechas indican la observación de hemorragias en la autopsia.
Las figuras 6A-6D muestran criosecciones de cerebros de ratones que expresan niveles elevados de Ap42 y Ap40 humano después de tratamiento con (A y C) PBS o (B y D) Ap/pE3/l. (A y B) se tiñeron usando solamente anticuerpo secundario anti-IgG2a de ratón. (C y D) se tiñeron después de proporcionar tanto anticuerpo primario como secundario. La barra de escala representa 2,5 mm.
Las figuras 7A-7C muestran tinción con hematoxilina y eosina (H&E) después de tratamiento con (A) anticuerpo 3D6, (B) Ap/pE3/1 o (C) PBS en ratones de 6 meses o 19-20 meses de edad que expresan niveles elevados de Ap42 y Ap40 humano.
La figura 8 es un sensograma (cinética de un solo ciclo) a partir de detección sin marcador en resonancia de plasmones superficiales de la interacción de unión de afinidad de Ap/pE3/1 con péptido Ap(3pE-40) humano.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Debe apreciarse que la terminología usada en este documento es solamente con el propósito de describir realizaciones particulares.
La invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones y los usos de los mismos como se indica en las reivindicaciones.
En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a 3pE Ap, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de SEQ ID NO:2, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de SEQ ID NO: 13. La región variable de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2. La región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13.
Una realización de la invención es un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia CDR1 que comprende los residuos aminoacídicos 31-35 de SEQ ID NO:2, una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia CDR2 que comprende los residuos aminoacídicos 50-66 de SEQ ID NO: 1, una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia CDR3 que comprende los residuos aminoacídicos 99-108 de SEQ ID NO:2, una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia CDR1 que comprende los residuos aminoacídicos 24-39 de SEQ ID NO: 13, una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR2 que comprende los residuos aminoacídicos 55-61 de SEQ ID NO: 13; y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR3 que comprende los residuos aminoacídicos 94-102 de SEQ ID NO: 13.
Una realización preferida es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:3, una secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:4, una secuencia CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:5, una secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 14, una secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 15, y una secuencia CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 16.
Anticuerpos
La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une a 3pE Ap. El término "anticuerpo" se refiere en este documento a una proteína de inmunoglobulina que puede unirse a un antígeno o parte del mismo, particularmente una proteína inmunoglobulina que puede unirse específicamente a 3pE Ap. La unión del anticuerpo al antígeno puede medirse por métodos conocidos por los expertos en la materia, siendo un ejemplo el uso de un instrumento BIAcore™. En líneas generales, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, se dice que se une específicamente: a un antígeno cuando la constante de disociación es menor de o igual a 1 pM, preferiblemente menor de o igual a 100 nM y mucho más preferiblemente menor de o igual a 10 nM.
Los fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos se refieren a un fragmento de un anticuerpo que puede unirse al antígeno con el que se une el anticuerpo intacto y compite con el anticuerpo intacto por la unión al antígeno. Los fragmentos de unión a antígeno comprenden una parte de un anticuerpo intacto que permite la unión al antígeno (es decir, la región variable del anticuerpo intacto). Los fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv), diacuerpos, minicuerpos y anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Los anticuerpos están compuestos de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada tiene un dominio o región variable (V<h>) seguido de un dominio o región constante (C<h>1), una región de bisagra y dos dominios o regiones constantes más (C<h>2 y C<h>3). Cada cadena ligera tiene un dominio o región variable (V<l>) y un dominio o región constante (C<l>). Los dominios o regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras forman el parátopo del anticuerpo (una estructura análoga a un candado), que es específico para un epítopo particular (asimismo análogo a una llave), que permite al parátopo y al epítopo unirse juntos con precisión. Dentro del dominio variable, los bucles variables de las hebras p, tres cada uno en las cadenas ligeras y pesadas, son responsables de la unión al antígeno. Estos bucles se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR, concretamente CDR1, CDR2 y CDR3).
Las CDR se definen como regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo. Estas son las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo que son principalmente responsables de la unión al antígeno. Hay tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Las CDR de un anticuerpo pueden definirse de varias maneras. Por ejemplo, las CDR dentro de la región variable pueden identificarse de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, IMGT y/o definiciones conformacionales o cualquier método de determinación de CDR bien conocido en la técnica. Las CDR de anticuerpo pueden identificarse como las regiones hipervariables originalmente definidas por Kabat (Kabatet al.,1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.), las estructuras de bucle estructural originalmente descritas por Chothia (Chothiaet al.,Nature 342:877-883 (1989)) o el sistema de numeración único de IMGT (Lefranc, The Immunologist 7:132-136 (1999); Lefranc,et al.,Nucleic Acids Res. 27:209-212 (1999); Scavineret al.,Exp. Clin. Immunogenet. 16:234-240 (1999); Lefranc,et al.,Nucleic Acids Res. 43:D413-422 (2015)).
"Aislado", cuando se usa en el contexto de un anticuerpo significa alterado "por la mano del hombre" a partir de cualquier estado natural; es decir, que, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un anticuerpo de origen natural presente de forma natural en un animal vivo en su estado natural no está "aislado", pero el mismo anticuerpo separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en este documento. Los anticuerpos pueden producirse en una composición, tal como un reactivo de inmunoensayo, que no son composiciones de origen natural, y en las mismas permanecen anticuerpos aislados dentro del significado de ese término como se emplea en este documento.
Los métodos para producir anticuerpos comprenden inocular un hospedador con un inmunógeno deseado. Los hospedadores adecuados incluyen, aunque sin limitación, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, pollos, burros, caballos, monos, chimpancés, orangutanes, gorilas, seres humanos y cualquier especie que pueda montar una respuesta inmunitaria madura. Los procedimientos de inmunización están bien establecidos en la técnica y se exponen en numerosos tratados y publicaciones que incluyen"The Immunoassay Handbook',2.a edición, editada por David Wild (Nature Publishing Group, 2000).
Preferiblemente, se administra un inmunógeno a un sujeto hospedador, por ejemplo, un animal o ser humano, en combinación con un adyuvante. Adyuvantes adecuados incluyen, aunque sin limitación, adyuvante de Freund, hidróxido de aluminio en polvo (alumbre), hidróxido de aluminio junto conBordetella pertussis,y monofosforil lípido A-dicorinomicolato de trehalosa sintético (MPL-TDM).
Típicamente, un inmunógeno o una combinación de un inmunógeno y un adyuvante se inyecta en un hospedador mamífero mediante una o múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Preferiblemente, el programa de inmunización se realiza durante al menos una semana, y más preferiblemente, durante dos o más semanas. Los anticuerpos policlonales producidos de esta manera pueden aislarse y purificarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante los métodos de hibridoma bien establecidos de Kohler y Milstein, por ejemplo,Nature256:495-497 (1975). Los métodos de hibridoma típicamente implican inmunizar un hospedador o linfocitos de un hospedador, recoger los linfocitos que secretan o tienen el potencial de secretar anticuerpos monoclonales, fusionar los linfocitos a células inmortalizadas, y seleccionar células que secretan el anticuerpo monoclonal deseado.
Un hospedador puede inmunizarse para obtener linfocitos que produzcan o puedan producir anticuerpos específicos para un inmunógeno. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarsein vitro.Si se desean células humanas, pueden usarse linfocitos de la sangre periférica, aunque se prefieren esplenocitos o linfocitos de otras fuentes de mamífero.
Los linfocitos pueden fusionarse con una línea celular inmortalizada para formar células de hibridoma, un proceso que puede facilitarse mediante el uso de un agente de fusión, por ejemplo, polietilenglicol. A modo de ilustración, pueden usarse células de mieloma mutantes de roedor, bovinas o humanas inmortalizadas por transformación. Se prefieren poblaciones sustancialmente puras de células de hibridoma, en oposición a las células inmortalizadas no fusionadas. Por tanto, después de la fusión, las células pueden cultivarse en un medio adecuado que inhibe el crecimiento o supervivencia de células inmortalizadas no fusionadas, por ejemplo, usando células de mieloma mutantes que carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). En dicho caso, puede añadirse hipoxantina, aminopterina y timidina al medio (medio HAT) para evitar el crecimiento de células HGPRT-deficientes mientras se permite que crezcan los hibridomas.
Preferiblemente, las células inmortalizadas se fusionan de forma eficaz, pueden aislarse de poblaciones mixtas por selección en un medio tal como HAT, y resisten la expresión estable y de alto nivel de anticuerpos después de la fusión. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas incluyen líneas celulares de mieloma disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Un aspecto de la invención es un método de producción de una línea celular de hibridoma que pueda producir un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Dichos métodos son normalmente conocidos por los expertos en la materia, y en general comprenden: (i) seleccionar un hospedador para la producción de anticuerpos; (ii) inocular el hospedador con un inmunógeno deseado; (iii) fusionar una línea celular del hospedador inoculado con una célula en división continua para crear una célula fusionada que pueda producir un anticuerpo monoclonal que se una al inmunógeno; y (iv) clonar la célula fusionada para obtener una línea celular de hibridoma.
Un método de la invención incluye producir una línea celular de hibridoma que pueda producir un anticuerpo monoclonal de la presente invención que se una al péptido 3pE Ap. El hibridoma puede producirse inmunizando un animal a partir del que puedan producirse hibridomas, tal como un ratón Balb/c, con inyecciones intraperitoneales iniciales de los inmunógenos deseados, tal como un péptido Ap que tiene un piroglutamato, en adyuvante de Freund, seguido de inyecciones de refuerzo, por ejemplo, cada una a dos semanas. La posterior fusión del bazo aislado puede realizarse usando cualquier técnica normalmente conocida por los expertos en la materia, preferiblemente usando células SP2/0 mediante un procedimiento modificado de Kohler y Milstein (Eur. J. Immunol., 1976; 6:292-295). El cribado de los hibridomas para determinar los que producen anticuerpos específicos para los péptidos 3pE Ap puede hacerse en un ensayo convencional, tal como ensayo ELISA o RIA. Un aspecto de la invención es un método de producción de una línea celular de hibridoma que genera el anticuerpo monoclonal Ap/pE3/1.
Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse por métodos recombinantes tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.166.452. El ADN que codifica anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales, por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se unen específicamente a genes murinos de la cadena pesada y ligera, preferiblemente para sondear el ADN aislado de líneas celulares de hibrido de anticuerpos monoclonales que secretan anticuerpos específicos para Ap que tiene un piroglutamato.
También pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específicos para péptidos amiloide beta. Dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitación, los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse al reducir los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse colecciones de expresión de Fab para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huseet al., Science256:1270-1281 (1989)). Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse todos en y secretarse deEscherichia coli,lo que permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Como alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH deE. coliy acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carteret al., BioTechnology10:163-167 (1992)). Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo son conocidas por los expertos en la materia. También se contemplan fragmentos Fv monocatenarios (scFv) (véanse las patentes de Estados Unidos n.° 5.761.894 y 5.587.458). Los fragmentos Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes; por tanto, probablemente mostrarán unión inespecífica reducida. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.642.870, por ejemplo.
Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar anticuerpos monoclonales aislados expresados por las células de hibridoma mencionadas anteriormente, pudiendo los anticuerpos reconocer específicamente 3pE Ap. Los anticuerpos monoclonales aislados pueden expresarse por células de hibridoma o de forma recombinante.
Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se une selectivamente a 3pE Ap, con poca o ninguna reactividad cruzada con otros Ap que no tienen 3pE o proteína precursora p-amiloide (APP). En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se une selectivamente a péptidos Ap 3pE-40 (SEQ ID NO:22) y Ap 3pE-42 (SEQ ID NO:30) con poca o ninguna reactividad cruzada con otros péptidos Ap que no contienen 3pE o APP.
La tabla 1 proporciona las secuencias de aminoácidos del anticuerpo de la invención. Las CDR de las regiones variables de la cadena pesada y ligera, como se definen por Kabat, Chothia e IMGT se exponen como secuencias separadas.
T l 1: n i ni r Af E 1
(Continuación)
Los anticuerpos de la invención también abarcan anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2 y a región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 13.
La expresión "identidad de secuencia" significa que cuando dos secuencias de aminoácidos se alinean de forma óptima, puede hacerse una comparación (es decir, en una base de aminoácidos residuo a residuo) sobre una ventana de comparación en cuanto a lo similares que son, medido por algoritmos bien conocidos de determinación de identidad de secuencia tales como BLAST, ToPLign, Supermatcher y Matcher.
Métodosin vitro
Debe apreciarse que se contemplan todas las formas de inmunoensayos que emplean anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para su uso de acuerdo con las realizaciones preferidas en la presente, incluyendo ensayos en que se unen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos a fases sólidas y ensayos en que los anticuerpos están en medio líquido. Los métodos de inmunoensayos que pueden usarse para detectar analitos usando anticuerpos que incorporan los rasgos característicos de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, ensayos competitivos (limitados por reactivo) en donde un analito marcado (análogo de analito) y un analito en una muestra compiten por los anticuerpos y ensayos inmunométricos de un solo sitio en donde el anticuerpo está marcado; y similares.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con la invención pueden usarse en técnicas inmunológicas convencionales para la detección de Ap3pE dondequiera que se pueda producir, incluyendo muestras biológicas para la supervisión de enfermedades relacionadas con p-amiloide y medios acondicionados de cultivo celular para supervisar el procesamiento intracelular de APP. Técnicas inmunológicas adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen por ejemplo, ELISA, análisis por inmunoelectrotransferencia, inmunoensayos competitivos o de tipo sándwich y similares, ya que por lo demás es bien conocido que todos dependen de la formación de un complejo inmunitario de antígeno-anticuerpo, en donde para el propósito del ensayo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede marcarse de forma detectable con, por ejemplo radiomarcadores, marcadores enzimáticos, luminiscentes o fluorescentes o puede inmovilizarse en vehículos insolubles. Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar inmunoensayos para la determinación o detección de Ap3pE o fragmento del mismo en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo contra Ap3pE de acuerdo con la invención y determinar si se forma un complejo inmunitario entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el Ap3pE o fragmento del mismo. Estos métodos pueden realizarse sobre muestras de tejido o muestras de líquidos corporales y en general comprenden obtener una muestra del cuerpo de un sujeto; poner en contacto dicha muestra con una cantidad eficaz para imágenes de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo marcado de forma detectable de acuerdo con la invención; y detectar el marcador para establecer la presencia de Ap3pE o fragmentos del mismo en la muestra. Los métodos de medición que usan los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención no están particularmente limitados. Puede usarse cualquier método de medición siempre que la cantidad de anticuerpos, antígenos o los complejos de antígeno-anticuerpo correspondientes a la cantidad de los antígenos, en particular la cantidad de Ap3pE o fragmentos del mismo en soluciones a medir, se detecte por medios químicos o físicos, y se calcule a partir de curvas patrón preparadas mediante el uso de soluciones patrón que contienen los antígenos en cantidades conocidas. Por ejemplo, se usan adecuadamente nefelometría, métodos competitivos, métodos inmunométricos y métodos competitivos. Con respecto a la sensibilidad y la especificidad, se prefiere particularmente usar métodos competitivos.
En los métodos competitivos, las soluciones de ensayo se hacen reaccionar con un anticuerpo insolubilizado, tal como anticuerpos anti-Ap3pE insolubilizados (la primera reacción), además, se hacen reaccionar los anticuerpos secundarios marcados (la segunda reacción); entonces se analiza la actividad de los agentes de marcaje sobre los vehículos insolubilizados, de ese modo puede determinarse la cantidad de Ap3pE o fragmentos del mismo en las soluciones de ensayo. La primera reacción y la segunda reacción puede llevarse a cabo simultánea o secuencialmente.
En los métodos de medición, se usan sustancias de marcaje, radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas, etc. como agentes de marcaje. Ejemplos de los radioisótopos incluyen 125I, 131I, 3H y 14C. Las enzimas habitualmente se hacen detectables por conjugación de un sustrato apropiado que, a su vez, cataliza una reacción detectable. Ejemplos de las mismas incluyen, por ejemplo, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y malato deshidrogenasa, preferiblemente peroxidasa de rábano rusticano. Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, ecuorina y luciferasa. Además, también pueden usarse los sistemas de avidina-biotina para marcar los anticuerpos y los inmunógenos de la presente invención. Cuando los inmunógenos o anticuerpos se insolubilizan, puede emplearse adsorción física o unión química habitualmente usada para la insolubilización o fijación de proteínas o enzimas. Ejemplos de los vehículos incluyen polisacáridos insolubles tales como agarosa, dextrano y celulosa, resinas sintéticas tales como poliestireno, poliacrilamida y polímeros siliconados, y vidrio.
En una realización más para detectar o diagnosticar enfermedades relacionadas con p-amiloide, una muestra biológica que incluye tejido, líquidos corporales, tales como LCR, sangre, plasma, suero, orina y similares, se contiene y pone en contacto con una cantidad adecuada de un primer anticuerpo para producir un complejo inmunitario. El contacto típicamente implica añadir la muestra a una matriz sólida recubierta con el primer anticuerpo. El complejo que se produce por el contacto de la muestra con el primer anticuerpo se separa de la muestra por elución. Sin embargo, pueden emplearse otros métodos de recuperación. El complejo recuperado se pone en contacto con al menos un segundo anticuerpo dirigido a un determinante antigénico en el antígeno y que puede unirse al antígeno en el complejo. El determinante antigénico al que está dirigido el segundo anticuerpo puede ser el mismo al que está dirigido el primer anticuerpo, debido a la naturaleza multiepitópica de la entidad antigénica. El primer o el segundo anticuerpo puede hacerse detectable usando cualquiera de los marcadores descritos anteriormente. En una realización preferida, el segundo anticuerpo se hace detectable. La presencia del anticuerpo detectable unido al complejo que consiste en antígeno unido al primer y segundo anticuerpo puede detectarse fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica. Al comparar los resultados obtenidos en la muestra biológica con los obtenidos en una muestra de control, puede determinarse la presencia de niveles de Ap3pE alterado o fragmentos del mismo.
Uso en métodos in vivo
Aspectos de la invención se refieren a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en la prevención, mejora, tratamiento y/o disminución del depósito de amiloide-beta en afecciones relacionadas con amiloide-beta, que comprende la administración de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se divulga en este documento en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto que lo necesita. Aspectos adicionales de la invención incluyen una composición farmacéutica para prevenir, mejorar, tratar y/o disminuir el depósito de amiloide en afecciones relacionadas con amiloide-beta, que comprende los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención. Realizaciones de la presente invención comprenden administrar una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención a un sujeto que lo necesita.
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en la prevención, mejora, tratamiento y/o disminución del depósito de amiloide-beta en afecciones caracterizadas por la formación de placas que contienen proteína beta-amiloide en seres humanos, que comprende administrar, preferiblemente de forma periférica, a un ser humano que necesita dicho tratamiento, una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del anticuerpo de acuerdo con la invención o fragmento inmunológicamente reactivo del mismo, cuyo anticuerpo se une específicamente a Ap3pE humano. En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en la inhibición de la formación de placas amiloides y/o para eliminar las placas amiloides en seres humanos, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto humano que necesita dicha inhibición o eliminación, una cantidad eficaz de un anticuerpo de acuerdo con la invención que secuestra el péptido Ap3pE en el cerebro e induce eliminación de Ap3pE alterado en el cerebro. En aspectos adicionales, la invención se refiere a dichos anticuerpos humanizados de la invención, incluyendo partes inmunológicamente eficaces de los mismos, y a métodos para su preparación. En realizaciones particulares, el anticuerpo humanizado tiene las CDR de Ap/pE3/1 (es decir, cualquiera de SEQ ID NOs:3-11 y 14-20).
Un sujeto que lo necesita es un ser humano que padece o está predispuesto a padecer una afección caracterizada por la formación de placas que contienen proteína beta-amiloide. En una realización, la afección es enfermedad de Alzheimer. En otras realizaciones, la afección es demencia asociada con trisomía del 21 (síndrome de Down), enfermedad con cuerpos de Lewy difusos, miositis por cuerpos de inclusión, angiopatía amiloide cerebral o hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis del tipo Dutch (HCHW A-D).
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo de una especie no humana cuyas secuencias proteínas se han modificado para aumentar su similitud a variantes de anticuerpo producidas de forma natural en los seres humanos. Generalmente, la secuencia proteínica de un anticuerpo humanizado es esencialmente idéntica a la de una variante humana con la excepción del origen no humano de alguno o todos sus segmentos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que son responsables de la capacidad del anticuerpo unirse a su antígeno diana. Las regiones flanqueantes de las regiones variables se sustituyen por las correspondientes regiones flanqueantes humanas dejando la CDR no humana sustancialmente intacta. En algunos casos, los anticuerpos humanizados tienen un pequeño número de sustituciones en una o más de las regiones CDR no humanas para conservar la afinidad de unión y/o la constante de disociación del anticuerpo no humano.
De nuevo, un anticuerpo humanizado se refiere a un anticuerpo que comprende una región flanqueante humana, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, y en que cualquier región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85 %, 90 %, preferiblemente al menos un 95 % idéntica o un 98 % idéntica. Por tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto una o más de las CDR, son sustancialmente idénticas a las correspondientes partes de una secuencia de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, una inmunoglobulina humanizada típicamente no abarcaría un anticuerpo quimérico de región variable de ratón/región constante humana.
Los anticuerpos humanizados tiene al menos tres posibles ventajas sobre los anticuerpos no humanos y quiméricos para su uso en tratamiento humano: 1) como la parte efectora es humana, puede interactuar mejor con las otras partes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, activar la microglía para eliminar las placas); 2) el sistema inmunitario humano no debe reconocer la región flanqueante o C del anticuerpo humanizado como exógeno y, por lo tanto, la respuesta de anticuerpos contra dicho anticuerpo administrado debe ser menor que contra un anticuerpo no humano totalmente exógeno o un anticuerpo quimérico parcialmente exógeno; y 3) se ha informado de que los anticuerpos no humanos administrados tienen una semivida en la circulación humana que es más corta que la semivida de anticuerpos humanos.
En un método para tratar y para prevenir afecciones caracterizadas por la formación de placas que contienen proteína beta-amiloide, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (incluyendo fragmentos inmunológicamente reactivos) de la invención se administran a un sujeto en riesgo de o que presenta síntomas relacionados con amiloide beta o patología tal como enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, demencia asociada con síndrome de Down o angiopatía amiloide clínica o preclínica, usando técnicas de administración convencionales. Preferiblemente, la administración es de forma periférica (es decir, no mediante administración al sistema nervioso central) por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o por supositorio. Aunque los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos pueden administrarse directamente al sistema ventricular, el líquido cefalorraquídeo o el parénquima cerebral, y las técnicas para abordar estas ubicaciones son bien conocidas en la técnica, no es necesario utilizar estos procedimientos más difíciles. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención son eficaces cuando se administran por las técnicas más simples que dependen del sistema de circulación periférica. Las ventajas de la presente invención incluyen la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de ejercer sus efectos beneficiosos, aunque no se proporcione directamente al propio sistema nervioso central.
Las composiciones farmacéuticas para administración se diseñan para que sean apropiadas para el modo seleccionado de administración, y se usan excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares según lo apropiado. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., última edición, proporciona un compendio de técnicas de formulación que son conocidas en general por los facultativos.
Puede ser particularmente útil alterar las características de solubilidad de los anticuerpos de la invención, haciéndolos más lipófilos, por ejemplo, encapsulándolos en liposomas o bloqueando los grupos polares.
Se prefiere la administración sistémica periférica por inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea. Los vehículos adecuados para dichas inyecciones son obvios. Además, sin embargo, la administración también puede lograrse a través de las membranas mucosas por medio de aerosoles nasales o supositorios. Las formulaciones adecuadas para dichos modos de administración son bien conocidas y típicamente incluyen tensioactivos que facilitan la transferencia a través de la membrana. Dichos tensioactivos a menudo derivan de esteroides o son lípidos catiónicos, tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleoil)propil-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) o diversos compuestos tales como hemisuccinato de colesterol, fosfatidil gliceroles y similares.
La concentración del anticuerpo humanizado en formulaciones de tan baja como aproximadamente un 0,1 % a tanta como aproximadamente un 15 o un 20 % en peso, se seleccionan principalmente en función de los volúmenes de líquido, la viscosidad y similares, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Por tanto, una composición farmacéutica típica para inyección podría estar compuesta para contener 1 ml de agua tamponada estéril de solución salina tamponada con fosfato y 1-100 mg del anticuerpo humanizado de la presente invención. La formulación podría filtrarse a esterilidad después de preparar la formulación, o hacerse de otro modo microbiológicamente aceptable. Una composición típica para infusión intravenosa podría tener un volumen de tanto como 250 ml de líquido, tal como solución de Ringer estéril, y 1-100 mg por ml, o más de concentración de anticuerpo.
Para la administración de anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y preferiblemente de 0,01 a 75 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 20 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg o 75 mg/kg del peso corporal del hospedador. En realizaciones, la dosificación está dentro del intervalo de 0,01-10 mg/kg, o dentro del intervalo de 0,1-15 mg/kg, o dentro del intervalo de 0,1-20 mg/kg, o dentro del intervalo de 0,1-30 mg/kg, o dentro del intervalo de 0,1-40 mg/kg, o dentro del intervalo de 0,1-50 mg/kg, o dentro del intervalo de 0,1-60 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mg/kg, al menos 5 mg/kg, al menos 10 mg/kg, al menos 20 mg/kg, al menos 30 mg/kg, al menos 40 mg/kg, al menos 50 mg/kg o al menos 60 mg/kg. En un ejemplo preferido, las dosificaciones pueden ser de aproximadamente 10 kg/mg, aproximadamente 20 kg/mg, aproximadamente 30 kg/mg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg o aproximadamente 70 mg/kg. En un ejemplo particularmente preferido, el anticuerpo se administra por vía intraperitoneal a un intervalo de dosis de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 60 mg/kg. En una pauta de tratamiento ejemplar, el anticuerpo se administra por vía intraperitoneal a una dosificación de aproximadamente 10 kg/mg, aproximadamente 20 kg/mg, aproximadamente 30 kg/mg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg o aproximadamente 60 mg/kg.
Como se usa en este documento, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, se entiende que abarca variaciones entre ±20 % y ±0,1 %, preferiblemente ±15 % o ±10 %, más preferiblemente ±5%, incluso más preferiblemente ±1 %, y aún más preferiblemente ±0,5%, ±0,1 %, ±0,05% o ±0,01 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas.
Una pauta de tratamiento ejemplar implica administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado está dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo habitualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique al medir los niveles sanguíneos de anticuerpo contra Ap en el sujeto. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación mantenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguidos de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos.
La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja con intervalos relativamente poco frecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos sujetos siguen recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, puede requerirse una dosificación relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y preferiblemente hasta que el sujeto muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, puede administrarse una pauta profiláctica.
En algunos métodos, la dosificación se administra para conseguir una concentración plasmática de anticuerpo de 1-1000 |jg/ml, y en algunos métodos 25-300 jg/ml. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación mantenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el sujeto.
El tratamiento con un anticuerpo de la invención puede ser un tratamiento independiente. Como alternativa, el tratamiento con un anticuerpo de la invención puede ser un componente o fase de una pauta de politerapia, en que también se usa uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar a un individuo.
Cuando se usan para tratamientoin vivo,los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se administran al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces, por ejemplo, cantidades que reducen, eliminan o evitan las placas p-amiloides o mejoran la función cognitiva en sujetos con AD u otras enfermedades relacionadas con p-amiloide. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se administran a un individuo, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los agentes de la invención opcionalmente pueden administrarse en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de enfermedad amiloidogénica. En el caso de enfermedad de Alzheimer y afecciones relacionadas en que se producen depósitos amiloides en el cerebro, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden administrarse junto con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera hematoencefálica.
En una realización de la invención, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se unen a 3pE Ap en los depósitos de placa. Al unirse a 3pE Ap en los depósitos de placa, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede inducir la eliminación de la placa. La inducción de la eliminación de la placa puede ser por activación de la microglía alrededor de las placas y al desestabilizar las placas al retirar una forma estable de Ap. Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden evitar la actividad de siembra de placas de 3pE Ap. El posible enriquecimiento de 3pE Ap en la placa en comparación con el amiloide vascular puede aumentar la ventana de seguridad terapéutica para inmunoterapia.
Kits y dispositivos
La presente invención proporciona kits y dispositivos que pueden usarse en los métodos mencionados anteriormente. Los kits y dispositivos comprenden un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une a 3pE Ap. Además, los kits pueden comprender reactivos y materiales instructivos. Las instrucciones pueden estar impresas, por ejemplo, en papel y/o suministrarse en un medio legible electrónicamente. Como alternativa, las instrucciones pueden proporcionarse al dirigir al usuario a un cibersitio en Internet, por ejemplo, especificado por el fabricante o distribuidor del kit.
Los reactivos incluidos en los kits pueden suministrarse en todas las formas de
recipientes, de modo que las actividades de los diferentes componentes se conserven sustancialmente mientras los propios componentes no se adsorben sustancialmente o se alteran por los materiales del recipiente.
Un kit o dispositivo comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, preferiblemente un anticuerpo purificado, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal, incluso más preferiblemente los anticuerpos monoclonales aislados que se unen a péptidos 3pE Ap. En realizaciones, los anticuerpos se expresan por las células de hibridoma.
Ejemplos
La invención puede entenderse adicionalmente en vista de los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Generación de anticuerpos monoclonales
Tres ratones Balb/c (Janvier Labs) se sensibilizaron con H2N-pEFRHDSGC-COOH (SEQ ID NO:21) (Eurogentec) en adyuvante completo de Freund (Sigma). Los péptidos se prepararon por acoplamiento de los péptides mediante un residuo de cisteína COOH-terminal a seroalbúmina bovina activada con maleimida (Life Technologies) usando kits disponibles en el mercado tales como el kit Imject Maleimide Activated BSA (Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ratones se reforzaron cada dos semanas con 100 |jg o 200 |jg de péptido acoplado a BSA, en primer lugar en adyuvante completo de Freund y posteriormente en incompleto (Sigma).
Hibridoma y producción de anticuerpos:El ratón que mostró la concentración sérica más alta se seleccionó para fusión, mientras que los bazos de los otros ratones se aislaron y se congelaron en nitrógeno líquido. En el día 4, antes de la fusión o extracción del bazo, todos los ratones se reforzaron por vía intraperitoneal con l00 jg de pEFRHDSGC (SEQ ID NO:21) acoplado a BSA (Merck) en solución salina. Los esplenocitos de ratón se fusionaron con células SP2/0 (ATCC, Manassas, VA) mediante un procedimiento modificado de Kohler y Milstein(Euro. J. Immunol.,1976; 292-295). Los hibridomas se sembraron en 30 placas de 96 pocillos y se cribaron después de 10 días en un ELISA directo sobre 0,5 jg/pocillos de péptido Ap 3pE-40 no acoplado (SEQ ID NO:22) (AnaSpec, Fremont, EE. UU.). Las células positivas se ensayaron para la (ausencia de) reactividad cruzada sobre 0,5 jg/m l de péptido Ap1-40 recubierto (SEQ ID NO:23) (AnaSpec, Fremont, EE. UU.) y se subclonaron inmediatamente.
Después de la primera fusión, 17 clones reaccionaron positivos en un cribado de ELISA recubierto directamente con péptido sintético Ap3pE-40 humano (SEQ ID NO:22) y se congelaron en nitrógeno líquido. Los 17 clones se denominaron Ap/pE3/1 a Ap/pE3/7. Se realizó una segunda fusión y también se incluyeron otros 2 clones de esta segunda fusión en caracterizaciones adicionales (Ap/pE3/18 y Ap/pE3/19).
Todos los hibridomas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Europa), complemento de clonación de fusión de hibridoma (2% ) (Roche, Bruselas, Bélgica), HT al 2% (Sigma, EE. Uu .), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM y penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml). Todos los productos estaban disponibles en el mercado y se adquirieron de Life Technologies (Paisley, Reino Unidos). Las células se incubaron en una estufa de incubación humidificada al 8 % de CO2.
ELISA directo para selección de anticuerpos:El ELISA de cribado usado para la detección de anticuerpos contra Ap 3pE-40 anterior fue un ELISA directo con 0,5 pg/ml de péptido Ap 3pE-40 humano libre (SEQ ID NO:22) recubierto durante una noche a 4 °C en placas de microvaloración de 96 pocillos de alta unión de fondo plano NUNC Maxisorp (Life Technologies) en 50 pl/pocillos de tampón de recubrimiento (Tris 10 mM, NaCl 10 mM y NaN310 mM, pH 8,5).
El siguiente día, las placas se bloquearon con 75 pl/pocillos de caseína al 0,1 % (Merck) en PBS durante 60 min a temperatura ambiente para reducir la unión inespecífica. Después, se añadieron 50 pl de sobrenadante de hibridoma y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Después del lavado, los anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con 50 pl/pocillos de anticuerpo de oveja anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Amersham-Pharmacia Biotech) durante 1 h at 37 °C. Ambos reactivos se diluyeron en caseína al 0,1 %/PBS. Las placas se lavaron y se añadieron 50 pl de una solución de 3,5,3',5'-tetrametil-benzidina (Biorad) 0,42 mM, H2O2 (Biorad) al 0,003 % (vol/vol) en ácido cítrico (Biorad) 100 mM; hidrogenofosfato de disodio (pH 4,3) (Biorad) 100 mM como sustrato. La reacción se dejó proseguir durante un máximo de 15 min en un agitador de placas a temperatura ambiente, tras lo que se detuvo el desarrollo de color con 50 pl/pocillo de H2SO4 (Merck) 2 N y las placas se leyeron en un lector de placas de microvaloración a 450 nm (Thermomax, Molecular Devices). La reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales seleccionados con Ap 1-40 libre humano de longitud completa (SEQ ID NO:23) se ensayó en un ELISA directo, idéntico al ensayo de cribado.
Se determinó que Ap/pE3/1 tiene una cadena pesada de isotipo IgG1 murina y una cadena ligera kappa murina. Aunque el Fc de IgG1 murina tiene solamente un 70 % de identidad de secuencia y un 76 % de similitud d secuencia con el Fc de IgG2a murina, estos isotipos tienen diferentes actividades y perfiles proteínicos. En comparación con IgG2a murina, IgG1 murina tiene menos función efectora Fc y del complemento murina a causa de la unión más débil a receptores F<cy>RI, F<cy>RIII y F<cy>RIV murinos y C1q murino. Considerado el isotipo más próximo a la actividad de IgG1 humana, IgG2a murina se une a los receptores FcyRI, FcyRIII y FcyRIV murinos y C1q murino, teniendo de ese modo actividad del complemento, ADCC y ADCP, que puede contribuir a la eliminación d placas Ap.
La secuencia de la cadena pesada de Ap/pE3/1 se alteró a partir de IgG1 murina (SEQ ID NO:31) en IgG2a murina (SEQ ID NO: 1). Los datos experimentales descritosinfrausaron Ap/pE3/1 con una cadena pesada de IgG2a. La región variable de la cadena pesada (incluyendo las CDR) no se alteró.
Ejemplo 2
ELISA competitivo para el ensayo de la sensibilidad
Para los anticuerpos monoclonales contra Ap3pE seleccionados, la sensibilidad para la detección de Ap3-40 (SEQ ID NO:24) (AnaSpec, Fremont, EE. UU.) y Ap3pE-40 (SEQ ID NO:22) (AnaSpec, Fremont, EE. UU.) se evaluó en un ensayo competitivo usando péptidos sintéticos como patrones. La combinación de anticuerpos Ap/pE3/1-19 para recubrimiento y JRF/cAp40/28-HRPO para la detección se usó para investigar la sensibilidad de detección.
Material y métodos:Los patrones de péptidos Ap3-40 (SEQ ID NO:24) y Ap3pE-40 (SEQ ID NO:22) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) a 0,1 mg/ml y se almacenaron a -80 °C. Para su uso en ELISA, los péptidos se diluyeron adicionalmente en caseína al 0,1 % en PBS hasta 1 pg/ml. Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos (placas negras de semiárea; Costar) durante una noche a 4 °C con anticuerpos monoclonales Ap/pE3/1-Ap/pE3/9 a una concentración de 1,5 pg/ml en tampón recubrimiento. El siguiente día, las placas se lavaron y bloquearon con caseína al 0,1 % en p Bs durante 1-4 horas a temperatura ambiente. Los patrones se incubaron durante una noche a 4 °C junto con anticuerpo secundario marcado con HRPO. Después de incubación durante una noche, las placas se lavaron y el ensayo se reveló con sustrato Quantablu (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Resultados:Se seleccionó el anticuerpo Ap/pE3/1 para caracterización adicional en función de la alta sensibilidad y selectividad por péptido Ap3pE-40 (SEQ ID NO:22) (tabla 2). Además, este anticuerpo demostró el marcaje de las placas en cerebro con AD de ratón transgénico y humano (tabla 2, y ejemplos 5 y 6).
Tabla 2
Ejemplo 3
ELISA competitivo para ensayo de reactividad cruzada
Para el anticuerpo monoclonal contra Ap3pE seleccionado Ap/pE3/1, se evaluó la reactividad cruzada con Ap3pE-40 de roedor y Api-40 (SEQ ID NO:23), AP3-40 (SEQ ID NO:24), Api-42 (SEQ ID NO:25), AP3-42 (SEQ ID NO:26), Ap11pE-40 (<s>E<q>ID NO:28) y Ap11pE-42 (SEQ ID NO:29) humanos usando péptidos sintéticos. La combinación de Ap/pE3/1 JRF/cAp40/28-HRPO se usó para investigar la reactividad cruzada con Ap1-40 (SEQ ID NO:23), Ap3-40 (SEQ ID NO:24), Api1lpE-40 y Ap3pE-40 de roedor. La combinación de Ap/pE3/1 JRF/cAp42/26-HRPO se usó para investigar la reactividad cruzada con Ap1-42 (SEQ ID NO:25), Ap11pE-42 y Ap3-42 (Se Q ID NO:26). Se ensayaron concentraciones de hasta 10000 pg/ml.
Materiales y métodos:Los patrones se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) a 0,1 mg/ml y se almacenaron a -80 °C. Para su uso en ELISA, los péptidos se diluyeron adicionalmente en caseína al 0,1 % en PBS hasta 1 pg/ml. Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos (placas Maxisorb ELISA; NUNC) durante una noche a 4 °C con anticuerpos monoclonales Ap/pE3/1 a una concentración de 1,5 pg/ml en tampón de recubrimiento. El siguiente día, las placas se lavaron y bloquearon con caseína al 0,1 % en PBS durante 1-4 horas a temperatura ambiente. Los patrones se incubaron durante una noche a 4 °C junto con anticuerpo secundario marcado con HRPO (JRF/cAp40/28-HRPO o JRF/cAp42/26-HRPO). Después de incubación durante una noche, las placas se lavaron y el ensayo se reveló con kit de sustrato de EIA de peróxido de TMB (Biorad) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Resultados:Se demostró que Ap/pE3/1 tiene unión selectiva a Ap3pE-40 (SEQ ID NO:22) (figura 2A) y Ap3pE-42 (SEQ ID NO:30) (datos no mostrados). No se detectó unión a Ap1-40 humano (SEQ ID NO:23) (figura 2C) y AppE11-40 (figura 2D). Tampoco se detectó unión a Ap1-42 humano (Se Q ID NO:25), AppE11-42 humano y Ap3pE-40 de roedor y a concentraciones de hasta 10 ng/ml (datos no mostrados). Se detectó reactividad cruzada limitada por péptidos Ap3-40 (SEQ ID NO:24) (figura 2B) y Ap3-42 (SEQ ID NO:26) (datos no mostrados) (tabla 2 y figura 2).Ejemplo 4
Inmunohistoquímica para ensayo de la reactividad de anticuerpo a placas en tejido cerebral humano con ADSe investigó la reactividad de Ap/pE3/1 a placas en tejido cerebral humano con AD tanto en tejido cerebral fijado en formol, incluido en parafina (FFpE) como en tejido cerebral crioconservado no fijado.
Materiales y métodos
Cerebro con AD fijado en formol, incluido en parafina:Se prepararon secciones de 6 pm de grosor a partir de cerebros fijados en formol, incluidos en parafina usando un micrótomo (Leica, Wetzlar, Alemania). La tinción se realizó en Labvision Autostainer (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA). En resumen, después de la desparafinación y la recuperación del epítopo con ácido fórmico (Merck) al 70 %, las secciones se bloquearon para peroxidasa endógena y se incubaron con anticuerpo primario Ap/pE3/1. Se aplicó anticuerpo secundario contra ratón o contra conejo, conjugado con HRPO (Envision) y se utilizó 3,3'-diaminobenzidina (DAB; Dako) como cromógeno. Finalmente, todas las secciones se tiñeron con contraste con hematoxilina (Dako).
Cerebro con AD crioconservado no fijado:Se obtuvieron secciones de una fuente comercial (T1236051Alz-sections, Gentaur) y se secaron al aire durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de aclarar en PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario Ap/pE3/1 a 37 °C. Las siguientes secciones se fijaron en NBF al 4 % (formol, VWR®)/etanol y se aclararon en PBS. Los anticuerpos secundarios marcados con Cy3 (Jackson-ImmunoResearch), se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de aclarado en PBS. Finalmente, todas las secciones se tiñeron con contraste con Hoechst (Invitrogen), y se añadieron los cubreobjetos.
Para el ensayo de inmunohistoquímica de Ap/pE3/1 para la reactividad a placas en tejido cerebral con ADN FFPE y crioconservado, el anticuerpo policlonal se usó como control.
Resultados:Se demostró la reactividad de Ap/pE3/1 en tejido humano con AD tanto FFPE (figura 3A) como crioconservado no fijado (figura 4A), presentando un patrón de tinción similar como anticuerpo de referencia (IgG de conejo antiamiloide p humano (N3pE), IBL, Japón) (figuras 3B y 4B). Esto demostró que Ap/pE3/1 detectaba placas en tejido cerebral humano.
Ejemplo 5
Acoplamiento a la diana y toxicidad del anticuerpo en tejido cerebral
Se investigó el acoplamiento a la diana y la toxicidad después del tratamiento con Ap/pE3/1 (anticuerpo del clon 1).
Material y métodos:Ratones transgénico envejecidos que expresaban niveles elevados de péptidos humanos Ap42 y Ap40 (19-20 meses de edad) se trataron con 3 dosis i.p. de 60 mg/kg de anticuerpos Ap/pE3/1 (clon 1) (IgG2a) en el día 1, 4 y 8 (n = 10). Se incluyó en el experimento un grupo de control que recibió inyección de PBS (n = 6). Los animales se sacrificaron en el día 12 después de la primera inyección. La mitad de los ratones tratados en cada grupo recibió perfusión con PBS, mientras que la otra mitad no se perfundió para permitir la evaluación de las posibles anomalías en la autopsia. El hemisferio izquierdo se crioconservó, mientras que el hemisferio derecho se fijó en DMFA, seguido de inclusión en parafina.
Los ratones transgénicos que expresaban niveles elevados de péptidos humanos Ap42 y Ap40 a los 6 meses de edad se trataron con una sola dosis i.p. de 20 mg/kg o 60 mg/kg de anticuerpo contra Ap 3D6 (IgG2a; se une al extremo N de Ap) en el día 1 (n = 4 por grupo). A esta edad, se sabe que los animales tienen depósito de Ap sustancial en el cerebro. Se incluyó en el experimento un grupo de control que recibió inyección de PBS (n = 3). Los animales se sacrificaron en el día 4. Los ratones no recibieron perfusión para permitir la evaluación de posibles anomalías en la autopsia.
Para evaluar el acoplamiento a la diana en el cerebro después de administración sistémica del anticuerpo, se realizó inmunohistoquímica con un anticuerpo secundario específico antiisotipo de ratón (anticuerpo secundario biotinilado anti-mIgG2a; Life Technologies) sobre criosecciones de ratones perfundidos y se normalizó el % del área marcada (corteza e hipocampo) a la misma medida en secciones adyacentes incubadas con anticuerpo primario y secundario para obtener el % de marcaje de placas para cada ratón.
Para evaluar la posible toxicidad, se evaluaron las hemorragias en la autopsia en los grupos de animales no perfundidos. Además, se realizó tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en el cerebro de todos los ratones tratados.
Resultados:Se observó acoplamiento a la diana (unión a la placa) y ausencia de toxicidad después de tratamiento con 3 doses de 60 mg/kg del anticuerpo Ap/pE3/1 en ratones de 19-20 meses de edad que expresaban niveles elevados de Ap42 y Ap40 humano. En animales no perfundidos, no se observaron hemorragias en la autopsia (figura 5E). Después de tratamiento con una sola dosis de 20 mg/kg o 60 mg/kg
de anticuerpo 3D6, se observaron fácilmente hemorragias en la autopsia en un 75 % de los ratones tratados que expresaban niveles elevados de Ap42 y Ap40 humano (6 meses de edad) (figuras 5B y 5C, indicadas por las flechas). Ninguno de los animales en los grupos tratados con PBS mostró hemorragias en la autopsia (figuras 5a y 5D).
La investigación de las criosecciones de ratones tratados con Ap/pE3/1 reveló un alto nivel de acoplamiento a la diana, como se demuestra por un % medio de marcaje de la placa en la corteza de un 60 % y en el hipocampo de un 84 % (figura 6B). No se observó marcaje de la placa en animales a los que se les inyectó<p>B<s>(figura 6A). Como control, se añadió anticuerpo primario (Ap/pE3/1) a secciones paraleles de cerebro y tinción con anticuerpo secundario para mostrar la presencia de placas en ambos cerebros (tratados con PBS y Ap/pE3/1) (figuras 6C-6D).
Tras la evaluación del tejido cerebral con tinción con H&E, los ratones tratados con Ap/pE3/1 no demostraron anomalías (figura 7B) en comparación con los controles a los que se les inyectó PBS (figura 7C). El tratamiento con anticuerpo 3D6, por otro lado, provocó la observación de las siguientes anomalías: degeneración/necrosis en la corteza (20 % y 40 % de los ratones tratados con 3D6 en el grupo de 20 mg/kg y 60 mg/kg, respectivamente), infiltrado inflamatorio meníngeo con congestión y microangiopatía (100 % y 80 % de los ratones tratados con 3D6 en el grupo de 20 mg/kg y 60 mg/kg, respectivamente) y microhemorragias corticales (60 % de los ratones tratados con 3D6 en el grupo tanto de 20 mg/kg como de 60 mg/kg, respectivamente) (figura 7A). Ninguno de los animales en los grupos tratados con PBS mostró anomalías en los cortes cerebrales teñidos con H&E (figura 7C). Los ratones tratados con Ap/pE3/1 y PBS eran de 19-20 meses de edad, mientras que los ratones tratados con 3D6 eran de 6 meses de edad.
En conclusión, se demostró el acoplamiento a la diana sin provocar hemorragias después de inyección i.p. con Ap/pE3/1 en un modelo de ratón de depósito de placas, lo que indica una relación favorable de acoplamiento a la diana frente a la toxicidad después de tratamiento con anticuerpo Ap/pE3/1.
Ejemplo 6
Unión de afinidad biomolecular de Ap/pE3/1
La resonancia de plasmones superficiales (SPR) es un método de detección sin marcador usado para investigar las interacciones biomoleculares. Al supervisar pequeños cambios en la masa en una superficie de sensor, este ensayo de unión directa inmediato proporciona datos cualitativos y cuantitativos sobre la interacción entre biomoléculas; es decir la determinación de la constante de unión en equilibrio (afinidad,Kd)y las constantes de velocidad cinéticas(ka/kd;velocidad de asociación de complejo ka, y velocidad de disociación de complejo kd). Este método es útil en estudios de interacciones de proteína-proteína y proteína-ácido nucleico, así como interacciones entre proteínas y micromoléculas. Aquí, se investigaron las interacciones entre Ap/pE3/1 y péptido Ap-3pE-40.
Materiales y métodos:Se usó un kit de captura de anticuerpo de ratón de GE Healthcare para el estudio de afinidad de Ap/pE3/1 contra el péptido Ap-3pE-40 (SEQ ID NO:22). La inmovilización del anticuerpo contra ratón se realizó mediante acoplamiento de amina en un chip sensor CM5 siguiendo el protocolo del fabricante. Posteriormente, se capturó Ap/pE3/1 (1 pg/ml) por el anticuerpo contra ratón hasta un nivel de 300 UR, seguido de inyección de péptido Ap 3pE-40 humano (Se Q ID NO:22) a diversas concentraciones (3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM y 50 nM) diluidas en tampón de migración (tampón fosfato 20 mM con KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM y tensioactivo P20 al 0,05 % (Tween™ 20)). La superficie se regeneró con glicina HCl 10 mM a pH 1,7 durante al menos 180 s y 60 s adicionales. Se usó péptido Ap (1-40) humano como control negativo.
Las mediciones de afinidad se realizaron usando un biosensor óptico T200 (Biacore®). El análisis cinético se realizó de acuerdo con el modelo de ajuste de unión 1:1 con el programa informático de evaluación Biacore T200 (versión 2.0).
Resultados:El análisis cinético del anticuerpo monoclonal Ap/pE3/1 confirmó la unión de afinidad a péptido Ap-3pE-40. La constante de unión en equilibrio (afinidad,Kd)y las constantes de velocidad cinéticas(ka/kd)se muestran en la tabla 3. El sensograma (cinética de un solo ciclo) que demuestra las interacciones de unión de Ap/pE3/1 a péptido Ap-3pE-40 humano se ilustra en la figura 8.
T l :in i A E 1 n =
Ap/pE3/1 Media 1,12E+05 9,37E-05 8,53E-10
CV 1,32E-01 1,64E-01 2,35E-01

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a péptidos amiloide-p que tienen piroglutamato en el tercer residuo (3pE Ap), que comprende:
a) una región variable de la cadena pesada que tiene una región determinante de la complementariedad (CDR) 1. CDR2 y CDR3 de una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:2, y
b) una región variable de la cadena ligera que tiene una CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 13, en donde las CDR de las regiones variables de la cadena pesada y ligera se definen por Kabat, Chothia o IMGT, y en donde:
I) como se define por Kabat:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:3,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:4,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:5,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 14,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 15, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 16;
II) como se define por Chothia:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:6,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:7,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:8,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 17,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 18, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 19; o
III) como se define por IMGT:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:9,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:10,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:11,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO:20,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 18, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 16; y
en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13.
2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde, como se define por Kabat:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 3,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 4,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 5,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:14,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO: 15, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:16.
3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde, como se define por Chothia:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 6,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 7,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 8,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:17,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO: 18, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:19.
4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde, como se define por IMGT:
i) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:9,
ii) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 10,
iii) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:11,
iv) la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:20,
v) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO: 18, y
vi) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:16.
5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:
a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13.
6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende
a) una cadena pesada de SEQ ID NO: 1; y
b) una cadena ligera de SEQ ID NO:12.
8. Un hibridoma que produce el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
9. Un método de producción de anticuerpos monoclonales, que comprende usar el hibridoma de la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en un método de tratamiento de una afección asociada con la formación de placas que contienen proteína betaamiloide en un sujeto, que comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto, en donde
a) la afección es enfermedad de Alzheimer, o
b) la afección se selecciona del grupo que consiste en demencia asociada con trisomía del 21 (síndrome de Down), enfermedad con cuerpos de Lewy difusos, miositis por cuerpos de inclusión, angiopatía amiloide cerebral y hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis del tipo Dutch (HCHW A-D).
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