TW201716436A - 特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及新穎種類的單株抗體，其特異性地結合病理性過度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化絲胺酸396殘基(pS396)，並且涉及在阿茲海默症和τ蛋白病變的治療中使用該等分子及它們的τ蛋白結合片段之方法。

Description

特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法
本發明涉及新穎種類的單株抗體，其特異性地結合病理性過度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化絲胺酸396殘基(pS396)，並且涉及在阿茲海默症和τ蛋白病變的治療中使用該等分子及它們的τ蛋白結合片段之方法。
序列表的引用
本申請包括根據37 C.F.R.1.821等的一個或多個序列表，所述序列表以電腦可讀介質揭露(檔案名稱：0995.txt，創建於2016年6月23日，並且具有40kB的大小)，將該文件藉由引用以其全文結合在此。
年齡相關性神經退行性疾病，如阿茲海默症(AD)和癡呆，是現今的最大社會性挑戰之一。世界衛生組織估計，護理老年人的成本將持續增加並且診斷為癡呆的病例的數目到2050年增至三倍(世界衛生組織和阿茲海默症國際狀態報告(2012)癡呆：公共衛生優先事項(World Health Organization and Alzheimer's Disease International-Status Report(2012)DEMENTIA：A public health priority)，WHO)。對於AD的首要治療係神經傳遞質調節劑，例如乙醯膽鹼酯酶抑制劑和NMDA調節劑。該等療法在世紀 之交變得可用，並且仍然形成用於癡呆和AD相關的記憶缺陷的症狀減輕的基礎。然而，該等藥物不靶向AD的潛在病因，即澱粉樣蛋白β(Aβ)肽和τ蛋白聚集體的積累以及神經元突觸和最終神經元的相關損失。
對老年人的縱向的社區範圍的研究(韋納(Weiner)，M.W.等人(2014)ADNI線上：http：//www.adni-info.org/；布勒泰爾(Breteler)，M.M.等人(1992)神經流行病學(Neuroepidemiology)11增刊1，23-28；勞納(Launer)，L.J.(1992)神經流行病學(Neuroepidemiology)11增刊1，2-13)以及大基因組範圍相關研究(蘭伯特(Lambert)，J.C.等人(2013)自然基因組學(Nat.Genet.)45，1452-1458)已經顯示，AD係癡呆的多相混合物，其中高達10%的晚期AD患者缺乏澱粉樣蛋白病變(克拉裡(Crary)，J.F.等人(2014)神經病理學學報(Acta Neuropathol.)128，755-766)。此外，由布拉克(Braak)&布拉克(Braak)進行的開創性病理學研究(布拉克(Braak)，H.和布拉克(Braak)，E.(1996)斯堪的納維亞神經學學報(Acta Neurol.Scand.)增刊165，3-12)證明神經原纖維纏結病變程度與屍體解剖前的認知狀態之間的明顯相關。該等觀察已經藉由一些研究者(內爾松(Nelson)，P.T.等人(2012)神經病理學與實驗神經學雜誌(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)71，362-381)以及在最近的縱向生物標記研究中得以驗證，所述研究指示，貫穿該疾病的早期和後期，τ蛋白和磷酸化τ蛋白的腦脊液(CSF)水平增加(傑克(Jack)，C.R.，Jr.等人(2013)柳葉刀神經學(Lancet Neurol.)12，207-216)。
如以上指出的，微管相關蛋白、τ蛋白、及其過度磷酸化形式形成作為AD的一類主要標誌的細胞內神經原纖維纏結的主要成分。此 外，τ蛋白的具體基因變體與額顳癡呆(FTD)的家族形式相關聯。在AD中τ蛋白病變的表現以不同的空間模式出現，起始於內嗅皮層中，隨後為海馬區以及皮層區(布拉克(Braak)，H.和布拉克(Braak)，E.(1996)斯堪的納維亞神經學學報(Acta Neurol.Scand.)增刊165，3-12)。τ蛋白病變的具體階段還良好地與認知能力相關(內爾松(Nelsoh)，P.T.等人(2012)神經病理學與實驗神經學雜誌(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)71，362-381；布拉克(Braak)，E.等人(1999)歐洲精神病學與臨床神經科學檔案(Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.)249增刊3，14-22)。綜上，此證據形成對於AD的基於τ蛋白的假設的基礎。需要的是τ蛋白的細胞內積累導致微管變性和脊髓坍塌。結果係神經元之間的通信故障和細胞死亡隨之發生。最近，還已經顯示τ蛋白本身可以形成內-病原性種類，該等種類可以將神經變性從一個細胞傳遞到下一個細胞(克拉維古(Clavaguera)，F.等人(2009)自然細胞生物學(Nat.Cell Biol.)11，909-913)。
I. 作為內-病原體的τ蛋白
克拉維古(Clavaguera)和同事們已經證明τ蛋白本身可以充當內-病原體(克拉維古，F.等人(2009)自然細胞生物學(Nat.Cell Biol.)11，909-913)。低自旋腦提取物分離自P301S τ蛋白轉基因小鼠(艾倫(Allen)，B.等人(2002)神經科學雜誌(J.Neurosci.)22，9340-9351)，稀釋並且注入幼小ALZ17小鼠的海馬迴和皮層區中。該ALZ17小鼠係τ蛋白轉基因小鼠品系，該品系僅發展晚期病變(普羅布斯特(Probst)，A.等人(2000)神經病理學學報(Acta Neuropathol.)99，469-481)。經注射的ALZ17小鼠快速發展實體絲狀病變，並且給予來自P301S小鼠的經免疫耗減的腦 提取物或來自野生型小鼠的提取物並不誘導τ蛋白病變。將腦提取物在可溶(S1)和十二烷基肌胺酸鈉-不溶的τ蛋白(P3)(撒哈拉(Sahara)，N.等人(2013)阿茲海默症雜誌(J.Alzheimer’s.Dis.)33，249-263)方面分級並且將該等注入ALZ17小鼠證明了P3部分係誘導病變中最有力的。它包含多數的細胞內過度磷酸化絲狀τ蛋白。大部分的病變還可以在將P301S提取物注入野生型小鼠的腦中時誘導，但無NFT形成。在後續的研究中，克拉維古等人已經顯示，從其他τ蛋白病變(嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD))的屍體解剖後的腦組織提取的人類τ蛋白也可以在ALZ17模型中誘導τ蛋白病變(克拉維古，F.等人(2013)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)110，9535-9540)。自從呈現了該等資料，若干其他τ蛋白接種和擴展模型已經被報導(艾哈邁德(Ahmed)，Z.等人(2014)神經病理學學報(Acta Neuropathol.)127，667-683；沃克(Walker)，L.C.等人(2013)美國醫學會雜誌：神經學分冊(JAMA Neurol.)70，304-310)。從該等研究得出的主要結論指示一機制，藉由該機制在細胞內內含物中的病原性τ蛋白從該細胞分泌進入周質空間。然後病理τ蛋白材料沿著囊泡鞘以順行方向和逆行方向被運輸，並且隨後藉由批量內吞作用被鄰近細胞吸收。這個機制解釋了為什麼在人類疾病中觀察到的病變的擴展遵循不同的解剖學模式。有趣的是，病理性τ蛋白的外週給予可以加速ALZ17小鼠中τ蛋白病變的形成(克拉維古，F.等人(2014)神經病理學學報(Acta Neuropathol.)127，299-301)。該擴展機制可以解釋其他蛋白病變中的疾病傳播(格代爾(Goedert)，M.等人(2010)神經科學趨勢(Trends Neurosci.)33，317-325； 西古德松(Sigurdsson)，E.M.等人(2002)分子醫學趨勢(Trends Mol.Med.)8，411-413)。
II. τ蛋白種類
τ蛋白可以充當內-病原體的發現已經引發出關於“病原性種類”的研究，可以在潛在的介入療法中靶向該等種類。
該微管相關蛋白τ基因(MAPT)位於人類基因組17號染色體上並且在成人腦中表現τ蛋白的六種同功型。該等同功型產生自MAPT基因內的16個外顯子的外顯子2、3以及10的可變剪接。外顯子2和3表現29個胺基酸重複，並且外顯子10表現另外的微管結合結構域。結果係τ蛋白同功型將包含0、1或2個N-末端重複以及3個或4個C-末端微管結合結構域(3R或4R τ蛋白)。通常τ蛋白的六種同功型被表現。最長的(2N4R)和最短的(0N3R)同功型分別由441和352個胺基酸組成(柯拉羅夫(Kolarova)，M.等人(2012)阿茲海默症國際雜誌(Int.J.Alzheimers.Dis.)2012，731526)。τ蛋白(2N4R)的N-末端突出結構域由富含甘胺酸尾的44個胺基酸組成，並且殘基45-102包括兩個高度酸性區域(N1、N2-結構域)。兩個富含脯胺酸的區域發現於殘基151-243處(P1、P2構域)。該蛋白的剩餘部分係由四個微管結合結構域(R1-R4)、隨後為短C-末端區域構成。
τ蛋白係極易溶的並且係高度磷酸化不穩定蛋白。在τ蛋白的最長同功型中大約20%或85%的胺基酸殘基係潛在的(Ser、Thr或Tyr)磷酸化位點。該等中大約有一半已經在實驗中觀察到(漢格(Hanger)，D.P.等人(2009)分子醫學趨勢(Trends Mol.Med.)15，112-119；長穀川 (Hasegawa)，M.等人(1992)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)267，17047-17054)，並且在微管結合結構域的末端殘基週圍聚簇。τ蛋白在細胞週期期間係動態地磷酸化和去磷酸化。它必須從微管解離以允許減數***發生。它在有絲***後細胞(分化神經元)中的主要作用係充當微管穩定劑，從而允許最佳軸突運輸。它可以按其主要的去磷酸化形式僅與微管關聯，由此磷酸化充當神經元內的直接微管關聯/解離開關。在正常條件下，胞質τ蛋白平均包含兩個磷酸化位點。在配對螺旋絲狀材料中，至少7-8個位點被磷酸化(漢格(Hanger)，D.P.等人(2009)分子醫學趨勢(Trends Mol.Med.)15，112-119；長穀川(Hasegawa)，M.等人(1992)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)267，17047-17054)。過度磷酸化配對螺旋絲狀τ蛋白係阿茲海默症的關鍵標誌(科希克(Kosik)等人(1986)PNAS，86，4044-4048)，在對人類AD腦材料的免疫細胞化學分析中觀察到過度磷酸化τ蛋白的不同的遷移性變動。
已經難於用反映其元穩定性質的傳統結構技術(像x射線結晶學或NMR光譜法)來研究τ蛋白。已經主要對非磷酸化蛋白的結構域片段進行了此類研究。迄今為止，使用NMR光譜學對全長τ蛋白(2N4R)的僅結構研究揭示了該蛋白質僅包含穩定的二級結構的稀少延展(莫克拉施(Mukraseh)，M.D.等人(2009)科學公共庫生物學(PLoS.Biol.)7，e34)。此分析指示肽骨架的二級結構具有適於β-片層結構的大的傾向。與包括微管結合結構域的C-末端相比，該骨架的前200個殘基係顯著更有序的。在溶液中在該蛋白內許多特異性的長程相互作用的存在指示它存在於非常無序的熔融球狀狀態中(小岸(Ohgushi)，M.和瓦達(Wada)，A.(1983)FEBS 快報(FEBS Lett.)164，21-24)。
具體地由半胱天冬酶和鈣蛋白酶產生的τ蛋白的蛋白酶產物(Asp13、Glu391和Asp421)已經在纏結材料中得以鑒定(岡布蘭(Gamblin)，T.C.等人(2003)美國科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)100，10032-10037)。特別地，已經使用τ蛋白C3抗體(其結合至游離Asp421末端)詳細研究了在Asp421處的截短。該截短已經被推測為AD發病機理中的與細胞凋亡誘導相關聯的早期事件(德卡利尼翁(deCalignon)A.等人(2010)自然(Nature)464，1201-1204)。在Asp13處的N-末端切割和在Glu391處的C-末端切割被認為是該發病機理中的晚期事件(德卡利尼翁(deCa1ignon)A.等人(2010)自然(Nature)464，1201-1204；德貝爾(Delobel)，P.等人(2008)美國病理學雜誌(Am.J.Pathol.)172，123-131)。最近，在來自AD和PSP患者的CSF中鑒定出另外的N-末端片段(殘基1-224)，並且已經被假設為疾病的早期標記並且具體是病原性的(US 14/092539；布賴特(Bright)，J.等人(2014)老化神經生物學(Neurobiol.Ageing)，1-17)。類似的鈣蛋白酶切割片段由其他團隊進行了報導(費雷拉(Ferreira)，A.和比焦(Bigio)，E.H.(2011)分子醫學(Mol.Med.)17，676-685；賴內克(Reinecke)，J.B.等人(2011)PLoS.One.6，e23865)。
除過度磷酸化和τ蛋白片段化之外，已經提出翻譯後乙醯化(科恩(Cohen)，T.J.等人(2011)自然通訊(Nat.Commun.)2，252；民(Min)，S.W.等人(2010)神經元(Neuron)67，953-966)和O-GlcN醯化係限定了與AD相關聯的纏結病變形成過程中的病變。
III. τ蛋白免疫療法
免疫療法傳統上分為被動和主動疫苗方法。在主動疫苗方法中，將病原性藥劑注入患者，並且先天免疫系統引發免疫應答。這觸發了B細胞的成熟，產生針對給予抗原的高親和力抗體。在被動疫苗方法中，藉由輸注針對抗原的特異性抗體來避免觸發先天免疫系統。固有清除系統然後去除結合抗體的配位基。
AC免疫正在追尋針對τ蛋白的磷酸化絲胺酸409的小鼠單株抗體。將抗體針對人類AD和對照腦組織進行特徵概括，並且基於它們識別纏結病變的能力來選擇該等抗體。人源化形式的兩種抗體，hACI-36-2B6-Ab1和hACI-36-3A8-Ab1，均結合至胺基酸401-418內的τ蛋白表位(WO 2013/151762)。
羅傑尼奇(Roger Nitsch)團隊已經從不具有退行性τ蛋白病變的體症的老年健康個體中分離了τ蛋白自身抗體。已經使用全長重組人類τ蛋白(2N4R)以發現τ蛋白特異性抗體而分離出多種抗體。然後，將該等針對其區分來自患病和健康個體的τ蛋白分離物的能力來進行篩選。三種領先抗體，4E4、4A3和24B2，已經描述於專利文獻(WO 2012049570；US 2012087861)中。它們的表位作圖指示所有均識別微管結合區內的以及C-末端到微管結合區的胺基酸(從位置V339到K369)。該等抗體未展現出任何磷酸化-特異性。
C2N診斷主要聚焦在用於早期檢測神經退行性疾病的發育診斷工具上。產生針對全長人類和小鼠τ蛋白的抗體。分別鑒定了識別人類和小鼠τ蛋白的八種和五種抗體(亞那曼德拉(Yanamandra)，K.等人(2013)神經元(Neuron)80，402-414)。選擇三種具有不同結合動力學的 抗體用於體內評價。即，分別識別τ蛋白殘基306-320、7-13和25-30的HJ9.3、HJ9.4和HJ8.5，其中最後一個係特異性針對人類τ蛋白的。在τ蛋白跨細胞傳播的獨創性機理報導測定中，還基於該等抗體防止病變轉移的能力來對該等抗體進行選擇(桑德斯(Sanders)，D.W.等人(2014)神經元(Neuron)82，1271-1288；克福裡(Kfoury)，N.等人(2012)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)287，19440-19451)。在P301S轉基因小鼠中的慢性i.c.v.注射研究中，對它們的評價證明了它們能夠降低過度磷酸化τ蛋白的水平，如藉由在對經處理小鼠的免疫組織化學分析中AT8染色所確定。
起初將彼得．大衛斯(Peter Davies)的抗體開發作為診斷工具，該診斷工具可以在AD和對照腦材料中的病理性和正常τ蛋白之間區分(格林伯格(Greenberg)，S.G.和大衛斯(Davies)，P.(1990)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87，5827-5831)。在P301S和JPNL3(P301L)中證明了PHF1和MC1抗體的治療效用的評價(布塔將奧(Boutajangout)，A.等人(2011)神經化學雜誌(J.Neurochem.)118，658-667；翟(Chai)，X.等人(2011)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)286，34457-34467；達布拉莫(D'Abramo)，C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402小鼠)。PHF1識別線性磷酸化τ蛋白表位(pS396、pS404)，而MC1係構象-依賴性抗體，其需要線性序列的兩個不同部分(即在殘基46-202內的表位和在殘基312-342之間的C末端表位)來識別結構性τ蛋白表位(伊哈(Jicha)，G.A.等人(1997)神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)48，128-132)。在慢性12-13週免疫研究中，這兩種抗體的注射導致脊髓病變的和在其他腦區域中的腦幹病變的實質性減少，該等轉化為該等小鼠中觀察到的運動缺陷的衰 減(達布拉莫(D'Abramo)，C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402)。
伊伯利亞(iPerian)/百時美施貴寶(Bristol Meyers Squibb)已經開發了針對推測的病理性τ蛋白種類(由τ蛋白的N-末端片段(e τ蛋白：殘基1-224)構成)的τ蛋白抗體，該病理性τ蛋白種類促進了在基於誘導性多能幹細胞的神經元培養物中的過度活性。已經開發了一系列抗體，但表徵已經聚焦於識別殘基9-18內的N末端表位的抗體IPN001和IPN002上。相應地，該等抗體檢測到來自分期AD和PSP患者的CSF中升高的τ蛋白水平，這可以是疾病的早期體症。在JPNL3小鼠(P301L)中體內注射抗體導致漸進性運動缺陷的部分逆轉(US 14/092539)。
艾納西古德松(Einar Sigurdsson)係證明基於τ蛋白的免疫療法的功效的第一個程式。將由τ蛋白的肽379-408[pS396、pS404]組成的主動疫苗連同Adju-Phos佐劑一起用於免疫JPNL3(P301L)小鼠。在該研究中，當與對照動物相比時，在經疫苗處理的小鼠中觀察到τ蛋白病變的顯著降低。也檢測到τ蛋白相關的運動表型的衰減。其功效在不同的不是由突變體τ蛋白驅動的小鼠模型(hτ/PS1)中得以確認(布塔將奧(Boutajangout)，A.等人(2011)AAIC 2011(7，發行4，增補版)p.s480-s431；康登(Congdon)，E.E.等人(2013)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)288，35452-35465；古(Gu)，J.等人(2013)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)288，33081-33095)。
蒲賽納(Prothena)已經評價了在K369I(K3)轉基因τ蛋白小鼠和P301L小鼠模型中的三種τ蛋白抗體。選擇具有不同特性的抗體用於體內評價。將具有不同同種型(isotybe)的兩種pS404抗體(IgG1/k和 IgG2a/k)或總(全)抗-τ蛋白抗體(IgG1/k)以慢性模式注射。將K369I小鼠每週採用注射處理，持續21週，在3週齡時開始；並且將P301L小鼠每週採用注射處理，持續7個月，在4月齡時開始。在採用IgG2a/k pS404抗體的K3小鼠中觀察到τ蛋白陽性神經原纖維內含物的減少。兩種pS404抗體均能降低pS422陽性τ蛋白的水平，然而在經全-抗-τ蛋白抗體處理的小鼠中沒有觀察到減少。該等研究表明：1)τ蛋白清除可以是同種型-依賴性的，並且；2)重要的是其靶向與疾病相關的τ蛋白種類，因為總-抗τ蛋白抗體不能減少過度磷酸化的τ蛋白(PCT/US 2014/025044)。
本發明的諸位發明人已經出人意料地發現特異性針對磷酸化τ蛋白絲胺酸殘基396(pS396)的抗體；所述抗體與先前技術抗體相比之下，其主要識別在τ蛋白上的396和404殘基兩者處磷酸化、僅在404殘基處或在其他殘基處磷酸化的τ蛋白。
諸位發明人已經開發了另外對人類病理性τ蛋白具有顯著特異性和選擇性的抗體。存在對於對病原性τ蛋白具有高度選擇性和特異性的抗體的需要。與WO 2013/050567的抗體(參見WO 2013/050567的圖1)相比較，本發明的該等抗體顯示出超過非病理性τ蛋白的對人類病理性τ蛋白非常高程度的特異性和選擇性。被報導為具有特異性結合的、WO 2012/045882的抗體係從τ蛋白胺基酸393-401、396-401、394-400和393-400的6至9殘基胺基酸序列引發的。這與本發明的抗體形成對比，本發明的抗體係針對包含如在此所述的更長胺基酸序列的病原性過度磷酸化τ蛋白引發的。
如在實例中所示，相比於五種公開的τ蛋白抗體：hACI-2B6 (描述於WO 2013151762)；IPN002(描述於WO 2014028777中)；HJ8.5(描述於WO 2014008404中)；抗τ蛋白pS422單株抗體2.10.3(描述於US 8609097中)；PHF13(可商購抗體，例如西格瑪奧德里奇)，推薦用於檢測在小鼠、大鼠和人類來源的、在Ser 396處磷酸化的τ蛋白，並且由三卡拉那雷南(Sankaranarayanan)(PLOSONE，DOI：10.1371/journal.pone.0125614五月1，2015)和奧特沃斯(Otvos)(生物化學(Biochemistry)1997，36，8114-8124)討論；以及4E4抗體(在US 8940272中描述為結合至V339、E342、D387、E391和K395)，顯示本發明的抗體及其表位結合片段展現出相比於對比抗體的任一個而言對於人類病理性τ蛋白更高程度的特異性和選擇性。
此外，本發明的抗體及其表位結合片段示出許多有利特徵，例如能夠在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分，並且特別是能夠結合與阿爾茨海默(AD)病理學相關聯的τ蛋白。在電生理研究中，本發明的抗體及其表位結合片段另外還能夠逆轉降低的配對脈衝易化以及自發微小興奮性突觸電流(mEPSC)。
本發明涉及單株抗體及其表位結合片段，它們能夠特異性地結合至人類(2N4R同功型)τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基絲胺酸396，並且涉及已經使用允許這種特異性分離和回收的新方法產生的此類抗體。該等抗體被進一步表徵為它們在磷酸化殘基396和404之間區分的能力，使得它們基本上不結合磷酸化404殘基。
不受具體理論的束縛，來自諸位發明人的證據證明，在殘基 404處而不是在396處磷酸化的τ蛋白的存在下，本發明的抗體針對在殘基396處磷酸化的人類τ蛋白的區分和選擇性從病理和治療角度上是顯著的。本發明的該等抗體在非病理性但磷酸化的τ蛋白的存在下對於病理性τ蛋白具有選擇性。在正常τ蛋白存在下，本發明的該等抗體能夠耗減病理性τ蛋白的τ蛋白纏結。不受具體理論的束縛，認為τ蛋白(包含在τ蛋白位置396處已經磷酸化的τ蛋白)的纏結耗減會防止將病理性τ蛋白接種到τ蛋白纏結中。因此，本發明的一個方面涉及一種抗體，該抗體能夠選擇性地結合至396-磷酸化τ蛋白，甚至當此類分子係在τ蛋白位置404處已經磷酸化的τ蛋白的存在下時。本發明的相關方面涉及一種抗體，該抗體能夠選擇性地結合至396-磷酸化τ蛋白，甚至當此類分子係在非病原性τ蛋白的存在下時。另外定義，本發明涉及一種針對病理性τ蛋白具有選擇性的抗體，所述病理性τ蛋白係過度磷酸化τ蛋白，其在過表現τ蛋白的人類2N4R同功型的轉基因小鼠中作為64kDa條帶出現(藉由西方墨點法分析)。
本發明的一個方面係針對一種抗τ蛋白抗體，其滿足以下測試標準：i)該抗體並不結合至非磷酸化τ蛋白；ii)該抗體並不結合至在404處磷酸化且在396處非磷酸化的τ蛋白；iii)該抗體結合至在396處磷酸化的τ蛋白；以及iv)該抗體結合至在396和404兩者處均磷酸化的τ蛋白。諸位發明人已經發現，在測試標準iii)和iv)下的結合係在同一數量級上，並且假定在位置404處的磷酸化不干擾也不增強該結合過程。諸位發明人已經進一步發現，與測試標準ii)相反，結合至一種在396處非磷酸化但在404處磷酸化的τ蛋白並不耗減在測試模型中的纏結或明顯的 病理性τ蛋白。
本發明的一個方面係針對抗τ蛋白抗體，該抗體與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，其特異性地以至少90%減少過度磷酸化τ蛋白64和70kDa條帶，同時以不多於10%減少55kDa τ蛋白條帶。本發明的另外一方面係針對抗τ蛋白抗體，該抗體特異性地以至少90%減少過度磷酸化τ蛋白64和70kDa條帶，同時以不多於10%減少55kDa τ蛋白條帶；或者當如在此所描述的與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，其特異性地以至少90%減少磷酸化S396過度磷酸化τ蛋白條帶、同時以不多於10%減少非過度磷酸化τ蛋白條帶的能力。
本發明的另一個方面係針對一種治療患有τ蛋白病變(例如阿茲海默症)的患者之方法，該方法包括耗減纏結或衰減所述纏結的進展，所述纏結包括過度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使過度磷酸化τ蛋白與本發明的抗體接觸，以使得該纏結被耗減，其過度磷酸化τ蛋白的含量得以減少，或者纏結形成的進展得以衰減。
可替代地定義的，本發明涉及一種治療患有τ蛋白病變(例如阿茲海默症)的患者之方法，所述方法包括使纏結與對具有磷酸化殘基396的τ蛋白具有選擇性的抗體接觸，這樣使得纏結耗減過度磷酸化τ蛋白。
更確切地說，本發明涉及選自下組的四種單株抗體中的任一種，該組包括：
抗體C5.2
其中抗體C5.2包括：(a)具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3；
抗體C8.3
其中抗體C18.3包括：(a)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列的重鏈CDR3；
抗體C10-2
其中抗體C10-2包括：(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3：(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及 (f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3；以及
抗體D1.2
其中抗體D1.2包括：(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的重鏈CDR3。
示例性抗體C5.2的全輕鏈和全重鏈(包括在此的恒定結構域)的胺基酸序列分別示出於SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中(如在實例中使用的)。
示例性抗體C8.3的全輕鏈和全重鏈(包括在此的恒定結構域)的胺基酸序列分別示出於SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32中(如在實例中使用的)。
感興趣抗體C10-2的全輕鏈和全重鏈(包括在此的恒定結構域)的胺基酸序列分別示出於SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中(如在實例中使用的)。人源化C10-2抗體的重鏈的胺基酸序列示於SEQ ID NO：35中。人源化C10-2抗體的輕鏈的胺基酸序列示於SEQ ID NO：36中。本發明的一個方面涉及本發明的抗體，其包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36或二者。
示例性抗體D1.2的全輕鏈和全重鏈(包括在此的恒定結構 域)的胺基酸序列分別示出於SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中(如在實例中使用的)。
在一替代實施方式中，抗體D1.2包含具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列的輕鏈，其中在位置3處的胺基酸係纈胺酸(然而在SEQ ID NO：7的示例性輕鏈中，該胺基酸係甲硫胺酸)。該輕鏈可以與如上所述的重鏈配對，即具有SEQ ID NO：4、5和6的CDR。例如，該抗體可以包含具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列的輕鏈，連同具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的重鏈(抗體“D1.2*”)。
本發明的一個方面係針對一種抗體，該抗體包含：(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和/或(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
本發明的另一個方面係針對一種抗體，該抗體包含或另外包含：(a)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；和/或(c)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3。
本發明的抗體及其表位結合片段，可以用於治療τ病變，例如阿茲海默症(AD)、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、TBI(輕度、急性或慢性創傷性腦損傷)、以及慢性創傷性腦病變(CTE)。
本發明的抗體及其表位結合片段另外預期用於治療精神 病，特別是由於AD引起的精神病或患有AD的患者中的精神病。
圖1：結合至病理性材料斑點印跡
圖1(圖A-B)呈現了斑點印跡(dot-blot)分析的結果，顯示用1μg/ml D1.2或C10-2探測，來自AD患者(AD)和老年健康個體(con)的腦的或者來自32週齡rTg4510和非轉基因(wt)同窩仔的500ng S1和P3部分(S1和P3部分的產生揭露於實例3中)，以評估病理性τ蛋白的檢測(實例3)。斑點圖示出D1.2(圖A)或C10-2(圖B)特異性地對來自AD患者的疾病材料或如在轉基因小鼠(Tg4510)中表現的人類(P301L)τ蛋白發生反應。
圖2：D1.2和C10-2抗體的西方墨點法分析
圖2(圖A-B)呈現出西方墨點法分析的結果，顯示用1μg/ml D1.2(圖A)或C10-2(圖B)探測，來自32週齡rTg4510和非轉基因(wt)同窩仔的腦的2μg S1和P3部分或者來自AD患者(AD)和老年健康個體(con)的腦的20μg S1和P3部分。S1和P3部分以1：50的比例(基於組織重量)載入，該比例衍生自0.01mg組織。在西方墨點法中，人類4R0N τ蛋白正常P301L突變體顯示為55kDa，而人類4R0N τ蛋白種類過度磷酸化P301L突變體顯示為64和70kDa。在來自AD過度磷酸化τ蛋白的P3部分中，顯示為54、64、69和74kDa(實例3)。該圖展示了該等抗體特異性地結合至過度磷酸化的遷移性變動的τ蛋白。
圖3：在MSD中結合至病理性P3材料
圖3(圖A-D)呈現了中尺度發現(Meso Scale Discovery， MSD)公司ELISA中D1.2(圖A)、C5-2(圖B)、C10-2(圖C)和C8-3(圖D)結合至從人類AD和非患病對照腦中分離的τ蛋白的結果(實例4)。類似於在圖1中證實的，將分離自疾病(AD)和健康對照腦中的τ蛋白固定在ELISA板上可以用於證明本發明中的抗體特異性地結合病理性τ蛋白種類。增加抗體的濃度導致飽和結合。結合的抗體的量係用二級抗-小鼠抗體檢測。
圖4：肽親和力和pS396選擇性(肽結合)
圖4(圖A-D)呈現了C10-2(圖A)和D1.2(圖B)特異性結合至τ(386-409)肽的分析結果，該等τ肽在位置S396和S404處具有磷酸化的全部組合(實例5)。對於人類病理性材料的特異性親和力係難於評估的，為此我們使用特異性肽結合以使用特定的磷酸化和非磷酸化肽確定準確的表位親和力。針對抗體C10-2(圖C)和D1.2(圖D)與在殘基Ser396和Ser404處磷酸化的肽TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)(pS396/pS404)的結合，示出特定的劑量反應曲線。競爭結合係採用非磷酸化肽(NP)和單磷酸化肽(pS396和pS404)進行的。此外，包括對應於磷酸化絲胺酸262的對照肽。該競爭結合證明了所有結合係藉由磷酸化396絲胺酸殘基獲得的。此外，該資料證明在殘基404處的磷酸化不干擾抗體在磷酸化絲胺酸396處的結合。
圖5：病理學特異性抗體的組織學表徵
圖5的圖A示出C10-2(左欄)和D1.2(右欄)抗體結合至Tg4510(頂行)細胞體和神經氈中的p-τ蛋白種類。在非Tg腦部分(底行)中未檢測到免疫反應性。圖5的圖B示出C10-2(左欄)和D1.2(右欄)抗 體結合至AD供體(頂行)中的細胞體和神經氈線中的p-τ蛋白種類。對照供體腦缺乏免疫反應性(底行)(實例6)。
圖6：C10-2和參考抗體結合至病理性和非病理性P3
圖6(圖A-E)呈現了與先前技術抗體2-10-3(圖A)、HACI-2B6(圖B)、IPN 002(圖D)、和HJ8.5(圖E)相比，本發明的抗體C10-2(圖C)在識別病理性材料中的優越性的結果。該圖示出C10-2特異性結合至來自健康(作為對照)和患病(AD)人類腦的τ蛋白，並且結合至來自表現人類τ蛋白P301L突變體的10月齡Tg4510小鼠的τ蛋白。將遞增濃度的抗體添加到固定在ELISA板上的P3 τ蛋白材料。針對病理性τ蛋白的選擇性的比率係以被活性種類全飽和來確定的。針對先前技術抗體的每一個的選擇性倍數示於圖中(實例7)。
圖7：防止在HEK293細胞中和在體外接種
圖7(圖A-C)呈現藉由西斯比(Cisbio)測定對τ蛋白聚集的定量。接種的pcDNA HEK293細胞沒有顯示信號，確認了不存在用於輸入接種材料的檢測。Wt(野生型)接種材料(WW)沒有示出接種，但相比之下與未接種的相比，rTg4510勻漿(CC)有效地接種。這種接種效應不受用HEL處理的影響，但部分地藉由用τ蛋白抗體(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)處理而逆轉。圖示(圖A-C)代表三個獨立的樣品組，並且被繪製為相對的τ蛋白聚集(超出背景的信號倍數，針對總蛋白歸一化)(實例8)。
圖8：電生理缺陷的逆轉
圖8示出在CA1誘發的場電位中配對脈衝易化(圖B和D) 以及基礎突觸傳遞(圖A和C)缺陷的抗體逆轉(C10-2，圖A；D1.2，圖B)，展示了在用C10-2在Tg4510小鼠中進行的CA1亞慢性處理中的誘發場電位，採用tTa小鼠作為對照。將動物每週兩次用15mg/kg劑量的抗體處理持續兩週(參見實例9)。在圖A(對於C10-2)和圖C(對於D1.2)中，場電位(fEPSP)斜率針對刺激強度繪製。圖A和C展示了在4.5到5.5月齡rTg4510(下部2個曲線)和tTA(上部2個曲線)對照小鼠中對海馬迴CA1區中突觸傳遞和可塑性的體內電生理評估：i)相比於tTA小鼠，在rTg4510中基礎突觸傳遞顯著受損，並且ii)相比於tTA小鼠，在rTg4510中配對脈衝易化顯著降低。
進一步在rTg4510和tTA小鼠中測量配對脈衝易化，這係一種被認為依賴於突觸前機制的短期突觸可塑性(圖B針對C10-2，且圖D針對D1.2)。簡言之，將具有從25到1000ms變化的刺激間時間間隔(ISI)的一對刺激施加至謝弗側枝(Schaffer collateral)，並且將第二fEPSP的斜率與第一fEPSP的斜率進行比較。在所有ISI處觀察到易化，其最大易化在50和75ms的ISI處。令人感興趣的是，在rTg4510小鼠(第二2個條)中觀察到當與tTA小鼠(第一2個條)比較時顯著更低的PPF。
圖9：如概括於圖1-8中的篩選概述
針對覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的雙磷酸化肽：TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)產生抗體。融合瘤係使用斑點印跡和MSD ELISA、採用固定的人類病理性和非病理性τ蛋白進行篩選(實例4)，以分離殖株，該等殖株對於磷酸化表位S396和/或S404的任一個具有高度特異性並且同時特異性地識別來自人類阿茲海默症腦的 過度磷酸化τ蛋白。在斑點印跡和西方墨點法中，在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分的能力用於選擇融合瘤。選擇16個殖株，其中的四個殖株(D1.2、C10-2、C5.2和C8.3)展現出結合至人類病理性材料的非凡能力。使用特異性免疫和篩選方案產生高度磷酸化絲胺酸-396(pS396)特異性抗體。
圖10：殘基pSer396結合在mAb C5.2的抗原結合位點的中心
在與磷酸化肽386-410的複合物中，mAb C5.2的晶體結構，解析度為1.9Å。在該結構中，確定了殘基392-398的電子密度。殘基{p}Ser396結合在mAb C5.2的抗原結合位點的中心。在抗τ蛋白mAb的該結構研究中，表位跨重鏈(底右)和輕鏈(底左)結合。
圖11：抗體C5.2與磷酸化絲胺酸τ(292-298)肽的相互作用
圖11表示抗體C5.2與磷酸化絲胺酸τ(292-298)肽之間的相互作用。示出Ile(392)-VAL(393)-Tyr(394)-Lys(395)-P-Ser(396)-Pro(397)-Val(398)的結構。主要相互作用涉及由τ肽的L3：H3、L3：F8*、H1：H13、H2：Y1、H2：Y3和Y(394)形成的疏水口袋。存在在溶劑化的{p}S(396)和L3：T4、H1：R10、H1：T11、H3：R1、H3：T3之間形成的廣泛氫鍵鍵合網路。在所使用的命名中，第一個字母(例如，L3：H3的“L”)表示涉及的CDR殘基是否是輕鏈CDR或重鏈CDR，第一個數目表示涉及此鏈的哪個CDR(例如，“L3”表示輕鏈的CDR3)，其餘術語(例如，L3：H3的“H3”)表示所涉及的胺基酸的名稱和位置(例如，“H3”表示在該CDR的第三個殘基位置處的組胺酸)；因此“L3：H3”表示輕鏈CDR3的第三個位置處的組胺酸殘基。在Y(394)側鏈和骨架之間存 在強氫鍵鍵合和電荷/極性相互作用，並且具有{p}S396的膦酸酯的骨架在肽骨架中形成轉彎。(*)L3：F8係CDR L3的C末端側翼框架殘基。
C5.2的CDR序列係：
CDR L1：QASQDTSINLN(SEQ ID NO：17)
CDR L2：GASNLED(SEQ ID NO：18)
CDR L3：LQHTYLP(SEQ ID NO：19)
CDR H1：KASGYTFTDRTIH(SEQ ID NO：20)
CDR H2：YIYPGDDSTKYNDNFKG(SEQ ID NO：21)
CDR H3：RGTMDY(SEQ ID NO：22)
圖12：τ蛋白的耗減用於接種測定(HEK293)
圖12(圖A-B)示出了使用鼠類C10-2(mC10-2)和人源化C10-2(hC10-2)的rTg4510腦勻漿的免疫耗減。經耗減的勻漿的西方墨點法被用E1檢測(總τ蛋白；圖A；下部))和C10-2(pS396 τ蛋白；圖A；上部)，並且mC10-2和hC10-2兩者有效地耗減過度磷酸化τ蛋白(在E1印跡上的上部條帶，以及在C10-2印跡上的所有條帶)。還針對聚集的τ蛋白的耗減使用西斯比(Cisbio)測定來分析經耗減的勻漿。圖B示出在樣品中聚集的τ蛋白的變化。用mC10-2和hC10-2的耗減研究分別以99%和99.5%去除了τ蛋白聚集物(圖B)。
圖13：用耗減材料的接種測定(HEK293)
圖A-C示出用於在HEK293細胞中接種P301L-h τ的經耗減的勻漿。來自對照動物(WW)的勻漿並不接種，而rTg4510勻漿(CC)有效地接種，如藉由西斯比聚集測定對總細胞裂解物所測量或者藉由在1% triton-X中對HEK293細胞的分級所測量(不溶性過度磷酸化D1.2和τ蛋白的定量(圖A，上部和下部))。用HEL和hHEL抗體的耗減不影響接種，然而用mC10-2和hC10-2的耗減分別以88%和96%(圖C)防止τ蛋白聚集並且以97%和100%(圖B)防止不溶性τ蛋白。
圖14：免疫耗減rTg4510材料(用於體內接種研究)
圖A-C證明了經免疫耗減的rTg4510腦提取物的西方墨點法(圖A；上部，下部)分析。C10-2和D1.2特異性地以90%減少人類過度磷酸化64kDa條帶，並且對55kDa τ蛋白τ 5(商業總τ蛋白抗體)沒有影響，相比之下將正常55kDa τ蛋白降低了74%並且對人類64kDa τ蛋白沒有影響(圖B-C)。
圖15：免疫耗減AD材料(用於體內接種研究)
圖15(圖A-C)描繪了經免疫耗減的阿爾茨海默腦提取物的西方墨點法(圖A)分析。使用C10-2和D1.2的免疫耗減並未將總τ蛋白水平降低多於10%，但特異性地降低了過度磷酸化τ蛋白(90%降低)(圖B-C)。
圖16(圖A)：在接種了經免疫耗減的rTg4510材料的rTg4510小鼠中的海馬迴τ蛋白病理學
圖16(圖A)展示在接種有rTg4510或AD腦勻漿的rTg4510腦中的τ蛋白病理學的定量。在接種之前，藉由使用C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已經在勻漿中降低了90%-95%。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。
圖16(圖B)在接種了經免疫耗減的AD材料的rTg4510小鼠中的海馬迴纏結病理學
圖16(圖B)展示在接種有rTg4510(A)或AD(B)腦勻漿的rTg4510腦中的τ蛋白病理學的定量。在接種之前，藉由使用C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已經在勻漿中降低了90%-95%。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。
圖17：在用D1.2處理的接種的rTg4510小鼠中海馬迴纏結病理學
圖17描繪了在接種的rTg4510小鼠的海馬迴中具有神經元的纏結的定量。病變隨著時間增加(IgG，1個月；IgG 2個月；IgG 3個月)。然而藉由用D1.2處理小鼠，在接種後1個月、2個月和3個月時病變顯著降低。(D1.2 1個月；D1.2 2個月；D1.2 3個月)。
圖18 τ蛋白的耗減用於接種測定(HEK293)
圖A示出了使用鼠類C10-2(mC10-2)和人源化C10-2(hC10-2)的rTg4510腦勻漿的免疫耗減。經耗減的勻漿的西方墨點法係用E1(總τ蛋白)和C10-2(pS396 τ蛋白)進行檢測，並且mC10-2和hC10-2兩者有效地耗減了過度磷酸化τ蛋白(在E1印跡上的上部條帶和在C10-2印跡上的所有條帶)。針對聚集的τ蛋白的耗減使用西斯比(Cisbio)測定來分析經耗減的勻漿。圖B示出用mC10-2和hC10-2的耗減分別將τ蛋白聚集物去除99%和99.5%。
圖19用耗減材料的接種測定(HEK293)
圖A示出τ蛋白分級(對不溶性部分的西方墨點法。圖B 示出西方墨點法定量。圖C示出在細胞裂解物中的聚集的τ蛋白。使用經耗減的勻漿以在HEK293細胞中接種P301L-h τ。來自對照動物(WW)的勻漿並不接種，而rTg4510勻漿(CC)有效地接種，如藉由西斯比聚集測定對總細胞裂解物所測量或者藉由在1% triton-X中對HEK293細胞的分級所測量(不溶性過度磷酸化D1.2+τ蛋白的定量)。用HEL和hHEL抗體的耗減不影響接種，然而用mC10-2和hC10-2(圖C)的耗減分別以88%和96%防止τ蛋白聚集並且以97%和100%防止不溶性τ蛋白(圖B)。
圖20 C10-2和D1.2針對過度磷酸化τ蛋白超過正常τ蛋白的免疫選擇性
用於體內接種研究的免疫耗減rTg4510材料：圖A示出經免疫耗減的rTg4510腦提取物的西方墨點法分析。圖B示出C10-2和D1.2特異性地降低在絲胺酸396處磷酸化的過度磷酸化64kDa條帶(與不包含顯著量的p396的τ蛋白55kDa條帶相比)。相比之下，τ 5，商業總τ蛋白抗體，減少了正常55kDa τ蛋白，並且低效地結合至64kDa τ蛋白。
圖21 C10-2和D1.2針對過度磷酸化τ蛋白超過正常τ蛋白的免疫選擇性
用於體內接種研究的免疫耗減AD材料：圖A示出經免疫耗減的阿爾茨海默腦提取物的西方墨點法分析。使用mC10-2和D1.2的免疫耗減並未將總τ蛋白水平降低多於10%(圖B)，但特異性地降低了過度磷酸化τ蛋白(90%降低)(圖C)。
圖22在rTg4510小鼠中的海馬迴τ蛋白病理學
圖A示出在接種了經免疫耗減的rTg4510材料的rTg4510小鼠中的海馬迴τ蛋白病理學。圖B示出在接種了經免疫耗減的AD材料的rTg4510小鼠中的海馬迴纏結病理學。接種有rTg4510(A)或AD(B)腦勻漿的rTg4510腦中的τ蛋白病理學的定量。在接種之前，藉由使用抗體C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已經在勻漿中降低了90%-95%。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。
圖23在用D1.2處理的接種的rTg4510小鼠中海馬迴纏結病理學
接種的rTg4510小鼠的海馬迴中的具有神經元的纏結的定量。該圖示出病變隨時間增加，並且藉由用D1.2處理小鼠，在接種後2個月和3個月時病變顯著更少。
圖24經免疫耗減的人類AD提取物的西方墨點法分析
該圖示出人源化形式的C10-2(hC10-2)以及mC10-2與2.10.3(P-S422)抗體的不同之處在於，雖然剩餘的總τ蛋白並非顯著不同(左圖)於2.10.3，但C10-2(hC10-2)以及mC10-2藉由免疫耗減方法去除存在於阿爾茨海默腦提取物中的更多過度磷酸化τ蛋白。這在圖25中藉由定量得以確認。
圖25在免疫耗減之後聚集的τ蛋白的定量
hC10-2和mC10-2抗體與2.10.3抗體的不同之處在於其能夠藉由免疫耗減方法將存在於阿爾茨海默腦提取物中的更多的聚集的τ蛋白去除。
圖26在免疫耗減之後剩餘的總τ蛋白
在使用不同量的人源化C10-2(▲)和2.10.3抗體(◆)來對阿爾茨萃取物進行免疫耗減之後，對西方墨點法信號的定量。在圖26中，示出使用τ 5對總τ蛋白信號的定量(所有τ蛋白同功型都包括在分析中)。兩種抗體去除來自阿爾茨海默腦製品的小部分τ蛋白。被設計為對P-S422 τ蛋白具有特異性的2.10.3去除了高達24%的總τ蛋白量，而C10-2去除了高達15%的總τ蛋白(參見圖26)。
圖27在過度磷酸化τ蛋白的免疫耗減之後，剩餘的總τ蛋白
圖27展示了對過度磷酸化τ蛋白(在絲胺酸422處磷酸化)的定量(所有條帶和高分子量塗片都包括在分析中)。2.10.3(▲)和C10-2(◆)兩者均去除多於90%的在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白。然而，去除50%的τ蛋白所需的抗體的量不同：針對相同效果，對於抗體2.10.3，需要0.42g抗體，而對於C10-2，需要0.27μg。
圖28在過度磷酸化τ蛋白的免疫耗減之後，剩餘的總τ蛋白
對過度磷酸化τ蛋白(在絲胺酸396處磷酸化)的定量(所有條帶和高分子量塗片都包括在分析中)。C10-2(◆)有效地去除了在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白(最大效應：88%，並且藉由使用0.30g抗體達到該效應的一半)。2.10.3(▲)去除了更少部分的在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白(最大效應：60%，並且當使用0.63g抗體時達到該效應的一半)。這指示所有的在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白在絲胺酸396處也被磷酸化，但在位置422處的磷酸化絲胺酸不存在時，存在在絲胺酸396處磷酸化的一部分過度磷酸化τ蛋白。
圖29在過度磷酸化τ蛋白的免疫耗減之後，剩餘的總τ蛋白
對過度磷酸化τ蛋白(在絲胺酸199/202處磷酸化)的定量(所有條帶和高分子量塗片都包括在分析中)。藉由C10-2(◆)去除的大部分τ蛋白在絲胺酸199/202處也被磷酸化，因為69%的具有該磷酸化的τ蛋白受到免疫耗減的影響(當使用0.34μg抗體時該效應的50%)。2.10.3(▲)免疫耗減並不對P-S199/202 τ蛋白給出S形劑量反應，但可看到信號隨遞增量的抗體而降低，當使用抗體的最大量(5μg)時最大值52%降低。該資料指示，與靶向在422位置處的磷酸化絲胺酸的2.10.3抗體相比，靶向磷酸化絲胺酸396的C10-2抗體結合更大量的過度磷酸化τ蛋白。
圖30在mC10-2包被的板中，mD1.2和mC10-2抑制τ抗原捕獲
在液相ELISA中，其中將rTg4510 P3製品和可變數的C10-2或D1.2抗體的混合物添加至C10-2包被的板上。結合至溶液中的P3 τ蛋白的抗體越多，能夠結合至板的可用τ蛋白表位越少。結合至板的τ蛋白的量係藉由硫標記的人類τ蛋白抗體來確定。C10-2(▲)和D1.2(□)與溶液中的τ蛋白具有不同的結合，其中C10-2可以從結合至板的所有中競爭而出(IC50 20nM)。在另一方面D1.2示出與溶液中的τ蛋白的非常低水平的結合。
圖31在mC10-2包被的板中，PHE13和mC10-2抑制τ抗原捕獲
在液相ELISA中，其中將AD P3製品與可變數的C10-2和PHF13抗體的混合物添加至C10-2包被的板上。結合至溶液中的P3 τ蛋白的抗體越多，能夠結合至板的可用τ蛋白表位越少。結合至板的τ蛋白的量係藉由硫標記的人類τ蛋白抗體來確定。C10-2和PHF13與溶液中的 τ蛋白具有不同的結合，其中C10-2可以從結合至板的所有中競爭而出(IC50=3nM)，然而PHF13並非如此。
圖32 mC10-2和PFH-13兩者劑量依賴性地結合至Pτ 386-408(pS396/pS404)
圖32示出mC10-2和PHF-13同樣地結合MSD板中的孔，所述MSD板用100ng/ml p-τ 386-408(pS396/pS404)包被。將漸增濃度的抗體(x軸上指示)在孔中培養2小時，隨後使用硫標記的抗人類IgG抗體洗滌並檢測結合的抗體。這指示用於後續實例中的製備的PHF-13係有活性的。
圖33比較mD1.2和mC10-2與AD-P3的結合
圖33示出mD1.2和mC10-2同樣地結合MSD板中的孔，所述MSD板用1μg/ml AD-P3包被。在存在和不存在10uM p-τ 386-408(pS396/pS404)肽的情況下，在室溫下培養漸增濃度的抗體(x軸上指示)1小時，隨後在孔中培養2小時，之後使用硫標記的抗人類IgG抗體檢測結合的抗體。對於AD-P3和AD-S1(p)的捕獲而言，IC50值係320nM和11nM。相比之下，mD1.2示出τ蛋白抗原捕獲的顯著更弱的抑制，其IC50值為589和503nM-表明對可溶性抗原的更低的親和力
以兩個步驟進行測定：A：將1μg/ml AD-P3和20ng/ml ADs1(p)分別用漸增濃度的mD1.2和mC10-2培養，並且在室溫下培養1小時，以允許漸增的抗體-抗原結合(佔有率)。B：將樣品在MSD板上培養2小時，所述MSD板用AD-P3(1μg/ml)包被，隨後使用硫標記的抗總τG抗體洗滌並檢測捕獲的τ抗原
圖34 mC10-2(而不是PHF-13)有效地結合至展示AD-P3抗原的固相 上
mC10-2而不是PHF-13的高度特異性結合：圖34示出mC10-2有效地結合至AD-P3抗原包被的MSD板(1μg/ml)。相比之下，PHF-13的低結合活性指示對生理學p-τ抗原的更低親和力。此外PHF-13證實了相比於mC10-2而言實質性更高程度的非特異性結合(參見表6)。將漸增濃度的抗體(x軸上指示)培養2小時，之後使用硫標記的抗人類IgG抗體檢測結合的抗體。針對非特異性結合活性校正結合信號(定義為在10uM p-τ 386-408(pS396/pS404)肽的存在下測量的信號)。對於AD-P3的mC10-2捕獲，IC50值係3nM。相比之下，PHF-13實質上沒有示出抑制。
以兩個步驟進行測定。A：將1μg/ml AD-P3用漸增濃度的mC10-2和PHF-13培養，並且在室溫下培養1小時，以允許增加抗體-抗原結合(佔有率)。B：將樣品在MSD板上培養2小時，所述MSD板用AD-P3(1μg/ml)包被，隨後使用硫標記的抗總τ蛋白抗體洗滌並檢測捕獲的τ抗原
藉由引用結合的序列
SEQ ID NO：1 D1.2輕鏈CDR1
SEQ ID NO：2 D1.2輕鏈CDR2
SEQ ID NO：3 D1.2輕鏈CDR3
SEQ ID NO：4 D1.2重鏈CDR1
SEQ ID NO：5 D1.2重鏈CDR2
SEQ ID NO：6 D1.2重鏈CDR3
SEQ ID NO：7 D1.2輕鏈
SEQ ID NO：8 D1.2重鏈
SEQ ID NO：9 C10-2輕鏈CDR1
SEQ ID NO：10 C10-2輕鏈CDR2
SEQ ID NO：11 C10-2輕鏈CDR3
SEQ ID NO：12 C10-2重鏈CDR1
SEQ ID NO：13 C10-2重鏈CDR2
SEQ ID NO：14 C10-2重鏈CDR3
SEQ ID NO：15 C10-2輕鏈
SEQ ID NO：16 C10-2重鏈
SEQ ID NO：17 C5.2輕鏈CDR1
SEQ ID NO：18 C5.2輕鏈CDR2
SEQ ID NO：19 C5.2輕鏈CDR3
SEQ ID NO：20 C5.2重鏈CDR1
SEQ ID NO：21 C5.2重鏈CDR2
SEQ ID NO：22 C5.2重鏈CDR3
SEQ ID NO：23 C5.2輕鏈
SEQ ID NO：24 C5.2重鏈
SEQ ID NO：25 C8.3輕鏈CDR1
SEQ ID NO：26 C8.3輕鏈CDR2
SEQ ID NO：27 C8.3輕鏈CDR3
SEQ ID NO：28 C8.3重鏈CDR1
SEQ ID NO：29 C8.3重鏈CDR2
SEQ ID NO：30 C8.3重鏈CDR3
SEQ ID NO：31 C8.3輕鏈
SEQ ID NO：32 C8.3重鏈
SEQ ID NO：33 人類τ蛋白
SEQ ID NO：34 D1.2*輕鏈
SEQ ID NO：35 人源化C10-2重鏈
SEQ ID NO：36 人源化C10-2輕鏈
SEQ ID NO：37 τ蛋白殘基386-408(pS396，pS404)
如在此使用的，術語“τ”與“τ蛋白”係同義的，並且係指τ蛋白同功型的任一種(例如在UniProt中鑒定為P10636，1-9)。在此使用的τ蛋白的胺基酸編號係相對於如以下所示的同功型2(SEQ ID NO：33)給出的，其中甲硫胺酸(M)係胺基酸殘基1： SEQ ID NO：33：
本發明涉及抗體及其表位結合片段，它們能夠特異性地結合至τ蛋白，並且特別是人類τ蛋白，並且在一個實施方式中展現出能夠特異性地結合至人類τ蛋白的磷酸化S396殘基(pS396)。本發明的抗體及其表位結合片段進一步表徵為不能或基本上不能特異性地結合至人類τ蛋 白上的磷酸化404(pS404)殘基，例如在抗體限制或非飽和條件下。此外，在pS404處的磷酸化並不干擾特異性結合至pS396。如在此所使用的，符號“pS”和“{p}S”表示胺基酸殘基磷酸化絲胺酸。如在此所使用的，如果相對於另一個表位，抗體與表位的結合係用這樣的其他表位觀察到的結合的小於20%、小於10%、小於5%、小於2%並且更較佳的是小於1%，那麼該抗體“基本上”不能結合至該表位。
在本發明的背景中術語“抗體”(Ab)係指免疫球蛋白分子，或者根據本發明的一些實施方式為具有特異性地結合至分子(“抗原”)表位的能力的免疫球蛋白分子片段。天然存在的抗體典型地包括四聚體，它通常由至少兩個重(H)鏈和至少兩個輕(L)鏈構成。每個重鏈由重鏈可變結構域(在此縮寫為VH)以及重鏈恒定結構域構成，該重鏈恒定結構域通常由三個結構域(CH1、CH2和CH3)構成。重鏈可以具有任何同種型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同功型)。每個輕鏈係由輕鏈可變結構域(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定結構域(CL)構成。輕鏈包括κ鏈和λ鏈。重鏈和輕鏈可變結構域典型地促成抗原識別，而該重鏈和輕鏈恒定結構域可以介導將該免疫球蛋白結合到宿主組織或因數，包括免疫系統的不同細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)。該VH和VL結構域可以進一步細分為高變性結構域，稱為“互補決定區”，其穿插有更保守序列的結構域(稱為“框架區”(FR))。每個VH和VL係由三個CDR結構域和四個FR結構域組成，從胺基末端到羧基末端按以下順序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重鏈和輕鏈的可變結構域包含與抗原相互作用的結合結構域。特別相關的是抗體與其表位結合片 段，它們已經被“分離”以在一照物理環境存在，該物理環境不同於它們在自然界中存在的環境，或者它們已經被修飾以在胺基酸序列方面不同於天然存在的抗體。
術語“表位”意指能夠特異性地結合至抗體的抗原決定簇。表位通常由分子的表面組群(如胺基酸或糖側鏈)組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構象表位和線性表位的區別在於與前者而非後者的結合在變性溶劑的存在下常常缺失。表位可以包含直接涉及於結合中的胺基酸殘基和其他未直接涉及於結合中的胺基酸殘基，例如被特異性表位結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基係在特異性表位結合肽的足跡內)。
如在此所使用的，術語“抗體的表位結合片段”意指抗體的片段、部分、區域或結構域(無論它如何產生(例如，經由切割、重組、合成，等))，其能夠特異性地結合至表位。表位結合片段可以包含這種抗體的CDR結構域的1、2、3、4、5或所有6個，並且雖然能夠特異性地結合至這種表位，但可以展現對這種表位的不同於這種抗體的特異性、親和力或選擇性。然而，較佳的是，表位結合片段將包含這種抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單一多肽鏈的部分或者包括單一多肽鏈(例如scFv)，或者可以是兩個或更多個多肽鏈的部分或者包括兩個或更多個多肽鏈，各自具有胺基末端和羧基末端(例如，抗體、Fab片段、Fab2片段等)。可以獲得展現表位結合活性的抗體的片段，例如藉由完整抗體的蛋白酶切割。更較佳的是，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH天然地由單獨基因編碼，編碼此類基因序列的多核苷酸(例如它們的編碼cDNA) 可以使用重組方法藉由能將所述VL和VH產生為單一蛋白鏈的柔性接頭進行連接，在該單一蛋白鏈中VL和VH區關聯以形成單價表位結合分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，博爾德(Bird)等人，(1988)科學(Science)242：423-426；和休斯頓(Huston)等人(1988)美國科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))85：5879-5883)。可替代地，藉由採用太短的柔性接頭(例如，小於約9個殘基)以使得單一多肽鏈的VL和VH結構域能夠關聯在一起，可以形成雙特異性抗體、雙體、或類似分子(其中兩個這樣的多肽鏈關聯在一起以形成二價表位結合分子)(關於雙體的說明參見例如PNAS USA 90(14)，6444-8(1993))。包含在本發明中的表位結合片段的實例包括(i)Fab'或Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，或如描述於WO 2007059782中的單價抗體；(ii)F(ab')2片段，即包括由在鉸鏈結構域處的二硫橋鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，實質上由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，實質上由VL和VH結構域組成，(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，自然(Nature)341，544-546(1989))，實質上由VH結構域組成，並且還稱為域抗體(霍爾特(Holt)等人；生物技術趨勢(Trends Biotechnol.)2003年11月；2i(ll)：484-90)；(vi)駱駝抗體或奈米抗體(瑞維特(Revets)等人；生物理論專家觀點(Expert Opin Biol Ther.)2005年1月；5_(l)：1 11-24)以及(vii)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然該Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼，它們可以使用重組方法藉由能將所述VL和VH產生為單一蛋白鏈的合成接頭來進行連接，在所述單一蛋白鏈中VL和VH結構域配對以形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，參見例如博爾德(Bird)等人，科學(Science) 242，423-426(1988)和休斯頓(Huston)等人，美國國家科學院院刊(PNAS USA)85，5879-5883(1988))。在此進一步討論在本發明的背景下的該等和其他有用的抗體片段。還應理解的是，術語抗體，除非另外指明，否則還包括抗體樣多肽(例如嵌合抗體和人源化抗體)、以及保留特異性地結合至抗原的能力的抗體片段(表位結合片段)，它們係藉由任何已知的技術提供的，例如酶切割、肽合成、以及重組技術。如產生的抗體可以具有任何同種型。如在此使用的，“同種型”係指由重鏈恒定結構域基因編碼的免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。此類抗體片段係使用熟習該項技術者已知的常規技術獲得；可以易於針對效用以與完整抗體相同的方式來篩選能夠結合至所希望的表位的適合片段。
術語“雙特異性抗體”係指包含兩個獨立表位結合片段的抗體，每個表位結合片段靶向獨立的靶標。該等靶標可以是存在於不同蛋白上的表位或者存在於相同靶標上的不同表位。雙特異性抗體分子可以藉由在親本單特異性雙價抗體分子的HC的恒定結構域中使用補償性胺基酸變化來產生。所得異源二聚體抗體包含從兩個不同的親本單特異性抗體貢獻的一個Fab。在Fo結構域中的胺基酸變化導致異源二聚體抗體的增加的穩定性，該異源二聚體抗體具有隨時間穩定的雙特異性。(裡奇韋(Ridgway)等人，蛋白質工程化(Protein Engineering)9，617-621(1996)，賈娜薩卡(Gunasekaran)等人，JBC 285，19637-1(2010)，莫耳(Moore)等人，MAbs 3：6 546-557(2011)，施特羅普(Strop)等人，JMB 420，204-219(2012)，梅茨(Metz)等人，蛋白質工程化(Protein Engineering)25：10 571-580(2012)，拉布林(Labrijn)等人，PNAS 110：113，5145-5150(2013)，施普雷特爾 範 弗裡登施泰因(Spreter Von Kreudenstein)等人，MAbs 5：5 646-654(2013))。雙特異性抗體還可以包括使用ScFv融合物產生的分子。然後將兩個單特異性scfv獨立地連接至能夠形成穩定異二聚體的Fc結構域，以產生單一雙特異性分子(馬布裡(Mabry)等人，PEDS 23：3 115-127(2010)。雙特異性分子具有雙重結合能力。
術語“抗體D1.2”旨在表示抗體或其表位結合片段，包含抗體輕鏈可變結構域或由抗體輕鏈可變結構域組成，該抗體輕鏈可變結構域具有：(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的輕鏈CDR3；以及抗體重鏈可變結構域，該抗體重鏈可變結構域具有：(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施方式中，抗體D1.2或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：8的重鏈和/或SEQ ID NO：7的輕鏈或由SEQ ID NO：8的重鏈和/或SEQ ID NO：7的輕鏈組成。
在一個相關實施方式中，抗體D1.2*或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：8的重鏈和/或SEQ ID NO：34的輕鏈或由SEQ ID NO：8的重鏈和/或SEQ ID NO：34的輕鏈組成。
術語“抗體C10-2”旨在表示抗體或其表位結合片段，包含 抗體輕鏈可變結構域或由抗體輕鏈可變結構域組成，該抗體輕鏈可變結構域具有：(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3；以及抗體重鏈可變結構域，該抗體重鏈可變結構域具有：(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施方式中，抗體C10-2或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：16的重鏈和/或SEQ ID NO：15的輕鏈或由SEQ ID NO：16的重鏈和/或SEQ ID NO：15的輕鏈組成。
在另外的實施方式中，人源化抗體C10-2或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：35的重鏈、SEQ ID NO：36的輕鏈、或兩者或由SEQ ID NO：35的重鏈、SEQ ID NO：36的輕鏈、或兩者組成。本發明的一個實施方式針對抗體或其表位結合片段，該抗體或其表位結合片段包含SEQ ID NO：35的重鏈、SEQ ID NO：36的輕鏈或由SEQ ID NO：35的重鏈、SEQ ID NO：36的輕鏈組成。
術語“抗體C5.2”旨在表示抗體或其表位結合片段，包含抗體輕鏈可變結構域或由抗體輕鏈可變結構域組成，該抗體輕鏈可變結構域具有：(a)具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的輕鏈CDR1； (b)具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及(c)具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3；以及抗體重鏈可變結構域，該抗體重鏈可變結構域具有：(d)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施方式中，抗體C5.2或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO 24的重鏈和/或SEQ ID NO：23的輕鏈或由SEQ ID NO 24的重鏈和/或SEQ ID NO：23的輕鏈組成。
術語“抗體C8.3”旨在表示抗體或其表位結合片段，包含抗體輕鏈可變結構域或由抗體輕鏈可變結構域組成，該抗體輕鏈可變結構域具有：(a)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及(c)具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的輕鏈CDR3；以及抗體重鏈可變結構域，該抗體重鏈可變結構域具有：(d)具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施方式中，抗體C8.3或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO 32的重鏈和/或SEQ ID NO：31的輕鏈或由SEQ ID NO 32的重鏈和/或SEQ ID NO：31的輕鏈組成。
“抗τ蛋白抗體”係一種抗體或其表位結合片段，其特異性地結合至τ蛋白或τ蛋白片段。
如在此使用的術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”係指具有單一分子組成的抗體分子的製品。常規的單株抗體組成物顯示對於具體表位的單一結合特異性和親和力。在某些實施方式中，單株抗體可以由多於一種Fab結構域構成，由此增加針對多於一種靶標的特異性。術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”不是旨在由任何具體產生方法(例如，重組的、轉基因、融合瘤、等)限制。
本發明的該等抗體及其表位結合片段將較佳的是“人源化”的，特別是當被採用以用於治療目的時。術語“人源化”係指一通常使用重組技術製備的分子，具有從來自非人類物種的免疫球蛋白衍生的表位結合位點，以及基於人類免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構。該表位結合位點可包括與人類恒定結構域融合的完整非人類抗體可變結構域，或者包括此類可變結構域的接枝到人類可變結構域的適當人類框架區上的僅互補決定區(CDR)。此類人源化分子的框架殘基可以是野生型(例如，全人的)或者它們可以被修飾為包含未在人類抗體中發現的一種或多種胺基酸取代，其序列可以充當人源化的基礎。人源化減輕或消除了分子的恒定結構域將在人類個體中充當免疫原的可能性，但外源可變結構域的免疫應答的可能性仍保留(洛布利(LoBuglio)，A.F.等人(1989)“在人類中的小鼠/人類嵌合單株抗體：動力學和免疫應答”(“Mouse/HumanChimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Re·sponse，”)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))86：4220-4224)。另一種 方法不僅聚焦於提供人類-衍生的恒定結構域，而且還聚焦於修飾可變結構域以便盡可能改造它們接近人類形式。已知的是重鏈和輕鏈兩者的可變結構域包含三個互補決定區(CDR)，該等互補決定區響應於討論的抗原而不同，並且決定結合能力，側翼為四個框架區(FR)，該等框架區在給定物種中是相對保守的並且推測為CDR提供支架。當非人類抗體相對於具體抗原製備時，可變結構域可以藉由將衍生自非人類抗體的CDR接枝到有待修飾的人類抗體中存在的FR上來“改造”或“人源化”。這種方法應用至不同抗體已經由以下報導：薩托(Sato)，K.等人(1993)癌症研究(Cancer Res)53：851-856；萊興曼(Riechmann)，L.等人(1988)“改造人抗體用於治療(Reshaping Human Antibodies for Therapy)”，自然(Nature)332：323-327；維霍演(Verhoeyen)，M.等人(1988)”改造人類抗體：接枝溶菌酶抗體活性”(“Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Activity”)，科學(Science)239：1534-1536；凱特伯拉夫(Kettleborough)，C.A.等人(1991)“藉由CDR接枝小鼠單株抗體的人源化：框架殘基對環構象的重要性”(“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting：THe Importance Of Framework Residues On Loop Conformation”)，蛋白質工程化(Protein Engineering)4：773-3783；梅達(Maeda)，H.等人.(1991)“具有HIV中和活性的改造人類抗體的構建”(“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity”)，人類抗體融合瘤(Human Antibodies Hybridoma)2：124-134；戈爾曼(Gorman)，S.D.等人.(1991)“改造治療性CD4抗體”(“Reshaping A THerapeutic CD4 Antibody”)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))88：4181-4185；坦皮斯特 (Tempest)，P.R.等人.(1991)“改造人類單株抗體以抑制人類呼吸道合胞病毒的體內感染”(“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo”)，生物/技術(Bio/Technology)9：266-271；可(Co)，M.S.等人.(1991)“用於抗病毒療法的人源化抗體”(“Humanized Antibodies For Antviral Therapy”)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))88：2869-2873；卡特(Carter)，P.等人.(1992)“抗p185her2抗體的人源化用於人類癌症療法”(“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy，”)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))89：4285-4289；以及可(Co)，M.S.等人.(1992)“具有針對CD33抗原的特異性的嵌合和人源化抗體”(“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For THe CD33 Antigen”)，免疫學雜誌(J.Immunol.)148：1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗體，它包含來自小鼠抗體的所有六種CDR)。在其他實施方式中，人源化抗體具有相對於該原始抗體被改變的一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，該等CDR還稱為“衍生自”來自原始抗體的一個或多個CDR的一個或多個CDR。人源化抗原的能力係熟知的(參見例如美國專利號5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
術語抗體“XX”旨在表示一抗體或其表位結合片段(例如抗體“C10-2”)，包含或其組成為輕鏈、輕鏈可變結構域、或輕鏈可變結構域CDR1-3(如藉由其對應的SEQ ID NO定義)以及重鏈、重鏈可變結構域、 或重鏈可變結構域CDR1-3(如藉由其對應的SEQ ID NO定義)。在某些實施方式中，該抗體或其表位結合片段係藉由它們的如藉由其SEQ ID NO定義的整個重鏈可變結構域以及它們的如藉由其SEQ ID NO定義的輕鏈可變結構域來定義。
除非在此另外指定，在抗體的Fc區或恒定結構域中胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，也稱為EU索引，如在以下中描述的：卡巴特(Kabat)等人)，具有免疫學意義的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共衛生服務(Public Health Service)，國立衛生研究院，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州(MD)，1991。
如在此所使用的，如果一抗體或其表位結合片段更頻繁地、更快速地以更大持續時間和/或更大親和力或親合力(相對於可替代表位而言)與該表位發生反應或締合，該抗體或其表位結合片段即被認為“特異性地”結合另一個分子的區域(即表位)。藉由閱讀本定義還應理解，例如，特異性地結合至第一靶標的抗體或其表位結合片段可以是或可以不是特異性地或優先地結合至第二靶標。如在此所使用的，在抗體結合至預定抗原的背景中，術語“結合”典型地是指當藉由例如表面電漿共振(SPR)技術在BIAcore® 3000儀器中使用抗原作為配位基並且使用抗體作為分析物來確定時，以相應於約10-7M或更小(例如約10-8M或更小，例如約10-9M或更小)的KD的親和力的結合，並且與結合至不是預定抗原或密切相關抗原的非特異性抗原(例如BSA，酪蛋白)的親和力相比，以相應於低至少十倍例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的親和力結合至該預定抗原。使親和力更低的量依賴於 抗體的KD，從而當抗體的KD非常低時(即抗體係高度特異性的)，則使針對抗原的親和力低於針對非特異性抗原的親和力的量可以是至少10,000倍。
如在此使用的，術語“kd”(sec -1或1/s)係指具體抗體-抗原相互作用的解離速率常數。所述值也稱為koff值。
如在此使用的，術語“ka”(M-1 x sec-1或1/Msec)係指具體抗體-抗原相互作用的締合速率常數。
如在此使用的，術語“KD”(M)係指具體抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，並且係藉由將kd除以ka來獲得。
如在此使用的，術語“KA”(M-1或1/M)係指具體抗體-抗原相互作用的締合平衡常數，並且係藉由將ka除以kd來獲得。
在一個實施方式中，本發明涉及一種抗τ蛋白抗體或其表位結合片段，其展現出以下特性中的一種或多種：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基(pS404)；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分； 和/或(viii)當如在此所述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%；或者當如在此所描述的與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，其特異性地以至少90%減少S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶、同時以不多於10%減少非過度磷酸化τ蛋白條帶的能力。
本發明的一個另外的實施方式涉及一種藉由用於產生高特異性、高親和力抗體的方法而產生的抗體，該等高特異性、高親和力抗體對於包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白具有免疫特異性，其中所述方法包括以下步驟：(A)將免疫原注入哺乳動物中，由此免疫所述哺乳動物，所述免疫原包含雙磷酸化肽，該雙磷酸化肽包含含有覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)的18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基；(B)將對所述哺乳動物的所述免疫重複進行兩次或更多次；(C)針對高特異性、高親和力抗體的存在對來自所述經重複免疫的哺乳動物的血清樣品進行篩選，該等高特異性、高親和力抗體能夠結合包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白、但係基本上很少能夠結合非病原性τ蛋白；並且(D)回收所述高特異性、高親和力抗體。
如在此使用的，“基本上不能”結合τ分子表示，相對於 由參考抗體介導的可檢測結合而言，在功能方面的多於20%差異、多於40%差異、多於60%差異、多於80%差異、多於100%差異、多於150%差異、多於2-倍差異、多於4-倍差異、多於5-倍差異、或多於10-倍差異。
術語“選擇性”和“免疫選擇性”當指代抗τ蛋白抗體相對於兩種表位的結合能力時，係旨在表示在飽和條件下觀察到的結合展現至少80%差異、至少95%差異、以及最較佳的是100%差異(即沒有與表位的可檢測結合)。術語“選擇性”和“免疫選擇性”當指代τ蛋白抗體時，進一步旨在意指該抗體結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白，並且能夠在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分。
術語TBS-可提取的(S1)、高鹽/肌胺醯-可提取的(S3)、以及肌胺醯-不溶性(P3)部分係如藉由在此描述的τ蛋白生物化學分級獲得的部分。
在一些抗體中，需要僅CDR的部分，即結合所需要的CDR殘基子集(稱為SDR)，以保持在人源化抗體中的結合。不接觸相關表位且不在SDR中的CDR殘基可以基於先前研究(例如在CDR H2中的殘基H60-H65常常不是需要的)，從位於喬西亞(Chothia)高變環外部的卡巴特CDR的區域(參見卡巴特(Kabat)等人(1992)具有免疫學意義的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，國立衛生研究院(National Institutes of Health)，出版號91-3242；喬西亞(Chothia)，C.等人(1987)“對於免疫球蛋白的高變區的典範結構”(“Canonical Structures For The Hypervarisble Regions Of Immunoglobulins”)，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196：901-917)，藉由分子建模和/或根據經驗來鑒定，或者如在以下 文獻中描述的來鑒定：岡薩雷斯(Gonzales)，N.R.等人(2004)“使用多種人類種系模板進行鼠類抗體的SDR接枝以最小化其免疫原性”(“SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity”)，分子免疫學(Mol.Immunol.)41：863-872。在此類人源化抗體中，在一個或多個供體CDR殘基不存在的位置處或者在整個供體CDR被省略的位置處，佔據該位置的胺基酸可以是受體抗體序列中佔據相應位置(藉由卡巴特編號)的胺基酸。在所包含的CDR中受體對於供體胺基酸的此類取代的數目反映競爭考慮的平衡。此類取代在降低人源化抗體中的小鼠胺基酸的數目方面係潛在有利的，並且因此降低潛在的免疫原性。然而，取代還可以引起親和力的變化，並且較佳的是避免親和力的顯著降低。還可以根據經驗選擇在CDR內用於取代的位置和用以取代的胺基酸。
CDR殘基的單一胺基酸改變可以導致功能性結合的損失的事實(魯迪科夫(Rudikoff)，S.等(1982)“改變抗原結合特異性的單一胺基酸取代”(“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity”)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6)：1979-1983)提供了用於系統地鑒定可替代功能CDR序列的手段。在用於獲得此類變體CDR的一個較佳的方法中，誘變編碼CDR的多核苷酸(例如經由隨機誘變或藉由定點方法(例如聚合酶鏈介導的採用編碼突變座位的引物進行的擴增))以產生具有經取代的胺基酸殘基的CDR。藉由比較原始(功能性)CDR序列中的相關殘基的身份與經取代的(非功能性)變體CDR序列的身份，可以針對該取代鑒定BLOSUM62.iij取代分數。BLOSUM系統提 供了藉由分析受信任的比對的序列的資料庫而創建的胺基酸取代的矩陣(埃迪(Eddy)，S.R.(2004)“BLOSUM62比對分數矩陣來自哪裡？”(“Where Did THe BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？”)，自然生物技術(Nature Biotech.)22(8)：1035-1036；赫尼科夫(Henikoff)，J.G.(1992)“來自蛋白質塊的胺基酸取代矩陣”(“Amino acid substitution matrices from protein blocks”)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))89：10915-10919；卡林(Karlin)，S.等人(1990)“用於藉由使用一般評分方案評估分子序列特徵的統計學顯著性的方法”(“Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes”)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))87：2264-2268；阿爾丘爾(Altschul)，S.F.(1991)“從資訊理論角度的胺基酸取代矩陣”(“Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective”)，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)219，555-565。目前，最先進的BLOSUM資料庫係BLOSUM62資料庫(BLOSUM62.iij)。表1呈現了BLOSUM62.iij取代分數(得分越高取代越保守，並且因此更加可能地，該取代將不會影響功能)。如果包含所得CDR的表位結合片段未能結合至τ蛋白，例如，則BLOSUM62.iij取代分數被認為是不足夠保守的，並且選擇並產生具有更高取代分數的新候選取代。因此，例如，如果原始殘基係穀胺酸(E)，並且非功能性取代殘基係組胺酸(H)，則BLOSUM62.iij取代分數將係0，並且更保守的變化(例如變為天冬胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、或賴胺酸)係較佳的。
因此，本發明考慮了使用隨機誘變來鑒定改進的CDR。在本發明的背景下，保守取代可以由表2、3、或4中的一個或多個中反映的胺基酸類別之內的取代來限定：
用於保守取代的胺基酸殘基類別：
可替代的保守胺基酸殘基取代類別：
胺基酸殘基的可替代的物理性和功能性分類：
更保守取代組群包括：纈胺酸-亮胺酸-異亮胺酸、***酸-酪胺酸、賴胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、和天冬醯胺-穀胺醯胺。
另外組的胺基酸還可以使用描述於例如克賴頓(Creighton)(1984)蛋白質：結構和分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)(第2版，1993)，W.H.弗裡曼(Freeman)和公司中的原則來配製。
噬菌體展示技術可以可替代地用於增加(或降低)CDR親和力。被稱為親和力成熟的這種技術採用誘變或者“CDR步移”和重選擇，使用靶標抗原或其抗原表位結合片段來鑒別具有如下CDR的抗體，該等CDR當與初始抗體或親本抗體比較時以更高(或更低)親和力結合到該抗原(參見例如格拉澤(Glaser)等人(1992)免疫學雜誌(J.Immunology) 149：3903)。誘變整個密碼子而不是單個核苷酸產生了胺基酸突變的半隨機譜。可構建由一組變體殖株所組成的庫，每一殖株都在單個CDR中相差單個胺基酸改變，並且該等殖株包含代表了每個CDR殘基的每個可能胺基酸取代的變體。可藉由使固定化突變體與標記的抗原相接觸來篩選對抗原的結合親和力增加(或減少)的突變體。本領域中已知的任何篩選方法(例如ELISA)可以用於鑒定對抗原具有增加或降低的親和力的突變體抗體(參見吳(Wu)等人，1998，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))95：6037；耶爾頓(Yelton)等人，1995，免疫學雜誌(J.Immunology)155：1994)。可以可能地使用使輕鏈隨機化的CDR步移(參見例如希爾(Schier)等人，1996，分子生物學雜誌(J.Mol.Bio.)263：551)。
用於完成此類親和力成熟的方法描述於以下中，例如：克勞斯(Krause)，J.C.等人(2011)“扭曲抗體結合位點構造的***突變增強了人類抗體的功能(An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody)”，MBio.2(1)pii：e00345-10.doi：10.1128/mBio.00345-10；寬(Kuan)，C.T.等人(2010)“靶向惡性膠質瘤和黑色素瘤的親和力成熟的抗糖蛋白NMB重組免疫毒素(Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas)”，國際癌症雜誌(Int.J.Cancer)10.1002/ijc.25645；哈克爾(Hackel)，B.J.等人(2010)“穩定性和CDR組成偏移豐富了結合物功能景觀(Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes)”，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)401(1)：84-96；蒙哥馬利(Montgomery)，D.L.等人(2009)“針對HIV-1 gp41的人 類單株抗體的親和力成熟和表徵(Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41)”，MAbs 1(5)：462-474；古斯查那(Gustchina)，E.等人(2009)“藉由源自合成原初人類抗體文庫並且針對Gp41的內部三聚捲曲螺旋的單殖株Fab的CDR-H2環的靶向多樣化的親和力成熟產生了一組具有改進的HIV-1中和效力和幅度的Fab(Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth)”，病毒學(Virology)393(1)：112-119；芬利(Finlay)，W.J.等人(2009)“用於抗RAGE治療的人源化大鼠抗體的親和力成熟：全面誘變揭示在互補決定區內外同時存在的高水平的突變可塑性((Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy：Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions)”，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)388(3)：541-558；博斯特倫(Bostrom)，J.等人(2009)“改進抗體結合親和力和特異性用於治療開發(Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development)”，分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)，525：353-376；施泰德爾(Steidl)，S.等人(2008)“藉由靶向的CDR多樣化的人類GM-CSF抗體的體外親和力成熟(In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification)”，分子免疫學(Mol.Immunol.)46(1)：135-144；和班德拉斯(Barderas)，R.等人(2008)“藉由電腦建模輔 助的抗體的親和力成熟(Affinity Maturation Of Antibodes Assisted By In Silico Modeling)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))105(26)：9029-9034。
因此，包括的抗體或其表位結合片段的CDR變體序列可以藉由取代而不同於親本抗體D1.2、C10-2、C5.2或C8.3的CDR序列；例如經取代的4個胺基酸殘基、3個胺基酸殘基、2個胺基酸殘基或1個胺基酸殘基。根據本發明的實施方式，進一步設想的是在CDR區中的胺基酸可以用如在上表3中定義的保守取代來取代。例如，酸性殘基Asp可以被Glu取代而不會實質性地影響該抗體的結合特徵。
術語“正常τ蛋白”係指每莫耳蛋白中包含2-3莫耳磷酸的正常腦τ蛋白。
術語“過度磷酸化τ蛋白”係指與多陰離子種類誘導的在西方墨點法中的遷移性變動相一致的τ蛋白的多磷酸化種類，或者係指具有多於五個、六個或七個磷酸化的絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸位點的τ蛋白種類。
術語“具有磷酸化殘基396的τ蛋白”涉及過度磷酸化τ蛋白，其中殘基396被磷酸化並且殘基404磷酸化或不被磷酸化。
術語“轉基因非人類動物”係指具有含一種或多種人類重和/或輕鏈轉基因或轉染色體(整合或未整合到動物的天然基因組DNA中)的基因組的非人類動物，並且其不能表現全人源化抗體。例如，轉基因小鼠可以具有人源化輕鏈轉基因以及人源化重鏈轉基因或人源化重鏈轉染色體，使得該小鼠當用τ抗原和/或表現τ蛋白的細胞免疫時產生人源化抗 τ蛋白抗體。人源化重鏈轉基因可以整合到小鼠的染色體DNA中，轉基因小鼠的例子例如HuMAb小鼠，如HCo7或Hco12小鼠，或者人源化重鏈轉基因可以保持在染色體外，轉染色體KM小鼠的例子如在WO 02/43478中所述。此類轉基因和轉染色體小鼠(在此統稱為“轉基因小鼠”)能夠藉由經歷V-D-J重組和同種型轉換而產生針對給定抗原的人源化單株抗體的多種同種型(例如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。
轉基因的非人類動物還可以用於藉由引入編碼這種特異性抗體的基因(例如藉由可操作地將基因連接至在動物乳中表現的基因)針對特定抗原產生抗體。
如在此所使用，術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”意指改善、減慢、衰減、或逆轉疾病或障礙的進展或嚴重性、或者改善、減慢、衰減、或逆轉這種疾病或障礙的一種或多種症狀或副作用。對於本發明的目的，“治療(treatment)”或“治療(treating)”另外指的係用於獲得有益的或希望的臨床結果之方法，其中“有益的或希望的臨床結果”包括但不限於症狀的緩解、障礙或疾病程度的減小、穩定化的(即沒有惡化的)疾病或障礙狀態、疾病或障礙狀態進展的延緩或減慢、疾病或障礙狀態的改善或減輕、以及疾病或障礙的緩解，不論是部分地或全部地、可檢出的或不可檢出的。
“有效量”，當應用於本發明的抗體或其表位結合片段時，係指在所需劑量和持續時期下足以實現預期生物效應或希望的治療結果(包括而不限於臨床結果)之量。短語“治療有效量”當應用於本發明的抗體或其表位結合片段時，旨在表示該抗體或其表位結合片段足以改善、 減輕、穩定、逆轉、減慢、衰減或延緩障礙或疾病狀態的進展或該障礙或疾病的症狀之量。在實施方式中，本發明的方法提供用於與其他化合物相組合來給予該抗體或其表位結合片段。在此類情況下，“有效量”係足以引起預期的生物效應的該組合之量。
本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的治療有效量可以根據因素例如個體的疾病狀態、年齡、性別、和體重以及抗τ蛋白抗體或其表位結合片段在該個體中引發希望的應答的能力來改變。治療有效量也是其中治療有利作用大於抗體或抗體部分的任何毒性或有害作用之量。
如以上指出的，本發明特別涉及單株抗體或表位結合片段，並且涉及全新的用於產生此類分子(以及由此此類其表位結合片段)之方法。這種方法概述於圖9中。新方法用以分離單株抗體的這種能力在此藉由將該方法用於分離能夠特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基絲胺酸396({p}S396)的單株抗體得以例證。該等抗體被進一步表徵為它們在磷酸化殘基絲胺酸396和絲胺酸404(pS404)之間區分的能力，使得它們不結合至具有磷酸化絲胺酸404的τ蛋白，除非τ蛋白在殘基396處也被磷酸化。
已經藉由使用新穎方法產生並分離本發明的抗體、或其表位結合片段(圖9)，該方法有利於選擇{p}S396特異性抗體(圖9)。此外，藉由應用這種非常嚴格的抗體殖株選擇程式，已經獲得不僅對S396具有高度特異性而且對磷酸化{p}S396表位具有高度選擇性的抗體。該等抗體唯一性地識別來自阿茲海默症腦的τ蛋白。我們還證實，概述於圖9中的篩選程式確保對具有功能性和治療性效用的抗體的鑒定。
針對覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-408的雙磷酸化肽：TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)產生抗體(實例1)。用該磷酸化肽免疫小鼠。一旦已經獲得足夠的抗體滴度，則處死該等小鼠並產生融合瘤(實例2)。使用斑點印跡(實例3)以及MSD ELISA篩選該等融合瘤，該ELISA中使用固定的人類病理性和非病理性τ蛋白(實例4)。在斑點印跡和西方墨點法中，在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分的能力用於選擇融合瘤。選擇16個殖株，回收其中的四個融合瘤殖株，這四個融合瘤殖株產生展現出結合至人類病理性τ蛋白材料的非凡能力的抗體。
還藉由從患病和未患病人類AD腦中分離τ蛋白，並且將此材料固定在MSD ELISA板上來確定與病理性和非病理性τ蛋白的特異性結合(實例4)。
本發明的另外一方面涉及針對雙磷酸化肽引發的單株抗體或其表位結合片段，該雙磷酸化肽包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)內的至少18個例如至少20個連續胺基酸殘基。在本發明的這個方面，該單株抗體或其表位結合片段典型地是針對雙磷酸化肽引發，該雙磷酸化肽包含含有覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)的18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基。
本發明的另外一方面係針對本發明的單株抗體或其表位結合片段，具有超過年齡匹配健康對照的、對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有超 過來自年齡匹配健康對照的τ蛋白的、對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用如在此所述的磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)。
本發明的一個相關方面係針對本發明的單株抗體或其表位結合片段，具有對於AD患病τ蛋白的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有超過年齡匹配健康對照的、對於AD的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用磷酸化-和多聚體-特異性設置1ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)。
設置1 ELISA方法包括步驟：A)使用C10-2包被的板，捕獲來自AD腦的病理性人類τ抗原；B)培養τ抗原與漸增濃度的pS396特異性抗體；以及C)使用來自MSD的硫標記的抗人類(總)τ蛋白抗體，檢測該τ抗原捕獲和抗體介導的抑制。
本發明進一步涉及藉由用於產生高特異性、高親和力抗體的方法而產生的抗體，該等高特異性、高親和力抗體對於包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白具有免疫特異性，其中所述方法包括以下步驟：(A)將免疫原注入哺乳動物中，由此免疫所述哺乳動物，所述免疫原包含雙磷酸化肽，該雙磷酸化肽包含含有覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410 的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)的18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基；(B)將對所述哺乳動物的所述免疫重複進行兩次或更多次；(C)針對高特異性、高親和力抗體的存在對來自所述經重複免疫的哺乳動物的血清樣品進行篩選，該等高特異性、高親和力抗體能夠結合包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白、但係基本上很少能夠結合非病原性τ蛋白；並且(D)回收所述高特異性、高親和力抗體。
更確切地說，步驟A包括：用典型地為在包被緩衝液中0.5μg/ml(捕獲抗體)的C10-2抗體包被MSD板(典型地在4℃過夜)，封閉(典型地在室溫1小時)，並且洗滌(典型地3次)。步驟B包括：將來自AD(從3名患者聚集)的P3裂解物的樣品(典型地1：1000=2-4g/ml總蛋白)和/或S1(p)(典型地1：300=20-40ng/ml總蛋白)與成梯度濃度的pS396肽表位特異性抗體進行混合，並且培養(典型在室溫下1小時)。隨後將該等反應物在步驟A中製備的板上培養2小時。步驟C包括使用硫標記的人類τ蛋白檢測C10-2捕獲的τ蛋白。來自MSD的τ蛋白抗體(典型地1：50)遵循廠商說明書。將板在MSD SECTOR® S600上進行分析。以類似設置測試AD P3和AD S1(p)。
另外一個實施方式涉及抗體或其抗原結合片段，其能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396，已經在一細胞系中產生或製造，該細胞系例如係人類細胞系、哺乳動物非人類細胞系、昆蟲細胞系、酵母細胞系或細菌細胞系。
該抗體或其抗原結合片段能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID No：33)的磷酸化殘基396，產生於CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11的細胞系、CAP細胞系和HuH-7人類細胞系中。
D1.2和C10-2特異性親和力和結合特性已經使用在位置396或404處磷酸化或非磷酸化的τ 386-410(2R4N)肽進行表徵(SEQ ID NO：29-32)。使用本申請中概述的特定免疫和篩選方案(圖9)將產生高度磷酸化絲胺酸-396(pS396)特異性抗體，如圖4中證明的。
為了證明該等抗體對於病理性τ蛋白具有特異性，已經藉由免疫組織化學分析對D1.2和C10-2抗體進行表徵(實例6)。該等抗體展現出與阿茲海默症腦中的以及來自表現人類(P301L)突變體τ蛋白的Tg4510 τ蛋白轉基因小鼠的部分中的神經原纖維纏結的高度特異性結合(圖5)。沒有觀察到與來自人類對照腦和來自非轉基因小鼠腦的組織的結合，證明了該等抗體特異性地結合人類τ蛋白並且特別是與阿爾茨病理學相關聯的τ蛋白。
該等抗體識別與疾病病理性相關聯的τ蛋白的獨特能力係在此處的實例7中得以證實。我們在實例3中描述的測定中比較了病理性對比非病理性τ蛋白的結合。比較係與五種公開的τ蛋白抗體：hACI-2B6、IPN002、HJ8.5、2.10.3、和4E4的比較。圖6展示了參考抗體的每一個對於來自健康和患病腦的τ蛋白的結合，以及與分離自10月齡Tg4510 τ蛋白轉基因小鼠的P301L人類突變體τ蛋白的結合。這證明了分離的抗體展現出對於人類病理性τ蛋白的格外高程度的特異性和選擇 ，性。該選擇性優於如表5中所示的對比抗體中的任一個。
飽和時，結合抗體D1.2和C10-2展現出對於分離自人類AD腦的P3 τ蛋白大於100倍的選擇性。
為了證明所選擇的抗體具有功能性和治療性效用，在體外和細胞內τ-聚集測定中測試了抗體(實例8)。該等測定係功能測定，證實該等抗體能夠干擾τ蛋白的病理性聚集過程。將HEK293細胞暫態轉染人類τ-P301L-FLAG(4R0N)。隨後將細胞暴露於來自人AD腦或來自轉基因Tg4510腦的τ蛋白提取物。到病理性τ蛋白的這種暴露促進τ蛋白攝取入細胞和細胞內聚集。使用抗體D1.2和C10-2兩者對τ蛋白-製品的免疫耗減以及用該等抗體直接處理細胞能夠顯著減少τ蛋白聚集體的形成(圖7)。
抗體D1.2和C10-2的治療效用也已經在人類τ/PS1小鼠中被評價(實例9)。這種小鼠模型係更加與AD疾病相關的動物模型，其僅在生命後期(12-18月齡)產生AD病理學。然而，該等小鼠在實體纏結病理學的出現之前展現出τ蛋白過度磷酸化。慢性注射小鼠持續13週，每 週兩次，劑量為15mg/kg。抗體處理的小鼠展現出磷酸化τ蛋白的顯著減少，如圖9中證明的，指示用抗體D1.2和C10-2慢性處理將降低纏結病理學，並且由此降低隨後的體內神經變性。
本發明的抗體藉由免疫耗減方法特異性地去除來自rTg4510小鼠腦提取物的過度磷酸化τ蛋白。此外，本發明的抗體並不去除來自勻漿的正常τ蛋白，而可商購的τ 5抗體去除來自勻漿的正常τ蛋白。與結合至τ蛋白(其中磷酸化在殘基404處或在殘基404和396兩者處)的商業抗體相比，本發明的抗體特異性地去除95%的在絲胺酸396上磷酸化的過度磷酸化τ蛋白。實驗(實例12)證明本發明的抗體，儘管僅去除腦勻漿中的總τ蛋白的非常少的部分(8%)，但該等抗體特異性地去除過度磷酸化τ蛋白(以90%)。因此，本發明的一個方面係針對單株抗體或其表位結合片段，能夠免疫特異性地結合至病原性過度磷酸化τ蛋白。其此外，在其中使用本發明的抗體去除過度磷酸化τ蛋白的實驗中，接種活性被消除。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。已經提出接種的減少降低了纏結形成的發展以及τ蛋白病變(包括阿茲海默症)的進展。因此，本發明的另一個方面係針對本發明的抗體，用於在AD進展或AD症狀的降低中使用。
更確切地說，如上詳述，本發明涉及選自下組的四種單株抗體中的任一種，該組包括：
抗體D1.2
(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的輕鏈CDR2； (c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的重鏈CDR3。
該抗體或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：8的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：7的輕鏈可變結構域或由SEQ ID NO：8的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：7的輕鏈可變結構域組成。
在一個相關實施方式中，抗體D1.2或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：8的重鏈和/或SEQ ID NO：34的輕鏈或由SEQ ID NO：8的重鏈和/或SEQ ID NO：34的輕鏈組成。
抗體C10-2
(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3。
該抗體或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：15的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：16的輕鏈可變結構域或由SEQ ID NO：15的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：16的輕鏈可變結構域組成。
人源化C10-2抗體的重鏈的胺基酸序列示於SEQ ID NO：35中。人源化C10-2抗體的輕鏈的胺基酸序列示於SEQ ID NO：36中。
總之，該等實例示出包括C10-2的本發明的抗體有效地結合至AD-P3抗原包被的MSD板上。相比之下，商業抗體如PHF-13，具有低的結合活性。此外PHF-13證實了相比於本發明的抗體而言實質上更高程度的非特異性結合(參見表6A-表6D)。表6示出在C10-2包被的板中，Pτ抗原捕獲的mC10-2液相抑制係有效的(IC50=10-20nM)，而mD1.2係無效的(IC50=500-1000nM)。在mC10-2包被的板中，p-τ抗原捕獲的mC10-2液相抑制係有效的(其IC50=10-20nM)，而PHF-13係無效的(IC50=500-1000nM)。
本發明的一個方面係針對一種抗體，該抗體包含(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
本發明的另一個方面係針對一種抗體，該抗體包含(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1：(e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3。
本發明的另一個方面係針對一種抗體，該抗體包含(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1：(e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3以及以下項中的一個、兩個或三個(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1； (b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
抗體C5.2
(a)具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3。
該抗體或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：23的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：24的輕鏈可變結構域或由SEQ ID NO：23的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：24的輕鏈可變結構域組成。
如可以從圖10的晶體結構看出，表位跨C5.2的重鏈和輕鏈結合。因此，在相關實施方式中，本發明的該抗體或其表位結合片段包含(a)具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的輕鏈CDR1；或(b)具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈CDR2；或(c)具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3；以及(d)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；或(e)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；或(f)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3。
抗體C8.3
(a)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列的輕鏈CDR2(c)具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列的重鏈CDR3。
該抗體或其表位結合片段可以包含SEQ ID NO：31的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：32的輕鏈可變結構域或由SEQ ID NO：31的重鏈可變結構域和/或SEQ ID NO：32的輕鏈可變結構域組成。
該抗體或其表位結合片段較佳的是一種人類抗體或人源化抗體。
根據一個實施方式，以上所述的抗體及其表位結合片段可以進一步包括這種輕鏈和/或重鏈CDR1、CDR2或CDR3的變體(具有不多於4個胺基酸差異，或不多於3個胺基酸差異，或不多於2個胺基酸差異，或不多於1個胺基酸差異)。
如可以從圖11中所見，在至少一個實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3和LC CDR3對於結合至τ蛋白的392-398區域係重要的。在本發明的一個實施方式中，本發明的抗體或其表位結合片段包括：a)重鏈CDR1，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、和SEQ ID NO：28；b)重鏈CDR2，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21、和SEQ ID NO：29；以及 c)重鏈CDR3，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22、和SEQ ID NO：30；以及d)輕鏈CDR3，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19、和SEQ ID NO：27。
如本發明所述的抗體，或其表位結合片段可以包含a)包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；b)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；c)包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3；以及d)包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在本發明的一個方面中，本發明係針對一種抗體或其表位結合片段，它們形成疏水口袋，該疏水口袋係由L3：H3、L3：F8*、H1：H13、H2：Y1、H2：Y3與τ肽的Y394形成。在一個實施方式中，本發明係針對一種抗體，該抗體與在此進一步描述的抗體相競爭以在溶劑化的{p}S396與L3：T4、H1：R10、H1：T11、H3：R1、H3：T3之間形成氫鍵鍵合網路；(*)L3：F8係CDR L3的C末端側翼框架殘基(參見圖11)。
如可以從x-射線晶體結構所見，本發明的抗體以兩個水平的選擇性結合。第一水平的選擇性係針對過度磷酸化病理性τ蛋白的選擇性，並且第二水平的選擇性係針對磷酸化絲胺酸殘基的選擇性，其中所述磷酸化絲胺酸的磷酸鹽藉由氫鍵鍵合到酪胺酸殘基的側鏈上，該酪胺酸殘基距離所述磷酸化絲胺酸兩個殘基。因此，本發明的令人感興趣的方面係針對一種對過度磷酸化τ蛋白的包含磷酸化絲胺酸的胺基酸基序具有選擇性的抗體或其表位結合片段，該磷酸化絲胺酸距離酪胺酸殘基兩個殘基。 典型地，該胺基酸基序具有以下序列：Y-X-S(磷酸化)-P-
其中Y係酪胺酸，X係天然存在的胺基酸，P係脯胺酸，並且S(磷酸化)係具有磷酸化羥基側鏈的絲胺酸。
類似地，本發明的令人感興趣的一個方面係針對一種抗體或其表位結合片段，其結合至磷酸化τ蛋白、較佳的是至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IA具有選擇性，其中R係天然存在的胺基酸的側鏈。
不受具體理論的束縛，認為當胺基酸基序IA處於病理性τ蛋白採用的構象中時，本發明的抗體對於所述基序具有選擇性。因此，胺基酸基序IA典型地是由本發明的抗體選擇性地識別。因此，本發明的令人感興趣的一個方面係針對一種抗體或其表位結合片段，其結合至磷酸化τ蛋白、較佳的是至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IB具有選擇性，其中R係天然存在的胺基酸的側鏈。
在本發明的此方面的一個典型實施方式中，本發明係針對一 種抗體或其表位結合片段，其結合至磷酸化τ蛋白、較佳的是至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IB具有選擇性，其中R係天然存在的胺基酸的側鏈，但不限於IC或ID。
本發明還提供了降低患者中τ蛋白纏結形成之方法，該方法包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的本發明的抗體或其表位結合片段。
本發明的一個方面係針對使用本發明的抗體或其表位結合片段治療τ蛋白病變之方法。典型地該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克症；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經原纖維纏結為主型老年失智(Neurofibrlllary tangle-predominant senile dementia)；拳擊手型失智症；慢性創傷性腦病變；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-失智複合症)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓氏症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病 (Haliervorden-Spatz disease)以及脂褐質症。更典型地，該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；以及匹克症。具體地，該τ蛋白病變可以選自阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀。
因此，本發明的另一個方面係針對本發明的抗體或其表位結合片段，用於在治療τ蛋白病變中使用。典型地該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克症；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經原纖維纏結為主型老年失智；拳擊手型失智症；慢性創傷性腦病變；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease)(關島型帕金森病-失智複合症)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓氏症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐質症。更典型地，該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神 病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；以及匹克症。具體地，該τ蛋白病變可以選自阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀。
本發明的另一個方面係針對在組成物中的本發明的抗體或其表位結合片段，連同藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑和/或穩定劑。本發明的抗體或其表位結合片段可以在用於治療τ蛋白病變的療法中使用。典型地該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克症；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經原纖維纏結為主型老年失智；拳擊手型失智症；慢性創傷性腦病變；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-失智複合症)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓氏症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐質症。更典型地，該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)； 皮質基底節變性(CBD)；以及匹克症。具體地，該τ蛋白病變可以選自阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀。
設想的藉由本發明的治療可以是慢性的，並且可以對該患者治療至少2週，例如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
本發明的該等抗體可以例如是藉由融合瘤方法產生的單株抗體，該融合瘤方法首次描述於科勒(Koh1er)等人，自然(Nature)256，495(1975)，或可以是藉由重組DNA或其他方法產生的單株抗體，或更較佳的是可以藉由在此揭露的新穎方法產生(圖9)。還可以使用例如，在克拉克森(Clackson)等人(自然(Nature)352：624-628，1991)和馬克思(Marks)等人分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)222：581-597,(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫分離單株抗體。單株抗體可以獲得自任何適合的來源。因此，例如，單株抗體可以獲得自從鼠類脾臟B淋巴細胞(獲得自用感興趣抗原免疫的小鼠)製備的融合瘤，該感興趣抗原例如處於以下形式：在表面上表現抗原的細胞、或者編碼感興趣抗原的核酸。單株抗體還可以獲得自融合瘤，該融合瘤衍生自經免疫的人類的抗體表現細胞，或者來自非人類哺乳動物例如大鼠、兔、狗、綿羊、山羊、靈長類動物等。
在一個實施方式中，本發明的抗體係人源化抗體。可以使用攜帶部分人免疫系統而不是小鼠免疫系統的轉基因或轉染色體小鼠產生針對τ蛋白的人源化單株抗體。此類轉基因和轉染色體小鼠包括分別在本文中稱為HuMAb(人源化單株抗體)小鼠和KM小鼠的小鼠，並且在本文中統稱為“轉基因小鼠”。
HuMAb小鼠包含人類免疫球蛋白基因迷你座位(mini-locus)，該迷你座位編碼未重排的人類重鏈可變和恒定(μ和Y)以及輕鏈可變和恒定(κ)鏈免疫球蛋白序列，連同靶向的突變，所述突變使內源性μ和K鏈座位失活(蘭博爾格(Lonberg)，N.等人，自然(Nature)368，856-859(1994))。因此，該等小鼠展示出小鼠IgM或κ的表現減少，並且響應於免疫，所引入的人類重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人類IgG、κ單株抗體(蘭博爾格(Lonberg)，N等人(1994)，同上；評論於蘭博爾格，N.，實驗藥物學手冊(Handbook of Experimental Pharmacology)113：49-101(1994)中；蘭博爾格,．N.和胡薩爾(Huszar)，D.)，國際免疫學評論(Intern.Rev.Immunol.)13：65-93(1995)，以及哈丁(Harding)，F.和蘭博爾格，N.，紐約科學院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)764：536-546(1995))。HuMAb小鼠的製備詳細描述於泰勒(Taylor)，L.等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)20，6287-6295(1992)，陳(Chen)，J.等人，國際免疫學(International Immunology)5，647-656(1993)，蒂阿永(Tuaillon)等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)152，2912-2920(1994)，泰勒(Taylor)，L.等人，國際免疫學(International Immunology)6，579-591(1994)，費雪維爾德(Fishwild)，D.等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)。還參見US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918和WO 01/09187。
HCo7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在它們的內源性輕鏈 (κ)基因中具有JKD破壞(如在陳(Chen)等人，EMBO J.12，811-820(1993)中所述)、在它們的內源性重鏈基因中的CMD破壞(如在WO01/14424的實例1中所述)、以及KCo5人類κ輕鏈轉基因(如在費雪維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中所述)。此外，該等HCo7小鼠具有HCo7人類重鏈轉基因(如US 5,770,429中所述)，該HCo12小鼠具有HCo12人類重鏈轉基因(如WO 01/14424的實例2中所述)，該HCo17小鼠具有HCo17人類重鏈轉基因(如WO 01/09187的實例2中所述)，並且HCo20小鼠具有HCo20人類重鏈轉基因。所得小鼠在內源性小鼠重鏈和κ輕鏈座位破壞的純合背景中表現人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉基因。
在KM小鼠品系中，內源性小鼠κ輕鏈基因已經純合地破壞，如在陳(Chen)等人EMBO J.12：811-820(1993)中所述，並且內源性小鼠重鏈基因已經純合地破壞，如在WO 01/09187的實例1中所述。該小鼠品系攜帶如在費雪維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中所述的人類κ輕鏈轉基因KCo5。該小鼠品系還攜帶由染色體14片段hCF(SC20)構成的人類重鏈轉染色體，如在WO 02/43478中所述。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以藉由將HCo12、HCo17和HCo20與KCo5[J/K](Balb)雜交來產生，如在WO 09/097006中所述。
rTg4510小鼠係已知的τ蛋白病變模型，提供了突變體τ蛋白轉基因表現上的時空控制。在KM小鼠品系中，內源性小鼠κ輕鏈基因已經純合地破壞，如在陳(Chen)等人EMBO J.12，811-820(1993)中所 述，並且內源性小鼠重鏈基因已經純合地破壞，如在WO 01/09187的實例1中所述。該小鼠品系攜帶如在費雪維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中所述的人類κ輕鏈轉基因KCo5。該小鼠品系還攜帶由染色體14表位結合片段hCF(SC20)構成的人類重鏈轉染色體，如在WO 02/43478中所述。
來自該等轉基因小鼠的脾細胞可以用於根據熟知技術產生分泌人源化單株抗體的融合瘤。本發明的人源化單殖株或多株抗體、源自其他物種的本發明的抗體還可以藉由以下方式轉基因地產生：產生對於感興趣的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列而言是轉基因的另一種非人類哺乳動物或植物，並且以從中可回收的形式產生抗體。結合哺乳動物中轉基因生產，抗體可以中山羊、母牛或其他哺乳動物的乳中產生並且從其回收。參見例如US 5,827,690；US 5,756,687；US 5,750,172和US 5,741,957。
本發明的抗體可以具有任何同種型。同種型的選擇典型地將由所希望的效應子功能(如ADCC誘導)引導。示例性同種型係IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4。可以使用人類輕鏈恒定結構域的任一個，κ或λ。如果希望的話，本發明的抗τ蛋白抗體的類別可以藉由已知的方法轉換。例如，最初是IgM的本發明的抗體可以經類別轉換變為本發明的IgG抗體。此外，類別轉換技術可以用於將一種IgG亞類轉變為另一種，例如從IgG1變為IgG2。因此，本發明的抗體的效應子功能可以藉由同種型轉換改變為例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM抗體，以用於各種治療用途。在一個實施方式中，本發明的抗體係IgG1抗體，例如IgG1、κ。如果相對於其他同種型而言，抗體的胺基酸序列與同種型最具有同源性，則 認為該抗體具有這種特定同種型。
在一個實施方式中，本發明的抗體係全長抗體，較佳的是IgG抗體，特別是IgG1、κ抗體。在另一個實施方式中，本發明的抗體係抗體表位結合片段或單鏈抗體。
抗體及其表位結合片段可以例如藉由使用常規技術的表位結合片段化獲得，並且以與在此對完整抗體所述的相同方式針對效用篩選表位結合片段。例如，F(ab')2表位結合片段可以藉由用胃蛋白酶處理抗體產生。可以處理所得F(ab')2表位結合片段以減少二硫橋，以產生Fab'表位結合片段。Fab表位結合片段可以藉由用木瓜蛋白酶處理IgG抗體獲得；Fab'表位結合片段可以用胃蛋白酶消化IgG抗體獲得。F(ab')表位結合片段還可以藉由經由硫醚鍵或二硫鍵結合以下描述的Fab'來產生。Fab'表位結合片段係藉由切割F(ab')2的鉸鏈結構域的二硫鍵獲得的抗體表位結合片段。Fab'-表位結合片段可以藉由用還原劑如二硫蘇糖醇處理F(ab')2表位結合片段獲得。抗體表位結合片段還可以藉由在重組細胞中表現編碼此類表位結合片段的核酸產生(參見例如埃文斯(Evans)等人，免疫學方法雜誌(J.Immunol.Meth.)184，123-38(1995))。例如，編碼F(ab')2表位結合片段一部分的嵌合基因可以包括編碼CH1結構域和H鏈的鉸鏈結構域的DNA序列，隨後為翻譯終止密碼子，以產生這樣一種截短的抗體表位結合片段分子。
在一個實施方式中，抗τ蛋白抗體係單價抗體，較佳的是如在WO 2007059782中所述的具有鉸鏈區缺失的單價抗體(將其藉由引用以其全文結合在此)。因此，在一個實施方式中，該抗體係單價抗體，其中所述抗τ蛋白抗體係藉由以下方法構建，該方法包括：i)提供一核酸構建 體，該核酸構建體編碼所述單價抗體的輕鏈，所述構建體包括對所選抗原特異性抗τ蛋白抗體的VL區進行編碼的核苷酸序列以及對Ig的恒定CL區進行編碼的核苷酸序列，其中所述對所選抗原特異性抗體的VL區進行編碼的核苷酸序列以及所述對Ig的CL區進行編碼的核苷酸序列可操作地連接在一起，並且其中，在IgG1同功型的情況下，編碼CL區的核苷酸序列已經被修飾為使得該CL區不包含任何能夠在多殖株人類IgG的存在下或當給予至動物或人類時與其他肽(包含CL區的相同胺基酸序列)形成二硫鍵或共價鍵的胺基酸；ii)提供一核酸構建體，該核酸構建體編碼所述單價抗體的重鏈，所述構建體包括對所選抗原特異性抗體的VH區進行編碼的核苷酸序列以及對人類Ig的恒定CH區進行編碼的核苷酸序列，其中這種對CH區進行編碼的核苷酸序列已經被修飾為使得對應於鉸鏈區的區域以及CH區的如Ig同功型所需要的其他區(例如CH3區)不包含任何參與在多殖株人類IgG的存在下或當給予至動物人類時與其他肽(包含人類Ig的CH區的相同胺基酸序列)形成二硫鍵或共價鍵或穩定非共價重鏈間鍵的胺基酸殘基，其中所述對所選抗原特異性抗體的VH區進行編碼的核苷酸序列以及所述對所述Ig的CH區進行編碼的核苷酸序列可操作地連接在一起；iii)提供一用於產生所述單價抗體的細胞表現系統；iv)藉由在(iii)的細胞表現系統的細胞中共表現具有(i)和(ii)的核酸構建體產生所述單價抗體。
類似地，在一個實施方式中，本發明的抗τ蛋白抗體係單價抗體，其包含：(i)如在此所述的本發明的抗體的可變結構域，或者所述結構域的表位結合部分，以及 (ii)免疫球蛋白的CH結構域或其包含CH2和CH3結構域的結構域，其中該CH結構域或其結構域已經被修飾為使得對應於鉸鏈結構域的結構域以及CH結構域的其他結構域(如果免疫球蛋白不是IgG4同功型)(例如CH3結構域)不包含任何能夠在多殖株人類IgG的存在下與相同CH結構域或者具有相同CH結構域的其他共價鍵或穩定非共價重鏈間鍵形成二硫鍵的胺基酸殘基。
在另外的實施方式中，本發明的單價抗體的重鏈已經被修飾為使得整個鉸鏈區已缺失。
在另一個另外的實施方式中，單價抗體的序列已經被修飾為使得它不包含任何用於N-連接的糖基化的受體位點。
本發明還包括“雙特異性抗體”，其中抗τ蛋白結合區(例如抗τ蛋白單株抗體的τ蛋白-結合區)係靶向多於一個表位(例如第二表位可以包括活性運輸受體的表位，使得雙特異性抗體可以展現出改進的跨生物障壁例如血腦障壁的轉胞吞作用)的二價或多價雙特異性支架的部分。因此，在另一個另外的實施方式中，抗τ蛋白抗體的單價Fab可以連接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv上，以產生雙特異性抗體。雙特異性抗體可以具有雙重功能，例如由抗τ蛋白結合結構域賦予的治療功能，以及可以結合至受體分子以增強跨生物障壁如血腦障壁的轉移的運輸功能。
本發明的抗體及其表位結合片段還包括單鏈抗體。單鏈抗體係其中重鏈和輕鏈Fv結構域連接的肽。在一個實施方式中，本發明提供了單鏈Fv(scFv)，其中在本發明的抗τ蛋白抗體的Fv中的重鏈和輕鏈與柔 性肽接頭(典型地具有約10、12、15或更多個胺基酸殘基)連接在單一肽鏈中。產生此類抗體的方法描述於例如US 4,946,778中，普呂克通(Pluckthun)單株抗體藥理學，第113卷，羅森堡(Rosenburg)和莫耳(Moore)編輯，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，紐約(New York)，第269-315頁(1994)，博爾德(Bird)等人，科學(Science)242，423-426(1988)，休斯頓(Huston)等人，美國國家科學院院刊(PNAS USA)85，5879-5883(1988)以及麥卡菲蒂(McCafferty)等人，自然(Nature)348，552-554(1990)。如果僅使用單一VH和VL，該單鏈抗體可以是單價的，如果使用兩個VH和VL則是雙價的，或者如果使用多於兩個VH和VL則是多價的。
在此描述的抗體及其表位結合片段可以藉由包含任何適合數目的修飾胺基酸和/或與此類綴合取代基的關聯來修飾。在該背景中的適合性通常是藉由至少基本上保留與未衍生化的親本抗τ蛋白抗體關聯的τ蛋白選擇性和/或τ蛋白特異性的能力來確定。該一個或多個修飾胺基酸的包含在以下方面可以是有利的，例如，增加多肽血清半衰期，降低多肽抗原性，或增加多肽貯存穩定性。對一種或多種胺基酸進行修飾，例如，在重組產生的過程中與翻譯同時進行或在翻譯之後進行(例如，在哺乳動物細胞中表現過程中在N-X-S/T基序上的N-連接的糖基化作用)，或藉由合成手段進行修飾。經修飾的胺基酸的非限制性實例包括：糖基化的胺基酸、硫酸化的胺基酸、異戊二烯化(例如，法尼基化(farnesylated)、香葉基-香葉基化(geranyl-geranylated))的胺基酸、乙醯化的胺基酸、醯化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、羧基化的胺基酸、磷酸化的胺基酸、以及類似胺基酸。足夠指導熟習該項技術者進行胺基酸修飾的參 考在文獻中相當充分。實例方案可見於沃克(Walker)(1998)關於CD-ROM的蛋白質方案(Protein Protocols on CD-ROM)胡瑪納出版社(Humana Press)，托瓦塔(Towata)，NJ。該經修飾的胺基酸可例如選自：糖基化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、法尼基化的胺基酸、乙醯化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、偶聯到脂類部分上的胺基酸、或偶聯到有機衍化劑上的胺基酸。
本發明的抗體及其表位結合片段還可以藉由共價綴合到聚合物上進行化學修飾，以例如增加它們的循環半衰期。示例性聚合物和將其附接至肽的方法展示於例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546。另外的說明性聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，具有在約1,000與約40,000之間，例如在約2,000與約20,000之間，例如約3,000-12,000g/mol的分子量的PEG)。
本發明的抗體及其表位結合片段可以進一步用於診斷方法中或用作診斷成像配位基。
在一個實施方式中，提供了包含一種或多種放射性標記的胺基酸的本發明的抗體及其表位結合片段。經放射性標記的抗τ蛋白抗體可以用於診斷和治療目的兩者(綴合至經放射性標記的分子係另一種可能的特徵)。此類標記的非限制性實例包括但不限於：鉍(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co、60Co)、銅(64Cu)、鏑(165Dy)、銀(169Er)、氟(18F)、釓(153Gd、159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge)、金(198Au)、鈥(166Ho)、氫(3H)、銦(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、125I、131I)、銥(192Ir)、鐵(59Fe)、氪(81mKr)、鑭(140La)、鑥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鉀(42K)、鐠(142pr)、鉕(149Pm)、 錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、銣(81Rb、82Rb)、釕(82Ru、97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鈉(24Na)、鍶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、鍀(99Tc)、鉈(201Tl)、錫(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb、177Yb)、釔(90Y)、鋅(65Zn)以及鋯(89Zr)。鋯(89Zr)係特別感興趣的。用於製備放射性標記的胺基酸和相關肽衍生物的方法在本領域中是已知的(參見例如榮漢斯(Junghans)等人，癌症化學療法和生物療法(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)655-686(第2版，查範納和隆哥編(Chafner and Longo，eds.)，Lippincott Raven(1996))，以及US 4,681,581；US 4,735,210；US 5,101,827；US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471以及US 5,697,902。例如，放射性同位素可以藉由氯胺T方法綴合(林德葛籣(Lindegren)，S.等人(1998)“在使用N-琥珀醯亞胺-3-(三甲基甲錫烷基)苯甲酸酯作為中間體對抗體進行高特異活性放射性碘化中的氯胺-T”(“Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate”)，核酸醫學生物學(Nucl.Med.Biol.)25(7)：659-665；庫爾特(Kurth)，M.等人(1993)“放射性碘化的苯乙胺衍生物與單株抗體的位點特異性綴合導致腫瘤中增加的放射活性定位”(“Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Anribody Results In Inereased Radioactivity Localization In Tumor”)，醫學化學雜誌(J.Med.Chem.)36(9)：1255-1261；雷亞(Rea)，D.W.等人(1990)“用於靶向腫瘤的位點特異性放射性碘化的抗體”(“Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors”)，癌症研究(Cancer Res.)50(3增刊)：857s-861s)。
本發明還提供了抗τ蛋白抗體及其表位結合片段，使用以下項將將它們可檢測地進行標記：螢光標記(例如稀土螯合物(例如銪螯合物))、螢光素型標記(例如螢光素、異硫氰酸螢光素、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素、二氯三基胺螢光素)、羅丹明(rhodamine)型標記(例如亞曆克薩螢光染料® 568(英傑公司)、塔姆拉®或丹磺醯氯)、VIVOTAG 680 X1螢光色素TM(珀金埃爾默)、藻紅蛋白；傘形酮、麗絲胺(Lissamine)；花菁；藻紅蛋白、德克薩斯紅、BODIPY FL-SE®(英傑公司(Invitrogen))或其類似物，所有該等都適合用於光學檢測。可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素、以及水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶聯至可檢測物質或輔基複合物來完成，該等可檢測物質包括但不限於：各種酶、包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶的酶，該等輔基複合物例如但不限於鏈黴親和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。
可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素、以及水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶聯至可檢測物質或輔基複合物來完成，該等可檢測物質包括但不限於：各種酶、包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶的酶，該等輔基複合物例如但不限於鏈黴親和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。還可以採用順磁性標記，並且較佳的是使用正電子發射斷層掃描攝影術(PET)或單光子發射型電腦斷層掃描攝影術(SPECT)來檢測。此類順磁性標記包括但不限於包含以下項的順磁離子的化合物：鋁(Al)、鋇(Ba)、鈣(Ca)、鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥 (Ho)、銥(Ir)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(M)、釹(Nd)、鋨(Os)、氧(O)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、銠(Rh)、釕(Ru)、釤(Sm)、鈉(Na)、鍶(Sr)、鋱(Tb)、銩(Tm)、錫(Sn)、鈦(Ti)、鎢(W)、以及鋯(Zi)，並且特別是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+3、和V+4，正電子發射金屬(使用各種正電子發射斷層掃描攝影術)，以及非放射性順磁金屬離子。
因此，在一個實施方式中，本發明的抗τ蛋白抗體或其τ蛋白-結合片段可以用螢光標記、化學發光標記、順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記來標記。標記的抗體或片段可以用於檢測或測量所述τ蛋白在受試者腦中的存在。這種方法可以包括檢測或測量結合到所述τ蛋白上的抗τ蛋白抗體或τ蛋白結合片段的體內成像，並且可以包括對結合到這種τ蛋白上的所述抗τ蛋白抗體或τ蛋白結合片段的離體成像。
在一個另外的方面，本發明涉及編碼本發明的抗體或其τ蛋白結合片段的一種或多種多肽鏈的表現載體。此類表現載體可以用於重組產生本發明的抗體或其表位結合片段。
在本發明的背景中的表現載體可以是任何適合的DNA或RNA載體，包括染色體、非染色體、以及合成的核酸載體(包含一組適合的表現控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、杆狀病毒、酵母質粒、衍生自質粒和噬菌體DNA的組合的載體、以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施方式中，編碼抗τ蛋白抗體的核酸被包含在包含例如直鏈表現元件的裸DNA或RNA載體(如例如賽克斯(Sykes)和約翰斯頓(Johnston)，自然生物技術(Nat Biotech) 12，355-59(1997)中所述)，壓縮核酸載體(如例如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述)，質粒載體如pBR322、pUC 19/18、或pUC 118/119，“midge”最小大小的核酸載體(如例如沙科夫斯基(Schakowski)等人，分子理論(MoI Ther)3，793-800(2001)中所述)中，或作為沈澱核酸載體構建體，如CaPO4-沈澱構建體(如例如WO 00/46147，本維尼斯特(Benvenisty)和雷瑟夫(Reshef)，PNAS USA 83，9551-55(1986)，魏格勒(Wigler)等人，細胞(Cell)14，725(1978)，以及柯拉羅(Coraro)和皮爾森(Pearson)，體細胞遺傳學(Somatic Cell Genetics)2，603(1981)中所述)。這種核酸載體及其使用在本領域中是熟知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一個實施方式中，該載體適合用於在細菌細胞中表現本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段。此類載體的實例包括表現載體，例如BlueScript(Stratagene)、pIN載體(范黑克(Van Heeke)&舒斯特(Schuster)，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)264，5503-5509(1989)，pET載體(諾沃根(Novagen)，麥迪森(Madison)，WI)。
表現載體還可以是或可替代地是適合用於在酵母系統中表現的載體。可使用任何適用於在酵母系統中進行表現的載體。適合的載體包括例如包含組成型或誘導型啟動子(例如α因數、醇氧化酶和PGH)的載體(綜述於：F.奧蘇貝爾(Ausubel)等人編，分子生物學中的當前工具(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版和威利跨學科(Greene Publishing and Wiley InterScience)紐約(New York)(1987)，格朗(Grant)等人，酶學方法(Methods in Enzymol)153，516-544(1987)，馬塔諾維赫(Mattanovich)，D.等人，分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)824，329-358 (2012)，切利克(Celik)，E.等人，生物技術進展(Biotechnol.Adv.)30(5)，1108-1118(2012)，李(Li)，P.等人，應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)142(2)，105-124(2007)，布林(Böer)，E.等人，應用微生物學與生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)77(3)，513-523(2007)，範德法特(van der Vaatrt)，J.M.分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)178，359-366(2002)，以及霍利格(Holliger)，P.分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)178，349-357(2002))。
在本發明的表現載體中，編碼抗τ蛋白抗體的核酸可以包括任何適合的啟動子、增強子、以及其他表現輔助元件或與其相關聯。此類元件的實例包括強表現啟動子(例如，人類CMV IE啟動子/增強子連同RSV、SV40、SL3-3、MMTV、以及HIV LTR啟動子)，有效聚(A)終止序列，用於大腸桿菌中的質粒產物的複製起點，作為選擇性標記的抗生素抗性基因，和/或便利的殖株位點(例如，多聚接頭)。核酸還可以包括與組成型啟動子如CMV IE相反的誘導型啟動子(熟習該項技術者將認識到此類術語實際上是在某些條件下基因表現程度的描述語)。
在一個甚至另外的方面，本發明涉及重組真核或原核宿主細胞，如轉染瘤，其產生如在此定義的本發明的抗體或其表位結合片段或者如在此定義的本發明的雙特異性分子。宿主細胞的實例包括酵母、細菌、和哺乳動物細胞，例如CHO或HEK細胞。例如，在一個實施方式中，本發明提供了一種細胞，該細胞包含穩定地整合到細胞基因組中的核酸，該核酸包含編碼用於表現本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的序列。在另一個實施方式中，本發明提供了一種細胞，該細胞包含一種非整合的 核酸，如質粒、粘粒(cosmid)、噬菌粒、或線性表現元件，該非整合的核酸包含編碼用於表現本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的序列。
在一個另外的方面，本發明涉及用於產生抗τ蛋白抗體之方法，所述方法包括以下步驟：a)培養融合瘤或如以上定義的本發明的宿主細胞，並且b)從培養基純化本發明的抗體。
在一個實施方式中，本發明涉及一製品，在這種術語在此使用時，該製品包含如在此定義的抗τ蛋白抗體，並且基本上不含天然產生的不能結合至τ蛋白或者不實質性地改變該製品的抗τ蛋白功能的抗體。因此，這種製品不包含天然產生的血清、或這種血清的純化衍生物，該血清或其純化衍生物包含抗τ蛋白抗體與另一種不改變該製品的抗τ蛋白抗體的功能的抗體的混合物，其中這種功能係：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述與經免疫耗減的來自轉基因小鼠的rTg4510提取 物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%，或者當如在此所述與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，特異性地將S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶減少至少90%，同時沒有將非過度磷酸化τ蛋白條帶減少多於10%。
本發明具體涉及這樣一種抗τ蛋白抗體的製品，該抗體在胺基酸序列方面(在其CDR、可變結構域、框架殘基和/或恒定結構域中的任一個中)相對於天然存在的抗τ蛋白抗體的結構而言具有結構變化，其中相對於由所述天然存在的抗τ蛋白抗體展現出的功能而言，所述結構變化引起抗τ蛋白抗體展現出顯著改變的功能(即在功能方面多於20%的差異，多於40%的差異，多於60%的差異，多於80%的差異，多於100%的差異，多於150%的差異，多於2-倍的差異，多於4-倍的差異，多於5-倍的差異，或多於10-倍的差異)；其中這種功能係：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分； 和/或(viii)當如在此所述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%；或者當如在此所描述的與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，其特異性地以至少90%減少S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶、同時以不多於10%減少非過度磷酸化τ蛋白條帶的能力。
術語“基本不含”天然產生的抗體係指在此類製品中完全不存在此類天然產生的抗體，或者在此類製品中包含不會實質性影響該等製品的τ蛋白結合特性的一個濃度的此類天然產生的抗體。如果抗體不具有天然產生的對應物或已經從天然伴隨該抗體的組分中分離或純化，則認為該抗體係“分離的”。
術語“天然產生的抗體”，在它涉及此類製品時，係指在活人或其他動物內引發的抗體(包括天然產生的自身抗體)，作為對活人或其他動物的免疫系統發揮作用的自然結果。
因此，本發明的製品不排除並且事實上明確涵蓋此類包含抗τ蛋白抗體和有意添加的能夠結合至未由τ蛋白擁有的表位上的另外抗體的製品。此類製品特別包括其實施方式，其中該製品在治療阿茲海默症(AD)、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、和皮質基底節變性(CBD)中展現出增強的功效。此外，本發明係針對包含抗τ蛋白抗體、或其表位結合片段的製品，旨在用於治療精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有雷維體失智症的患者的精神 病症狀。此外，本發明的製品包含抗τ蛋白抗體或其表位結合片段，其可以用於治療中風、中風恢復、與帕金森病相關的神經變性。
在一個甚至另外的方面，本發明涉及醫藥組成物，該醫藥組成物包括：(i)均在此定義的τ蛋白抗體、或其表位結合片段，或包含這種抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的製品(在這種術語在此定義時)；以及(ii)藥學上可接受的載體。
該等醫藥組成物可以用藥學上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑和賦形劑根據常規技術配製，該等常規技術係例如在以下中揭露的技術：雷明頓：藥學科學與實踐(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第22版，Gennaro(熱納羅)編，Mack Publishing Co.(馬克出版公司)，伊斯頓，賓夕法尼亞，2013。
藥學上可接受的載體或稀釋劑連同任何其他已知的佐劑和賦形劑應該適合用於本發明的所選化合物和所選給藥模式。對於載體和醫藥組成物的其他組分的適合性係基於對本發明的所選化合物或醫藥組成物的關於表位結合的期望生物學特性缺乏顯著負面影響(例如少於實質性影響(10%或更低的相對抑制，5%或更低的相對抑制，等))而確定的。
本發明的醫藥組成物還可以包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、洗滌劑(例如，非離子型洗滌劑(如吐溫-20或吐溫-80)、穩定劑(例如，無糖或無蛋白胺基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑、和/或其他適合用於包含於醫藥組成物中的材料。以不影響組成物的生物活性為目的來選擇稀釋劑。此類稀釋劑的實例為蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶 液、右旋糖溶液和漢克氏溶液(Hank’s solution)。此外，該醫藥組成物或製劑還可以包括其他載體，或無毒的、非治療性的、非免疫原性的穩定劑等。該等組成物還可以包括大的緩慢代謝的大分子，例如蛋白質、多糖(例如殼聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸以及共聚物(例如，乳膠官能化瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、以及類似物))、聚胺基酸、胺基酸共聚物、以及脂質聚集體(例如，油滴或脂質體)。
本發明醫藥組成物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得對於具體的患者、組成物和給藥模式而言能有效實現期望治療反應的活性成分量。選擇的劑量水平將取決於多種藥代動力學因素，包括所採用的本發明具體組成物或其醯胺的活性，給藥路徑，給藥時間，所採用具體化合物的***速率，治療的持續時間，與所採用的具體組成物組合應用的其他藥物、化合物和或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史，以及醫學領域公知的類似因素。
該醫藥組成物可以藉由任何適合途徑和模式給予，包括：用於預防性和/或治療性治療的腸胃外、局部、口服或鼻內手段。在一個實施方式中，本發明的醫藥組成物係腸胃外給予。如在此使用的短語“腸胃外給藥”和“腸胃外給予”意指除了腸道和局部給藥之外的給藥模式，通常藉由注射進行，並且包括：表皮、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、腱內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊髓內、顱內、胸內、硬膜外和胸骨內(intrasternal)注射和輸注。
在體內和體外給予本發明的化合物的另外的適合途徑係本 領域中熟知的，並且可以由熟習該項技術者選擇。
在一個實施方式中，該醫藥組成物係藉由靜脈內或皮下注射或輸注來給予。
藥學上可接受的載體包括任何和全部適合的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑以及吸收延遲劑等與本發明的化合物生理上相容的載體。
可以用於本發明的醫藥組成物中的適合的水性和非水性載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及類似物)、以及其適合的混合物、植物油(如橄欖油、玉米油、花生油、棉籽油、以及芝麻油)、羧甲基纖維素膠體溶液、黃蓍膠以及可注射的有機酯(例如油酸乙酯)和/或各種緩衝劑。在藥物領域中其他載體係熟知的。
藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和無菌粉劑，其用於臨時製備無菌注射液或分散體。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質係本領域中已知的。除了與活性化合物不相容的任一常規介質或試劑之外，預期其用於本發明的醫藥組成物。
可例如藉由使用包衣材料如卵磷脂，藉由維持所需的顆粒大小(在分散劑的情況下)和藉由使用表面活性劑，來維持適當的流動性。
本發明的醫藥組成物還可以包括藥學上可接受的抗氧化劑，例如(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、 α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本發明的醫藥組成物還可以包括在該等組成物中的等滲性試劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化鈉。
本發明的醫藥組成物還可以包含適合用於所選給藥途徑的一種或多種佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩衝劑，其可以增強該醫藥組成物的保質期或有效性。本發明的化合物可用保護該化合物免於快速釋放的載體製備，例如控釋製劑，包括植入物、經皮貼片和微囊化遞送系統。此類載體可以包括明膠，單硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，可生物降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸(單獨地或與蠟一起)，或者本領域中熟知的其他材料。製備此類製劑的方法係熟習該項技術者通常已知的。參見例如緩釋和控釋藥物遞送系統(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，(羅賓遜(J.R.Robinson)編，馬塞爾.德克爾公司(Marcel Dekker，Inc.)，紐約(New York)，1978)。
在一個實施方式中，本發明的該等化合物可以配製為確保適當的體內分佈。用於腸胃外給藥的藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和無菌粉劑，其用於臨時製備無菌注射液或分散體。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質係本領域中已知的。除了與活性化合物不相容的任一常規介質或試劑之外，預期其用於本發明的醫藥組成物。補充性活性化合物也可以摻入該等組成物中。
用於注射的醫藥組成物典型地必須是在生產和保存條件下 是無菌的和穩定的。可以將組成物配製為溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度的其他規則結構。該載體可以是水性或非水性溶劑或分散介質，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及類似物)、以及其適合的混合物、植物油(如橄欖油)、以及可注射的有機酯(例如油酸乙酯)。恰當的流動性可例如藉由使用包衣如卵磷脂來維持，在分散體的情況下藉由維持所需的顆粒大小來維持，以及藉由使用表面活性劑來維持。在許多情況下，較佳的是在組成物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中包括延遲抗體吸收的試劑，如單硬脂酸鹽和明膠來實現。無菌可注射溶液可藉由按需要將處於適當溶劑中的所需量的活性化合物與例如如上文列舉的成分中的一種或組合摻在一起、隨後微濾除菌來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌運載體中來製備分散體，該無菌運載體包含基礎分散介質以及例如來自以上列舉的那些的所需的其他成分。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)，該等方法由其先前無菌過濾的溶液得到活性成分加任何另外所希望的成分的粉末。
藉由將活性化合物以所需的量在合適的溶劑中與上面列舉的成分之一或者組合摻和，如果需要，隨後進行無菌微量過濾來製備無菌注射溶液。通常，藉由將活性化合物摻入無菌運載體中來製備分散體，該無菌運載體包含基礎分散介質以及來自以上列舉的那些的所需的其他成分。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)，該等方法由其先前無菌過濾的溶液得到活性成 分加任何另外所希望的成分的粉末。
在此處所述的治療和使用的上述方法中的劑量方案被調整為提供最佳的期望反應(例如，治療反應)。例如，可以給予單一推注劑，可以隨時間給予若干個分劑量或可以由治療情況的緊迫性指示來按比例的減少或增加劑量。腸胃外組成物可以被配製成單位劑型，以易於給藥和劑量的均一性。如在此使用的單位劑型係指適合作為針對待治療受試者的單一劑量的物理上離散的單位；每個單位含有經計算產生與所需藥用載體相關的所需治療效應的活性化合物的預先確定的量。針對本發明的單位劑型的說明受指示於並直接依賴於：(a)活性化合物的獨特特性和將要達到的特定療效，和(b)在複合這樣的活性化合物以在個體中獲得靈敏治療的領域中固有的限制。
針對本發明的抗體或其表位結合片段的有效劑量和劑量方案取決於待治療的疾病或病症，並且可以由熟習該項技術者確定。在給予一個劑量的任何給定日，該劑量的範圍可以是從約0.0001至約100mg/kg、並且更通常是從約0.01至約5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/Kg體重或10mg/kg體重，或在1-10mg/kg體重範圍內。因此示例性劑量包括：從約0.1至約10mg/kg/體重、從約0.1至約5mg/kg/體重、從約0.1至約2mg/kg/體重、從約0.1至約1mg/kg/體重，例如約0.15mg/kg/體重、約0.2mg/kg/體重、約0.5mg/kg/體重、約1mg/kg/體重、約1.5mg/kg/體重、約2mg/kg/體重、約5mg/kg/體重、或約10mg/kg/體重。
具有本領域普通技術的醫師可以容易地決定且開出所需醫藥組成物的有效量。例如，該醫師可以按低於用以實現所希望的治療效果 所需的水平，起始用於醫藥組成物中的本發明的抗體或其表位結合片段的劑量，並且逐漸增加劑量直到實現所希望的效果。一股而言，本發明組成物的適合的日劑量將是有效產生治療效果的最低劑量的化合物量。這種有效劑量通常將取決於上述因素。給予可以是例如靜脈內、肌內、腹膜內、或皮下。如果期望，醫藥組成物的有效日劑量可以在一整天以適當的時間間隔分開為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個分劑量來給藥，任選以單位劑型來給予。雖然可以單獨給予本發明的化合物，但較佳的是以如上所述的醫藥組成物的形式給予本發明化合物。
標記的本發明的抗體或其表位結合片段可以用於診斷目的以檢測、診斷、或監測疾病或障礙。本發明提供用於對神經退行性或認知疾病或障礙的檢測或診斷，所述疾病或障礙包括但不限於阿茲海默症、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD)，該檢測或診斷包括：(a)使用特異性地結合至τ蛋白的一種或多種抗體，測定焦穀胺酸化的Aβ片段在受試者細胞或組織樣品中的存在；並且(b)將該抗原的水平與對照水平(例如，在正常組織樣品中的水平)進行比較，借此相比於抗原的對照水平而言該抗原的測定水平的增加指示該疾病或障礙或者指示該疾病或障礙的嚴重性。
本發明的抗體或其表位結合片段可以用於使用在本領域中熟知的免疫組織化學方法測定生物樣品中的τ蛋白或τ蛋白片段。可用於檢測蛋白的基於其他抗體的方法包括免疫測定，例如酶聯免疫測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)，以及基於中尺度發現平臺(mesoscale discovery platform)的測定(MSD)。適合的抗體標記可以用於此類套組(kit) 和方法中，並且本領域中已知的標記包括酶標記，如鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素標記，例如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)、以及鍀(99mTc)；和發光標記，例如魯米諾和螢光素酶；和螢光標記，例如螢光素和羅丹明。
可以在體內檢測經標記的抗τ蛋白抗體或其τ蛋白結合片段的存在，以用於診斷目的。在一個實施方式中，診斷包括：a)向受試者給予有效量的這種經標記分子；b)在給予之後等待一個時間間隔，以允許經標記的分子在Aβ沈積位點(如果有的話)濃縮，並且以允許未結合的經標記的分子被清除至背景水平；c)確定背景水平；並且d)檢測受試者中經標記的分子，使得對超過背景水平的經標記的分子的檢測指示受試者患有該疾病或障礙，或者指示該疾病或障礙的嚴重性。根據這樣的實施方式，該分子用成像部分標記，以用於使用熟習該項技術者已知的具體成像系統檢測。背景水平可以藉由本領域中已知的不同方法來確定，包括將檢測到的標記抗體的量與先前確定的針對具體成像系統的標準值進行比較。可用於本發明的診斷方法中的方法以及系統包括但不限於電腦斷層掃描攝影術(CT)、全身掃描諸如正電子發射體層攝影(PET)、磁共振成像(MRI)、以及超音波檢查。
在一個另外的方面，本發明提供了如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在治療中使用。
在一個另外的方面，本發明提供了如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在τ蛋白病變的治療、診斷或成像中使用。
在一個另外的方面，本發明提供了如在此定義的單株抗體或 其表位結合片段，用於在治療阿茲海默症、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD)中使用。
在一個另外的方面，本發明提供了如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在製造用於對τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的藥劑中使用。
較佳的是，該藥劑係用於治療阿茲海默症(AD)、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD)，最較佳的是阿茲海默症(AD)。該藥物還較佳的是用於治療精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有雷維體失智症的患者的精神病症狀。
在一個另外的方面，本發明提供了在受試者中對阿茲海默症或其他τ蛋白病變進行治療、診斷或成像之方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的如在此定義的藥劑單株抗體或其表位結合片段。
在一個較佳的實施方式中，該治療係慢性的，較佳的是持續至少2週，例如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
在一個另外的方面，本發明提供了一種套組，該套組包括如在此定義的用於在治療中使用的抗體或其片段。
1.一種單株抗體或其表位結合片段，能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白的磷酸化殘基396，例如SEQ ID NO：33的磷酸化殘基396。
2.根據實施方式1所述的抗體，由完整抗體組成。
3.根據實施方式1或2所述的抗體或其表位結合片段，包括選自下組 的表位結合片段或由其組成，該組由以下各項組成：Fv片段(例如單鏈Fv和二硫鍵鍵合的Fv)；Fab樣片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)；迷你體(mini-body)(Fv)2-CH3結構域，以及結構域抗體(例如，單一VH可變結構域或VL可變結構域)。
4.根據任何前述實施方式所述的抗體或其表位結合片段，其中該抗體選自下組，該組由以下抗體組成：同功型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.根據前述實施方式項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其係人類的或人源化的。
6.根據前述實施方式項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該抗體或其表位結合片段展現以下特性中的一種或多種(a)針對人類病理性τ蛋白的選擇性和特異性；(b)對於p-τ 386-408(pS396/pS404)(SEQ ID NO：33)的結合親和力(KD)在0.5-10nM之間，例如1-5nM或1-2nM
7.根據前述實施方式項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中所述抗體基本上不結合τ蛋白(SEQ ID NO：33)上的磷酸化404殘基。
8.一種單株抗體或其表位結合片段，包含：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不 多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
9.根據實施方式8所述的單株抗體，包含SEQ ID NO：8的重鏈可變結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；和/或SEQ ID NO：7的輕鏈可變結構域，具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異。
10.一種單株抗體或其表位結合片段，包含：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列； (b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
11.根據實施方式10所述的單株抗體，包含SEQ ID NO：16的重鏈可變結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；和或SEQ ID NO：15的輕鏈可變結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
12.一種單株抗體，其中該表位結合片段包含： (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
13.根據實施方式12所述的單株抗體，包含SEQ ID NO：24的重鏈可變結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；和或SEQ ID NO：23的輕鏈可變結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺 基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
14.一種單株抗體或其表位結合片段，包含：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列或有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
15.根據實施方式14所述的單株抗體，包含SEQ ID NO：32的重鏈可變 結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列；和或SEQ ID NO：31的輕鏈可變結構域或者具有不多於4個胺基酸差異、或不多於3個胺基酸差異、或不多於2個胺基酸差異、或不多於1個胺基酸差異的胺基酸序列。
16.根據實施方式1至7中的一項所述的抗體或其表位結合片段，其中所述抗體或其片段與在實施方式8-15中定義的抗體或其表位結合片段相競爭以結合至人類τ蛋白。
17.根據任何前述實施方式所述的抗體或其表位結合片段，包含Fc結構域。
18.根據任何前述實施方式所述的抗體或其表位結合片段，進一步包括增加體內半衰期的部分。
19.根據實施方式18所述的抗體或其表位結合片段，其中用於增加體內半衰期的該部分選自由以下各項組成之群組：聚乙二醇(PEG)、人類血清白蛋白、糖基化基團、脂肪酸和葡聚糖。
20.根據任何前述實施方式所述的抗體或其表位結合片段，其中該抗體進一步包含可檢測部分。
21.根據實施方式20所述的抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分選自由以下各項組成之群組：螢光標記；化學發光標記；順磁性標記；放射性同位素標記；或酶標記。
22.根據實施方式20或21所述的抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分包括放射性同位素或由其組成。
23.根據實施方式22所述的抗體或其表位結合片段，其中該放射性同位素選自由以下各項組成之群組：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。
24.根據實施方式21所述的抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分包括順磁性同位素或由其組成。
25.根據實施方式24所述的抗體或其表位結合片段，其中該順磁性同位素選自由以下各項組成之群組：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
26.根據實施方式20至25項中任一項所述之抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分係藉由成像技術可檢測的，該成像技術係例如SPECT、PET、MRI、光學或超音波成像。
27.根據實施方式20至26項中任一項所述之抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分經由連接部分間接地連接到該抗體或其表位結合片段上。
28.根據實施方式27所述的抗體或其表位結合片段，其中該連接部分選自由以下各項組成之群組：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物，去鐵胺(DFO)，二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物，S-2-(4-異硫氰基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物，以及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
29.單株抗體或其表位結合片段，其中該重鏈選自由以下各項組成之群組：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32、和SEQ ID NO：35，並且該輕鏈選自由以下各項組成之群組：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：23、和SEQ ID NO：36。
30.一種單株抗體或其表位結合片段，包含(a)重鏈CDR1，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、和SEQ ID NO：28；(b)重鏈CDR2，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21、和SEQ ID NO：29；以及(c)重鏈CDR3，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22、和SEQ ID NO：30；以及(d)輕鏈CDR3，其包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19、和SEQ ID NO：27。
31.根據實施方式1至7中任一項所述之本發明的抗體、或其表位結合片段，包含a)包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
32.一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼如在實施方式1至31中任一項所定義的抗體或其表位結合片段。
33.根據實施方式32所述之核酸分子，其中該分子係cDNA分子。
34.一種載體，包含如在實施方式32或33中所定義之核酸分子。
35.一種重組宿主細胞，包含如在實施方式32至34中任一項所定義之核酸分子。
36.一種用於產生如在實施方式1至31中任一項所定義之抗體或表位結 合片段之方法，該方法包括在允許表現該編碼的抗體或其表位結合片段的條件下培養如在實施方式35中所定義的宿主細胞。
37.一種包含如前述申請專利範圍中任一項所述之抗體或其表位結合片段之製品，其中所述製品基本上不含天然產生的抗體，該等天然產生的抗體不能結合至τ蛋白或不實質性地改變該製品的抗-τ蛋白功能，其中所述功能選自由以下各項組成之群組：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%；或者當如在此所描述的與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，其特異性地以至少90%減少S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶、同時以不多於10%減少非過度磷酸化τ蛋白條帶的能力。
38.一種包含如前述申請專利範圍中任一項所述之抗體或其表位結合片段的製品，其中相對於天然存在的抗τ蛋白抗體的結構，所述抗體或所述其表位結合片段在其胺基酸序列方面具有結構改變，其中所述結構改變導致所述抗體或所述片段展現出相對於由所述天然存在的抗τ蛋白抗體展現出的功能而言改變的功能，其中所述功能選自由以下各項組成之群組：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%‘同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%；或者當如在此所描述的與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，其特異性地以至少90%減少S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶、同時以不多於10%減少非過度磷酸化τ蛋白條帶的能力。
39.一種醫藥組成物，包含如在實施方式1至31中任一項所定義的單株 抗體或其表位結合片段，或者如在實施方式37-38中任一項所定義的製品；以及藥學上可接受的載體。
40.如在實施方式1-31中任一項所述之單株抗體或其片段，如在實施方式37-38中任一項所述之製品，或者如實施方式39所述的醫藥組成物，用於在醫學中使用。
41.如在實施方式1-31中任一項所述之單株抗體或其片段，如在實施方式37-38中任一項所述之製品，或者如實施方式39所述的醫藥組成物，用於在治療τ蛋白病變中使用。
42.根據實施方式41所述之單株抗體或其片段、製品或醫藥組成物，其中該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；進行性核上性麻痹(PSP)；皮質基底節變性(CBD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
43.如在實施方式1-31中任一項所述之單株抗體或其片段、如在實施方式37-38中任一項所述之製品、或者如實施方式39所述的醫藥組成物的在製造用於治療τ蛋白病變的藥劑中的用途。
44.根據實施方式43所述之單株抗體或其片段、製品或醫藥組成物的用途，其中該τ蛋白病變選自由以下各項組成之群組：阿茲海默症、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病、以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
45.一種在受試者中對阿茲海默症或其他τ蛋白病變進行治療之方 法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的根據實施方式1-31項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、根據實施方式37-38項中任一項所述之製品、或如實施方式39所述的醫藥組成物。
46.根據實施方式45所述之方法，其中該治療係慢性的。
47.根據實施方式46所述之方法，其中該慢性治療係持續至少2週，例如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
48.根據實施方式45至47中任一項所述之方法，其中該受試者係人類。
49.一種套組，該套組包括用於在醫學中使用的如在實施方式1-31項中任一項所述之單株抗體或其片段、如在實施方式37-38項中任一項所述之製品、或者如實施方式39所述之醫藥組成物。
50.如在實施方式1-31中任一項所述之單株抗體或其片段，如在實施方式37-38中任一項所述之製品，或者如實施方式39所述的醫藥組成物，用於在檢測或測量所述τ蛋白在受試者腦中的存在或量中使用。
51.如實施方式50所述之單株抗體或其片段、製品或醫藥組成物，其中所述檢測或測量包括對結合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗體進行體內成像。
52.如實施方式50所述之單株抗體或其片段、製品或醫藥組成物，其中所述檢測或測量包括對結合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗體或所述其片段進行離體成像。
53.一種單株抗體或其表位結合片段，其在殘基404處磷酸化而在殘基396處非磷酸化的人類τ蛋白的存在下能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
54.一種單株抗體或其表位結合片段，根據以下測試準則該單株抗體或其表位結合片段展現出免疫特異性地結合至包含磷酸化殘基396的人類τ蛋白：i)該抗體基本上不結合至非磷酸化τ蛋白；ii)該抗體基本上不結合至當396非磷酸化時在404處磷酸化的τ蛋白；iii)該抗體結合至在396處磷酸化的τ蛋白；以及iv)該抗體結合至當396和404兩者均磷酸化時的τ蛋白。
55.一種針對雙磷酸化肽產生的單株抗體或其表位結合片段，該雙磷酸化肽為覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)，該單株抗體或其表位結合片段能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
56.根據實施方式55所述之單株抗體，其中將融合瘤用人類病理性τ蛋白和非病理性τ蛋白來進行篩選以分離以下殖株，該等殖株i)免疫特異性地針對磷酸化表位S396的任一個並且ii)特異性地識別來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分。
57.一種將過度磷酸化τ蛋白從纏結中去除之方法，所述纏結包含過度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使過度磷酸化τ蛋白與抗體接觸從而導致該纏結耗減90%的過度磷酸化τ蛋白，所述抗體對於具有磷酸化殘基396的τ蛋白具有選擇性。
58.一種延遲患者中的阿茲海默症的進展之方法，所述方法包括減少或衰減所述患者中的病理性τ蛋白的積累，所述方法包括給予去除具有磷酸 化396殘基的τ蛋白的抗體。
59.一種延遲患者中的阿茲海默症的進展之方法，所述方法包括去除該等接種用於病理性τ蛋白的τ蛋白，其中具有磷酸化396殘基的τ蛋白被去除。
60.一種治療患有阿茲海默症的患者之方法，該方法包括藉由使過度磷酸化τ蛋白與一種對具有磷酸化殘基396的τ蛋白具有選擇性的抗體進行接觸而從纏結去除過度磷酸化τ蛋白，所述纏結包括過度磷酸化τ蛋白和正常τ蛋白。
61.根據實施方式57至59中任一項所述之方法，該方法包括使用如在實施方式1至31、40至42或50至56中任一項所定義的抗體。
62.一種分離的單株抗體或其分離的表位結合片段，能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
63.一種重組人類或重組人源化單株抗體或其分離的表位結合片段，能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
64.一種重組單株抗體或其表位結合片段，係針對雙磷酸化肽產生的，該雙磷酸化肽為覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：37)，其中所述重組單株抗體或其表位結合片段能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
65.一種醫藥組成物，該醫藥組成物包括分離的單株抗體或其分離的表位結合片段，其中所述分離的單株抗體或其分離的表位結合片段係如在以上實施方式中的任一項中定義的。
66.一種嵌合單株抗體或其分離的表位結合片段，能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
67.如實施方式1-31和51-56中任一項定義的抗體或其抗原結合片段，其已經在細胞系中產生或製造，該細胞系例如係人類細胞系、哺乳動物非人類細胞系、昆蟲細胞系、酵母細胞系或細菌細胞系。
68.根據實施方式67所述的抗體或其抗原結合片段，產生於CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11的細胞系、CAP細胞系和HuH-7人類細胞系中。
【實例】
實例1：用磷酸化肽396/404免疫小鼠
將C56/BL6和FVB小鼠用在TiterMax佐劑中配製的10μg綴合P30的磷酸化τ 386-408(pS396/pS404)(SEQ ID NO：37)免疫。
小鼠(C56/BL6和FVB品系，雌性和雄性。將2-3月齡小鼠用綴合肽表位P30的磷酸化τ 386-408進行免疫。
遵循TiterMax/供應商方案，將綴合免疫原性P30的磷酸化τ 386-408(pS396/pS404)肽配製於TiterMax(400μg/ml肽，以1：1 vol：vol混合)中，並且將小鼠皮下注射20μg抗原肽(100μl)。對於對照小鼠僅注射佐劑。將所有用肽免疫的小鼠用0.5μg肽/Titermax(10μg/ml肽，如上所述配製並且注射)以月間隔進行強化。最後在將脾細胞與SP-2細胞融合前3天，在不用Titermax的情況下，將小鼠用綴合P30的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)進行強化。在展現與ELISA板的陽性結合後(所述ELISA 板已經用1μg/ml磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被)，並且展現出與來自AD和TG4510腦裂解物的S1和P3抗原的優先結合活性之後，選擇融合瘤用於再殖株循環(下文描述於實例3中)。使用斑點印跡和腦裂解物包被的ELISA或MSD板，將這種結合與此類抗體結合到來自對照的腦裂解物的活性進行比較。
實例2：融合瘤產生
在將脾細胞與SP-2細胞融合前3天，在不用Titermax的情況下，將小鼠用綴合P30的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)進行強化。在用1μg/ml磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被的ELISA板中陽性結合、並且使用斑點印跡和腦裂解物包被的ELISA或MSD板相比於來自對照的腦裂解物與來自AD和TG4510腦裂解物的S1和P3抗原的優先結合活性之後，選擇融合瘤用於再殖株循環。
實例3特異性抗體的西方墨點法和斑點印跡分析
τ蛋白生物化學分級
將來自過表現人類τ蛋白突變P301L的人類或rTg4510小鼠的腦組織勻漿化於10個體積的如下包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的Tris-緩衝鹽水中：50mM Tris/HCl(pH 7.4)；274mM NaGl；5mM KCl；1%蛋白酶抑制劑混合物(羅氏公司(Roche))；1%磷酸酶抑制劑混合物I & III(西格瑪公司)；和1mM苯甲基磺醯氟(PMSF；西格瑪公司)。將勻漿物在27,000 x g下4℃離心20min，以獲得上清液(S1)和沈澱部分。將沈澱重新勻漿化於5個體積的高鹽/蔗糖緩衝液(0.8M NaCl、10%蔗糖、10mM Tris/HCl[pH 7.4]、1mM EGTA、1mM PMSF)中，並且如上離心。將上清液 收集並且與肌胺醯(1%最終濃度；西格瑪)在37℃一起培養一小時，隨後在150,000 x g下4℃離心一小時，以獲得肌胺醯不可溶的沈澱，稱為P3部分。將P3沈澱重懸浮於TE緩衝液(10mM Tris/HCl[pH 8.0]、1mM EDTA)中到一個體積，該體積相當於對於腦勻漿所使用的原始體積的一半。
西方墨點法和斑點印跡
將分級的組織提取物S1和P3溶解於含有0.1M DTT的SDS-樣品緩衝液中。將經熱處理的樣品(95℃持續10min)藉由在4%-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠(英傑公司)上的凝膠電泳進行分離，並且轉移到PVDF膜(伯樂實驗室(BioRad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亞州)上。將斑點印跡樣品以跨樣品已知的濃度直接點樣到硝酸纖維素膜(阿默舍姆(Amersham)，匹茲堡，賓夕法尼亞州)上。將西方墨點法和斑點印跡膜在TBS-吐溫(0.5%)pH 7.4中的5%脫脂奶粉中封閉，隨後在1μg/ml D1.2或C10-2中於4℃培養過夜。將膜進行洗滌，並且與綴合過氧化物酶的抗小鼠IgG一起培養(1：5000；傑克遜免疫研究(Jackson ImmunoResearch)，西格羅夫(West Grove)，賓夕法尼亞州)中。使用增強的化學發光系統(ECL PLUS套組；珀金埃爾默(PerkinElmer))檢測結合的抗體。使用連接電腦的LAS-4000生物成像分析儀系統(富士膠片(Fujifilm)，東京，日本)和Multi Gauge v3.1軟體(富士膠片)進行西方墨點法和斑點印跡免疫反應性的定量和視覺分析。將蛋白載入藉由原始部分的體積進行調節，並且可以轉化為原始的組織濕重。結果示於圖1和圖2中。
實例4使用固定的人類病理性材料篩選和選擇396/404抗體
針對在能肯(nunc)板中的抗體結合來篩選融合瘤上清液， 使用0.1M碳酸鹽緩衝液(pH 9)將所述板用1μg/ml肽磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)進行了包被。
隨後將陽性上清液以1：50-1：800稀釋於PBS、0.1% BSA和0.1 NP40中，以便在分別用來自AD和健康對照(HC)的腦(P3沈澱，參見實例3)裂解物抗原包被的ELISA或MSD板中結合。將腦裂解物抗原在0.1M碳酸鹽緩衝液(pH 9)中稀釋1500倍，之後進行ELISA或MSD板的培養/包被。將孔隨後在室溫下封閉2小時(PBS、3mg/ml BSA、0.1% NP-40)，並且遵循供應商方案，用HRP(DAKO)和綴合硫標記(MSD，產品#)的抗小鼠IgG檢測抗體結合活性。稀釋於具有0.1% BSA的PBS中的抗體的選擇(D1-2、C5-2、C8-3和C10-2)表徵為劑量反應，並且示出的與AD-P3抗原包被的板的亞納莫耳-納莫耳結合活性被另外針對特異性肽和對照肽的選擇的結合活性來表徵。結果在圖3中示出。
實例5：肽特異性以及結合親和力
對於與病理性τ蛋白的結合呈陽性的抗體被進一步針對對於一系列磷酸化肽(p)表位的表觀親和力(IC50)和選擇性/特異性來表徵。將MSD板用100ng/ml磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被，如上所述。在劑量反應測定中分析針對磷酸化τ蛋白的抗體，以鑒定提供適當分析信號水平(典型地在MSD中為5,000-20,000RU，相應於最大儀器信號的0.5%-2%，或在ELISA中450nm下1.0-1.5的OD信號)的抗體濃度。將抗體的選擇與梯度濃度(0-1000nM)的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/404)一起在室溫培養2小時。將反應物隨後施加至肽包被的MSD板上，如上所述的將該MSD板用100ng/ml肽磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被， 並且測量結合活性。來自抑制測定的IC50值對應於10-100nM之間的表觀親和力(KD)。
特異性和磷酸化選擇性：將適當濃度的單株抗體與100nM雙磷酸化的(pS396/pS404)、非磷酸化或單磷酸化(pS396或pS404)的磷酸化τ蛋白386-408一起培養，並且分析結合活性(抑制測定)。將對照磷酸化τ肽(磷酸化τ蛋白260-270(pS262)或磷酸化τ蛋白240-270(pS262))和重組非磷酸化τ蛋白進行分析以用於比較。所有AD-P3抗原陽性抗體示出對於磷酸化肽τ蛋白386-408(pS396/pS404)和單磷酸化肽磷酸化τ蛋白386-408(pS396)的強優先性，以及對於單磷酸化肽磷酸化τ蛋白386-408(pS404)和非磷酸化肽τ蛋白386-408沒有結合活性對照磷酸化肽τ蛋白240-270和磷酸化τ蛋白。結果示於圖4和圖32中。
實例6：藉由免疫組織化學對抗體的組織學表徵
從8月齡rTg4510小鼠(在CamKII啟動子下過表現人類P301L-τ)和非轉基因同窩仔(非-Tg)收集小鼠腦組織，固定於4%低聚甲醛中，並且包埋於石蠟中。從組織方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英國)獲取石蠟包埋的人類額皮質的腦樣品。將來自患有診斷的末期阿茲海默症的供體的組織與年齡匹配的非癡呆對照供體進行比較。將四微米厚的切片去石蠟，並且藉由在10mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)中微波處理切片10分鐘，使其經受抗原修復。將內源性過氧化物酶用PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100(PBS-BT)中的1%過氧化氫酶、隨後用5%正常豬血清進行封閉。將切片與稀釋於PBS-BT中的處於一系列濃度的D1.2和C10-2抗體在4℃培養過夜。將切片在PBS、0.25% BSA、0.1% Triton X-100中洗滌，之後與 生物素醯化的二級豬抗小鼠抗體(E0464；DAKO，格洛斯楚普(Glostrup)，丹麥(Denmark))以1：500一起培養1小時。在另外的洗滌後，應用鏈黴親和素-生物素複合物套組(載體實驗室(Vector Laboratories)，伯林蓋姆(Burlingame)，加利福尼亞州)‘並且用二胺基聯苯胺使免疫反應性可見。將切片用蘇木精複染。結果在圖5中示出。
實例7：抗體對於病理性τ蛋白的選擇性
將MSD板用來自AD腦(1：1500稀釋)或TG4510腦(1：3000稀釋)的溶解的P3抗原包被。結果在圖6中示出。
如在上述實例4中所述進行檢測
實例8：HEK細胞接種測定
在6孔板中在鋪板後24h，將HEK293細胞用人類τ-P301L-FLAG暫態轉染，24h後接著與腦勻漿一起培養24h，隨後分離並重鋪板細胞，並且在再一個24h之後收穫。在補充有1% triton X、Phos-stop和完全的磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑(羅氏)緩衝液的PBS中，將細胞裂解並進行聲處理，並且在100,000 x g下超速離心30min。將沈澱重懸浮於SDS中，進行聲處理，在100,000 x g下超速離心30min。藉由西方墨點法分析上清液。表現人類τ-P301L的細胞在用來自rTg4510 τ蛋白轉基因小鼠的總腦勻漿接種後，顯示不溶性(SDS級分，E1/FLAG檢測)過度磷酸化的(D1.2}pS396檢測)τ蛋白。用來自小鼠的對照腦勻漿處理的細胞示出不存在聚集的過度磷酸化人類τ蛋白。此外，使用來自西斯比的τ蛋白聚集測定來分析HEK293細胞的總細胞裂解物。這種測定係基於在FRET中的時間分辨螢光，對於供體(Tb3+綴合的)和受體(d2綴合的)抗體而 言使用的是相同抗體。將10μl樣品與10μl抗體混合物進行混合，並且培養20h。在Pherastar酶標儀上讀取板以評估時間分辨螢光(在切換激發光之後，測量的/積分的FRET信號)。該測定以高特異性和靈敏性測量在人類屍體解剖材料、rTg4510小鼠以及接種的HEK細胞兩者中聚集的τ蛋白。結果在圖7中顯示，並且示出接種效應不受用HEL處理的影響，但部分地藉由用τ蛋白抗體(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)處理而逆轉。
實例9：對於D1.2和C10-2的體內功能(電生理學(elphys))響應的逆轉
在4.5到5.5月齡rTg4510和tTA對照小鼠中對海馬迴CA1區中突觸傳遞和可塑性的體內電生理評估示出i)相比於tTA小鼠，在rTg4510中基礎突觸傳遞顯著受損，並且ii)相比於tTA小鼠，在rTg4510中配對脈衝易化顯著降低。
根據關於照料和使用實驗室動物的歐共體委員會指令(European Communities Council Directive)(86/609/EEC)以及管理動物實驗的丹麥立法進行所有實驗。
將5到5.5個月大的rTg4510和tTA雄性小鼠(歐洲泰康利公司(Taconic Europe A/S))在記錄的時間用於本研究中。將小鼠分組籠養於受控溫度(22℃±1.5℃)和濕度條件(55%-65%)，並且保持在12：12小時光/暗週期中(在06：00h光亮)。隨意可獲得食物和水。
將動物用腹膜內(i.p.)注射尿烷(1.2g/kg)進行麻醉。然後將小鼠安裝在立體定位架中，經由熱板將它們的溫度調節至37.5℃，並且暴露顱骨。將鉑絲放置於額骨中以充當參考，並且打額外的孔以用於按照 根據帕西尼奧斯和佛蘭克林圖集(atlas of Paxinos and Franklin)(帕西尼奧斯(Paxinos)和佛蘭克林(Franklin)，2001)的以下座標將記錄和刺激電極***海馬迴中：記錄，前囪後部1.5-1.7mm，中線側部1.0-1.2mm，在腦表面1.4-1.7mm之下；刺激，前囪後部1.8-2.0mm，中線側部1.5-1.7mm，腦表面之下1.3-1.7mm。在記錄的整個過程中，將動物保留在立體定位架中，並且規律地檢查它們的麻醉水平。
每30s藉由謝弗側枝(Schaffer collateral)的電刺激在CA1誘發場電位(fEPSP)，並且調節記錄電極的深度，直至檢測到響應於單極方形脈衝的負fEPSP。典型地在30%和70%之間的fEPSP最大幅值之間測量誘發fEPSP的斜率。
一旦誘導最優的fEPSP，則藉由刺激強度和誘發fEPSP的斜率之間的關係(輸入-輸出關係)評估基礎突觸傳遞。不同的刺激強度係0、25、50、75、100、150、200、300、400、和500μA，並且以遞增順序相繼施加，每個強度重複2至3次。發現與tTA小鼠相比，在rTg4510中基礎突觸傳遞顯著受損。
進一步在rTg4510和tTA小鼠中測量配對脈衝易化，這係一種被認為依賴於突觸前機制的短期突觸可塑性。簡言之，將具有從25到1000ms變化的刺激間時間間隔(ISI)的一對刺激施加至謝弗側枝，並且將第二fEPSP的斜率與第一fEPSP的斜率進行比較。在所有ISI處觀察到易化，其最大易化在50和75ms的ISI處。令人感興趣的是，在rTg4510小鼠中觀察到當與tTA小鼠比較時顯著更低的PPF。
將鑒定的在基礎突觸傳遞中的受損以及在rTg4510小鼠中的 配對脈衝易化進一步用作用以測試抗體效價的讀數。
在每週兩次給予(i.p.)4個劑量的抗體持續2週之後2至4天，在所有實驗中進行記錄。當可能時，將在每個動物的兩個海馬迴中的基礎突觸傳遞和配對脈衝易化進行記錄，並且進一步用作單獨的實驗。結果在圖8中顯示，並且示出在CA1誘發場電位中配對脈衝易化和基礎突觸傳遞缺陷的抗體逆轉。
實例10：來自rTg4510腦提取物的τ蛋白的耗減
將60μg小鼠和人源化C10-2抗體固定到300μl的磁珠(Magnetic dynabead)懸浮物(免疫沈澱套組磁珠蛋白G(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G)Novex，貨號10007D)上。在徹底洗滌之後，將珠粒與60μl rTg4510腦提取物混合，並且在室溫培養10分鐘。將磁珠與提取物分離，並且將提取物藉由西方墨點法進行分析。用mC10-2和hC10-2的耗減分別將τ蛋白聚集物去除99%和99.5%。結果在圖12中示出。
實例11：使用經免疫耗減的提取物進行HEK細胞接種測定
在6孔板中將HEK293細胞用人類τ-P301L-FLAG暫態轉染。24h後，將細胞與已經使用人源化或小鼠C10-2進行了免疫耗減的腦勻漿一起培養。在24h之後，將細胞重新鋪板，並且在再一個24h之後收穫。在補充有1% triton X、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑(羅氏)的PBS中，將細胞裂解並進行聲處理，並且在100,000 x g下超速離心30min。將沈澱重懸浮於1% SDS中，進行聲處理，在100,000 x g下超速離心30min。藉由西方墨點法分析上清液。在用來自rTg4510 τ蛋白轉基因小鼠的總腦勻漿接種後，表現人類τ-P301L的細胞示出不可溶的(SDS部分，E1/FLAG檢 測)過度磷酸化τ蛋白(D1.2/pS396 τ，以更高的分子量運行)。用來自tTA小鼠對照腦勻漿處理的細胞示出不存在聚集的過度磷酸化人類τ蛋白。此外，使用來自西斯比的τ蛋白聚集測定來分析HEK293細胞的總細胞裂解物。用HEL和hHEL抗體的耗減不影響接種，然而用mC10-2和hC10-2的耗減分別以88%和96%防止τ蛋白聚集並且以97%和100%防止不溶性τ蛋白。結果在圖13中示出。
實例11：來自rTg4510腦提取物的τ蛋白的耗減
將100μg小鼠C10-2、D1.2和τ 5(英傑公司)抗體固定到500μl的磁珠(Magnetic dynabead)懸浮物(免疫沈澱套組磁珠蛋白G(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G)Novex，貨號10007D)上。在徹底洗滌之後，將珠粒與100μl rTg4510腦提取物混合，並且在室溫培養10分鐘。將磁珠與提取物分離，並且將提取物藉由西方墨點法進行分析。C10-2和D1.2未去除來自勻漿的正常τ蛋白，而可商購的τ 5抗體去除了來自勻漿的正常τ蛋白。相比之下，本發明的兩種抗體特異性地將過度磷酸化τ蛋白(64kDa)(其係在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白)去除95%。結果在圖14中示出。
實例12：來自阿爾茨海默腦提取物的τ蛋白的免疫耗減
將100μg小鼠C10-2和D1抗體固定到500μl的磁珠(Magnetic dynabead)懸浮物(免疫沈澱套組磁珠蛋白G(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G)Novex，貨號10007D)上。在徹底洗滌之後，將珠粒與100μl阿爾茨海默腦提取物混合，並且在室溫培養10分鐘。將磁珠與提取物分離，並且將提取物藉由西方墨點法進行分析。D1.2和C10-2僅去 除腦勻漿中非常少部分的總τ蛋白(8%)。然而該等抗體特異性地將對於AD患者具有特異性的過度磷酸化τ蛋白去除(90%)。結果在圖15中示出。
實例13：使用經免疫耗減的提取物在rTg4510小鼠中接種
使用在CamK2陽性神經元(rTg4510)中在tet-關(tet-off)響應元件下表現人類突變τ蛋白(P301L 0N4R)的轉基因小鼠。該模型正常地在3月齡開始發展τ蛋白病理學，但藉由在妊娠期間用多西環素飼養母鼠並且持續到小鼠生命的第一個3週，病理學在後期(在六月齡之後開始)發展。用於研究中的經多西環素預處理的小鼠在注射時間點係2.5月大。將小鼠藉由固定於立體定位架中的異氟烷吸入進行麻醉。將顱骨暴露並且調節直至前囪和人字點在水平向上。在顱骨中在前囪側向2mm(右)和後部2.4mm處鑽孔。使用10μl的注射器斜尖(SGE)在腦表面側部1.4mm以上文所述的座標注射接種材料。將實例11和12中描述的2μl的經免疫耗減的提取物緩慢輸注在位點處(1μl/分鐘)，並且將注射器保留5分鐘之後將其移除。藉由縫線將傷口閉合並且在小鼠醒來時加熱。將小鼠籠養3個月，並且然後處死，並且用4% PFA進行灌注固定。
免疫組織化學：在NSA上將固定的腦切成35μm冠狀切片，並且將每6個切片針對τ蛋白纏結(加萊斯(Gallyas)銀染)和針對過度磷酸化τ蛋白(ATS)進行染色。將陽性染色的神經元(胞體)在所有腦的海馬迴的同側和對側中進行計數。包括海馬迴的所有亞區。每個腦計數八個切片。結果反映來自這8個切片的陽性神經元的總和。在2個未注射的小鼠中確定背景信號。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。結果在圖16中示出。接種有rTg4510(A) 或AD(B)腦勻漿的rTg4510腦中的τ蛋白病理學的定量。在接種之前，藉由使用C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已經在勻漿中降低了90%-95%。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。
來自rTg4510或阿爾茨海默腦的勻漿可以在rTg4510小鼠中在內源性τ蛋白病變還未發展的時期處接種τ蛋白病變。藉由經使用D1.2或C10-2而從勻漿去除過度磷酸化τ蛋白(如實例11和12所述)，接種活性消除。
實例14：在接種的rTg4510小鼠中的抗體處理
將多西環素處理的rTg4510小鼠(如實例13中所述)慢性地用小鼠D1.2或對照抗體處理，15mg/kg/週，在2月齡時開始。在2.5月大時，將rTg4510腦提取物輸注到海馬迴中(如實例13中所述)。在腦輸注之後1、2和3個月，將小鼠處死，並且如實例13中所述的進行免疫組織化學法和以下分析。在接種已經起始之後2和3個月，D1.2處理顯著降低了τ蛋白病變。結果在圖17中示出。
接種的rTg4510小鼠的海馬迴中的具有神經元的纏結的定量。病變隨時間增加，並且藉由用D1.2處理小鼠，在接種後2個月和3個月時病變顯著更少。接種的rTg4510小鼠的海馬迴中的具有神經元的纏結的定量。病變隨時間增加，並且藉由用D1.2處理小鼠，在接種後2個月和3個月時病變顯著更少。
來自rTg4510或阿爾茨海默腦的勻漿可以在rTg4510小鼠中在內源性τ蛋白病變還未發展的時期處接種τ蛋白病變。藉由系統地用 D1.2處理小鼠，τ蛋白病變的發展可以顯著降低。
實例15：使用人源化τ蛋白抗體對來自阿爾茨海默腦提取物的τ蛋白進行免疫耗減
將100μg小鼠和人源化C10-2以及先前技術抗體2.10.3和HJ8.5抗體(來源)固定到500 μ l的磁珠(Magnetic dynabead)懸浮物(免疫沈澱套組磁珠蛋白G Novex，貨號10007D)上。在徹底洗滌之後，將珠粒與100μl阿爾茨海默腦提取物混合，並且在室溫培養10分鐘。將磁珠與提取物分離，並且將提取物藉由西方墨點法和西斯比測定進行分析。與hHel對照抗體相比，小鼠和人源化C10-2有效地將93%和97%的pS396磷酸化τ蛋白去除，但僅去除22%和17%的總τ蛋白。2.10.3抗體去除91%的絲胺酸396磷酸化τ蛋白和10%的總τ蛋白。看起來與C10-2抗體(中間64kDa條帶)相比，2.10.3在去除過度磷酸化條帶方面不是很有效。HJ8.5抗體具有完全不同於C10-2和2.10抗體二者的特徵，其去除大部分τ蛋白，89%的總τ蛋白和88%的pS396 τ蛋白。結果在圖23-24中示出。
實例16：使用人源化τ蛋白抗體對來自阿爾茨海默腦提取物的聚集的τ蛋白進行免疫耗減
還藉由使用實例10中所述的τ蛋白聚集測定分析了實例13中所述的經免疫耗減的AD提取物。與2.10.3抗體相比，C10-2和HJ8.5抗體更有效地去除來自AD材料的聚集的τ蛋白。按照效率的順序為：HJ8.5(99%)、hC10-2(98%)、mC10-2(96%)和2.10.3(90%)，所有均與hHel抗體相比。結果在圖25中示出。
實例17：τ蛋白的免疫耗減
將25μg抗體(人源化C10-2或2.10.3)固定到125μl的磁珠(Magnetic dynabead)懸浮物(免疫沈澱套組磁珠蛋白G Novex，貨號10007D)上。在徹底洗滌之後，將包被的珠粒與可變數的非包被洗滌珠粒進行混合。從100% Ab包被的珠粒(對應於5μg抗體)開始，直到100%未包被的珠粒。珠粒的總量在所有樣品中是相同的。將珠粒與20μl AD提取物混合，並且在室溫下培養10分鐘。將磁珠與提取物分離，並且將提取物等分，迅速冷凍，並且保持在-80℃直到使用。
使用西方墨點法對耗減的分析
將樣品在1x LDS載入緩衝液和100mM DTT中煮沸。將對應於3μl提取物的體積載入在4%-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠(LifeTech Novex)上。在電泳後，將西方墨點法在Immobilon-FL PVDF膜(0.45μm，IPFL10100，密理博(Millipore))上。將膜用SEA封閉緩衝液(Prod#37527，賽默(Thermo))封閉。使用τ 5(艾碧康(Abcam)ab80579，1：2000)、小鼠C10-2(1μg/ml)、P-S199/202(英傑公司，44768G，1：1000)、P-S422(艾碧康(Abcam)ab79415，1：750)、人類IPN(1μg/ml)，對樣品中的τ蛋白和P-τ蛋白水平進行評估將磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)和肌動蛋白用作載入對照(艾碧康(Abcam)ab9484，1：2000，西格瑪A5441，1：20000)。使用二級螢光團綴合的IgG抗體(IRDye 800CW山羊抗-人，IRDye 800CW，山羊抗-兔，IRDye 680山羊抗-小鼠，LI-COR生物科學)，並且使用Odyssey CLx和Image studio軟體(LI-COR生物科學)對信號定量。進行對整個泳道中單獨條帶以及信號的定量，並且據此繪製S形劑量反應曲線，並且可能時，評價最大效應和EC50值。
結果
兩種抗體去除來自阿爾茨海默腦製品的小部分τ蛋白。被設計為對P-S422 τ蛋白具有特異性的2.10.3去除了高達24%的總τ蛋白量，而C10-2去除了高達15%的總τ蛋白(參見圖26)。
2.10.3和C10-2兩者去除多於90%的在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白，但去除50%的P-S422 τ蛋白所需的抗體的量不同，對相同效果而言，對於2.10.3需要0.42μg抗體，並且對於C10-2需要0.27μg(參見圖27)。
C10-2有效地去除了在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白(最大效應：88%，並且藉由使用0.30μg抗體達到該效應的一半)。2.10.3去除了更少部分的在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白(最大效應：60%，並且當使用0.63μg抗體時達到該效應的一半)(參見圖28)這指示所有的在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白在絲胺酸396處也被磷酸化，但在位置422處的磷酸化絲胺酸不存在時，存在在絲胺酸396處磷酸化的一部分過度磷酸化τ蛋白。
藉由C10-2去除的大部分τ蛋白在絲胺酸199/202處也被磷酸化，因為69%的具有該磷酸化的τ蛋白受到免疫耗減的影響(當使用0.34μg抗體時該效應的50%)(參見圖29)。2.10.3免疫耗減並不對P-S199/202 τ蛋白給出S形劑量反應，但可看到信號隨遞增量的抗體而降低，當使用抗體的最大量(5μg)時最大值52%降低(參見圖29)。
該資料指示，與靶向在422位置處的磷酸化絲胺酸的2.10.3抗體相比，靶向磷酸化絲胺酸396的C10-2抗體結合更大量的過度磷酸化τ 蛋白。
實例18：對AD腦裂解物中病理性τ抗原的mC10-2特異性捕獲的抗體介導的抑制
材料與方法
材料
包被緩衝液：碳酸鹽緩衝液pH 8.5，150mM NaCL。封閉緩衝液：3% BSA(部分V(fraction V))，0.1% NP40於PBS中，pH 7.4。洗滌緩衝液：0.1% BSA(部分V)，0.1% NP40於PBS中，pH 7.4。硫標記山羊總人源化τ蛋白抗體(MSD D221LA-1，50μg/ml)
方法旨在將τ抗原與遞增濃度的pS396特異性抗體一起培養(步驟B)之後，使用C10-2包被的板(步驟A)測量來自AD腦的病理性人類τ抗原的捕獲。使用來自MSD的硫標記抗人類(總)τ蛋白抗體檢測τ抗原捕獲和抗體介導的抑制。
A：將MSD板用在包被緩衝液中的0.5μg/ml mC10-2(捕獲抗體)包被(4℃過夜)，並且隨後在室溫下封閉1小時，並且洗滌3次。(圖30)
B：將來自AD(從3名患者聚池)的樣品P3裂解物(1：1000=2-4μg/ml總蛋白)和/或S1(p)(1：300=20-40ng/ml總蛋白)與梯度濃度的pS396肽表位特異性抗體混合，並且在室溫培養1小時。隨後將反應在步驟A中製備的板上培養2小時。(圖31)
C：使用硫標記的人類τ蛋白檢測C10-2捕獲的τ蛋白。來自MSD的τ蛋白抗體(典型地1：50)遵循廠商說明書。在MSD SECTOR® S 600上分析板。以類似設置測試AD P3和AD S1(p)。(圖33/34)
表6A-6D：τ抗原捕獲抑制
<110> H.朗德貝克公司
<120> τ 396抗體
<130> 0995-WO-PCT
<160> 37
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2 CDR 1輕鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2 CDR 2輕鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2 CDR 3輕鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2 CDR 1重鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2 CDR 2重鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2 CDR 3重鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2輕鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2重鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2 CDR 1輕鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2 CDR 2輕鏈
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2 CDR 3輕鏈
<400> 11
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2 CDR 1重鏈
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2 CDR 2重鏈
<400> 13
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2 CDR 3重鏈
<400> 14
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2輕鏈
<400> 15
<210> 16
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C10.2重鏈
<400> 16
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2 CDR 1輕鏈
<400> 17
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2 CDR 2輕鏈
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2 CDR 3輕鏈
<400> 19
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2 CDR 1重鏈
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2 CDR 2重鏈
<400> 21
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2 CDR 3重鏈
<400> 22
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2輕鏈
<400> 23
<210> 24
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C5.2重鏈
<400> 24
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3 CDR 1輕鏈
<400> 25
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3 CDR 2輕鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3 CDR 3輕鏈
<400> 27
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3 CDR 1重鏈
<400> 28
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3 CDR 2重鏈
<400> 29
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3 CDR 3重鏈
<400> 30
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3輕鏈
<400> 31
<210> 32
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> C8.3重鏈
<400> 32
<210> 33
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> No 33人類τ
<400> 33
<210> 34
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D1.2*輕鏈
<400> 34
<210> 35
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hC10.2重鏈
<400> 35
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hC10.2 LC
<400> 36
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 386-408 τ與磷酸化S396和S404
<400> 37

Claims (53)

  1. 一種單株抗體或其表位結合片段，能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，包含完整抗體或由完整抗體組成。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，包括選自以下群組的表位結合片段或由其組成，該群組由以下各項組成：Fv片段(例如單鏈Fv和二硫鍵鍵合的Fv)；Fab樣片段，例如Fab片段、Fab’片段和F(a.b)2片段；以及結構域抗體，例如單一VH可變結構域或VL可變結構域。
  4. 如任何前述申請專利範圍所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該抗體選自以下群組，該群組由以下抗體組成：同功型(subtype)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，它們係人類的或人源化的。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中所述抗體基本上不能結合至τ蛋白(SEQ ID NO：33)上的磷酸化404殘基。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，包括：(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的輕鏈CDR2； (c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的重鏈CDR3。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之單株抗體或其表位結合片段，包括SEQ ID NO：8的重鏈及/或SEQ ID NO：7的輕鏈。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之單株抗體或其表位結合片段，包括SEQ ID NO：8的重鏈及/或SEQ ID NO：34的輕鏈。
  10. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該表位結合片段包括：(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之單株抗體，包括SEQ ID NO：16的重鏈及/或SEQ ID NO：15的輕鏈。
  12. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該表位結合片段包括：(a)具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈CDR2； (c)具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之單株抗體，包括SEQ ID NO：24的重鏈及/或SEQ ID NO：23的輕鏈。
  14. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該表位結合片段包括：(a)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列的重鏈CDR3。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之單株抗體，包括SEQ ID NO：32的重鏈和/或SEQ ID NO：31的輕鏈。
  16. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該重鏈選自由以下各項組成之群組：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35，並且該輕鏈選自由以下各項組成之群組：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：31。
  17. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片 段，包括(a)重鏈CDR1，其包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下各項組成：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：28；(b)重鏈CDR2，其包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下各項組成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：29；以及(c)重鏈CDR3，其包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下各項組成：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：30；以及(d)輕鏈CDR3，其包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下各項組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：27。
  18. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，包括：(a)包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  19. 一種單株抗體或其表位結合片段，對於過度磷酸化τ蛋白的、包含磷酸化絲胺酸的胺基酸基序(motif)具有選擇性，該磷酸化絲胺酸距離酪胺酸殘基兩個殘基。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該胺基酸基序具有以下序列：-Y-X-S(磷酸化)-P-其中Y係酪胺酸，X係天然存在的胺基酸，S(磷酸化)係具有磷酸化羥基側鏈的絲胺酸，並且P係脯胺酸。
  21. 如前述申請專利範圍中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，包括Fc區。
  22. 如前述申請專利範圍中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，進一步包括用於增加試劑體內半衰期的部分。
  23. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，根據以下測試準則它們展現出免疫特異性地結合至包含磷酸化殘基396的人類τ蛋白：i)該抗體基本上不結合至非磷酸化τ蛋白；ii)該抗體基本上不結合至在404處磷酸化且在396處未磷酸化的τ蛋白；iii)該抗體結合至在396處磷酸化的τ蛋白；iv)該抗體結合至在396處和404處兩者均磷酸化時的τ蛋白。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，針對雙磷酸化肽而被引發，該雙磷酸化肽包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：39)之內的至少18個連續胺基酸殘基，例如至少20個連續胺基酸殘基。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之單株抗體或其表位結合片段，針對雙磷酸化肽而被引發，該雙磷酸化肽包含18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基，該等連續胺基酸殘基包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘 基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：39)。
  26. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，具有對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)之相較於年齡匹配健康對照的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)相較於來自年齡匹配健康對照的τ蛋白的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)(SEQ ID NO：33)。
  27. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，具有對於AD患病τ蛋白的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有對於AD相較於於年齡匹配健康對照的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，其對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)(SEQ ID NO：33)。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，針對以下雙磷酸化肽而被引發：覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：39)，或其表位結合片段，該單株抗體或其表位結合片段能夠免疫特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：33)的磷酸化殘基396。
  29. 如申請專利範圍第1-28項中任一項定義的抗體或其表位結合片段，其已經在細胞系中被產生或製造，該細胞系例如係人類細胞系、哺乳動物非人類細胞系、昆蟲細胞系、酵母細胞系或細菌細胞系。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的抗體或其表位結合片段，產生於CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11的細胞系、CAP細胞系和HuH-7人類細胞系中。
  31. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中所述單株抗體係由融合瘤表現，該融合瘤係藉由用人類病理性τ蛋白和非病理性τ蛋白篩選融合瘤以分離以下殖株來分離的，該等殖株i)免疫特異性地針對磷酸化表位S396之任一者並且ii)特異性地識別來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分。
  32. 如前述申請專利範圍中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該抗體或其表位結合片段進一步包括可檢測部分。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之單株抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分係螢光標記、化學發光標記、順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記。
  34. 一種包含如前述申請專利範圍中任一項所述之抗體或其表位結合片段之製品，其中所述製品基本上不含天然產生的抗體，該等天然產生的抗體不能結合至τ蛋白或不實質性地改變該製品的抗-τ蛋白功能，其中所述功能選自由以下各項組成之群組： (i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使得該製品基本上不能結合該磷酸化404殘基(pS404)或使得該製品優先結合至S396；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此描述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rtg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%。
  35. 一種包含如前述申請專利範圍中任一項所述之抗體或其表位結合片段之製品，其中相對於天然存在的抗τ蛋白抗體的結構，所述抗體或所述其表位結合片段在其胺基酸序列方面具有結構改變，其中所述結構改變導致所述抗體或所述片段展現出相對於由所述天然存在的抗τ蛋白抗體展現出的功能而言改變的功能，其中所述功能選自由以下各項組成之群組：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的 τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使得所述抗體或所述片段基本上不能結合該磷酸化404殘基(pS404)或使得所述抗體或所述片段優先結合至S396；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rtg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%。
  36. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如申請專利範圍第1至31項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、或者如申請專利範圍第34至35項中任一項所述之製品，以及藥學上可接受的載體。
  37. 一種對如申請專利範圍第1至31項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段進行編碼的或者對其組成鏈進行編碼的核酸。
  38. 一種用於在治療中使用之如申請專利範圍第1至31項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、如申請專利範圍第34至35項中任一項所述之製品、或如申請專利範圍第36項所述之醫藥組成物。
  39. 一種在對τ蛋白病變進行治療、診斷或成像中使用之如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、如申請專利 範圍第34至35項中任一項所述之製品、或如申請專利範圍第36項所述之醫藥組成物。
  40. 一種用於在治療選自以下群組的τ蛋白病變中使用之如申請專利範圍第1至31項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、或如申請專利範圍第34至35項中任一項所述之製品或醫藥組成物、或如申請專利範圍第36項所述之組成物，該群組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒癡呆(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智症的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳癡呆(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克症；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經原纖維纏結為主型老年失智；拳擊手型失智症；慢性創傷性腦病變；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease)(關島型帕金森病-失智複合症)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓氏症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)以及脂褐質症。
  41. 一種用於在製造用於對τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的藥劑中使用之如申請專利範圍第1至31項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、或如申請專利範圍第34至35項中任一項所述之製品或醫藥組成物、或如申請專利範圍第36項所述之醫藥組成物。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之單株抗體或其表位結合片段、或製品或 醫藥組成物、或組成物，其中該藥劑係用於治療阿茲海默症、嗜銀顆粒癡呆(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病、以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
  43. 一種在受試者中對阿茲海默症或其他τ蛋白病變進行治療、診斷或成像之方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的如申請專利範圍第1-37項中任一項所述之單株抗體或其表位結合片段、如申請專利範圍第34至35項中任一項所述之製品、或如申請專利範圍第36項所述之醫藥組成物。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之方法，其中該治療係慢性的。
  45. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該慢性治療係持續至少2週，例如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
  46. 如申請專利範圍第43至45項中任一項所述之方法，其中該受試者係人類。
  47. 一種套組，該套組包含如申請專利範圍第1-31項中任一項所述之抗體或其片段、如申請專利範圍第34至35項中任一項所述之製品、或如申請專利範圍第36項所述之醫藥組成物，用於在治療中使用。
  48. 一種用於在檢測或測量所述τ蛋白在受試者的腦中的存在或量中使用之如申請專利範圍第1至33項所述之單株抗體或其表位結合片段或包含所述抗體或片段的製品或醫藥組成物。
  49. 如申請專利範圍第48項所述之單株抗體或其表位結合片段、製品或醫藥組成物，其中所述檢測或測量包括對結合至所述τ蛋白的所述抗τ 蛋白抗體進行體內成像。
  50. 如申請專利範圍第48或49項所述之單株抗體或其表位結合片段、製品或醫藥組成物，其中所述檢測或測量包括對結合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗體或所述其片段進行離體成像。
  51. 一種將過度磷酸化τ蛋白從纏結中去除之方法，所述纏結包含過度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使過度磷酸化τ蛋白與抗體接觸從而導致該纏結耗減90%的過度磷酸化τ蛋白，所述抗體對於具有磷酸化殘基396的或如申請專利範圍第1至31項中任一項定義的τ蛋白具有選擇性。
  52. 一種延遲患者中的阿茲海默症的進展之方法，所述方法包括藉由給予對於如申請專利範圍第1至31項中任一項定義的、具有磷酸化殘基396的τ蛋白有選擇性的抗體從而減少或衰減所述患者中的病理性τ蛋白的積累。
  53. 一種藉由用於產生高特異性、高親和力抗體的方法而產生的抗體，該等高特異性、高親和力抗體對於包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白具有免疫特異性，其中所述方法包括以下步驟：(A)將免疫原注入哺乳動物中，由此免疫所述哺乳動物，所述免疫原包含雙磷酸化肽，該雙磷酸化肽包含18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基，該等連續胺基酸殘基包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：39)；(B)將對所述哺乳動物的所述免疫重複進行兩次或更多次；(C)針對高特異性、高親和力抗體的存在對來自所述經重複免疫 的哺乳動物的血清樣品進行篩選，該等高特異性、高親和力抗體能夠結合包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白、但是基本上很少能夠結合非病原性τ蛋白；並且(D)回收所述高特異性、高親和力抗體。
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