JP2022513481A - 抗アルファ－シヌクレイン抗体およびその使用 - Google Patents

抗アルファ－シヌクレイン抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗アルファ－シヌクレイン抗体、およびパーキンソン病などの疾患を治療するためのその使用に関する。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、医薬の分野に属する。より具体的には、本発明は、アルファ－シヌクレインに結合する抗体、そのようなアルファ－シヌクレイン抗体を含む組成物、およびパーキンソン病、多系統萎縮症、およびアルツハイマー病などのシヌクレイノパチーの治療のためのそのようなアルファ－シヌクレイン抗体を使用する方法に関する。
アルファ－シヌクレイン（ここではα－シヌクレインとも呼ばれる）は、神経系で豊富に発現し、生理学的条件下でシナプス前終末に優先的に局在する１４０個のアミノ酸のシナプス前神経タンパク質である。アルファ－シヌクレインは、「シヌクレイノパチー」と呼ばれる複数の神経変性疾患の病因に関連する。これらの疾患は、ニューロン（例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）など）またはグリア（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）など）のいずれかで、凝集したα－シヌクレインで構成される細胞内封入体の病理学的特徴を共有する。ＰＤでは、これらのα－シヌクレイン封入体は、細胞体（すなわち「レビー小体」）および神経突起（すなわち「レビー神経突起」）の両方で観察される。アルツハイマー病では、患者の約半数がα－シヌクレインと、アミロイドおよびタウとの共病理を有する。
この病理学的関連に加えて、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）をコードする遺伝子の変異が家族性ＰＤで発見されており、これにより一般にα－シヌクレインの凝集傾向が高くなる。さらに、ＳＮＣＡの二倍体および三倍体は家族性ＰＤと関連しており、α－シヌクレインの過剰発現が神経変性障害につながる可能性があることを示唆している。
α－シヌクレインの時間的および局所的な広がりは、ＰＤの疾患症状の進行と相関している。さらに、カルパインおよび／またはカスパーゼ切断によって生成されるα－シヌクレインのタンパク質分解性Ｎ末端およびＣ末端フラグメントは、ＰＤ患者およびＤＬＢ患者の両方のレビー小体抽出物で上方調節されることが報告されている。さらに、インビトロ研究は、α－シヌクレインのＣ末端の漸進的な切断が、線維化した病原性凝集体を形成するより高い固有の能力を与えることを示した（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，（２０１６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１３（３４）：９５８７－９５９２を参照のこと）。まとめると、これらの観察結果は、フラグメント化されたα－シヌクレインが疾患の進行速度の増加および患者の予後不良に寄与する可能性があることを示唆している。したがって、α－シヌクレインに結合する抗体は、シヌクレイノパチーの治療に治療効果がある可能性がある。
アルファ－シヌクレイン抗体は当技術分野で知られている。例えば、米国特許第８，６０９，８２０号は、ヒト化抗α－シヌクレイン抗体９Ｅ４、およびそのような疾患に罹患しているもしくはそのリスクのある患者におけるシヌクレイノパチーまたはレビー小体型認知症の予防を治療または実施する方法を開示している。しかしながら、α－シヌクレイン免疫療法に関連する現在の戦略は、抗体がカルパインおよび／またはカスパーゼフラグメント化種に結合および／または認識しないようにエピトープを標的とする抗体を主に採用し、それによって最適以下の効力を提供する可能性が高い。
したがって、当技術分野では、カルパインおよび／またはカスパーゼ生成種のヒトα－シヌクレインに結合する抗アルファ－シヌクレイン抗体が大いに必要とされている。本発明の抗体によって認識される独特のアルファ－シヌクレインエピトープは、抗体が完全長およびフラグメント化されたα－シヌクレイン凝集種の両方に結合することを可能にし、ＰＤおよびＤＬＢなどのシヌクレイノパチーにおいてより高度な疾患制御を与える可能性が高い。
さらに、本発明の抗体は、インビボＰＫおよび免疫原性などの許容可能な特性を有し、表面静電ポテンシャルのバランスをとり、熱安定性を高め、ｐＩを低下させ、および／または非抗原タンパク質への結合を低下させる高親和性抗体である。
したがって、本発明は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む抗アルファ－シヌクレイン抗体であって、ＨＣは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣは軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ＨＣＶＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＶＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１（ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧ、式中、１６位のＸａａはリジンまたはグルタミンである）によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３（ＡＲＧＹＧＭＤＶ）によって示され、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４（ＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭ、式中、５位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸である）によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５（ＹＫＶＳＸＲＮＳ、式中、５位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である）によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６（ＭＱＧＴＫＱＹＰＴ）によって示される、抗アルファ－シヌクレイン抗体を提供する。一実施形態では、配列番号２の１６位のＸａａは、リジンまたはグルタミンである。一実施形態では、配列番号４の５位のＸａａは、セリンまたはアスパラギン酸である。一実施形態では、配列番号５の５位のＸａａは、アスパラギンまたはアスパラギン酸である。特定の実施形態では、配列番号２の１６位のＸａａはリジンであり、配列番号４の５位のＸａａはセリンであり、配列番号５の５位のＸａａはアスパラギンである。別の特定の実施形態では、配列番号２の１６位のＸａａはグルタミンであり、配列番号４の５位のＸａａはアスパラギン酸であり、配列番号５の５位のＸａａはアスパラギン酸である。
本発明はまた、ＨＣおよびＬＣを含む抗アルファ－シヌクレインであって、ＨＣがＨＣＶＲを含み、ＬＣがＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７（ＸＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ、式中、１位のＸａａはグルタミン酸またはピログルタミン酸であり、６５位のＸａａはリジンまたはグルタミンである）によって示され、ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号８（ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＸＲＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＫＱＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ、式中、２８位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸であり、５８位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である）によって示される、抗体を提供する。一実施形態では、配列番号７の１位のＸａａは、グルタミン酸またはピログルタミン酸である。一実施形態では、配列番号７の６５位のＸａａは、リジンまたはグルタミンである。一実施形態では、配列番号８の２８位のＸａａは、セリンまたはアスパラギン酸である。一実施形態では、配列番号８の５８位のＸａａは、アスパラギンまたはアスパラギン酸である。特定の実施形態では、配列番号７の１位のＸａａはグルタミン酸であり、配列番号７の６５位のＸａａはリジンであり、配列番号８の２８位のＸａａはセリンであり、配列番号８の５８位のＸａａはアスパラギンである。別の特定の実施形態では、配列番号７の１位のＸａａはグルタミン酸であり、配列番号７の６５位のＸａａはグルタミンであり、配列番号８の２８位のＸａａはアスパラギン酸であり、配列番号８の５８位のＸａａはアスパラギン酸である。
本発明はまた、ＨＣおよびＬＣ含む抗アルファ－シヌクレイン抗体であって、ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９（ＸＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＸ、式中、１位のＸａａはグルタミン酸またはピログルタミン酸であり、６５位のＸａａはリジンまたはグルタミンであり、４４１位のＸａａはグリシンであるかまたは不在である）によって示され、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０（ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＸＲＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＫＱＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ、式中、２８位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸であり、５８位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である）によって示される、抗体を提供する。一実施形態では、配列番号９の１位のＸａａは、グルタミン酸またはピログルタミン酸である。一実施形態では、配列番号９の６５位のＸａａは、リジンまたはグルタミンである。一実施形態では、配列番号９の４４１位のＸａａは、グリシンであるかまたは存在しない。一実施形態では、配列番号１０の２８位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸であり、配列番号１０の５８位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である。特定の実施形態では、配列番号９の１位のＸａａはグルタミン酸であり、配列番号９の６５位のＸａａはリジンであり、配列番号９の４４１位のＸａａはグリシンであり、配列番号１０の２８位のＸａａはセリンであり、配列番号１０の５８位のＸａａはアスパラギンである。別の特定の実施形態では、配列番号９の１位のＸａａはグルタミン酸であり、配列番号９の６５位のＸａａはグルタミンであり、配列番号９の４４１位のＸａａはグリシンであり、配列番号１０の２８位のＸａａアスパラギン酸であり、配列番号１０の５８位のＸａａはアスパラギン酸である。
本発明はまた、本発明の抗体および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、シヌクレイノパチーを有する患者を治療する方法であって、当該患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、シヌクレイノパチーは、ＰＤ、ＭＳＡ、またはＡＤである。特定の実施形態では、シヌクレイノパチーはＤＬＢである。別の特定の実施形態では、シヌクレイノパチーはＰＤである。
本発明はまた、療法における使用のための本発明の抗体を提供する。一実施形態では、本発明の抗体は、シヌクレイノパチーの治療に使用するためのものである。一実施形態では、シヌクレイノパチーは、ＰＤ、ＭＳＡ、またはＡＤである。特定の実施形態では、シヌクレイノパチーはＤＬＢである。別の特定の実施形態では、シヌクレイノパチーはＰＤである。
本発明は、シヌクレイノパチーの治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用を提供する。一実施形態では、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である。
本発明はまた、アミノ酸配列が配列番号９によって示される抗体ＨＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、ＤＮＡ分子は、配列番号１１によって示されるポリヌクレオチド配列を有する。
本発明はまた、アミノ酸配列が配列番号１０によって示される抗体ＬＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、ＤＮＡ分子は、配列番号１２によって示されるポリヌクレオチド配列を有する。
本発明は、アミノ酸配列が配列番号９によって示されるＨＣをコードするポリヌクレオチドを含み、かつアミノ酸配列が配列番号１０によって示されるＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、ＨＣをコードするポリヌクレオチドの配列は配列番号１１によって示され、ＬＣをコードするポリヌクレオチドの配列は配列番号１２によって示される。
本発明はまた、アミノ酸配列が配列番号９によって示される抗体ＨＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子、およびアミノ酸配列が配列番号１０によって示される抗体ＬＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、形質転換された哺乳動物細胞が２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示される、哺乳動物細胞を提供する。
本発明はまた、１）アミノ酸配列が配列番号９によって示されるＨＣをコードするポリヌクレオチド、および２）アミノ酸配列が配列番号１０によって示されるＬＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、形質転換された哺乳動物細胞が、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示される、哺乳動物細胞を提供する。
本発明は、抗体を産生するためのプロセスを提供し、抗体は２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示され、当該プロセスは、アミノ酸配列が配列番号９によって示される抗体ＨＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子、およびアミノ酸配列が配列番号１０によって示される抗体ＬＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞を、抗体が発現されるような条件下で培養することであって、形質転換された哺乳動物細胞が、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示される、培養することと、発現された抗体を回収することと、を含む。一実施形態では、本発明は、抗体を産生するためのプロセスによって得られる抗体を提供する。
本発明は、抗体を産生するためのプロセスを提供し、抗体は２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示され、当該プロセスは、アミノ酸配列が配列番号９によって示されるＨＣをコードするポリヌクレオチドを含み、かつアミノ酸配列が配列番号１０によって示されるＬＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞を、抗体が発現されるような条件下で培養することであって、形質転換された哺乳動物細胞が、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示される、培養することと、発現された抗体を回収することと、を含む。一実施形態では、本発明は、抗体を産生するためのプロセスによって得られる抗体を提供する。
本発明はまた、配列番号１３の１１５位のアスパラギン酸、１１６位のメチオニン、１１９位のアスパラギン酸、１２６位のグルタミン酸、および１２８位のプロリンの１つ以上の残基でヒトアルファ－シヌクレインに結合するアルファ－シヌクレイン抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、配列番号１３の１１５位のアスパラギン酸、１１６位のメチオニン、１１９位のアスパラギン酸、１２６位のグルタミン酸、および１２８位のプロリンの残基の少なくとも２つのアミノ酸に結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３の１１５位のアスパラギン酸、１１６位のメチオニン、１１９位のアスパラギン酸、１２６位のグルタミン酸、および１２８位のプロリンの残基の少なくとも３つのアミノ酸に結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３の１１５位のアスパラギン酸、１１６位のメチオニン、１１９位のアスパラギン酸、１２６位のグルタミン酸、および１２８位のプロリンの残基の少なくとも４つのアミノ酸に結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３の１１５位のアスパラギン酸、１１６位のメチオニン、１１９位のアスパラギン酸、１２６位のグルタミン酸、および１２８位のプロリンの残基に結合する。いくつかのそのような実施形態では、結合は、アラニンスキャニングによって決定される。これらの抗体は、完全長のアルファ－シヌクレインに加えて、開裂されたアルファ－シヌクレインを除去するのにより効果的であるかもしれないと考えられている。
本発明は、配列番号１３の残基１～１２１を含むアルファ－シヌクレインフラグメントの取り込みを阻害する抗体を提供する。本発明はまた、配列番号１３の残基１２０～１４０を含むアルファ－シヌクレインフラグメントの取り込みを阻害する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、１～１２１および１２０～１４０フラグメントの両方の取り込みを阻害する。本発明はまた、配列番号１３の残基１～１２０を含むアルファ－シヌクレインフラグメントに結合する抗体を提供する。本発明はまた、配列番号１３の残基１２０～１４０を含むアルファ－シヌクレインフラグメントに結合する抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、１～１２０および１２０～１４０の両方のアルファ－シヌクレインフラグメントに結合する。
アルファ－シヌクレインの残基１～１２１のフラグメントの内在化の阻害。 アルファ－シヌクレインの内在化の阻害。 完全長およびアルファ－シヌクレインフラグメントへの抗体の結合。
定義
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、アルファ－シヌクレインは、野生型アルファ－シヌクレインを指し、好ましくは、配列番号１３によって示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトアルファ－シヌクレインを指す。「抗アルファ－シヌクレイン抗体」または「アルファ－シヌクレイン抗体」は、二量体化された形態のアルファ－シヌクレインに優先的に結合し、インビトロまたはインビボで投与された場合、達成された応答、例えばアルファ－シヌクレインの凝集および細胞へのアルファ－シヌクレイン凝集体の取り込みの防止などの少なくとも１つの大幅に低下した望ましい活性をもたらす抗体を指す。
本明細書で使用される「凝集された」または「凝集」という用語は、１つより多いアルファ－シヌクレイン単量体から構成される集合体を指す。
「播種」とは、細胞内凝集の誘導を指す。具体的には、播種とは、細胞外アルファ－シヌクレインの細胞への取り込み、およびアルファ－シヌクレインの単量体プールを誘導して凝集体を形成することを指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によって相互接続されるように、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を有する、操作された天然に存在しないポリペプチド複合体を指し、抗体は、ＩｇＧアイソタイプ抗体である。各重鎖は、Ｎ末端ＨＣＶＲおよび重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、Ｎ末端ＬＣＶＲおよび軽鎖定常領域から構成される。特定の生物学的系において発現する場合、抗体は、Ｆｃ領域においてグリコシル化される。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位の抗体のＦｃ領域に生じる。Ｎ－グリカンは、典型的には、アスパラギンに結合する。抗体は、他の位置でもグリコシル化され得る。
本発明の抗体はエフェクター機能を欠いている。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ４ＰＡＡ抗体である。ＩｇＧ４ＰＡＡ抗体は、それぞれ２２８位、２３４位、２３５位（ＥＵ番号付けに従う）にセリンからプロリンへの置換および２つのロイシンからアラニンへの置換（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＩｇＧ４抗体である。Ｓ２２８Ｐ変異は、抗体形成の半分を排除する。２つのアラニン変異は、ＦｃγＲとの疎水性相互作用を破壊して、残存するエフェクター機能を排除することが知られている。
重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ１は、ＨＣＶＲの後にあり、ＣＨ１およびＨＣＶＲは、抗原（複数可）に結合する抗体の一部である抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントの重鎖部分を形成する。ＣＨ２は、ヒンジ領域の後にあり、ＣＨ３の前にある。ＣＨ３は、ＣＨ２の後にあり、重鎖のカルボキシ末端にある。軽鎖の定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＣＬは、ＬＣＶＲの後にあり、ＣＬおよびＬＣＶＲは、Ｆａｂの軽鎖部分を形成する。
本発明の抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分することができ、それには、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存されている領域が点在する。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でのアミノ末端からカルボキシ末端へと配置している３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含む。Ｋａｂａｔ ＣＤＲの定義（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１））は、抗体配列可変性に基づく。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））は、抗体の３次元構造およびＣＤＲループのトポロジーに基づく。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの定義は、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２を除いて、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの定義と同一である。Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲの定義（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））は、多数の結晶構造を有する親和性伝搬クラスター化（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づく。本発明の目的で、本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規則およびＮｏｒｔｈ番号付け規則に基づく。本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲの場合、Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲの定義が使用される。重鎖では、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３の両方もまた、Ｎｏｒｔｈの定義を使用する。ＨＣＤＲ２は、ＮｏｒｔｈおよびＫａｂａｔの定義のハイブリッドを使用する。Ｎｏｒｔｈの定義は、開始Ｎ末端部位を識別するために使用されるが、Ｋａｂａｔは、最後の位置を定義するために使用される。
本発明は、本発明の抗体がヒト化されているかまたはヒト抗体であることを企図している。モノクローナル抗体の文脈において、「ヒト」および「ヒト化」という用語は、当業者によく知られている（Ｗｅｉｎｅｒ ＬＪ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６；２９：１－９；Ｍａｌｌｂｒｉｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｅｓｔｈｅｔ．２０１６；９：１３－１５）。
本発明のＤＮＡ分子は、本発明の抗体中のポリペプチド（例えば、重鎖、軽鎖、可変重鎖、および可変軽鎖）のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子である。
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域でよい。好ましくは、本発明の抗体について、軽鎖定常領域は、カッパ定常領域である。
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後に宿主細胞において発現し得る。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含む。
本発明の抗体は、哺乳動物細胞において容易に産生することができ、この非限定的な例は、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ２９３、またはＣＯＳ細胞を含む。宿主細胞は、当該技術分野において周知の技術を使用して培養される。
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じて異なる周知の方法によって宿主細胞に導入され得る。
タンパク質精製の様々な方法は、抗体を含むがこれらに限定されないタンパク質を精製するために使用されることができ、そのような方法は当該技術分野で知られている。
本発明の抗体、またはそれを含む医薬組成物は、非経口経路によって投与されることができ、この非限定的な例は皮下投与および静脈内投与である。本発明の抗体は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に単回用量または複数回用量で患者に投与され得る。本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．（２０１２），Ａ．Ｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）、本明細書に開示される抗体、および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」（または「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）という用語は、既存の症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を遅延、妨害、抑制、緩和、停止、軽減、または反転させることを指す。
「有効量」とは、研究者、医師、または他の臨床医によって求められている組織、系、動物、哺乳動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的応答、またはそれに対する所望の治療効果を誘発するであろう本発明の抗アルファ－シヌクレイン抗体、またはそのような抗体を含む医薬組成物の量を意味する。抗体の有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子に応じて変動し得る。そのような利益には、病理学的レビー小体の広がりの減少、運動機能の改善、および／または認知の改善が含まれるが、これらに限定されない。有効量は、既知技法の使用によって、そして同様の状況下で得られる結果を観察することによって、当業者によって容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、これらに限定されないが、患者のサイズ、年齢、および全体的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度、または関与、または重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物の生物学的利用能特性；選択される投薬計画；付随する医薬品の使用；ならびに他の関連する状況を含む、多数の因子が担当診断医によって考慮される。
本明細書で使用される場合、「シヌクレイノパチー」という用語は、ニューロンにおけるα－シヌクレインタンパク質の凝集体の異常な蓄積を特徴とする神経変性疾患または神経変性疾患のファミリーを指す。例示的な状態には、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が含まれる。
実施例：抗体発現および精製
本発明の抗アルファ－シヌクレイン抗体は、本質的に以下の通りに調製および精製することができる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比（１：３または１：２など）を使用して抗体を分泌するための発現系、またはＨＣおよびＬＣの両方をコードする単一のベクター系で、一過性でまたは安定的にトランスフェクトすることができる。抗体が分泌された既知組成培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを使用して精製されてもよい。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合した緩衝液で平衡化された、Ｆａｂフラグメント用のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用され得る。カラムは、非特異的結合構成成分を除去するために洗浄され得る。
結合抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．０～１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４～１００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ３．０など）によって溶出され得る。抗体画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどによって検出され得、次いで、プールされてもよい。意図する使用に応じて、さらなる精製は任意選択的である。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮およびまたは滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダル、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、約９５％～約９９％である。
抗体重鎖のＮ末端にある低い割合（約１％）のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換され得ると予想される。さらに、抗体重鎖のＣ末端にあるグリシンの割合が低い（約１％未満）が、翻訳後に切断（クリップ）され得る。
産物は、冷蔵で保持され得るか、－７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。本発明の例示的なヒト化抗体のアミノ酸配列番号を以下の表１に示す。
Figure 2022513481000001
Figure 2022513481000002
例：組換えヒトα－シヌクレイン原線維に対する抗体親和性
組換えヒトα－シヌクレイン原線維に対する抗体親和性を定量的に測定するために、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が実行される。ヒトα－シヌクレイン原線維は、超音波処理する前に組換えα－シヌクレイン単量体を２週間連続的に振とうすることによって生成される（Ｐｏｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ８（２０１８）３０３－３２２）。
ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの組換えヒトα－シヌクレイン原線維で、４℃で一晩コーティングされる。翌日、プレートを１％カゼインとともに室温で１時間インキュベートして、プレート上の非特異的結合部位をブロックする。次に、プレートを０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄し、３ｘ連続希釈抗体（抗体１、抗体２、またはコンパレーター抗体１）と室温で１時間インキュベートする。コンパレーター抗体１（「Ｃ．Ａ．１」）は、米国特許第８，６０９，８２０号（例えば、図１および図２）に示され、記載されているように、ＨＣＤＲ １～３（Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ３）およびＬＤＣＲ １～３（Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ３）を有する抗体として記載されている。インキュベーション後、プレートを０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄して未結合の抗体を除去し、０．１％ＰＢＳＴ中の検出剤（１：１０００希釈ヤギ抗ヒトカッパ－ＡＰ）と室温で１時間インキュベートする。プレートを０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄して、結合していない検出剤を除去し、基質とともに室温で１５分間インキュベートする。次に、ＯＤをＥＬＩＳＡプレートリーダーで５６０ｎｍで読み取る。結合曲線は、抗体濃度およびＯＤ５６０の読み取り値に基づいて得られる。抗体親和性は、最大結合シグナルの５０％（ＥＣ５０）を与える濃度として決定される。
本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 2022513481000003
これらのデータは、本発明の抗体がヒトアルファ－シヌクレイン原線維に高い親和性で結合することを示している。
例：抗体１および抗体２の単量体アルファ－シヌクレインへの結合
単量体のヒトα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３７８４０；配列番号１３）に対する抗体１および抗体２の結合親和性を評価する。抗体１および抗体２の結合親和性はまた、ヒト、カニクイザル、ウサギ、ラット、およびマウスのアルファ－シヌクレインを含むさまざまな種について決定される。
単量体α－シヌクレイン結合親和性は、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｋｉｎｅｘａ）を使用して３７℃で測定される（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｒ，ａｎｄ Ｂｒａｕｌｔ，Ｐ．Ａ．（２００４）Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２（６）：６４７－６５７）。Ｋｉｎｅｘａアッセイは、プレートベースのＥＬＩＳＡアッセイにおけるα－シヌクレインのクラスター化された性質とは対照的に、溶液中のα－シヌクレインの親和性を評価する能力があるため、特に生理学的に関連性がある。
２００ｐＭの固定抗体濃度の別々の容器を、５０μＭ～８４７ｐＭの範囲の単量体アルファ－シヌクレインの段階希釈液と混合する。これらのサンプルを３７℃で２４～４８時間インキュベートして、定常状態の平衡を達成できるようにする。この間、セファロースビーズは単量体のヒトアルファ－シヌクレインと結合し、好適な非特異的結合タンパク質（通常はＢＳＡまたはカゼイン）でブロックされる。定常状態が達成されると、小さなキャピラリーにコーティングされたビーズが詰められ、各固定抗体／アルファ－シヌクレイン単量体のサンプルがカラムに注入される。このステップでは、結合していない遊離抗体は複合体抗体から選択的に捕捉され、その後、蛍光標識された二次抗ヒト抗体を介して検出される。このステップは、アルファ－シヌクレイン単量体の各濃度および結果として生じる蛍光シグナル（遊離抗体の割合に比例）に対して繰り返され、次に、単量体α－シヌクレイン濃度に対する蛍光シグナルの関数としてプロットされ、１：１結合モデルにグローバルに適合させてＫＤが得られる。技術的な重複（９５％信頼区間）を使用した独立した実行（ｎ＝３）が報告される。
基本的に上記のように実施された実験では、以下の種のα－シヌクレインについて以下のデータが得られた：ヒト（ｕｎｉｐｒｏｔ受託Ｐ３７８４０）、カニクイザル（ｕｎｉｐｒｏｔ受託Ｐ６１１４２）、ラット（ｕｎｉｐｒｏｔ受託Ｐ３７３７７）、ウサギ（ｕｎｉｐｒｏｔ受託Ｇ１Ｕ０Ｖ２）およびマウス（ｕｎｉｐｒｏｔ受託Ｏ５５０４２）。
Figure 2022513481000004
これらのデータは、抗体１および抗体２がヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスのアルファ－シヌクレインに結合し、程度は低いがウサギのアルファ－シヌクレインに結合することを示している。
例：抗体１および抗体２の二量体アルファ－シヌクレインへの結合
マウスＦｃ（ｍＩｇＧ１－ｈＡｓｙｎ１００～１４０）上の残基１００～１４０を含むヒトα－シヌクレインのＣ末端フラグメントのアビディティーサロゲート二量体提示に対する抗体１および抗体２の結合親和性を評価する。結合親和性は、ＭＳＤ－ＳＥＴと呼ばれるＫｉｎｅｘａの原理に基づくプレートキャプチャー法を使用して決定される（Ｅｓｔｒｅｐ， ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＭＡｂｓ，５（２）：２７０－２７８）。短い非構造化リンカー要素によって分離された、マウスＦｃフラグメントのＣ末端に融合した配列番号１３の最後の４０個のアミノ酸を含むヒトアルファ－シヌクレインの合成二量体提示が作製される（ｍＩｇＧ１－ｈＡｓｙｎ１００～１４０）。この合成サロゲート分子は、生化学的特性評価の取り組みのために、アビディティーコンピテントなヒトα－シヌクレイン凝集体サロゲートの比較的安定した均一な提示を提供する。
抗体（１００ｆＭ）は、２倍希釈系列で３．６７ｆＭ～７．６９ｎＭの範囲のｍＩｇＧ１－ｈＡｓｙｎ１００～１４０の濃度を増加させながら混合し、２５℃または３７℃で定常状態の平衡を達成する。このインキュベーション時間中、ＭＳＤセクタープレートは単量体のヒトアルファ－シヌクレインでコーティングされ、ブロッキング試薬（すなわち、ＢＳＡ、カゼイン）でブロックされる。定常状態の平衡インキュベーション時間に続いて、個々の抗体／ｍＩｇＧ１－ｈＡｓｙｎ１００～１４０混合物をプレートに同時に添加し、１０分間インキュベートして遊離抗体を捕捉し、ｍＩｇＧ１－ｈＡｓｙｎ１００～１４０と複合体を形成した抗体との交換を最小限に抑える。この短いインキュベーションに続いて、プレートを洗浄し、ビオチン化抗ヒト二次抗体とインキュベートし、ＭＳＤ機器でストレプトアビジン－Ｓタグを使用して検出する。次に、得られたＭＳＤシグナル（遊離抗体％に比例）をｍＩｇＧ１－ｈＡｓｙｎ１００～１４０濃度の関数としてプロットし、４つのパラメーターに全体的に適合させてＩＣ５０（ＫＤ）を取得する。報告された９５％信頼区間は、それぞれ技術的な重複があるＮ＝３の独立した実行のフィッティングを表している。アビディティー因子は、単量体親和性と二量体親和性の間のレシオメトリックな差であり、抗体に対する単量体と二量体のα－シヌクレイン間の結合の選択性を表す。親和性の値を表４に示す。
Figure 2022513481000005
表４に示すように、２５℃のデータは、抗体２およびＣ．Ａ．１と比較して抗体１の二量体α－シヌクレインに対する親和性が高いことを示している。３７℃では、抗体１の親和性は二量体α－シヌクレインに対するＣ．Ａ．１と比較して（平均で）６．７倍高くなる。抗体１の３７℃のデータは、単量体ヒトα－シヌクレイン（ＫＤ １９ｎＭ、表３を参照）と二量体ヒトα－シヌクレイン（凝集体サロゲート；ＫＤ ０．９７ｐＭ、表４参照）との間のアビディティー因子（選択性指標）は約２０，０００倍であることを示している。
例：ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞へのヒトα－シヌクレイン原線維取り込みのインビトロ定量化
抗体１がヒトα－シヌクレイン凝集体の形成を阻害するメカニズムを調査するために、抗体１がα－シヌクレイン原線維の内在化（取り込み）をブロックする能力を測定する。
ヒトα－シヌクレイン原線維は、組換えα－シヌクレイン単量体（アミン反応性ｐＨ感受性色素ｐＨＡｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９８４１）で標識）を２週間連続して振とうすることにより生成され、その後超音波処理される（Ｐｏｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ８（２０１８）３０３－３２２）。ｐＨＡｂ色素で標識されたヒトα－シヌクレイン原線維（２μｇ／ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌ～０．０９７μｇ／ｍｌの範囲の段階希釈抗体に添加する。次に、この混合物を平均２５，０００個のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞／ウェルに加え、３７℃で一晩インキュベートする。
翌日、細胞を洗浄し、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒ３７６０５）で２０分間インキュベートし、再度洗浄した後、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５装置（ＢｉｏＴｅｋ）でハイコンテントイメージングにより画像化した。ｐＨＡｂ色素は、酸性ｐＨでのみ蛍光を発する（すなわち、色素が内部移行時にエンドサイトーシス／リソソーム経路に入るとき）。したがって、細胞あたりの内在化強度を計算するには、ｐＨＡｂ色素からの総蛍光強度をウェルあたりの核の数で割る。データポイントごとに少なくとも２０，０００個の細胞が重複してカウントされる。細胞の蛍光強度は、ヒトα－シヌクレイン原線維の内在化と相関しており、生細胞を可能にし、ｐＨＡｂ標識ヒトα－シヌクレインの取り込みを定量的に読み取ることができる。
本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 2022513481000006
表５に示すように、抗体１はヒトα－シヌクレイン原線維の内在化を阻害し、平均ＩＣ５０は０．４５μｇ／ｍｌであった。抗体２は、ヒトα－シヌクレイン原線維の内在化を阻害し、平均ＩＣ５０は０．５６μｇ／ｍｌであった。同様の研究では、Ｃ．Ａ．１は、０．４４μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有し、制御ｈＩｇＧ１抗体は、内在原線維ｐＨＡｂ標識ヒトα－シヌクレインには影響を及ぼさなかった。これらのデータは、試験された抗体がα－シヌクレインの取り込みを阻害できることを示している。
例：ＳＨＳＹ－５Ｙ－Ａ５３Ｔ－ｍｙｃ細胞におけるヒトα－シヌクレイン媒介凝集の抗体１阻害のインビトロ評価
Ａ５３Ｔは、早期発症型ＰＤの強い素因を持つ特定の個人に見られるα－シヌクレインの天然に存在するバリアントである。いくつかの研究は、Ａ５３Ｔがヒトα－シヌクレインにより迅速な凝集表現型を与えることを示している。ヒトα－シヌクレイン凝集体形成の阻害は、ヒトα－シヌクレインの変異体Ａ５３Ｔ型を過剰発現するようにテトラサイクリン誘導性であるヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ－Ａ５３Ｔ－ｍｙｃ発現細胞を使用して決定される。
ヒトα－シヌクレインの凝集を測定するために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－Ａ５３Ｔ－ｍｙｃ細胞を、増殖培地および１μｇ／ｍｌテトラサイクリンのウェルあたり４０，０００個の細胞で、黒色のＣｅｌｌＢＩＮＤプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する。翌日、培地を除去し、６０μｇ／ｍｌ～０．０２７μｇ／ｍｌの範囲の抗α－シヌクレイン抗体の８点希釈曲線を含み、３μｇ／ｍｌの固定濃度の超音波処理したヒトα－シヌクレインであらかじめ形成された原線維（ＰＦＦ）および１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む新しい培地と交換する。テトラサイクリン単独およびＰＦＦ単独が凝集対照として含まれている。希釈系列の各濃度について３つの技術的反復がある。
プレートを３７℃、湿度９５％で５日間インキュベートした後、１Ｘ Ｐｒｅｆｅｒ固定液（Ａｎａｔｅｃｈ）で１時間固定する。プレートを１ＸＤＰＢＳで２回、トリス緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）で１回洗浄する。細胞をＴＢＳＴ中の５％ミルク（Ｄｉｆｃｏ）で１時間ブロックし、１μｇ／ｍｌの一次抗体マウス抗ｐＳ１２９、および５％ミルク／ＴＢＳＴで１：１０００に希釈したヒツジ抗ｍｙｃ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＰＡ３－９８１）で、４℃で一晩免疫染色する。
次にプレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体のヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３２７２８）およびロバ抗ヒツジＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１４３６）とともに室温で２時間超インキュベートし、それぞれＴＢＳＴで１：１０００に希釈する。プレートをＴＢＳＴで２回、次にＤＰＢＳで２回洗浄し、次に密封する。プレートを、Ｓｐｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｖ４．０アルゴリズムを使用したハイコンテントイメージングおよび分析のためにＩｎｓｉｇｈｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに装填する。アルゴリズムによって生成されたデータを、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアｖ７．０を用いてＩＣ５０の計算のために処理する。
本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 2022513481000007
これらのデータは、本発明の抗体がＳＨＳＹ－５Ｙ－Ａ５３Ｔ－ｍｙｃ細胞におけるアルファ－シヌクレイン凝集を阻害することができることを示している。表５に示すｐＨＡｂ内在化阻害データと比較して、非常に類似したＩＣ５０の値を有するＣＲＣ曲線の重複がある（表６の０．４１μｇ／ｍｌと比較した表５のＩＣ５０ ０．４５μｇ／ｍｌ）。これらの結果は、抗体１によるヒトα－シヌクレイン原線維誘発性の凝集および播種の阻害は、細胞へのヒトα－シヌクレイン原線維の内在化を阻害することによって直接引き起こされる可能性があることを示唆している。
例：ＳＨＳＹ－５Ｙ－Ａ５３Ｔ－ｍｙｃ細胞でのｐＨＡｂ標識残基１～１２１および１～１４０のα－シヌクレイン原線維取り込みの抗体１およびＣ．Ａ．１阻害のインビトロ評価
長さが残基１～１２１（配列番号１３のアミノ酸１～１２１）および１～１４０（配列番号１３）のｐＨＡｂ標識α－シヌクレイン原線維が生成される。アルファ－シヌクレイン単量体はｐＨＡｂ色素で標識され、緩衝液が交換された後、１４００ＲＰＭで２週間振とうされる。２週間の終わりに、実験の前に原線維を１２０秒間超音波処理する。
抗体１およびＣ．Ａ．１は、１００μｇ／ｍＬ～０．１μｇ／ｍＬまで段階希釈される。抗体は、ｐＨＡｂで標識されたα－シヌクレインの１～１２１フラグメントおよび２μｇ／ｍＬの完全長アルファ－シヌクレインと組み合わされる。次に、この溶液をＳＨＳＹ５Ｙ細胞に適用し、一晩インキュベートする。次に、細胞はＣｙｔａｔｉｏｎ ５、閾値２０００で画像化される。
本質的に上記の手順に基づいて、結果は、残基１～１２１のα－シヌクレインおよび完全長α－シヌクレインｐＨＡｂ原線維の取り込みを示した。抗体１は残基１～１２１のα－シヌクレイン原線維の取り込みをブロックしたが、Ｃ．Ａ．１は残基１～１２１のα－シヌクレイン原線維の取り込みに最小限の影響しか示さなかった（図１ａ）。抗体１およびＣ．Ａ．１は、完全長のα－シヌクレイン取り込みの阻害において同様の活性を示した（図１ｂ）。
これらのデータは、抗体１およびＣ．Ａ．１がα－シヌクレイン原線維の内在化をブロックするのに異なる効果があることを示している。抗体１は、全長原線維および残基１～１２１の原線維の両方で細胞への取り込みを用量依存的にブロックすることができたが、Ｃ．Ａ．１は残基１～１４０の原線維しかブロックすることができなかった。これは、抗体１が、フラグメント化されたアルファ－シヌクレインの内在化に結合してブロックする能力によって、より効果的であることを示唆している。
例：抗体１および抗体２のエピトープ決定。
エピトープの生化学的決定
抗体１および抗体２のエピトープは、ペプチドアラニンスキャンによって決定される。結合は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でのバイオレイヤー干渉法によって測定される。ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＰＢＳＴアッセイ緩衝液中の配列番号１３のヒトα－シヌクレイン残基１１０～１３３のビオチン化アラニン変異ペプチドのそれぞれを装填し、同じ緩衝液で洗浄し、次いで、１５μｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液を含むウェルに移した。応答信号および解離速度は、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを使用した１：１フィッティングモデルで取得される。野生型ペプチドと比較したアラニン変異ペプチドに対する応答シグナルの喪失または解離速度の変化（Ｋｏｆｆ）は、エピトープ残基を示している。
本質的に上記の手順に従って実施された実験では、抗体１および抗体２の重要な残基は、２つの別々の領域（Ｄ１１５、Ｍ１１６およびＤ１１９、およびＥ１２６およびＰ１２８）にあると決定される。同様の実験をＣ．Ａ．１で実行した。Ｃ．Ａ．１のエピトープ残基はＮ１２２およびＹ１２５であると決定された。これは、米国特許第１０，０８１，６７４号で報告されているエピトープに対応する（例えば、図６を参照）。
２つの独立したエピトープへの結合
重要なエピトープ残基は（上記のように）２つの領域にあるため、抗体１および抗体２が２つの領域に独立して結合できるかどうかを理解するために、切断されたヒトα－シヌクレインフラグメント１～１２０（配列番号１３の残基１～１２０）およびビオチン化ヒトα－シヌクレインペプチド１２０～１４０（配列番号１３の残基１２０～１４０）を使用してＥＬＩＳＡを実行した。完全長（残基１～１４０）のα－シヌクレインの結合も測定される。手順は本質的に、α－シヌクレイン原線維結合について上記した通りである。基本的に上記の手順に従って、結合曲線を図２に示す。
これらのデータは、抗体１および抗体２が、α－シヌクレインフラグメント１～１２０および１２０～１４０の両方にピコモル範囲の結合親和性で結合することを示している。抗体１は、２つのα－シヌクレインフラグメントのそれぞれに対して同様の親和性を有する。抗体２は、α－シヌクレインフラグメント１～１２０に対する抗体１と同様の親和性を有するが、α－シヌクレインフラグメント１２０～１４０に対する親和性は弱い。結果は、両方のα－シヌクレインフラグメントのＣ．Ａ．１の明確な上部および下部の漸近線の欠如を示した。抗体１、抗体２、およびＣ．Ａ．１は、同様の親和性でα－シヌクレイン単量体（１～１４０）に結合する。これらのデータは、抗体１および抗体２が切断されたアルファ－シヌクレインおよび完全長のアルファ－シヌクレインの両方に結合できることを示唆している。
アルファ－シヌクレインフラグメント分析
抗体１の結合が、パーキンソン病で上方調節されることが報告されているα－シヌクレインのカルパインＩおよびカスパーゼ切断（それぞれ残基１２２／１２３および１２１／１２２）によって影響を受けるかどうかを判断するために（Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０（５）：１７２５－１７３８、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，（２０１６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１３（３４）：９５８７－９５９２）、抗体１の単量体の進行性Ｃ末端切断への結合ヒトα－シヌクレインは、上記の完全長の単量体ヒトアルファ－シヌクレインについて前述したのと同じＫｉｎｅｘａの方法および手順を使用して評価される。試験されたアルファ－シヌクレインフラグメントは、配列番号１３のアミノ酸１～１４０、１～１２１、および１～１１５である。
本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 2022513481000008
これらのデータは、抗体１のα－シヌクレインへの結合は、パーキンソン病の患者で観察されたヒトα－シヌクレインのカルパインおよびカスパーゼ切断種の影響を受けないが、Ｃ．Ａ．１はこれらのフラグメント化された種と結合できないことを示唆している。
例：インビボでの有効性
インビボでの本発明の抗体の薬理学的有効性を評価するために、中和および末梢慢性研究の両方が、播種されたＡ５３Ｔマウスモデルにおいて実施される。
中和研究のために、組換えα－シヌクレイン原線維を本発明の抗体またはＣ．Ａ．１とほぼモル当量（わずかにモル過剰の抗体）で予備混合し、エクスビボで３０分間複合体化させ、次に混合物をマウスに注射する。動物は注入の９０日後に安楽死させる。
末梢慢性試験では、腹腔内注射によって慢性的に投与された場合の抗体の有効性を調べる。要するに、組換えα－シヌクレイン原線維を脳に注入し、本発明の抗体またはＣ．Ａ．１を原線維注入の１６時間後に注射する。抗体は隔週で合計１２０日間投与される。
両方の研究において、抗体の薬理学的有効性は、生化学的に、およびα－シヌクレイン病理の発達における変化を定量化することによる免疫組織化学によって評価される。生化学は、ＳＤＳ不溶性画分から組織から抽出されたオリゴマーα－シヌクレイン、およびレビー小体形成のマーカーとして広く受け入れられているホスホ１２９修飾（Ｐ１２９；セリン１２９でリン酸化されたα－シヌクレイン）を監視する。免疫組織化学研究は、これらのマウスのＰ１２９染色負荷を評価する。化合物の定常状態レベルを理解するために、研究終了時の血清およびＣＳＦ中の薬物濃度のＰＫパラメーターも収集される。
本発明の抗体での処理は、オリゴマーのアルファ－シヌクレインの減少およびＰ１２９染色の減少をもたらす可能性がある。
配列
抗体１および抗体２ＨＣＤＲ１（配列番号１）
ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ
抗体１および抗体２ＨＣＤＲ２（配列番号２）
ＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧ
式中、１６位のＸａａはリジンまたはグルタミンである。
抗体１および抗体２ＨＣＤＲ３（配列番号３）
ＡＲＧＹＧＭＤＶ
抗体１および抗体２ＬＣＤＲ１（配列番号４）
ＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭ
式中、５位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸である。
抗体１および抗体２ＬＣＤＲ２（配列番号５）
ＹＫＶＳＸＲＮＳ
式中、５位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である。
抗体１および抗体２ＬＣＤＲ３（配列番号６）
ＭＱＧＴＫＱＹＰＴ
抗体１および抗体２ＨＣＶＲ（配列番号７）
ＸＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
式中、１位のＸａａはグルタミン酸またはピログルタミン酸であり、６５位のＸａａはリジンまたはグルタミンである。
抗体１および抗体２ＬＣＶＲ（配列番号８）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＸＲＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＫＱＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
式中、２８位のＸａａは、セリンまたはアスパラギン酸であり、５８位のＸａａは、アスパラギンまたはアスパラギン酸である。
抗体１および抗体２ＨＣ（配列番号９）
ＸＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＸ
式中、１位のＸａａはグルタミン酸またはピログルタミン酸であり、６５位のＸａａはリジンまたはグルタミンであり、４４１位のＸａａはグリシンであるかまたは存在しない。
抗体１および抗体２ＬＣ（配列番号：１０）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＸＲＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＫＱＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
式中、２８位のＸａａは、セリンまたはアスパラギン酸であり、５８位のＸａａは、アスパラギンまたはアスパラギン酸である。
抗体１ＨＣをコードするＤＮＡ（配列番号１１）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＧＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
抗体１ＬＣをコードするＤＮＡ（配列番号１２）
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＧＣＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＡＣＣＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
ヒトアルファ－シヌクレイン（配列番号１３）
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ

Claims (32)

  1. 重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む抗アルファ－シヌクレイン抗体であって、前記ＨＣは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣは軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＶＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１によって示され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧ、式中、１６位のＸａａはリジンまたはグルタミンである）によって示され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３によって示され、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４（ＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭ、式中、５位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸である）によって示され、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５（ＹＫＶＳＸＲＮＳ、式中、５位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である）によって示され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６によって示される、抗アルファ－シヌクレイン抗体。
  2. 配列番号２の１６位のＸａａがリジンであり、配列番号４の５位のＸａａがセリンであり、配列番号５の５位のＸａａがアスパラギンである、請求項１に記載の抗体。
  3. 配列番号２の１６位のＸａａがグルタミンであり、配列番号４の５位のＸａａがアスパラギン酸であり、配列番号５の５位のＸａａがアスパラギン酸である、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７（ＸＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ、式中、１位のＸａａはグルタミン酸またはピログルタミン酸であり、６５位のＸａａはリジンまたはグルタミンである）によって示され、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号８（ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＸＲＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＫＱＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ、式中、２８位のＸａａはセリンまたはアスパラギン酸であり、５８位のＸａａはアスパラギンまたはアスパラギン酸である）によって示される、請求項１に記載の抗体。
  5. 配列番号７の１位のＸａａがグルタミン酸であり、配列番号７の６５位のＸａａがリジンであり、配列番号８の２８位のＸａａがセリンであり、配列番号８の５８位のＸａａがアスパラギンである、請求項４に記載の抗体。
  6. 配列番号７の１位のＸａａがグルタミン酸であり、配列番号７の６５位のＸａａがグルタミンであり、配列番号８の２８位のＸａａがアスパラギン酸であり、配列番号８の５８位のＸａａがアスパラギン酸である、請求項４に記載の抗体。
  7. 前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示され、
    ａ．配列番号９によって示される前記アミノ酸配列が、ＸＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＦＨＮＨＹＴＱＫＳＦＳＦＳＦＸであり、式中、１位のＸａａはグルタミン酸またはピログルタミン酸であり、６５位のＸａａはリジンまたはグルタミンであり、４４１位のＸａａはグリシンであるかまたは存在せず、
    ｂ．配列番号１０によって示される前記アミノ酸配列が、ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＸＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＭＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＸＲＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＫＱＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣであり、式中、２８位のＸａａは、セリンまたはアスパラギン酸であり、５８位のＸａａは、アスパラギンまたはアスパラギン酸である、請求項１または４に記載の抗体。
  8. 配列番号９の１位のＸａａがグルタミン酸であり、配列番号９の６５位のＸａａがリジンであり、配列番号９の４４１位のＸａａがグリシンであり、配列番号１０の２８位のＸａａがセリンであり、配列番号１０の５８位のＸａａがアスパラギンである、請求項７に記載の抗体。
  9. 配列番号９の１位のＸａａがグルタミン酸であり、配列番号９の６５位のＸａａがグルタミンであり、配列番号９の４４１位のＸａａがグリシンであり、配列番号１０の２８位のＸａａがアスパラギン酸であり、配列番号１０の５８位のＸａａがアスパラギン酸である、請求項７に記載の抗体。
  10. 配列番号１３の１１５位のアスパラギン酸、１１６位のメチオニン、１１９位のアスパラギン酸、１２６位のグルタミン酸、および１２８位のプロリンの残基でヒトアルファ－シヌクレインに結合するアルファ－シヌクレイン抗体。
  11. 前記抗体が、配列番号１３の残基１～１２０を含むアルファ－シヌクレインフラグメントに結合する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 前記抗体が、配列番号１３の残基１２０～１４０を含むアルファ－シヌクレインフラグメントに結合する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体、および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
  14. シヌクレイノパチーを有する患者を治療する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
  15. 前記シヌクレイノパチーがＰＤ、ＭＳＡ、またはＡＤである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記シヌクレイノパチーがＤＬＢである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記シヌクレイノパチーがＰＤである、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
  18. 療法での使用のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体。
  19. シヌクレイノパチーの治療における使用のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体。
  20. 前記シヌクレイノパチーがＰＤ、ＭＳＡ、またはＡＤである、請求項１９に記載の使用のための抗体。
  21. シヌクレイノパチーの治療のための医薬の製造における請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
  22. 前記シヌクレイノパチーがＰＤ、ＭＳＡ、またはＡＤである、請求項２１に記載の使用。
  23. アミノ酸配列が配列番号９によって示される抗体ＨＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
  24. アミノ酸配列が配列番号１０によって示される抗体ＬＣをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
  25. 前記ＨＣをコードする前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号１１によって示される、請求項２３に記載のＤＮＡ分子。
  26. 前記ＬＣをコードする前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号１２によって示される、請求項２４に記載のＤＮＡ分子。
  27. アミノ酸配列が配列番号９によって示されるＨＣをコードするポリヌクレオチド、およびアミノ酸配列が配列番号１０によって示されるＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ分子。
  28. 前記ＨＣをコードする前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号１１によって示され、前記ＬＣをコードする前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号１２によって示される、請求項２７に記載のＤＮＡ分子。
  29. 請求項２３に記載のＤＮＡ分子および請求項２４に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記形質転換された哺乳動物細胞が、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示される、哺乳動物細胞。
  30. 請求項２７に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記形質転換された哺乳動物細胞が、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示される、哺乳動物細胞。
  31. 抗体を産生するためのプロセスであって、前記抗体が２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、各ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９によって示され、各ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０によって示され、前記プロセスが、
    ａ．請求項２９に記載の哺乳動物細胞または請求項３０に記載の哺乳動物細胞を、前記抗体が発現するような条件下で培養することと、
    ｂ．発現した前記抗体を回収することと、を含む、プロセス。
  32. 請求項３１に記載のプロセスによって得られる抗体。
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