CN104195068A

CN104195068A - 一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂及其应用

Info

Publication number: CN104195068A
Application number: CN201410356555.XA
Authority: CN
Inventors: 王娇; 梁晶晶; 谢金萍; 张大伟; 田相利
Original assignee: QINGDAO SHANGDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: QINGDAO SHANGDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明提供了一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂及其应用，所述复合微生态制剂含有保藏编号为CGMCCNo.9161的短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和载体，所述枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌为粉剂，所述枯草芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于3×10⁹CFU/g；所述短小芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于2×10⁹CFU/g。该微生态制剂可兑水全池泼洒或拌食投喂，可降低对虾养殖水体或饲料中的副溶血弧菌的数量，减少对虾早期死亡综合症的发生几率，具有专一、安全等特点，无耐药、无残留，使用后可减少抗生素药物的使用，提高养殖时间30d以内对虾养殖成活率。

Description

一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂及其应用

技术领域

本发明属于微生态技术领域，涉及一种复合微生态制剂，具体涉及一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂及其应用。

背景技术

2009年以来，南美白对虾“早期死亡综合症”(Early Mortality Syndrome，又称急性肝胰腺坏死综合症)在亚洲地区爆发并蔓延，给各国对虾养殖业造成了巨大的经济损失，研究现已确认其病原菌为副溶血弧菌。目前弧菌病的防治主要依靠抗生素，使用方便、见效快，但过度使用或滥用会造成水体微生态失衡、耐药性菌株的产生、水产品药物残留等问题。随着水产养殖业的快速发展，利用生态防治法来控制水产养殖病害受到越来越多的重视与青睐。

发明内容

针对如何改善养殖水体生态环境，抑制副溶血弧菌的生长，减少南美白对虾放苗30d以内疾病的发生率，本发明提供了一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂及其应用，利用微生物控制技术，通过分泌抗菌活性物质、营养竞争、空间竞争等方式抑制致病副溶血弧菌的增殖，预防和减少疾病的对虾早期疾病的发生；同时微生态制剂是良好的免疫激活剂和免疫佐剂，可提高对虾抗弧菌感染能力。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

一株短小芽孢杆菌S3，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，其保藏编号为:CGMCC No.9161。

所述短小芽孢杆菌S3革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径为2-3mm，边缘整齐光滑，中间褶皱，乳白色，菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，中生。

本发明还提供了用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂，所述复合微生态制剂含有保藏编号为CGMCC No.9161的短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和载体，所述枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌为粉剂，所述枯草芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于3×10⁹CFU/g；所述短小芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于2×10⁹CFU/g。

所述载体、枯草芽孢杆菌粉剂、短小芽孢杆菌粉剂的质量配比为1:0.5:0.2。

所述的载体为加益粉，60目筛上物为0。

本发明还提供了所述的复合微生态制剂在用于制备预防和治疗对虾早期死亡综合症的饲料中的应用。

将所述复合微生态制剂兑水全池泼洒或拌料投喂。

进一步的，将该制剂兑水直接泼洒全池，用量为10³～10⁴CFU/mL；或以10⁶～10⁷CFU/kg的比例拌食投喂。与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明从对虾养殖环境中分离、筛选得到所述的短小芽孢杆菌，经中国微生物菌种保藏管理中心鉴定，并于2014年5月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.9161。

本发明所述复合微生态制剂含有的商业化枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌可适应淡水、海水中生长，低温萌发率高，生长速度较快；芽孢杆菌在养殖水体通常的温度下可较快萌发，通过分泌抗菌活性物质、营养竞争、空间竞争抑制致病溶血弧菌的生长和繁殖，能够有效控制对虾早期死亡综合症的发生和蔓延，提高了南美白对虾30d内的对虾养殖成活率。此外，芽孢杆菌生长过程中可产生丰富的蛋白酶、淀粉酶及代谢产物，改善水质，提高饲料利用率并促进动物生长。

本发明中所选用的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌在制备中采用液体深层高密度发酵技术和喷干或者冻干一系列的后处理加工工艺技术制成粉剂，制剂中活菌含量高，具有耐高温、耐胆盐、耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。

本发明所述复合微生态制剂应用于对虾养殖中，可有效预防、控制及治疗由于水体中副溶血弧菌浓度超标引起的对虾早期死亡综合症，改善对虾生长状态，提高放苗成功率，减少抗生素的使用，具有安全性、高效性、专一性、无残留和无副作用等优点，提高水产品的食用安全性。

附图说明

图1为所述复合微生态制剂的抑菌试验结果。

图2为本发明中副溶血弧菌在TCBS平板上的菌落形态。

具体实施方式

本发明结合以下具体实例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1颉颃菌的筛选

一、短小芽孢杆菌S3的分离筛选

2013年5月至2013年9月，从胶州沿海多处采集虾养殖区域的水样、底泥、对虾肠道粪便。底泥、对虾肠道粪便样品分别于无菌生理盐水中10倍稀释，充分研磨，取上清为样品液；水样直接作为样品液；样品液分别接种于2216E液体培养基中30℃富集培养48h后稀释，涂布于2216E平板中进行菌株的分离、纯化，共筛选出26株纯菌。

已纯化单菌株采用平板点种法筛选颉颃菌。以副溶血弧菌为指示菌，将副溶血弧菌接种于2216E液体培养基中培养18h，稀释制备成10⁵～10⁶CFU/mL的菌悬液，取0.1mL涂布2216E平板，备用。用无菌牙签挑取待筛选的菌株，点接于含菌平板中，25℃恒温培养24h，观察点接菌落周围是否出现明显的抑菌圈或覆盖区。

对分离到的26株细菌采用点种法筛选到3株对副溶血弧菌具有颉颃作用的菌株，其中S3对副溶血弧菌具有较强的颉颃作用，能明显抑制病原菌的生长，在病原菌周围产生明显清晰的抑菌圈。

经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株S3为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约2mm，边缘整齐光滑，中间褶皱，乳白色。菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，中生。

二、短小芽孢杆菌的分子遗传学分类鉴定

首先提取菌株S3的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16S rRNA片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率达到99％。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S316S rRNA与Bacilluspumilus同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌。

将筛选到的菌株S3进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年5月13日；短小芽孢杆菌Bacilluspumilus的保藏编号为CGMCC No.9161。

实施例2、抑菌效果测定

利用所述短小芽孢杆菌配制复合微生态制剂，所述复合微生态制剂含有保藏编号为CGMCC No.9161的短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和载体，所述枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌为粉剂，所述枯草芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于3×10⁹CFU/g；所述短小芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于2×10⁹CFU/g。本发明中所述复合微生态制剂中所述载体、枯草芽孢杆菌粉剂、短小芽孢杆菌粉剂的质量配比为1:0.5:0.2。所述的载体为加益粉，60目筛上物为0。

采用96微孔板法测定复合微生态制剂的抑菌效果。将副溶血弧菌在2216E培养基中30℃培养约8h，菌液备用。取复合微生态制剂1g于100mL无菌水中振荡离心取上清备用。首先，在无菌96微孔板的A排2-8孔中添加100μl2216E培养基；在第1、2孔中再分别加入100μl微生态制剂上清液，混匀，从第2孔开始二倍稀释至第8孔；最后，1-8孔每孔加入100ul弧菌液、100ul2216E培养基。A排第9、10孔为弧菌对照，即加入100ul弧菌液和200ul2216E培养基。第11、12孔为空白对照，加入300ul2216E培养基。B、C、D…加样方式同A排进行重复试验。加完样后，酶标板放置30℃、75rpm孵育16h，用酶标仪测定OD630nm。

结果如图1所示，结果表明本发明所述复合微生态制剂稀释100、200、400倍后对副溶血弧菌具有明显的抑制作用，即酶标板上第1-3孔吸光值与第11-12空白吸光值无显著性差异，表明在此浓度下，复合微生态制剂可以完全抑制弧菌生长。但随着稀释倍数再次放大，复合微生态制剂抑菌效果大幅降低。

实施例3、在南美白对虾早期死亡综合症预防中的应用

试验分为对照组和试验组，每组3个平行，每组50万尾，虾苗0.3～0.5cm。试验组每7天泼洒一次所述复合微生态制剂(0.2～2g/m³)，对照组不泼洒制剂，试验组与对照组其他管理保持一致，30天后计算虾苗成活率。对照组成活率为49.3％，试验组成活率为72.3％，差异显著(P<0.05)，说明该复合微生态制剂可明显提高对虾育苗成活率。

实施例4、在发生早期死亡综合症的南美白对虾养殖池塘中的副溶血弧菌抑制试验

试验选取10个虾苗来源、生长状态一致的虾塘(约2亩/塘)，随机分为2组，对照组按养殖户通常模式饲养(使用抗生素或者蛭弧菌类产品)，试验组分别在第0、1、6天时只向水体中泼洒微生态制剂，用量为100g/亩，在第0、1、2、7、15天取池塘水样(每个池塘取3处不同位置水样，混匀后作为检测水样)，采用TCBS平板测定疑似副溶血弧菌数量(菌落形态为绿色大菌落)，同时观察对虾摄食及生长、死亡情况。

表1水体中弧菌数量变化

注：数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)

从表1中可以看出，对照组使用氟苯尼考、土霉素等抗生素可控制弧菌数量，但成本偏高，效果一般，15天后弧菌减少量为37.2％，与使用前相比差异显著(P<0.05)。试验组泼洒复合微生态制剂2天后，弧菌数量减少了74.7％，与使用前相比差异显著(P<0.05)，15天时弧菌减少量为77.6％(P<0.05)，使用效果优于对照组。从TCBS平板中挑取单菌落，经16S rRNA测序比对，确定为副溶血弧菌(如图2所示)。

为改善水体微生态环境，减少水体中弧菌数量，提高对虾抗弧菌感染能力，在使用方面可将该制剂兑水直接泼洒全池(10³～10⁴CFU/mL)，或以(10⁶～10⁷CFU/kg)的比例拌食投喂两种方法。

使用方法：直接施用于养殖水体。取菌剂兑养殖水搅拌30min后全池泼洒，一般预防病害的使用频率为7～10天/次，使用前后严禁使用抗生素。高密度养殖或有疾病发生时可增加使用频率2～3天/次。

本发明所述复合微生态制剂在淡水、海水养殖应用方面使用简单、效果稳定显著，无污染无残留；菌株发酵可实现产业化，成本低，适于产品的推广应用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一株短小芽孢杆菌S3，其特征在于：其分类命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），其保藏编号为:CGMCC No. 9161。

2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌S3，其特征在于，所述短小芽孢杆菌S3革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径为2-3 mm，边缘整齐光滑，中间褶皱，乳白色，菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，中生。

3.一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂含有保藏编号为CGMCC No. 9161的短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和载体，所述枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌为粉剂，所述枯草芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于3×10⁹CFU/g；所述短小芽孢杆菌粉剂的菌含量不低于2×10⁹CFU/g。

4.根据权利要求3所述的用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂，其特征在于，所述载体、枯草芽孢杆菌粉剂、短小芽孢杆菌粉剂的质量配比为1: 0.5: 0.2。

5.根据权利要求3所述的用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂，其特征在于，所述的载体为加益粉，60目筛上物为0。

6.根据权利要求3所述的复合微生态制剂在用于制备预防和治疗对虾早期死亡综合症的饲料中的应用。

7.根据权利要求6所述的复合微生态制剂在用于制备预防和治疗对虾早期死亡综合症的饲料中的应用，其特征在于，将所述复合微生态制剂兑水全池泼洒或拌料投喂。

8.根据权利要求7所述的复合微生态制剂在用于制备预防和治疗对虾早期死亡综合症的饲料中的应用，其特征在于，将该制剂兑水直接泼洒全池，用量为10³～10⁴CFU/mL；或以10⁶～10⁷CFU/kg的比例拌食投喂。