KR20140048008A - 효소 반응성 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체 및 이를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 조성물 - Google Patents
효소 반응성 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체 및 이를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암세포에서 과발현되는 특정 효소의 작용에 의하여 형광 및 반응성 산소 생성이 활성화되는 나노복합체에 대한 것으로, 더 자세하게는 생체 고분자-광감각제 결합체에 그라핀 옥사이드를 결합시킨 암세포 선택적 형광 영상 또는 광열 치료를 위한 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체에 관한 것이다. 이에 따른 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암세포에서 발현하는 효소에 선택적으로 반응하여 강한 형광신호를 생성시킬 뿐만 아니라, 반응 산소종 및 열을 발생시키는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암의 형광 영상 진단뿐 아니라 광역학/광열 치료에 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암의 형광 영상 진단뿐 아니라 광역학/광열 치료에 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 암세포에서 과발현되는 특정 효소의 작용에 의하여 형광 및 반응성 산소 생성이 활성화되는 나노복합체에 관한 것으로, 더 자세하게는 생체 고분자-광감각제 결합체에 그라핀 옥사이드를 결합시킨 암세포 선택적 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료를 위한 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체에 관한 것이다.
광역학 치료법(photo dynamic therapy: PDT)은 광감각제(photo-sensitizer)를 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하는 기술을 일컫는다. 이러한 광역학 치료법(PDT)은 BC 1400년경부터 시도되어 20세기 초부터 활발한 연구가 진행되었고, 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 동맥경화 및 관절염을 포함한 염증성 질환의 치료, 치과 질환 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 피부질환 등의 치료에서 사용되고 있으며 그 응용범위는 점차 확대되고 있다.
광감각제는 특정 파장의 빛에 조사되어 에너지적으로 여기(excitation)될 수 있으며, 이때 형광 신호를 발생하거나, 여기된 에너지를 주변의 기질 또는 산소에 전달하여 반응성 산소종(일항산소, 산소 라디칼, superoxide 및 peroxide 등)을 생성하면서 주변 종양 세포를 자멸(apoptosis) 또는 괴사(necrosis) 시킬 수 있다.
현재 광역학 치료 요법에 사용되고 있는 광민감성 물질로는 포르피린(porphyrin) 유도체, 크로린(chlorin), 박테리오크로린(bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid) 유도체 등이 알려져 있으며, 광민감성 사이클릭 테트라피롤 유도체는 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특성상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단 시약으로도 활용될 수 있는 특징이 있다.
또한, 암세포 뿐 아니라 정상세포에도 심각한 독성효과를 나타내는 부작용을 갖는 항암제와는 달리, 광감각제는 빛에 노출되지 않으면 높은 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않으므로 빛에 노출되지 않은 정상 세포는 그대로 보존하면서 암세포만 선택적으로 제거할 수 있기 때문에 반복치료가 가능하며, 대부분 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있으며, 간단한 국소 마취만으로도 수술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다.
다만, 광감각제를 이용한 광역학 치료법이 기존의 항암치료나 방사선 치료에서 보이는 부작용을 현저히 줄이면서도 암 치료 효과는 극대화할 수 있는 장점이 있으나, 광역학 치료 후 발생하는 피부 광민감성(skin photosensitivity)의 문제가 지적되고 있다. 일례로, 미국 식약청의 허가를 받아서 암치료에 사용되는 광감각제인 Photofirin의 경우, 정상조직에 비특이적으로 축적되어 광역학 치료 후에도 오랜기간 광감각제가 피부와 눈 등에 잔존하므로, 환자가 빛에 노출되는 경우 피부 또는 눈의 정상세포를 죽이는 피부 광민감성 부작용을 보인다.
또한, 광역학 치료는 빛이 투과하지 못하는 부피가 큰 종양세포에는 적용하기 어려우며 특히, 종양 내에서의 축적이 어려워서 종양 내의 광감각제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못한다는 문제점이 있다.
또한, 이러한 광역학 치료는 광감각제의 반감기가 길어 시술 후 6주 이상 빛이 없는 환경에서 생활해야하는 불편함이 있으며, 광감각제가 종양 조직 주변의 정상조직에도 쌓이는 경우 표적-대비-배경신호 비(target-to-background signal ratio)가 나빠지기 때문에 광감각제를 이용한 종양의 형광 영상 진단에 효율적이지 못하다.
이에, 정상조직에 대한 비특이적 축적을 줄이기 위한 친수성 특성을 갖는 개질된 광감각제가 개발되고 있다. 그러나, 정상세포에 대한 비특이적인 축적이 감소되고 체내에서 보다 빠르게 배출 되어 피부 광민감성 지속 기간이 상당히 단축되는 장점이 있는 반면, 종양 조직 치료에 충분한 양이 전달되기 위해서는 용량을 높여서 투야해야하는 단점이 있으며, 암 세포 내 침투도 어렵기 때문에 광역학 치료 효능이 낮아진다는 단점이 있다. 따라서, 암 세포에 특이적으로 축적률이 높고, 부작용이 없으며, 치료 효과가 우수한 새로운 광역학 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 그라핀 옥사이드는 단일층 탄소 원자의 2차원 결정으로 구성된 그라핀 상에 카르복시, 하이드록시 또는 에폭시기가 결합된 구조를 갖는 화합물로, 빛에 반응하여 열을 생성해 내는 특성을 가지고 있다. 따라서, 빛을 이용하여 암을 비침습적으로 광열 치료할 수 있는 나노 광의약품의 후보 물질로 가능성을 나타내고 있다. 그러나, 그라핀 옥사이드는 형광신호 등을 생성해 내지는 못하기 때문에 그 자체로서는 암의 위치를 알려주는 기능이 없으며, 정맥주사로 투여한 그라핀 옥사이드가 암 조직에 도달했는지를 알기 위해서는 그라핀 옥사이드에 영상 조영제를 추가로 도입해야 하는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 암세포에 선택적으로 반응하여 형광 영상 진단이 가능하고 광역학 및 광열 치료가 가능한 신규한 나노의약품을 연구하던 중, 그라핀 옥사이드에 생체 고분자-광감각제 결합체를 결합시킨 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체가 특정 효소의 활성에 반응하여 분해됨으로써 선택적으로 강한 형광 및 반응성 산소를 생성하는 것은 물론, 그라핀 옥사이드가 빛에 반응하여 열을 내는 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암세포에서 과발현되는 특정 효소의 작용에 의하여 강한 형광을 생성하는 형광 영상용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체를제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 빛에 반응하여 반응성 산소종 및 열을 생성하는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생체 고분자-광감각제 결합체에 그라핀 옥사이드를 결합한 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '그라핀 옥사이드'는, 단일층 탄소 원자의 2차원 결정으로 구성된 그라핀 상에 카르복시, 하이드록시 또는 에폭시기가 결합된 구조를 갖는 화합물을 의미하며, 근적외선 파장 영역(600 nm 내지 900 nm)에서 높은 빛 흡수 능력을 가지고 있다. 본 발명에서 상기 그라핀 옥사이드는 광감각제에 대한 소광자(quencher)로 작용할 수 있으며, 빛에 반응하여 열을 발생할 수 있다. 또한, 그라핀 옥사이드는 5 nm 내지 500 nm 범위의 입자 크기를 갖는 것이 바람직하다.
상기 생체 고분자-광감각제 결합체는 효소에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 폴리펩티드 기질을 함유하는 백본을 포함하고 있는 생체 고분자 화합물 또는 효소에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩타이드 기질을 함유하는 생체 고분자와 광감각제를 연결하는 연결자를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 '생체 고분자(biopolymer 또는 biomacromolecules)'는, 생물에 의해 합성되어 생체 내에서 존재하며 특정 효소에 의하여 분해되는 생체 적합성 고분자 화합물의 총칭을 의미한다. 본 발명의 생체 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 폴리라이신(poly(L-lysine)), 폴리에틸렌 글리콜-폴리 라이신(poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)), 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 풀루란(pullulan), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 엘라스틴(elastin) 또는 덱스트란(dextran)인 것이 바람직하다.
상기 효소는 히알루로니디아제(hyaluronidase), 헤파라네이즈(heparanase), 카텝신류(cathepsin), 콘드로이티나아제(chondroitinase), MMP류(matrix metallo-peptidase), 막 유형의 MMP류(matrix metallo-peptidase), 콜라게나제류(colloganase), 스트로멜리신류(stromelysin), 유로키나제형 플라스미노젠 활성화제(urokinase-type plasminogen activator, u-PA), 카스파제류(caspase), 바이러스성 단백질분해효소류(viral protease), HIV 단백질분해효소류(HIV protease), HSV 단백질분해효소류(HSV protease), 젤라틴분해효소(gelatinase), 유로키나제(urokinase), 세크리테이즈류(secretase), 엔도솜 가수분해효소(endosomal hydrolase), 전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA), 플라스미노겐활성화제(plasminogen activator), 트롬빈(thrombin), 에스테라아제(esterase), 플루라나아제(pullulanase) 및 덱스트라나아제(dextranase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 펩타이드 기질은 RPLALWRS(서열번호 1), GGLGQRGRSANAILE(서열번호 2), GVSQNYPIVG(서열번호 3), LVLASSSFGY(서열번호 4), PLGMWSR(서열번호 5), PGNWT(서열번호 6), PAGLLGC(서열번호 7), LGGSGRSANAILE(서열번호 8), RR, RRG, GPICFFRLG(서열번호 9), HSSKLQG(서열번호 10), PIC(Et)FF(서열번호 11), HSSKLQ(서열번호 12), P(L/Q)G(I/L)AG(서열번호 13), GVVQASCRLA(서열번호 14) 또는 KK를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 '광감각제'는, 특정 파장의 빛에 조사되었을 때 여기(excitation)된 후, 형광 신호를 생성하거나, 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 반응성 산소종(reactive oxygen species)를 생성하고, 생성된 반응성 산소종은 주변 종양 세포를 자멸 또는 괴사시키는 효과가 있다. 본 발명의 광감각제는 유리염기(free base) 또는 금속 착물(metal complex) 형태의 포르피린계 화합물 또는 비포르피린계 화합물일 수 있으며, 로다민 유도체, 알렉사 유도체, BODIPY 유도체 또는 시아닌 유도체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 광감각제는 chlorin e6이다.
또한, 상기 광감각제는 600 nm 내지 900 nm의 근적외선 파장 영역에서 형광신호를 내는 것이 바람직하다.
상기 생체 고분자-광감각제 결합체는 아미드 결합 또는 에스터 결합에 의해서 공유결합을 형성하는 것이 바람직하며, 상기 생체 고분자-광감각제 결합체의 공유결합 비율은 1:1 내지 1:20 몰비인 것이 바람직하다.
상기 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 광감각제가 그라핀 옥사이드의 표면으로부터 20 nm 이내의 거리에 위치하는 것이 바람직하다. 이는, 효소 작용에 의해서 상기 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체가 효과적으로 반응하게 하기 위한 것이다. 그라핀 옥사이드와 광감각제의 거리가 20 nm 이내인 경우 광감각제의 에너지를 그라핀 옥사이드가 빼앗아감으로써 광감각제가 형광신호를 발생시키지 못하게 되며, 20 nm를 초과하는 경우에는 에너지 전달현상(resonance energy transfer)에 의한 에너지 소광 현상이 효과적으로 발생하지 않아 그라핀 옥사이드 표면으로부터 광감각제가 용이하게 떨어져 나가게 하여 형광신호를 효과적으로 발생시킬 수 있다. 또한, 상기 그라핀 옥사이드와 광감각제가 파이-파이 스택킹(π-π stacking)을 이루는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명에서는 생체 고분자-광감각제 결합체를 합성하고 그라핀 옥사이드와 복합체를 형성하도록 함으로써 광감각제와 그라핀 옥사이드가 에너지 전달 현상이 일어나기에 충분히 가까운 거리를 유지하도록 조절하였다.
이하, 도 1을 통하여 본 발명의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체를 설명한다. 하기에 기재된 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 그라핀 옥사이드 표면과 광감각제가 파이-파이 스택킹(π-π stacking) 작용을 함으로써, 광감각제의 흡착이 일어난다. 추가로 생체 고분자의 백본과 그라핀 옥사이드의 소수성 상호작용에 의한 상호인력에 의해서 생체 고분자-광감각제 결합체와 그라핀 옥사이드가 더욱 견고하게 나노복합체를 이룰 수 있다. 이에, 그라핀 옥사이드 표면에 흡착된 광감각제는 그라핀 옥사이드 표면으로부터 20 nm 이내의 거리에 위치하게 되며, 광감각제가 빛에 의해서 조사되더라도 받은 에너지를 그라핀 옥사이드에 빼앗기기 때문에 형광 신호를 생성하지 못하고 반응성 산소종도 생성하지 못한다. 그 후, 질병관련 효소(예를 들어, 암세포의 성장에 관여하는 효소 등)의 작용에 의해서 생체 고분자-광감각제 결합체가 분해되어 작은 분자량으로 나뉘어지게 됨으로써, 생체 고분자-광감각제와 그라핀 옥사이드의 상호작용이 약해져 광감각제가 그라핀 옥사이드 표면으로부터 용이하게 떨어져 나가게 된다.
효소의 작용에 의해서 광감각제가 그라핀 옥사이드로부터 떨어져 나가기 되는 경우에는, 광감각제와 그라핀 옥사이드 간의 에너지 전달현상(resonance energy transfer)이 없어지기 때문에, 광감각제가 강한 형광신호 및 반응성 산소를 생성하게 된다. 이러한 원리에 의하여, 특정 효소를 과발현하는 암과 같은 질병 병소의 위치를 형광 영상으로 진단할 수 있으며, 선택적으로 광역학 치료 효과를 얻을 수 있다. 또한, 빛에 반응하여 열을 발생하는 그라핀 옥사이드에 의하여 광열 치료 효과를 복합적으로 얻을 수 있다.
상기 형광영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암 조직에 선택적으로 반응하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체 고분자 및 광감각제를 결합시키는 단계(단계 1); 및 상기 생체 고분자-광감각제 결합체 분산액에 그라핀 옥사이드 분산액을 첨가하고 혼합하여 복합체를 형성하는 단계(단계 2)를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1은, 생체 고분자 및 광감각제를 혼합하여 암세포의 특정 효소 작용에 의하여 형광 및 반응성 산소 생성이 활성화되게 하는 하기 화학식 1로 표시되는 생체 고분자-광감각제 결합체를 형성하는 단계로, 하기 단계를 통하여 제조할 수 있다.
[화학식 1]
1) 생체 고분자에 관능기를 도입하는 단계; 및
2) 상기 관능기가 도입된 생체 고분자를 용해한 용액에 활성화된 광감각제를 첨가하여 반응시키는 단계.
상기 단계 1)은, 생체 고분자에 관능기를 도입하기 위하여 아민계 화합물을 첨가하고 반응시켜 아민기가 결합된 생체 고분자를 제조하는 단계로, 생체 고분자에 카복실기 활성화제를 첨가하여 생체 고분자를 활성화하고 아민계 화합물을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 카복실기 활성화제는 1-에틸-3(3-디메텔아미노프로필)카보디이미드(EDC), N-히드록시설포석신이미드(sulfo-NHS) 또는 상기 두 물질을 순차적으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 아민계 화합물은 에틸렌디아민을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 생체 고분자의 종류 및 관능기의 종류에 따라 티올계 화합물(thiol derivative), 카로복실산계 화합물(carboxylic acid derivative), 아지드(azide)계 화합물 또는 알킨(alkyne)계 화합물을 사용할 수 있다.
상기 단계 2)는, 상기 단계 1)에서 제조된 아미노화된 생체 고분자를 광감각제와 혼합하여 생체고분자-광감각제 결합체를 형성하는 단계이다. 카복실기 활성화제로 활성화된 광감각제를 용매에 용해한 후 상기 아미노화된 생체 고분자를 첨가하여 20℃ 내지 30℃에서 20 내지 28시간 동안 반응시켜 생체고분자-광감각제 결합체를 제조할 수 있다. 상기 카복실기 활성화제는 1-에틸-3(3-디메텔아미노프로필)카보디이미드(EDC), N-히드록시설포석신이미드(sulfo-NHS) 또는 상기 두 물질을 순차적으로 사용할 수 있다. 상기 용매는 디메틸폼아마이드(DMF) 및 물을 1:1 부피비로 혼합한 혼합용액인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 1) 및 상기 단계 2)의 반응 부산물을 정제하기 위하여 투석 방법 또는 컬럽 분리방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기의 방법으로 제조된 생체 고분자-광감각제 결합체는 FT-IR 측정 결과를 통해 강한 특징의 피크를 나타냄으로써, 효과적으로 결합체가 형성되었음을 확인하였다.
상기 단계 2는, 생체 고분자-광감각제 결합체를 빛에 반응하여 열을 생성시키는 그라핀 옥사이드에 첨가하여 반응시킴으로써 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체를 제조하는 단계이다. 상기 단계 2는 반응되지 않은 생체 고분자-광감각제 결합체를 분리하기 위하여, 증류수로 투석한 후 원심분리하여 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암 세포에서 발현하는 효소에 특이적으로 반응하여 강한 형광을 생성할 뿐 아니라, 빛에 반응하여 산소종 및 열을 발생시킴으로써, 암 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암세포에서 발현하는 효소에 선택적으로 반응하여 강한 형광신호 및 반응 산소종을 생성시킬 뿐만 아니라, 열을 발생시키는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암의 형광 영상 진단뿐 아니라 광역학/광열 치료에 적용할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 그라핀 옥사이드/생체고분자-광감각제 나노복합체의 효소 반응 특성 개념을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 (A) 주사전자현미경(FE-SEM) 사진 및 (B) 수용액상 크기(hydrodynamic size) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 형광 및 일항산소 억제 특성, 및 효소 반응에 의한 형광 및 일항산소 생성 회복현상 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드 함량이 증가함에 따른 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체의 형광 억제현상 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀옥사이드(GO), 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 및 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 (A) 형광 방출 스펙트라 및 (B) 레이저 조사시 발생하는 일항산소 생성에 의한 singlet-oxygen-sensor-green 시약의 형광 방출 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체에 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 억제제 처리된 히알루로니디아제(inhibitor-pretreated hyaluronidase)를 처리하였을 때 (A) 형광 강도의 증가/억제 경향 및 (B) SOG(일항산소 생성의 증가/억제) 경향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 레이저 조사에 따른 세포배양액, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 및 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 (A) 시간별 온도 변화 그래프 및 (B) 레이져 조사 후 열화상 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 소태아혈청(FBS) 처리에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 시간 변화에 따른 형광 강도 변화를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 암 세포의 생존률을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 (A) 주사전자현미경(FE-SEM) 사진 및 (B) 수용액상 크기(hydrodynamic size) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 형광 및 일항산소 억제 특성, 및 효소 반응에 의한 형광 및 일항산소 생성 회복현상 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드 함량이 증가함에 따른 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체의 형광 억제현상 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀옥사이드(GO), 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 및 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 (A) 형광 방출 스펙트라 및 (B) 레이저 조사시 발생하는 일항산소 생성에 의한 singlet-oxygen-sensor-green 시약의 형광 방출 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체에 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 억제제 처리된 히알루로니디아제(inhibitor-pretreated hyaluronidase)를 처리하였을 때 (A) 형광 강도의 증가/억제 경향 및 (B) SOG(일항산소 생성의 증가/억제) 경향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 레이저 조사에 따른 세포배양액, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 및 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 (A) 시간별 온도 변화 그래프 및 (B) 레이져 조사 후 열화상 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 소태아혈청(FBS) 처리에 따른 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 시간 변화에 따른 형광 강도 변화를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 암 세포의 생존률을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 하기 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 생체 고분자-
광감각제
결합체의 제조
히알루론산(HA, MW 66,300 Da)은 Lifecore Biomedical(MN, USA)로부터 구입하였으며, 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), N-히드록시설포석신이미드(sulfo-NHS) 및 에틸렌디아민 하이드로클로라이드는 Sigma-Aldrich(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Chlorin e6(Ce6) 및 투석막(MW cut-off: 50,000 Da)는 Frontier Scientific(UT, USA) 및 Spectrum Laboratories(CA, USA)로부터 각각 구입하였다.
아민 기능기화된 생체 고분자 히알루론산과 광감각제인 Chlorin e6를 결합시키기 위하여, 먼저 아미노화 히알루론산을 제조하였다. 200 ㎎ 히알루론산을 인산완충액(pH 7.4, 10 mM, 10 ㎖)에 용해시킨 후, 카르복실기 활성화제인 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC, 1M, 0.125 ㎖) 및 N-히드록시설포석신이미드(sulfo-NHS, 100 mM, 0.5 ㎖)를 순차적으로 첨가하였다. 15분 동안 반응시킨 후, 에텔렌디아민(9.4 mg)이 용해된 인산완충액(0.5 ㎖)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 반응물은 증류수로 투석하고 동결건조하여 아미노화 히알루론산을 얻었다. 수득한 아미노화 히알루론산과 Chlorin e6(Ce6)의 결합체를 제조하기 위하여, 먼저 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 녹인 카르복실기 활성화제인 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC, 1M, 0.125 ㎖) 및 N-히드록시설포석신이미드(sulfo-NHS, 100 mM, 0.5 ㎖)를 Chlorin e6(Ce6, 5.3 ㎎)에 순차적으로 첨가하고 반응시켜 활성화된 NHS-Chlorin e6 용액을 제조하였다. 디메틸폼아마이드(DMF):물을 부피비로 1:1 혼합한 혼합용매 2.5 ㎖에 상기 아미노화 히알루론산(25 mg)을 녹이고, 상기 활성화된 NHS-Chlorin e6 용액을 혼합한 후 상온에서 24시간 동안 반응시켜 생체 고분자-광감각제 결합체인 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 용액을 합성하였다. 상기 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 용액은 하루 동안 인산완충액 및 증류수로 각각 투석하여 정제하고, 동결건조하여 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체를 얻었다.
실시예
2:
그라핀
옥사이드
/생체 고분자-
광감각제
(
GO
/
HA
-
Ce6
) 나노복합체의 제조
그라핀 옥사이드(graphene oxide, GO)는 Graphene Laboratories Inc.(Calverton, NY, USA)에서 구입하였다. 그라핀 옥사이드 분산액은 증류수에 넣고 1시간 동안 초음파 처리한 후, 상기 실시예 1에서 제조한 증류수에 용해된 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체와 혼합한 후 실온에서 12시간 이상 반응시켰다. 그 후, 그라핀 옥사이드와 반응하지 않은 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 미반응물은 반복적인 원심분리 및 투석을 통하여 제거함으로써, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나나복합체를 얻었다. 최종생성물인 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체는 증류수에 재분산 시키고 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.
실험예
1: 생체 고분자-
광감각제
결합체의
FT
-
IR
분석
상기 실시예 1에서 제조된 생체 고분자-광감각제 결합체인 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 형성되었는지 확인하기 위하여, FT-IR(Fourier transform infrared) 분광계로 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 히알루론산 내에 Ce6의 결합비를 계산하기 위하여, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체를 0.1M 수산화나트륨/0.1% SDS(황산도데실나트륨)수용액에 용해시킨 후 흡광도를 400 nm에서 측정하였다. Ce6은 400 nm에서 1.5×105 M-1㎝-1의 몰흡광계수를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 결합된 Ce6 및 히알루론산의 몰비는 1.5:1로 확인되었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 950 ㎝-1 및 1200 ㎝-1 사이에서 C-O 신축진동을 의미하는 강한 특징의 피크를 확인할 수 있었으며, 1500 ㎝-1 및 1700 ㎝-1에서 카보닐 및 카복실 밴드, 2900 ㎝-1에서 C-H 신축진동 및 3400 ㎝-1에서 O-H 신축진동 피크를 관찰할 수 있었다. 이는 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 성공적으로 형성되었음을 의미한다.
실험예
2:
그라핀
옥사이드
/생체 고분자-
광감각제
(
GO
/
HA
-
Ce6
) 나노복합체의 형태 및 크기 분석
상기 실시예 2에서 제조된 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 표면 특성분석을 위하여, 주사전자현미경(FE-SEM)을 이용하여 분석하였다. 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체 분산 수용액을 슬라이드 글라스에 떨어트리고 건조한 후 진공하에서 얇은 gold film으로 스핀코팅하여 주사전자현미경 분석용 샘플을 준비하였다.
또한, 수용액에 분산된 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 제타전위 및 크기(hydrodynamic size) 측정은 제타전위/입도 분석기(Marvern Instruments Worcestershire, UK)를 이용하여 측정하였다. 상기 주사전자현미경 분석 결과 및 크기 분석 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3A는 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 주사전자현매경(FE-SEM) 이미지를 나타낸 것이며, 도 3B는 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 크기(hydrodynamic size)를 나타낸 것이다. 평균 크기(hydrodynamic size)는 441.1±48.8 nm로 나타났다.
실험예
3:
그라핀
옥사이드
/생체 고분자-
광감각제
(
GO
/
HA
-
Ce6
) 나노복합체의
형광 및
일항산소생성
억제 현상 분석
도 4에, 상기 실시예 2에서 제조한 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 효소반응 특성을 모식적으로 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체는 Ce6와 그라핀 옥사이드 간의 초분자 π-π 스택킹(stacking)에 의한 상호작용과 더불어, 히알루론산 백본과 그라핀 옥사이드 간의 소수성 상호작용에 의해서 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 그라핀 옥사이드 표면에 강하게 흡착된다. 이 결과, 광감각제인 Ce6와 그라핀 옥사이드가 20 nm 이내의 거리를 유지하게 되면서 Ce6와 그라핀 옥사이드 간에 에너지 전달현상이 매우 잘 일어날 수 있다. 이에, 광감각제인 Ce6는 특정 파장의 빛에 노출이 되더라도 형광신호와 반응성 산소종(특히, 일항산소)를 생성해 내지 못하고 소광(quenching)된다. 이후, 효소인 HAdase의 작용에 의해서 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 저분자량 화합물로 분해되면서 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) q분해체(fragments)가 그라핀 옥사이드의 표면으로부터 떨어져 나가게 되며 강한 형광신호를 생성해내고, 광역학 치료를 위한 반응성 산소종도 활발히 생성하게 된다. 또한, 강한 근적외선 빛을 추가로 조사해주는 경우, 그라핀 옥사이드 나노입자가 열을 발생하게 되어 광열 치료 효과를 나타내게 된다.
상기와 같은, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 반응특성을 설명하기 위하여, 그라핀 옥사이드(GO), 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 및 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 광학특성을 UV/Vis spectrometer로 측정하고, multifunctional microplate reader(Safire2; Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 형광분석을 수행하였다.
형광분석을 위하여, 샘플은 400 nm 파장으로 여기(excitation)한 후 형광을 측정하였다. 모든 샘플은 인산완충액(PBS: 6.7 mM, pH 7.4, NaCl 154 mM)에 분산시켜 준비하였다. 광감각제의 일항산소 생성(singlet oxygen generation, SOG) 능력의 억제 및 회복 특성을 평가하기 위하여, 일항산소 검출 시약인 Singlet Oxygen Sensor Green(SOSG, Molecular Probes, NY, USA)을 사용하였다. 일항산소 검출 시약을 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 또는 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 함유된 인산완충액(PBS: 6.7 mM, pH 7.4, NaCl 154 mM)에 혼합하고, 최종적으로 광감각제인 Ce6의 농도가 1.8 μM Ce6 당량이 되도록 하였다. 일항산소 생성을 위하여, 각 샘플 용액은 670 nm 레이져(조사 선량 속도: 100 mW/cm2 및 조사 선량: 20 J/cm2)로 조사하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다. 도 5 및 도 6에 결과를 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체의 농도를 일정하게 유지하면서, 그라핀 옥사이드의 농도를 높였을 때 광감각제인 Ce6의 형광강도가 그라핀 옥사이드 농도에 비례하여 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 그라핀 옥사이드(GO)와 복합체를 형성할 때 광감각제인 Ce6의 형광이 소광(quenching)됨을 보여준다.
또한, 도 6A에 나타난 바와 같이, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체와 비교하여 약 5.3% 수준으로 형광강도가 감소되었다. 이는, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 그라핀 옥사이드(GO)와 복합체를 형성한 후 형광세기가 19배 감소됨을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
또한, 도 6B에 나타난 바와 같이, 670 nm 레이저 조사 동안에 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체로부터의 일항산소 검출시약(SOSG)의 형광이 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체보다 9배 작게 증가되었다. 이는, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체에 비하여 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6)의 일항산소 생성 능력이 9배 억제되었음을 나타낸다.
실험예
4:
그라핀
옥사이드
/생체 고분자-
광감각제
나노복합체에서 형광 및
SOG
의 효소 반응성 회복 분석
상기 실시예 2에서 제조된 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 형광 및 일항산소 생성능력이 효소의 작용에 의하여 회복되는지를 확인하기 위하여, 효소 반응성 회복 실험을 실시하였다. 인산완충액(PBS)에 용해된 ㄱ그그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6)에 HAdase(히알루니다아제, 800 unit/㎖)를 첨가하고 용액을 37℃에서 3시간 동안 효소반응 시켰다.
또한, 형광 및 반응성 산소 생성능력 회복이 HAdase 특이적인지를 확인하기 위하여, 37℃에서 HAdase 억제제 6-O-palmitoly-L-ascorbic acid(1 μM)를 HAdase에 30분 동안 전처리해주고, 이것을 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 용해되어 있는 인산완충액(PBS)에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 후, 형광 강도 및 일항산소 생성능력(SOG)을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 실험은 3회 반복하였으며, 실험을 위하여 샘플의 농도는 1.8 μM Ce6 당량으로 조절하였다.
도 7A에 나타난 바와 같이, HAdase를 처리함으로써 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 형광이 5배 증가하였다. 이로부터 HAdase 처리에 의해서 약 21%의 Ce6가 그라핀 옥사이드 표면으로부터 방출된 것으로 계산되었다. 한편, HAdase를 HAdase 억제제로 전처리하고 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체에 반응시켰을 때는 형광의 증가가 상당히 감소하였으며, 이는 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 형광증가는 HAdase의 활성에 의한 것임을 나타낸다.
또한, 도 7B에 나타난 바와 같이, 레이저 조사 동안에 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6)으로부터의 일항산소 생성능력(SOG)을 확인한 결과, HAdase를 처리해준 경우에 일항산소 생성능력이 약 5배 증가하였고, HAdase를 억제제로 전처리해준 경우에는 일항산소 생성능력이 다소 감소하는 것을 확인하였다. 이 결과로, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체는 HAdase의 작용에 의해서 선택적으로 형광 및 일항산소 생성이 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예
5: 레이저 조사에 의한 온도 변화 측정
그라핀 옥사이드는 흡수된 빛에너지를 열에너지로 전환시킴으로써 온도상승을 일으키는 특성이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 레이저 조사시 발열 현상을 나타냄으로써 암의 광열 치료제로서 효용성이 있는지 확인하기 위하여, 온도 변화 분석을 시행하였다. 실험을 시작하기 전에, 대기온도와 평형을 위하여 각 샘플(상기 실시예 1의 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 용해된 수용액 및 상기 실시예 2의 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 용해된 수용액)을 30분 동안 실온에 두었다. 그 후, 810 nm 레이저를 이용하여 1 W/cm2 및 4 W/cm2 조사 선량 속도로 각 샘플을 8분 동안 조사하였다. 레이저로 빛을 조사하는 동안 온도 변화는 열화상카메라(Thermovision A40, FLIR, Wilsonville, OR)을 사용하여 실시간으로 기록하였다. 온도 상승은 상용소프트웨어(ThermaCam Research, Boston, Ma)를 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 용해된 수용액 샘플의 경우에는 810 nm 레이저 조사에도 불구하고 온도의 변화가 없는 반면, 그라핀 옥사이드/HA-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 용해된 수용액 샘플은 레이저의 조사선량 속도(laser irradiation dose rate)에 의존적으로 온도가 상승하였다. 810 nm 레이저(4 W/cm2, 250 J/cm2) 조사시, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체 샘플의 온도는 100초 후에 약 50℃까지 온도가 상승하였으며, 이후 이 온도를 유지하였다. 이 결과로부터 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체가 암의 광열 치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실험예
6: 혈청 단백질 존재하에서의
그라핀
옥사이드
/생체 고분자-광감각제(
GO
/
HA
-
Ce6
) 나노복합체의 안정성 분석
혈청 단백질 존재하에서도 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 그라핀 옥사이드에 안정적으로 복합체를 형성할 수 있는지를 확인하였다. 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체를 10%(v/v) 소태아혈청(FBS)을 함유하는 인산완충액(PBS)에 분산시키고 24시간 동안 Ce6의 형광 변화를 관찰하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 10% 소태아혈청(FBS)의 처리에도 불구하고 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 형광은 24시간 동안 1.5배 밖에 증가하지 않았다. 이는, 혈청 내에 존재하는 단백질이 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체의 결합 안정성에 미치는 영향이 작으며, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체가 그라핀 옥사이드와 안정적으로 강한 복합체를 형성하고 있음을 나타낸다.
실험예
7:
생체외
광독성
세포 실험
상기 실시예 2에서 제조한 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체를 이용한 암의 광역학 및 광열치료 효과를 확인하기 위하여, 생체외 세포 생존능 분석을 시행하였다. A549 인간 폐암세포를 96-well 플레이트에 1×104 cells/well 밀도로 접종하고 세포부착을 위해 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 10% 소태아혈청(FBS)를 함유하는 RPMI 1640 세포 배양액을 사용하여 Ce6, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체, HAdase 전처리된 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체, 그라핀 옥사이드-히알루로산-Ce6 나노복합체 및 HAdase로 전처리된 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체를 녹이고, 최종농도 1.8 μM Ce6 당량이 되도록 샘플을 희석하였다. 세포에 있는 기존의 세포배양액을 광감각제를 함유한 배지로 교체하고 24시간 동안 처리해주었다. 이 후, 광감각제가 함유된 세포배양액을 제거하고, 세포를 3번 세척한 후 새로운 세포배양액을 각각의 well에 첨가해 주었다. 광역학 치료(PDT)를 위하여, 세포에 670 nm 레이저(선량 속도 230 mW/cm2 및 선량 20 J/cm2)를 사용하여 빛을 조사하였다. 빛 조사 후, 세포를 24시간 동안 추가 배양하고 세포 계수 키트(cell counting kit, Dojindo Labotatories)를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 대조구 암세포는 광감각제가 들어있지 않은 세포배양액으로 처리하고, 세포 생존율을 측정하였다. 대조구의 세포 생준율을 100%로 하여, 각 샘플 처리군의 세포 생존율을 구하였다.
또한, 광열치료(PTT) 효과를 확인하기 위하여, 810 nm 레이저를 각 샘플군에 4 W/cm2 선량 속도 및 250 J/cm2 선량으로 조사하고, 24시간 후에 세포 계수 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
또한, 광열 및 광역학 복합치료(PTT + PDT) 효과를 분석하기 위하여, 세포를 먼저, 810 nm 레이저를 사용하여 4 W/cm2 선량 속도 및 250 J/cm2 선량으로 조사하고, 이어서 670 nm 레이저를 사용하여 선량 속도 230 mW/cm2 및 선량 20 J/cm2으로 조사하였다. 추가적으로 24시간 배양한 후, 세포 생존율을 분석하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체를 세포에 처리하고 810 nm 레이저를 조사하여 광열 치료를 시행한 경우에는 20% 내지 33%의 암세포 사멸을 유발하였다. 반면에, Ce6 또는 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체를 처리하고 810 nm 레이저를 조사한 경우에는 광열 치료 효과가 나타나지 않았다. 또한, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6)를 처리하고 670 nm 레이저를 조사하여 광역학 치료를 시행한 경우에는, 히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 또는 Ce6를 처리하고 레이저 조사한 것에 비하여 현저하게 향상된 암세포 사멸 효과를 얻을 수 있었다. 이는 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6)이 암세포내로의 섭취가 Ce6 및 HA-Ce6 결합체에 비해서 높을 뿐 아니라, 암세포내의 HAdase에 의해서 반응성산소 생성능력이 회복되었기 때문이다.
또한, 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체를 처리하고 광열/광역학 복합 치료를 시행한 경우에는 광역학 치료를 단독으로 시행한 경우에 비해서 보다 향상된 암 치료 효과를 얻을 수 있었다(P < 0.05).
히알루론산-Ce6(HA-Ce6) 결합체 및 그라핀 옥사이드/히알루론산-Ce6(GO/HA-Ce6) 나노복합체를 HAdase로 전처리하고 광역학 치료를 시행한 경우에는, 작지만 일관되게 광역학 치료 효능이 향상됨을 확인할 수 있었다.
상기 모든 실험의 통계학적 분석은, student's t test를 사용하여 수행하였으며, P 수치가 0.05 보다 낮으면 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
<110> National cancer center
<120> Enzyme-responsive graphene oxide/biopolymer-photosensitizer
nanocomplex and composition for fluorescence image and
photodynamic/photothermal treatment comprising thereof
<130> PA120514/KR
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 1
<400> 1
Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 2
<400> 2
Gly Gly Leu Gly Gln Arg Gly Arg Ser Ala Asn Ala Ile Leu Glu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 3
<400> 3
Gly Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 4
<400> 4
Leu Val Leu Ala Ser Ser Ser Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 5
<400> 5
Pro Leu Gly Met Trp Ser Arg
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 6
<400> 6
Pro Gly Asn Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 7
<400> 7
Pro Ala Gly Leu Leu Gly Cys
1 5
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 8
<400> 8
Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Ile Leu Glu
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 9
<400> 9
Gly Pro Ile Cys Phe Phe Arg Leu Gly
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 10
<400> 10
His Ser Ser Lys Leu Gln Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 11
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> Xaa = Cys(Et) which is ethylcysteine
<400> 11
Pro Ile Xaa Phe Phe
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 12
His Ser Ser Lys Leu Gln
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 13
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> Xaa = Leu or Gln
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> Xaa = Ile or Leu
<400> 13
Pro Xaa Gly Xaa Ala Gly
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 14
<400> 14
Gly Val Val Gln Ala Ser Cys Arg Leu Ala
1 5 10
Claims (14)
- 생체 고분자-광감각제 결합체에 그라핀 옥사이드를 결합한 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 생체 고분자-광감각제 결합체는 효소에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 폴리펩티드 기질을 함유하는 백본을 포함하고 있는 생체 고분자 화합물 또는 효소에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩타이드 기질을 함유하는 생체 고분자 와 광감각제를 연결하는 연결자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제2항에 있어서, 상기 생체 고분자는 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 폴리라이신, 폴리에틸렌 글리콜-폴리 라이신, 헤파린, 헤파란 설페이트, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 엘라스틴 또는 덱스트란인 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제2항에 있어서, 상기 효소는 히알루로니디아제(hyaluronidase), 헤파라네이즈(heparanase), 카텝신류(cathepsin), 콘드로이티나아제(chondroitinase), MMP류(matrix metallo-peptidase), 막 유형의 MMP류(matrix metallo-peptidase), 콜라게나제류(colloganase), 스트로멜리신류(stromelysin), 유로키나제형 플라스미노젠 활성화제(urokinase-type plasminogen activator, u-PA), 카스파제류(caspase), 바이러스성 단백질분해효소류(viral protease), HIV 단백질분해효소류(HIV protease), HSV 단백질분해효소류(HSV protease), 젤라틴분해효소(gelatinase), 유로키나제(urokinase), 세크리테이즈류(secretase), 엔도솜 가수분해효소(endosomal hydrolase), 전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA), 플라스미노겐활성화제(plasminogen activator), 트롬빈(thrombin), 에스테라아제(esterase), 플루라나아제(pullulanase) 및 덱스트라나아제(dextranase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제2항에 있어서, 상기 펩타이드 기질은 RPLALWRS(서열번호 1), GGLGQRGRSANAILE(서열번호 2), GVSQNYPIVG(서열번호 3), LVLASSSFGY(서열번호 4), PLGMWSR(서열번호 5), PGNWT(서열번호 6), PAGLLGC(서열번호 7), LGGSGRSANAILE(서열번호 8), RR, RRG, GPICFFRLG(서열번호 9), HSSKLQG(서열번호 10), PIC(Et)FF(서열번호 11), HSSKLQ(서열번호 12), P(L/Q)G(I/L)AG(서열번호 13), GVVQASCRLA(서열번호 14) 또는 KK를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 광감각제가 그라핀 옥사이드의 표면으로부터 20 nm 이내의 거리에 위치하는 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 광감각제는 유리염기(free base) 또는 금속 착물(metal complex) 형태의 포르피린계 화합물 또는 비포르피린계 화합물인 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제7항에 있어서, 상기 광감각제는 로다민 유도체, 알렉사 유도체, BODIPY 유도체 또는 시아닌 유도체인 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제7항에 있어서, 상기 광감각제는 chlorin e6인 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제 6항에 있어서, 상기 광감각제는 600 nm 내지 900 nm의 근적외선 파장 영역에서 형광신호를 내는 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 생체 고분자-광감각제 결합체는 아미드 결합 또는 에스터 결합에 의해서 공유결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제11항에 있어서, 상기 생체 고분자-광감각제 결합체의 공유결합 비율은 1:1 내지 1:20 몰비인 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 형광영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체는 암 조직에 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는, 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 조성물.
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