CN109777858A - 对基因重复区域进行杂交捕获的探针及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对基因重复区域进行杂交捕获的探针及方法。其中，该探针是以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置作为3’末端的具有检测标记的引物探针。应用本发明的技术方案，采用引物扩增延伸的原理，利用引物延伸对序列尤其是3’末端序列的特异性要求大于杂交捕获中碱基互补配对对序列的特异性要求，以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内相对特异位置作为引物特异性要求最高的3’末端，设计具有检测标记的引物探针作为捕获探针，结合传统液相杂交捕获体系，特异性地提高基因重复区域的捕获效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种对基因重复区域进行杂交捕获的探针及方法。
背景技术
液相杂交捕获技术是根据碱基互补原则发展而来的，通过在溶液中目标DNA片段和已带有生物素标记的探针直接杂交，然后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的磁珠上。磁珠由磁微粒与高纯度链霉亲和素共价结合而成，可用于捕获生物素标记的底物，生物素-链霉亲和素的相互作用很强，非特异性结合率很低，使得被捕获的底物可满足后续实验要求。通过清洗磁珠洗去非目标DNA，再通过洗脱磁珠获取目的区域DNA。
人类基因组中存在着大量的重复序列，重复序列往往具有很高的拷贝数，在基因组杂交实验中会与目的片段发生竞争性杂交，导致真正的目的序列杂交效率降低。人Cot-1DNA是胎盘DNA，长度主要为50至300bp，富含重复的DNA序列，比如Alu和Kpn家族成员。因此在传统杂交过程中，往往通过加入Human Cot1DNA作为封闭剂用于封闭基因组中重复序列以提高捕获效率。但是部分重要癌症相关基因的区域内同样存在重复序列，虽然这些区域是我们希望进行捕获的目的区域，但是在传统的杂交捕获技术中，为了达到整体性能的优化，往往需要“牺牲”这些重要区域内的重复序列，不针对这些区域进行探针的设计。也就是说，现有杂交捕获技术无法对目的基因区域中的高重复序列进行设计探针或者即便是设计探针，其捕获效率也不高。
发明内容
本发明旨在提供一种对基因重复区域进行杂交捕获的探针及方法，以解决现有杂交捕获方法中无法对高重复区域进行探针设计和有效捕获的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种对基因重复区域进行杂交捕获的探针。该探针是以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置作为3’末端的具有检测标记的引物探针。
进一步地，引物探针的5’端具有Illumina P5接头序列。
进一步地，检测标记为在引物探针的5’端加入的生物素修饰。
进一步地，引物探针的长度为63bp～73bp，优选为68bp。
进一步地，引物探针能够匹配在目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置的长度为5bp～20bp，优选为10bp。
进一步地，目的基因为ROS1基因，基因重复区域为31号内含子区域。
进一步地，对ROS1基因31号内含子区域进行杂交捕获的引物探针如下表1所示：
表1
进一步地，引物探针单独使用特异性捕获基因重复区域，或同常规多基因的捕获探针池混合使用。
根据本发明的另一方面，提供了一种对基因重复区域进行杂交捕获的方法。该方法采用上述任一种探针对基因重复区域进行杂交捕获。
进一步地，杂交捕获采用液相杂交捕获体系进行，在使用引物探针进行捕获过程中加入扩增酶。
应用本发明的技术方案，采用引物扩增延伸的原理，利用引物延伸对序列尤其是3’末端序列的特异性要求大于杂交捕获中碱基互补配对对序列的特异性要求，以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内相对特异位置作为引物特异性要求最高的3’末端，设计具有检测标记的引物探针作为捕获探针，结合传统液相杂交捕获体系，特异性地提高基因重复区域的捕获效率。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
现有杂交捕获技术的缺点是无法对目的基因区域中的高重复序列进行设计探针或者设计的探针捕获效率不高。本发明的目的在于提高目的基因内高重复区域的捕获效率。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种对基因重复区域进行杂交捕获的探针。该探针是以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置作为3’末端的具有检测标记的引物探针。
应用本发明的技术方案，采用引物扩增延伸的原理，利用引物延伸对序列尤其是3’末端序列的特异性要求大于杂交捕获中碱基互补配对对序列的特异性要求，以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内相对特异位置作为引物特异性要求最高的3’末端，设计具有检测标记的引物探针作为捕获探针，结合传统液相杂交捕获体系，特异性地提高基因重复区域的捕获效率。
优选的，引物探针的5’端具有Illumina P5接头序列，方便后续应用过程中杂交捕获的进行。优选的，检测标记为在引物探针的5’端加入的生物素修饰，方便后续应用过程中杂交捕获信号的检测。
优选的，引物探针的长度为63bp～73bp，优选为68bp。此引物探针长度合适，既包括了所必须的接头序列和特异性3’末端序列，又不至于长度过长增加合成的难度和成本。
优选的，引物探针能够匹配在目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置的长度为5bp～20bp，优选为10bp。在此种情况下，引物探针的3’末端可以提供良好的特异性。
根据本发明一种典型的实施方式，目的基因为ROS1基因，基因重复区域为31号内含子区域。
优选的，对ROS1基因31号内含子区域进行杂交捕获的引物探针如下表1所示：
表1
本发明的引物探针可以单独使用特异性捕获基因重复区域，也可以同常规多基因的捕获探针池混合使用。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种对基因重复区域进行杂交捕获的方法。该方法采用上述任一种探针对基因重复区域进行杂交捕获。优选的，杂交捕获采用液相杂交捕获体系进行，在使用引物探针进行捕获过程中加入扩增酶。
根据本发明一种典型的实施方式，设计了肺癌、结直肠癌靶向基因检测探针池，包括了16个基因的外显子区域和部分的内含子区域，其中针对目的基因内部重复区域，设计了用于特异捕获的引物，提高对应区域的捕获效率。
该实施方式具体步骤包括：
1)目的基因区域的分析。
从NCBI上获得肺癌、结直肠癌相关16个基因的外显子DNA序列，其中包括ALK基因、ROS1基因的内含子区域作为杂交捕获的目的区域。
根据目的区域的DNA序列，每120bp作为一条探针的序列，使用Blast比对工具，每条探针比对人类基因组。由于基因外显子区域序列相对保守，因此比对得到的相似序列数目(blast hit)都较小，可以用于设计杂交捕获的探针。但是在ROS1基因的31号内含子区域，发现了大量的重复序列(表2)，这些重复序列无法直接作为捕获探针。由于ROS1基因的发生与癌症相关的主要突变形式为基因融合，基因融合在DNA水平上能发生在基因的内含子区域，因此提高对ROS1基因内含子区域的捕获效率对于提高基因融合的检出具有重要意义。
表2:ROS1基因31号内含子重复区域探针
2)特异性捕获引物的设计
根据以上分析结果，本实施方式根据重复区域侧翼的保守区域和通过Blast选取重复区域内相对特异碱基作为引物3’端，并在引物的5’端加入生物素的修饰和IlluminaP5接头序列。ROS1第31号内含子区域内6840bp重复序列可设计20条特异性捕获引物(表1)。
3)使用杂交捕获和特异捕获引物进行目的片段的捕获和洗脱
将以上合成的16个肺癌、结直肠癌相关基因的捕获探针和特异性捕获引物进行混合，在使用探针进行捕获过程中加入扩增酶，使设计的特异捕获引物可以进行结合和目的片段的延伸。由于特异引物末端具有生物素修饰，因此在后续杂交捕获之后，延伸后的片段可以连同杂交捕获得到的目的片段一起被带有链霉亲合素的磁珠所收集。随后的洗脱液可以将未被探针和特异引物捕获的片段冲洗掉。
4.)捕获片段的PCR扩增
无论是被杂交探针还是特异引物捕获下来的目的片段两端都已经连接上Illumina平台测序所需的接头，因此使用通用P5/P7引物将目的片段进行扩增。
5)上机测序
将构建的捕获文库使用Illumina测序平台进行上机测序，得到原始测序数据。
6)信息分析
使用杂交捕获信息分析流程，对原始测序数据进行质控参数的分析，包括目标区域覆盖度、平均测序深度、捕获效率和均一性等。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果，以下实施例中没有明确描述的步骤可采用本领域的常规技术手段实现。
实施例1
样本信息：细胞系H1299DNA
试剂和仪器见下表3：
表3
| 仪器名称 | 厂商 | 型号 |
| Savant<sup>TM</sup>DNA SpeedVac<sup>TM</sup>浓缩器 | Thermo | DNA120-230 |
| 热循环仪 | BIO-RAD | T100<sup>TM</sup>Thermal Cycler |
| 96孔磁力架 | Invitrogen | 12331D |
| 涡旋振荡仪 | 鼎昊源科技 | VS-1 |
| mini smart掌上离心机6×1.5mL | 鼎昊源科技 | 0401061 |
| mini smart掌上离心机2×8×0.2mL | 鼎昊源科技 | 0401062 |
| 磁力架1.5-2mL | ||
| 干式恒温器 | 杭州奥盛仪器有限公司 | K30 |
| 试剂 | 厂商 | 货号 |
| 10×洗涤缓冲液Ⅰ | IDT | 1072273 |
| 10×洗涤缓冲液Ⅱ | IDT | 1072274 |
| 10×洗涤缓冲液Ⅲ | IDT | 1072275 |
| 10×增强清洗液 | IDT | 1072276 |
| 2×杂交缓冲液 | IDT | 1072277 |
| 杂交增强剂 | IDT | 1072278 |
| 2×磁珠清洗液 | IDT | 1072279 |
| xGen Universal blockers | IDT | 1076154 |
| Dynabeads M-270streptavidin | Thermo | 65306 |
| Human cot-1DNA | Thermo | 15279-101 |
| KAPA HIFI hotstart ready mix | KAPA | KK2601 |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo | Q32854 |
| 无核酶水 | Thermo | AM9930 |
| 无水乙醇 | 北京化工厂 | 无 |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411-02 |
操作流程：
1.DNA提取：使用常规细胞系DNA提取试剂盒提取细胞系H1299细胞系DNA，提取后的DNA采用Qubit定量，取200ng用于捕获前文库的构建。
2.捕获前文库构建：细胞系DNA打断成200～300bp的片段，使用通用基因测序用文库试剂盒，按照试剂盒说明书进行捕获前文库的构建，并对文库进行纯化和Qubit定量。
3.液相杂交捕获
3.1捕获探针的准备
制备两份探针，其中探针1为根据肺癌、结直肠癌16个相关基因(分别为：EGFR、ALK、ROS1、MET、ERBB2、RET、NTRK1、KRAS、BRAF、PIK3CA、NRAS、AKT1、UGT1A1、KIT、PDGFRA和TP53)设计的杂交捕获探针(委托IDT合成)；探针2为根据ROS1基因31号内含子设计的特异捕获引物(表1，委托IDT合成)与探针1的混合物，将两份探针分别稀释至工作浓度为0.75nM，放置于冰盒内。
3.2分别取两份制备的捕获前文库各500ng，命名为样本1和样本2，每份样本分别加入5ug Human Cot1DNA和2ul接头封闭剂，涡旋混匀。并于70℃以下烘干，约1.5～2h。
3.3将上一步骤中烘干的混合物加入8.5μL 2×杂交缓冲液，2.7μL杂交增强剂和1.8μL无核酶水，颠倒混匀并在室温放置5～10min；
3.4将混合物转移到0.2mL的PCR管中，95℃孵育10min；
3.5在室温条件下，样本1加入4μL探针1(杂交捕获探针)，样本2加入4μL探针2(杂交捕获探针+特异捕获引物)；涡旋混匀，并瞬时离心。再在PCR仪上65℃孵育4h(PCR仪的加热盖设置为75℃)。
3.6洗脱缓冲液的准备
1×洗脱缓冲液，见表4。
表4
注意：洗脱缓冲液配制前要提前在室温放置2h。
3.7缓冲液的孵育，参数见表5。
表5
| 溶液 | 1×洗脱缓冲液 | 工作温度 |
| 清洗缓冲液I | 100μL | 65℃ |
| 清洗缓冲液I | 200μL | 室温(15～25℃) |
| 增强清洗液 | 400μL | 65℃ |
3.8磁珠的准备
a)从4℃冰箱取出EquilibrateM-270磁珠，涡旋15s，在室温下放置30min左右。
b)在每个200μL EP管内加入100μL磁珠，在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
c)加入200μL 1×磁珠清洗液，并涡旋混匀10s。在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
d)重复步骤3；
e)加入100μL 1×磁珠清洗液，在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清。
3.9链霉亲和素磁珠吸附杂交捕获目标区域
将步骤3.5的产物转移到步骤3.8-e中的EP管内，颠倒混匀10次；在热循环仪上(盖子温度设为75℃)进行65℃孵育45min，其中每隔12min涡旋3s。
3.10.冲洗链霉亲和素磁珠以去除未结合的DNA
a)加入100μL 65℃预热的1×清洗缓冲液I，涡旋混匀并瞬时离心；
b)在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
c)加入200μL增强清洗液，颠倒混匀10次，并于65℃孵育5min；
d)在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
e)重复步骤h和i。
f)加入200μL常温孵育的1×清洗缓冲液I，涡旋混匀2min，并瞬时离心；
g)在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
h)加入200μL常温孵育的1×清洗缓冲液II，涡旋混匀1min，并瞬时离心；
i)在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
j)加入200μL常温孵育的1×清洗缓冲液III，涡旋混匀30s，并瞬时离心；
k)在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清。
l)将上步EP管转移到试管架上，并加入20μL无核酶水，上下颠倒混匀10次以重悬磁珠。
4.杂交捕获后的PCR扩增
4.1.PCR反应试剂的配制表如下表6：
表6
将配制好的PCR混合物涡旋混匀，并瞬时离心。
4.2按照表7中的PCR反应程序进行PCR反应：
表7
5.扩增后的纯化
5.1加入75μL(1.5×)XP磁珠到每个PCR扩增管内，涡旋混匀，并常温孵育10min；
5.2磁力架吸附5min，待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；
5.3加入200μL 80％乙醇漂洗DNA，在磁力架上静置30s，用枪头吸取丢弃上清；
5.4重复上一步；
5.5瞬时离心，待乙醇收集至管底，吸净管底残留的液体，室温晾干5～10min；
5.6加入22μL无核酶水，涡旋混匀，室温静置5min；
5.7瞬时离心，吸取20μL液体至新的EPR管内；
6.文库质控
采用VAHTSTM Library Quantification Kit for试剂盒进行定量杂交捕获的DNA浓度，采用Bioptic Qseq100对文库片段进行检测。
7.使用Illumina Nextseq550测序仪进行文库的测序。
8.使用生物信息分析流程，对原始数据进行分析。分析结果如下表8：
表8
从表8的数据可以看出，包含根据ROS1基因31号内含子设计的特异捕获引物的探针2提高了探针的捕获效率，特别是ROS1内含子捕获效率由常规探针1的10％提高到40％。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
本发明提供的对基因重复区域进行捕获的方法，可以有效提高探针的捕获效率。相比传统杂交捕获方法具有以下优点：
1)本发明设计的特异捕获引物能够比普通杂交捕获探针具有更高特异性，能够提高对基因重复序列捕获效率；
2)本发明设计的特异捕获引物可以单独使用特异捕获重复区域，也可以同常规多基因的捕获探针池混合使用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津诺禾医学检验所有限公司
<120> 对基因重复区域进行杂交捕获的探针及方法
<130> PN78265NHZY
<141> 2018-12-19
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 引物探针1
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<223> 引物探针17
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<223> 引物探针19
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<222> (1)..(68)
<223> 引物探针20
<400> 20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat 60
atccctgc 68
Claims (7)
1.一种对基因重复区域进行杂交捕获的探针，其特征在于，所述探针是以目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置作为3’末端的具有检测标记的引物探针；
所述引物探针的5’端具有Illumina P5接头序列；
所述检测标记为在所述引物探针的5’端加入的生物素修饰；
所述引物探针的长度为63bp～73bp；
所述引物探针能够匹配在目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置的长度为5bp～20bp。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述引物探针能够匹配在目的基因重复区域旁侧保守区域或重复区域内特异位置的长度为10bp。
3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述目的基因为ROS1基因，基因重复区域为31号内含子区域。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，对ROS1基因31号内含子区域进行杂交捕获的引物探针如下表1所示：
表1
5.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述引物探针单独使用特异性捕获基因重复区域，或同常规多基因的捕获探针池混合使用。
6.一种对基因重复区域进行杂交捕获的方法，其特征在于，采用如权利要求1至5中任一项所述的探针对基因重复区域进行杂交捕获。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述杂交捕获采用液相杂交捕获体系进行，在使用所述引物探针进行捕获过程中加入扩增酶。
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